Artykuł metodologiczny

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66801

⸱

9 sierpnia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine, University Hospital of Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół witryfikacji tkanki jajnikowej, jako alternatywną metodę kriokonserwacji do powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania.

Streszczenie

Kriokonserwacja tkanek jajnika (OTC) jest ważną opcją dla zachowania płodności. Dla pacjentów, u których leczenia gonadotoksycznego nie można odroczyć, lub dla dziewcząt przed okresem dojrzewania, jest to często jedyna opcja ochrony płodności. Kriokonserwację można przeprowadzić przez witryfikację lub powolne zamrażanie. Powolne zamrażanie jest obecnie standardowym podejściem. Coraz więcej badań wskazuje, że witryfikacja może zastąpić powolne zamrażanie w najnowocześniejszych laboratoriach zapłodnienia in vitro (IVF), znacznie poprawiając wskaźniki przeżywalności po rozmrożeniu i upraszczając techniczne aspekty kriokonserwacji. Opisano oparty na metalowej, wysokoprzepustowej procedurze szybkiej witryfikacji tkanki kory jajnika, odpowiedni do rutynowych badań klinicznych. Sterylizacja siatek metalowych i ciekłego azotu zapewnia wysoką jakość, spełniając standardy dobrej praktyki produkcyjnej (GMP). Przeprowadzono witryfikację, aby zapewnić ultraszybkie tempo chłodzenia. Zamiast powoli rozmrażać próbki, były szybko podgrzewane. Aby ocenić żywotność pęcherzyków, barwienie kalceiną przeprowadzono zarówno przed kriokonserwacją, jak i po szybkim podgrzaniu. Doniesiono o udanym zastosowaniu witryfikacji i szybkiego ocieplenia za pomocą metalowych siatek. Nie zaobserwowano istotnych różnic w żywotności pęcherzyków przed witryfikacją i po szybkim ociepleniu. Wyniki te potwierdzają wysoką zdolność witryfikacji tkanek do rutynowych zastosowań klinicznych jako potencjalny substytut szeroko stosowanej metody powolnego zamrażania.

Wprowadzenie

Kriokonserwacja tkanki jajnika jest ważną opcją dla zachowania płodności. Eksplantowana tkanka zawierająca pęcherzyki jajnikowe, w których osadzone są oocyty, jest kriokonserwowana. Po przechowywaniu tkanka jajnika może zostać rozmrożona, ogrzana i ponownie wszczepiona pacjentce. W przypadku żywotnych komórek lub tkanek dostępne są dwie metody kriokonserwacji: powolne zamrażanie i witryfikacja1.

Witryfikacja służy do konserwacji materiałów biologicznych, takich jak zarodki i oocyty, o lepszych wskaźnikach przeżycia w porównaniu do protokołu powolnego zamrażania1,2,3,4. Powolne zamrażanie ma ograniczenia, takie jak tworzenie się kryształków lodu, które mogą potencjalnie uszkodzić struktury komórkowe i tkankowe. Jednak powolne zamrażanie jest ważnym podejściem do kriokonserwacji, które ułatwia długotrwałe przechowywanie próbek biologicznych, a funkcjonalność tej metody została szeroko udowodniona5. Witryfikacja indukuje szklisty stan agregacji, zapobiegając tworzeniu się kryształków lodu6,7. Na poziomie technicznym witryfikacja znacznie upraszcza procedurę kriokonserwacji, zmniejszając konserwację sprzętu, zmniejszając prawdopodobieństwo błędów technicznych i skracając czas trwania procesu kriokonserwacji8,9. W zachowaniu płodności kobiet, kriokonserwacja tkanki jajnika jest decydującym podejściem przed leczeniem raka10. Różne grupy z powodzeniem zademonstrowały koncepcję krioprezerwacji, rozmrażania i przeszczepiania tkanek w oparciu o protokół powolnego zamrażania11,12,13,14, który jest obecnie uważany za standardowe podejście15.

Witryfikacja tkanki jajnika jest uważana za obiecującą metodę alternatywną16,17,18,19,20,21, pod względem oszczędzania zasobów22, wskaźniki przeżywalności pęcherzyków, poziomy fragmentacji DNA i zrównoważony potencjał angiogenny23,24,25,26,27. Potwierdzają to udane dostawy w Japonii28, USA29 i Niemczech30.

Porównanie dwóch opcji kriokonserwacji tkanek jajnikowych (OTC) - witryfikacji w porównaniu ze standardową procedurą powolnego zamrażania - wyniki są częściowo sprzeczne w obecnych metaanalizach16. Mogło się do tego przyczynić kilka czynników, ponