Artykuł metodologiczny

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66795

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, Center for Research in Transplantation and Translational Immunology, UMR 1064, 2CHU Nantes, Nantes Université, Department of Pediatric and Congenital Cardiac Surgery, 3Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, CNRS, BioCore, SFR Bonamy

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Streszczenie

Wytwarzanie funkcjonalnego i samotolerancyjnego repertuaru limfocytów T jest złożonym procesem zależnym od mikrośrodowiska grasicy, a przede wszystkim od właściwości jej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Komórki nabłonka grasicy (TEC) odgrywają kluczową rolę w tymopoezie, pielęgnowaniu i selekcji rozwijających się limfocytów T poprzez filtrowanie samoreaktywnych klonów. Empirycznie wykazano, że TEC są szczególnie wrażliwe na fizyczne i chemiczne wskazówki dostarczane przez ECM, a klasyczna monowarstwowa hodowla komórkowa prowadzi do szybkiej utraty funkcjonalności aż do ich śmierci. Ze względu na tę delikatną konserwację w połączeniu ze względną rzadkością i pomimo wysokiej stawki w modelowaniu biologii grasicy in vitro, nadal brakuje modeli zdolnych do wiernego naśladowania niszy TEC na dużą skalę i z biegiem czasu. W tym miejscu opisujemy tworzenie wielokomórkowego modelu organoidu ludzkiej grasicy, w którym przedział TEC pochodzi z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i jest reagregowany z pierwotnymi wczesnymi przodkami tymocytów w trójwymiarowym (3D) hydrożelu na bazie fibryny. Model ten odpowiada na obecne potrzeby w zakresie skalowalnego systemu hodowli, który odtwarza mikrośrodowisko grasicy ex vivo i wykazuje funkcjonalność, tj. zdolność do wytwarzania limfocytów T i wspierania wzrostu organoidów grasicy przez kilka tygodni. W związku z tym proponujemy praktyczny model funkcjonalności grasicy in vitro za pomocą organoidów pochodzących z iPSC, który przyniósłby korzyści badaniom nad biologią TEC i generacją limfocytów T ex vivo.

Wprowadzenie

Grasica jest głównym narządem limfoidalnym, który odgrywa kluczową rolę w tworzeniu kompetentnego i tolerancyjnego układu odpornościowego1,2,3. Wczesne przodki grasicy (ETP) migrują ze szpiku kostnego do grasicy, gdzie rozszerzają się i różnicują w funkcjonalne limfocyty T1,2,4,5. W procesach tych pośredniczy wyspecjalizowana populacja, komórki nabłonka grasicy (TEC)2,6,7. TEC wywodzą się od progenitorów nabłonka grasicy (TEPs)8,9 i obejmują TEC korowe (cTEC) i TEC rdzeniaste (mTEC), które odgrywają określone role w tworzeniu wyspecjalizowanego mikrośrodowiska 3D potrzebnego do migracji, ekspansji i dojrzewania komórek T. TEC pośredniczą w rozwoju limfocytów T głównie poprzez dostarczanie czynników wzrostu i różnicowania1,10,11 oraz poprzez negatywną selekcję niefunkcjonalnych i nietolerancyjnych tymocytów poprzez prezentację własnych antygenów5,7,12. Złożone interakcje między rozwijającymi się limfocytami T a TEC odgrywają również kluczową rolę w dojrzewaniu i organizacji 3D populacji TEC w procesie znanym jako przesłuch grasicy1,11. Interakcje między populacjami komórek grasicy w dużym stopniu opierają się na specyficznym mikrośrodowisku kształtowanym przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM). ECM grasicy znajduje się w stanie dynamicznej wzajemności z populacjami komórek grasicy, wpływając na regulację genów i będąc stale przekształcanym w zamian przez wydzielanie enzymów lub białek macierzy13. ECM wpływa na komórki poprzez modyfikację biodostępności czynników wzrostu i cytokin, bezpośrednią sygnalizację przez receptory związane z błoną, takie jak integryny, oraz poprzez kształtowanie cytoszkieletów poprzez siły fizyczne14. Wykazano, że składniki ECM grasicy, takie jak kolageny i laminina, mają wysokie powinowactwo do czynników wzrostu TGFb i FGF, które mają kluczowe znaczenie dla utrzymania TEC i ich wiązania poprzez tworzenie kompleksów. Plastyczność ECM grasicy, moduł sprężystości i gęstość również odgrywają kluczową rolę w instruowaniu losu TEC i kształtowaniu podziału grasicy, co jest niezbędne dla jej funkcjonalności. Te wskazówki podkreślają, jak ważne jest uwzględnienie ECM i jego struktury 3D w celu naśladowania grasicy ex vivo. Potwierdza to fakt, że pierwotne TEC szybko się deróżnicują, tracą swoją funkcjonalność i ostatecznie umierają, gdy są hodowane w klasycznych konfiguracjach hodowli komórkowych15,16,17.

Modele hodowli zostały opracowane w celu rozszerzenia funkcjonalnych populacji TEC z ludzkich eksplantatów grasicy, aby zachować strukturę ECM i kluczowe wskazówki, które dostarcza do TECs18,19,20. Ten system hodowli był w stanie z powodzeniem rozszerzyć i utrzymać populację funkcjonalnych TEC in vitro, ale nie mógł być utrzymany dłużej niż 7 do 8 dni hodowli18. W związku z tym opracowanie dostępnego, praktycznego systemu hodowli 3D zdolnego do odtworzenia mikrośrodowiska grasicy i jego funkcjonalności in vitro i w dłuższej perspektywie jest kluczowym wyzwaniem w tej dziedzinie. Niedawny rozwój systemów hodowli 3D na bazie hydrożelu doprowadził do pojawienia się kilku sztucznych systemów organoidów grasicy, co stanowi duży postęp w modelowaniu grasicy in vitro15,16,21,22. Opracowaliśmy system kohodowli ludzkich organoidów grasiczych (hTO) poprzez reagregację ludzkich pierwotnych ETP z ludzkimi TEP pochodzącymi z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sferoidy i ich wysiewanie na hydrożelu fibryny.

Wybór materiału i konfiguracji hydrożelu w tym badaniu miał na celu odtworzenie natywnej struktury ECM grasicy, przy jednoczesnym zachowaniu praktyczności i możliwości zwiększenia skali procesu w celu uzyskania niedrogiego i obfitego źródła materiału do eksperymentów15. Ten system hTO wykazuje potencjał różnicowania wieloliniowego i może wspierać produktywną tymoidezę z ETPs23. Ten system organoidowy stanowi wiarygodne narzędzie do badania interakcji wewnątrz-grasicowych oraz modelowania prawidłowej i patologicznej limfopoezy człowieka. Wykorzystanie komórek iPS wprowadza również do modelu możliwości edycji genów. Skuteczne różnicowanie iPSC w funkcjonalną tkankę grasiczą było długoterminowym celem tej dziedziny przez ostatnie 15 lat i poczyniono znaczne postępy w rozszyfrowywaniu sygnalizacji losu linii TEC21,24,25,26,27. Aby odpowiedzieć na zapotrzebowanie na taki model grasicy 3D in vitro, w niniejszej nocie technicznej opisano metody i szczegóły techniczne dotyczące stopniowego generowania organoidów grasicy ludzkiej pochodzących z iPSC, koncentrując się na tworzeniu rusztowania hydrożelowego, reagregacji i wysiewie mikromasy komórkowej oraz hodowli i zbiorze organoidów.

Protokół

Linia hiPSC hiN.Fm.m.Lon71.019 została wygenerowana z dorosłych męskich fibroblastów i przeprogramowana przez transfekcję mRNA. Linia hiPSC hiN.Fm.f.Lon80.002 została wygenerowana z dorosłych fibroblastów żeńskich i przeprogramowana poprzez transfekcję mRNA. Linia hiPSC hiN.Fs.f.MIPS203.003 została wygenerowana z dorosłych fibroblastów żeńskich i przeprogramowana poprzez rekombinowane zakażenie wektorem wirusowym Sendai. Wszystkie linie komórkowe zostały dostarczone przez platformę iPSC w Nantes. Pacjenci wyrazili świadomą zgodę na wykorzystanie ich komórek do celów badawczych (anonimowe pobranie, Lonza, kat. # CC-2511). Pierwotne ETP są izolowane przez dysocjację pourodzeniowych próbek grasicy ludzkiej uzyskanych jako zanonimizowane wyrzucone odpady od pacjentów poddawanych kardiochirurgii dziecięcej w szpitalu w Nantes (CHU Nantes) tego samego dnia, zgodnie z francuskim rozporządzeniem CODECOH na podstawie deklaracji DC-2017-2987.

1. Ukierunkowane różnicowanie iPSC w kierunku tożsamości TEP

UWAGA: Od czasu pierwszych prac opublikowanych przez Lai i Jin, demonstrujących różnicowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (EScs) w kierunku tożsamości nabłonka grasicy28, kilka badań opracowało i zoptymalizowało protokoły opisujące ukierunkowane różnicowanie ludzkich komórek iPS do tożsamości TEP21,24,25,26,27,29. Badania te prowadzą do zróżnicowania TEP wyrażających markery tożsamości nabłonka grasicy, takich jak FOXN1 i PAX924,25,28,30, a także markerów funkcjonalności, takich jak DLL4 i AIRE26, ale bez markerów dojrzewania TEC24,25. Wykazano, że dwa podejścia wspierają dojrzewanie zróżnicowanych TEP do dojrzałej tożsamości TEC: przeszczepienie do modelu in vivo, takiego jak myszy29, oraz reagregacja do 3D systemów organoidów grasicy hodowanych w konfiguracji interfejsu powietrze-ciecz21. Oba systemy wykazały kluczową rolę, jaką odgrywa struktura 3D w utrzymaniu i wspieraniu dojrzewania funkcjonalnych populacji TEC zdolnych do wspierania limfopoezy T in vivo lub in vitro15,24,25,31.

  1. W przypadku systemu organoidów grasicy użytego w tym badaniu, przeprowadź różnicowanie komórek iPS w kierunku tożsamości TEP zgodnie z protokołem opracowanym i szczegółowo opisanym w Provin et al.23.

2. Izolacja pierwotnych ETP z próbki grasicy dziecięcej

UWAGA: ETP są przodkami pochodzącymi ze szpiku kostnego, dającymi początek linii limfocytów T i komórkom dendrytycznym w grasicy i wykazującymi następujący fenotyp: CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33.

  1. Przygotowanie koralików zubożających
    1. Dzień wcześniej przenieś magnetyczne kulki izolacyjne komórek (tabela materiałów) do probówki o pojemności 15 ml i przemyj 4 ml buforu izolacyjnego (PBS + 0,1% BSA + 2 mM EDTA).
    2. Umieścić probówkę w stojaku magnetycznym, usunąć supernatant i dodać 2 ml buforu izolacyjnego.
    3. Dodać mysie przeciwciała anty-ludzkie CD3, CD4 i CD8 do kulek i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C pod mieszaniem. Umieścić probówkę w stojaku magnetycznym, umyć ją kilkakrotnie w buforze izolacyjnym i ponownie zawiesić w 20 ml buforu izolacyjnego.
  2. Dysocjacja próbki grasicy
    1. Przenieść świeże próbki grasicy na szalkę Petriego wypełnioną RPMI1640 (tabela materiałów). Pokrój go sterylnymi nożyczkami i szczypcami preparacyjnymi na kawałki o wielkości około 1 mm3.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml kilkakrotnie przepłukać pożywkę i fragmenty (podłoże powinno stać się mętne), a następnie pozostawić fragmenty do osadu i zebrać połowę pożywki do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj więcej podłoża i powtarzaj, aż podłoże pozostanie klarowne.
    3. Zebrać pożywkę do tylu probówek o pojemności 50 ml, ile potrzeba, i wirować probówki o masie 200 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek (tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut i dodać 20 ml buforu do przemywania (PBS + 0,5% BSA + 4 mM EDTA + 1% penicyliny/streptomycyny).
    5. Wirować w masie 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulki w 10 ml buforu do mycia, przecedzić przez filtr siatkowy o wielkości 70 μm i policzyć komórki.
  3. Wzbogacanie ETP
    1. Po zliczeniu komórek dostosuj objętość do 10 ml na probówkę z buforem myjącym. Dodać wymaganą ilość kulek izolacyjnych komórek (na 200 milionów komórek użyć 500 μl kulek w 20 ml buforu izolacyjnego) i inkubować w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania przez 30 minut.
    2. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i ostrożnie zbierz supernatant do czystej probówki. Wyjmij probówkę i wyczyść kulki 20 ml buforu izolacyjnego. Zmieszaj probówkę, umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym i zbierz supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    3. Wirować supernatanty w temperaturze 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osady w 2 ml buforu izolacyjnego i policzyć komórki.
  4. Izolacja ETP
    1. Dostosuj stężenie do 200 milionów komórek na ml i zbierz niewielką objętość jako niebarwioną kontrolę.
    2. Oznacz komórki mysimi przeciwciałami anty-ludzkimi (Lin) (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56), CD7 i CD34 (użyj tego samego fluorochromu dla wszystkich markerów Lin). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut.
    3. Umyj komórki w równej objętości buforu do mycia. Wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 1 ml i policzyć komórki.
    4. Dostosuj objętość do stężenia 50 milionów komórek na ml i przecedź komórki przez filtr siatkowy o wielkości 70 μm.
    5. Dodaj wybrany marker żywotności i posortuj żywe komórki Lin-CD34+ CD7+ za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą dyszy 70 μm.

3. 3D kultura organoidów grasicy

.
  1. Przygotowanie TEP
    1. Bezpośrednio po izolacji ETP należy sprawdzić jakość hodowli TEP w dniach 13-15. Upewnij się, że komórki osiągają zbieg i tworzą gęstą monowarstwę z wybrzuszeniami (Rysunek 1).
    2. Aby zebrać zróżnicowane TEPs, przemyć komórki DPBS-/-, usunąć je, dodać 1 ml TrypLE (tabela materiałów) na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
    3. Dodać 1 ml XVIVO10 (tabela materiałów) do dołka, przepłukać kilka razy, aby odłączyć komórki, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml XVIVO10 i policzyć komórki.
      UWAGA: Aby ocenić skuteczność różnicowania z wyprzedzeniem, należy oddzielnie użyć dołka hodowlanego i zweryfikować ekspresję FOXN1 i PAX9 za pomocą RT-qPCR oraz wydajność różnicowania za pomocą cytometrii przepływowej (obliczoną jako frakcja komórek EPCAM+ CD205+, która powinna wynosić powyżej 50%) (Ryc. 1). Na tym etapie różnicowania prawie wszystkie komórki EPCAM+ są również dodatnie dla CD205, co świadczy o ich tożsamości prekursorowej11.
  2. Przygotowanie ETP
    1. Natychmiast po wyizolowaniu ETP należy obracać probówkę zbiorczą o masie 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osad w 1 ml XVIVO10 i policzyć komórki.
  3. Agregacja organoidów grasicy
    1. Odpipetować odpowiednie objętości i połączyć obie zawiesiny komórek w stężeniu 2 000 000 TEP i 40 000 ETP na ml, delikatnie pipetować raz w górę i w dół w celu homogenizacji.
    2. Dodać odpowiednie suplementy zgodnie z tabelą 1 i podać 100 μl zawiesiny komórek mieszanych na basenik na 96-dołkowych płytkach o niskim poziomie wiązania U. Użyj pipety wielokanałowej, aby zwiększyć wydajność; Jednak klasyczna pipeta z pojedynczą końcówką ogranicza utratę objętości cennych komórek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  4. Przygotowanie hydrożeli
    UWAGA: Układ doświadczalny używany do tworzenia hydrożelu, wysiewu organoidów i dystrybucji pożywki hodowlanej jest pokazany na Rysunek 2.
    1. Następnego dnia (dzień 1 fazy hodowli organoidów) rozmrozić porcje trombiny (10 U/ml), aprotyniny (26 000 U/ml) i fibrynogenu (8 mg/ml) (tabela materiałów). Rozmrozić trombinę i aprotyninę na lodzie, a fibrynogen w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (nie umieszczać ich na lodzie, ponieważ spowoduje to wytrącenie). Nie należy wirować, ale umieścić podwielokrotności pod pokrywą i homogenizować je przez delikatne pipetowanie.
    2. Przygotować tyle wiszących wkładek, ile potrzeba w stosunku do liczby wyprodukowanych organoidów, zgodnie ze stosunkami przedstawionymi w tabeli 2. Umieść wkładki w dołkach hodowlanych za pomocą sterylnych szczypiec i pozostaw co najmniej jedną kolumnę lub rząd pusty na płytce hodowlanej.
    3. Przygotuj tyle probówek o pojemności 1,5 ml, ile żeli do odlania. W każdej probówce należy najpierw pobrać pipetą wymagane objętości fibrynogenu i aprotyniny, jak wyszczególniono w Tabeli 2.
    4. Po raz drugi dodaj wymaganą objętość trombiny do jednej probówki, szybko przepłucz 2 razy bez tworzenia pęcherzyków w celu homogenizacji odczynników, a następnie wyciągnij całą zawartość probówki i szybko przepłucz mieszaninę do wiszącej wkładki. Ustawić pipetę pionowo nad środkiem wkładu i delikatnie przepłukać mieszaninę odczynników, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Na tym etapie szybkość wykonania ma kluczowe znaczenie, ponieważ odczynniki polimeryzują w ciągu kilku sekund i ważne jest, aby je prawidłowo wymieszać, aby uniknąć tworzenia się grudek lub nierównej gęstości żelu. Postępuj pojedynczo, używając innej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego dołka (jeśli probówka jest ponownie używana do kilku dołków, pozostałe stałe grudki żelu mogą zablokować końcówkę pipety). Jeśli polimeryzacja zachodzi zbyt szybko ze względu na wysoką aktywność trombiny, należy użyć rozcieńczenia 1:2. Tuż po odlaniu żele muszą być przezroczyste lub lekko przezroczyste i nadal płynąć po kilku sekundach, gdy płytka jest przechylona w pionie.
    5. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aż przezroczysty roztwór zestali się i stanie się nieprzezroczysty na biało, a żele pozostaną na swoim miejscu, gdy płytka jest przechylona pionowo (Rysunek 2A).
  5. Siew organoidów
    1. Sprawdź jakość kroku agregacji. Upewnij się, że mikromasy tworzą kuliste masy komórkowe, ze zwartym rdzeniem otoczonym halo ETP o niższej gęstości (Rysunek 3).
    2. Odetnij końcówkę stożka P200 i umyj ją roztworem zapobiegającym przywieraniu (tabela materiałów). Aby zebrać masy komórkowe, przechyl płytkę do pozycji prawie pionowej: mikromasy opadną na dolną ścianę studzienek i można je łatwo odzyskać, stopniowo dociskając końcówkę pipety do dna studzienki podczas zasysania.
    3. Zasiać masę na górze hydrożeli, delikatnie je osadzając, nie dotykając żelu końcówką pipety, postępując zgodnie ze stosunkami przedstawionymi w Tabeli 1 (Rysunek 2B). Nawet jeśli organoidy wydają się swobodnie unosić na tym etapie, po spuchnięciu pożywką hodowlaną żel zmięknie, a organoidy zagnieżdżą się w górnej warstwie. Sprawdź pod mikroskopem, czy w studzienkach P96 nie pozostał żaden organoid.
    4. Przygotować wymaganą objętość pożywki hodowlanej zgodnie z Tabelą 1 i Tabelą 2 i w każdym dołku powoli dodawać jedną czwartą objętości na górze hydrożeli, nie dotykając ich, pipetując wzdłuż ścianek wkładki, a pozostałe trzy czwarte na dnie studzienki, umieszczając pipetę między ramionami wiszącej wkładki (Rysunek 2C).
    5. Umieść 1 ml PBS w pustych dołkach hodowlanych, aby utrzymać wilgotność na płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Kultura organoidów grasicy
    1. W dniu 2 sprawdź, czy organoidy są dobrze wysiane: hydrożele musiały pozostać na miejscu, a organoidy nie mogły osadzać się na dnie wkładki.
    2. Przygotować wymaganą ilość pożywki hodowlanej zgodnie z tabelą 1 i tabelą 2. Usuń pożywkę, kierując końcówkę stożka aspiracyjnego między ramiona wiszącej wkładki, uważając, aby nie dotknąć żelu. Dodaj nową pożywkę, ustawiając pipetę w ten sam sposób.
    3. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, przechodząc na pożywkę drugiej fazy (Tabela 1) po 2 do 4 dniach (w 18 dniu po rozpoczęciu różnicowania TEP).
      UWAGA: Partia organoidów może być utrzymywana w ten sposób w kulturze przez okres do 6 tygodni.
  7. Zbieranie organoidów
    1. Przygotuj probówkę o pojemności 15 ml z 1 ml trypLE na dołek do zbioru.
    2. Odetnij końcówkę stożka P1000 i pokryj ją roztworem zapobiegającym przywieraniu. Delikatnie odpipetuj żel, umieszczając końcówkę pipety pionowo na środku wkładek (należy uważać, aby nie przebić membrany) i przenieś do probówki TrypLE. Umyj membranę wkładu za pomocą TrypLE i przenieś również do tuby.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie wirując w odstępach 5 minut. Upewnij się, że żele i organoidy dysocjują.
    4. Po 15 minutach przecedzić na filtr siatkowy o wielkości 70 μm i wirować z prędkością 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad w buforze płuczącym i przejść do wybranej metody analitycznej.

Wyniki

Przebieg procedury przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 4. W przypadku tego modelu 3D hodowli organoidów zastosowaliśmy hydrożel z trombiny i fibrynogenu, który był wcześniej wykorzystywany przez nasz zespół do utrzymania pierwotnych mTECs myszy przez kilka dni, dzięki zapewnionym przez niego wskazówkom fizycznym i mechanicznym34. Po polimeryzacji żel powinien wykazywać luźną, gąbczastą strukturę sieciową (Rysunek 5).

Po początkowej fazie wysiewania i przylegania, organoidy stopniowo rosły i rozwijały się zarówno na powierzchni, jak i w obrębie górnych warstw żelu. W zależności od właściwości żelu, warunków wysiewania oraz liczby organoidów wysianych na żel, organoidy formowały struktury od sferycznych po wydłużone (Rycina 6) i sporadycznie łączyły się, tworząc większe struktury. Po pierwszym tygodniu hodowli w obrębie organoidów zaobserwowano dwa szczególne poziomy organizacji: po pierwsze, zauważono długie struktury przypominające projekcje powierzchni komórkowych, utworzone przez duże komórki promieniście wychodzące z organoidów i kolonizujące hydrożel we wszystkich kierunkach (Rycina 6 i Rycina 7). Po drugie, zaobserwowano struktury przypominające skupiska, utworzone przez mniejsze komórki koncentrujące się wokół tych projekcji komórkowych. Choć nie udało się wyizolować obu typów komórek w celu potwierdzenia hipotezy badawczej, zjawisko to przypomina układy 3D występujące w korze grasicy, tworzone przez oddziaływanie pojedynczych cTEC z dużą liczbą znacznie mniejszych rozwijających się limfocytów T, znane jako kompleksy komórek pielęgnujących grasicy11 (Rycina 8).

W kilku punktach czasowych podczas fazy hodowli organoidów oceniliśmy skład komórkowy organoidów grasicy za pomocą cytometrii przepływowej i zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych komponentów: TEC (charakteryzowane jako EPCAM+ CD45-), tymocyty (EPCAM- CD45+ CD3+) (Rysunek 9) oraz komponent EPCAM- CD45+ CD3- obejmujący tymiczne hematopoetyczne subpopulacje niebędące tymocytami. Więcej szczegółów można znaleźć w pracy Provin et al.23.

Analiza różnicowania komórek; obraz mikroskopowy, wykres cytometrii przepływowej, immunofluorescencja, wykres ekspresji genów.
Rycina 1: Charakterystyka różnicowania iPSC do TEP. (A) Przykład różnicowania iPSC do TEP w dniu 13, odwrócony mikroskop fazokontrastowy, 400x. Pasek skali: 500 µm. (B) Przykład wykresu kropkowego, proporcja komórek EPCAM+ wśród komórek DAPI- w 14 dniu różnicowania, obraz z programu FlowJo 10.0.7. (C) Immunobarwienie przeciwko DAPI (niebieski), PAX9 (czerwony) i KRT8 (zielony), immunofluorescencja i obrazowanie konfokalne w 16 dniu różnicowania iPSC do TEP. Białe strzałki wskazują przykłady barwienia przeciw-PAX9. Pasek skali: 50 µm (D) Poziom ekspresji FOXN1 (RQ do GAPDH) podczas różnicowania iPS do TEP. TEC: Referencyjna kontrola pozytywna, pierwotne ludzkie TEC wyizolowane z próbek grasicy dziecięcej. Wykres z programu Prism (GraphPad wersja 8.0.1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Proces przygotowania płytki do hodowli komórkowej; technika pipetowania w układzie eksperymentalnym; badania biologiczne.
Rysunek 2: Układ eksperymentalny do formowania hydrożelu, wysiewania organoidów i rozprowadzania pożywki hodowlanej. (A) Płytka hodowlana z hydrożelami odlanymi w zawieszonych insertach rozmieszczonych w górnym i dolnym rzędzie. (B) Wysiewanie organoidów: odcięty koniec końcówki pipety zawierający 1 organoid jest umieszczany nad hydrożelem bez dotykania go, a organoid jest delikatnie wysiewany na powierzchnię żelu. (C) Pożywka hodowlana jest nanoszona do dołka hodowlanego poprzez umieszczenie końcówki pipety pomiędzy ramionami zawieszonego insertu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Organotypowa hodowla tkanek, analiza obrazu mikroskopowego, skala 100 μm, badanie biologiczne.
Rysunek 3: Dzień 0 hodowli organoidów grasicy przed wysiewaniem (dni 13-15 pełnego protokołu). (A) organoid wytworzony z TEC pochodzących z linii iPS Lon71.019. (B) Organoid wytworzony z TEC pochodzących z linii iPS MIPS203.003. Odwrócony mikroskop fazokontrastowy, powiększenie 1000x. Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu tworzenia organoidów grasicy przedstawiający dysocjację, cytometrię przepływową i kierowaną dyferencjację.
Rysunek 4: Podsumowanie wszystkich etapów protokołu. Pobrano i zdysocjowano próbki grasicy dziecięcej, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej wyizolowano pierwotne komórki ETP Lin- CD34+ CD7+. Przeprowadzono dyferencjację komórek iPS w kierunku fenotypu TEP. Komórki ETP i pochodne z iPS TEP połączono i wysiano na płytki 96-dołkowe o niskim powinowactwie wiązania, gdzie w ciągu nocy uległy agregacji w organoidy grasicy. Hydrożele fibrynowe przygotowano z aprotininy, fibrynogenu i trombiny, a następnie wylano do zawieszeń (hanging inserts). Po polimeryzacji organoidy osadzono na powierzchni hydrożeli, a do dołków dodano pożywkę hodowlaną z fazy 1. Organoidy utrzymywano w kulturze do 6 tygodni. Stworzono w BioRender, licencja publikacyjna AG26EFCZOM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, przedstawiający morfologię komórek w skali 500 µm do analizy biologicznej.
Rysunek 5: Organizacja i struktura hydrożelu. Odwrócony mikroskop kontrastowy, 1000x. Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost komórkowy; obraz mikroskopowy; badanie morfologii kolonii; ekspansja mikrobiologiczna na podłożach stałych.
Rysunek 6: Dojrzałe organoidy i struktura trójwymiarowa. (A) Organoid grasicy w 24. dniu hodowli 3D, linia iPS MIPS203.003. (B) Obraz złożony organoidu grasicy w 32. dniu hodowli 3D, linia iPS Lon71.019. Odwrócony mikroskop fazokontrastowy. Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe wzrostu grzybni na podłożu; badanie wydłużania strzępek i oddziaływania z podłożem.
Rysunek 7: Szczegóły struktury organoidów grasicy. (A) Organoid grasicy w 32. dniu hodowli 3D, linia iPS L71.019. (B) Organoid grasicy w 27. dniu hodowli 3D, linia iPS L80.002. Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy, powiększenie 400x. Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rozmrażanie krio konserwowanych komórek, obraz mikroskopowy, zmiany morfologii komórek, strzałki wskazujące kierunek.
Rysunek 8: Szczegółowa struktura organoidu grasicy w 32. dniu hodowli 3D. Białe strzałki wskazują skupiska małych tymocytów proliferujących w bliskim sąsiedztwie komórek TEC. Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy, 400x. Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cytometryczna żywotności komórek i populacji CD45+ CD3+; zawiera wykresy rozrzutu i wykres słupkowy.
Rysunek 9: Proporcja kompartmentu limfocytów T w organoidach grasicy. (A) Przykład wykresu kropkowego przedstawiający proporcję komórek CD45+ CD3+ wśród komórek żywych (DAPI-) w organoidach grasicy w 35. dniu hodowli 3D, obraz z programu FlowJo 10.0.7. Frakcja CD45+ CD3- obejmuje komórki hematopoetyczne niebędące tymocytami. (B) Proporcja komórek CD45+ CD3+ wśród komórek żywych w organoidach grasicy w 17., 24/25., 32. i 39/40. dniu hodowli 3D, n=2 w dubletach lub tripletach technicznych, wykres z programu Prism (GraphPad wersja 8.0.1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

JednostkaPośr. fazy 1 dzień 14 do dnia 18Pośr. fazy 2 od dnia 19
BazaXVIVO10XVIVO10
BMP4ng/mL50
FGF8ng/mL10
FGF10ng/mL10
IGF1ng/mL10
EGFng/mL10
RANK Lng/mL5050
IL7ng/mL55
FLT3 Lng/mL55
SCFng/mL1010
Glutamaxng/mL1%1%

Tabela 1: Suplementy i ich odpowiednie stężenia.

Aprotynina (µL)Trombina (µL)Fibrynogen (µL)Medium fazy 1Organoidy (jednostka)
płytka 24-dołkowa575751od 3 do 5
płytka 12-dołkowa9.2138.2138.21.85
płytka 6-dołkowa16240.8240.83.2od 8 do 9

Tabela 2: Wymagane proporcje składników do przygotowania hydrożeli i wysiewania organoidów w płytkach 6-, 12- i 24-dołkowych.

Dyskusja

W porównaniu z klasyczną hodowlą jednowarstwową w 2D lub nawet bardziej zaawansowanymi, najnowocześniejszymi modelami 3D, takimi jak RTOC (reagregowana hodowla narządów grasicy), model, który tutaj opisujemy, wykazuje znaczną poprawę. Z technicznego punktu widzenia model ten oferuje lepszą skalowalność i odtwarzalność, ponieważ TEC pochodzą z samoodnawiających się komórek iPS. Umożliwia również edycję genów na etapie iPSC w celu łatwiejszego badania knock-in lub knock out w TEC. Przeżywalność organoidów grasicy pokazanych w tym badaniu jest niezwykła i zapewnia znaczną poprawę w porównaniu z hodowlami 2D lub RTOC, z wykazanym wytwarzaniem limfocytów T przez okres do 6 tygodni (Figura 9). W ten sposób odtworzenie struktury 3D grasicy i właściwości ECM prowadzi do trwałej funkcjonalności grasicy w naszych organoidach grasicy, tj. zdolności do generowania limfocytów T z najbardziej dojrzałego przedziału tymocytowego, niedawnych emigrantów grasicy około 4 tygodnia hodowli 3D, z generacją limfocytów T CD4 + i CD8 +23.

Ponieważ mikrośrodowisko grasicy sprzyja intensywnej aktywności ekspansji i różnicowania, prawidłowa wymiana gazowa jest kluczowym parametrem w każdym modelu grasicy in vitro. Rzeczywiście, lepsze wyniki zaobserwowano w modelach utrzymywanych albo w atmosferze wzbogaconego ditlenu, albo na granicy faz powietrze-ciecz21,35. Nasze obserwacje potwierdzają ten punkt i podkreślają znaczenie prawidłowego wysiewu organoidów w górnej części hydrożelu tuż pod interfejsem powietrza. Wady polimeryzacji prowadzące do lepkich lub ciekłych hydrożeli spowodują zapadanie się organoidów na dnie wkładek i utrudnią ich wzrost. Kohodowla z komórkami śródbłonka na chipie jest obiecującą alternatywą, która może przełamać tę barierę poprzez dodanie unaczynienia. Wielkość organoidów grasicy wytworzonych w tym badaniu jest ograniczona do około 5 mm, rzekomo z powodu braku wymiany gazów i składników odżywczych w kluczowych obszarach. Unaczynienie pozwoliłoby zatem na zwiększenie skali hodowli, a w połączeniu z optymalizacją procesów umożliwiłoby produkcję organoidów zawierających miliony TEC i limfocytów T. Gęstość hydrożelu jest również kluczowym parametrem, a jego powtarzalność w różnych partiach jest jednym z głównych ograniczeń protokołu, biorąc pod uwagę wrażliwość enzymów na cykle zamrażania i rozmrażania. Etap odlewania hydrożelu jest krytycznym krokiem w protokole; Zalecamy wykonanie testu poprzez odlewanie jednego hydrożelu na 1 godzinę przed planowanym eksperymentem w celu sprawdzenia aktywności odczynnika. W przypadku niewystarczającej aktywności enzymatycznej prowadzącej do upośledzenia polimeryzacji i biorąc pod uwagę koszt TEP pochodzących z iPSC, nie zalecamy rozwiązywania problemów w inny sposób, jak tylko ponowne rozpoczęcie protokołu z nowymi podwielokrotnościami odczynników. TEC są ważnymi producentami ECM; Jednak biorąc pod uwagę ostatnie postępy w zrozumieniu roli fibroblastów grasicy, interesujące może być dodanie populacji napromieniowanych fibroblastów do modelu organoidowego. Populacja ta może wydzielać czynniki wzrostu i ECM, które uczestniczą w rozmnażaniu środowiska grasicy, co ma pozytywny wpływ na różnicowanie i utrzymanie TEC i limfocytów T. Innym ważnym ograniczeniem tego modelu organoidu grasicy jest brak prawidłowej segregacji korowo-rdzeniowej. Ponieważ wykazano, że fibroblasty torebkowe grasicy kształtują tworzenie się kory mózgowej, ich dodanie do modelu hodowlanego może pomóc w rozwiązaniu tego problemu. W ten sposób protokół ten wprowadza podstawę złożonych modeli grasicy in vitro. Łączy w sobie najnowsze postępy poczynione w dziedzinie różnicowania grasicy iPSC, kultur 3D na bazie hydrożelu oraz limfopoezy in vitro. Model ten można jeszcze bardziej udoskonalić, aby zapewnić skalowalność i zwiększyć jego złożoność, na przykład poprzez dodanie przedziałów mezenchymalnych i naczyniowych. W ten sposób może dojść do powstania cennych platform badawczych dotyczących odporności lub zastosowań w spersonalizowanej terapii komórkowej opartej na komórkach T.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcemy podziękować członkom głównego ośrodka iPSC w Nantes we Francji, kierowanym przez Laurenta Davida. Prace te były wspierane przez program JP-Rare Disease JTC2019 projekt TARID (EJPRD19-208) finansowany przez ANR (ANR-19-RAR40011-5) dla M.G. przez grant RFI Bioregate (ThymIPS) z regionu Legii Loary dla M.G., przez ANR (ANR-22-CE15-0045) dla M.G. oraz projekt "SATT Ouest Valorisation" OrgaTreg dla M.G. N.P. był wspierany przez "la fondation d'entreprise ProGreffe". Projekt M.d.A. był wspierany przez "la Fondation pour la Recherche Médicale". Dziękujemy głównej placówce iPSC w Nantes, wspieranej przez IBiSA i Biogenouest, za wykorzystanie ich zasobów i wsparcie techniczne. Praca ta została częściowo sfinansowana przez program Labex IGO wspierany przez Narodową Agencję Badawczą poprzez inwestycję w przyszły program ANR-11-LABX-0016-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AprotyninaSigma Aldrich616370
BMP4Miltenyi130-111-165
CCR7 (CD197)BD BiosciencesPEKlon: 3D12; Rozcieńczenie: 1: 200
CD14BD BiosciencesFITCKlon: M5E2; Rozcieńczenie: 1: 200
CD19BD BiosciencesPEKlon: HIB19; Rozcieńczenie: 1: 200
CD205BioLegendFITCKlon: MG38; Rozcieńczenie: 1: 200
CD3BD BiosciencesPEKlon: HIT3a; Rozcieńczenie: 1: 200
CD34BD BiosciencesFITCKlon: 8G12; Rozcieńczenie: 1: 100
CD4BD BiosciencesPEKlon: RPA-T4; Rozcieńczenie: 1: 100
CD4BD BiosciencesBV711Klon: L200; Rozcieńczenie: 1: 200
CD45BD BiosciencesPerCPKlon: HI30; Rozcieńczenie: 1: 200
CD56BD BiosciencesPEKlon: B159; Rozcieńczenie: 1: 200
CD62LBD BiosciencesBV605Klon: DREG-56; Rozcieńczenie: 1: 200
CD69BD BiosciencesBV510Klon: FN50; Rozcieńczenie: 1: 200
CD7BD BiosciencesAPCKlon: M-T701; Rozcieńczenie: 1: 200
CD8BD BiosciencesPeCy7Klon: RPA-T8; Rozcieńczenie: 1: 200
CD8BD BiosciencesPEKlon: HIT8a; Rozcieńczenie: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgGInvitrogen11041
EGFMiltenyi130-097-751
EPCAM (CD326)BD BiosciencesPEKlon: HEA-125; Rozcieńczenie: 1: 200
EPCAM (CD326)MiltenyiBV711Klon: EBA-1; Rozcieńczenie: 1: 200
FGF10Miltenyi130-127-858
FGF8Biotechne R& D423-F8
FibrinogenSigma Aldrich341578
FLT3 LPeprotechAF-300-19
GlutamaxGibco35050-61
IGF1Miltenyi130-093-886
IL7PeprotechAF-200-07
RANK LBiotechne R& D6449-TEC
Roztwór do lizy czerwonych krwinekMiltenyi130-094-183
RPMI1640Gibco11875093
SCFPeprotechAF-300-07
TrombinSigma Aldrich605190
TrypLEGibco2605010
XVIVO10LonzaLONBE04-380Q

Bibliografia

  1. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  2. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).
  3. Miller, J. F. A. P. The function of the thymus and its impact on modern medicine. Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).
  4. Haddad, R., et al. Dynamics of thymus-colonizing cells during human development. Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).
  5. Cumano, A., et al. New molecular insights into immune cell development. Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).
  6. Bautista, J. L., et al. Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla. Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).
  7. Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC. Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).
  8. Alves, N. L., et al. Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments. Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).
  9. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  10. Tavian, M., Peault, B. Embryonic development of the human hematopoietic system. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).
  11. Abramson, J., Anderson, G. Thymic epithelial cells. Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).
  12. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  13. Sharma, H., Moroni, L. Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation. Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).
  14. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).
  15. Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).
  16. Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation. Biomaterials. 118, 1-15 (2017).
  17. Asnaghi, M. A., et al. Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells. Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).
  18. Villegas, J. A., et al. Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality. Front Immunol. 9, 1663(2018).
  19. Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla. Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).
  20. Campinoti, S., et al. Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds. Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).
  21. Ramos, S. A., et al. Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).
  22. Fan, Y., et al. Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts. Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).
  23. Provin, N., et al. Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development. bioRxiv. 2023, 572664(2023).
  24. Parent, A. V., et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).
  25. Sun, X., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).
  26. Inami, Y., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype. Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).
  27. Gras-Pena, R., et al. Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus. J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).
  28. Lai, L., Jin, J. Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).
  29. Ramos, S. A., et al. Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).
  30. Provin, N., Giraud, M. Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED. Front Immunol. 13, 930963(2022).
  31. Montel-Hagen, A., et al. In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells. Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).
  32. Park, J. -E., et al. A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation. Science. 367 (6480), 3224(2020).
  33. Flippe, L., et al. Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).
  34. Padonou, F., et al. Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium. EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).
  35. Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis. Front Immunol. 12, 652665(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki nab onkowe grasicyindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystegenerowanie limfocyt w Tmikro rodowisko grasicyhodowla organoid wmodel autoimmunizacjiprogenitorzy tymocyt wmacierz pozakom rkowa

Powiązane artykuły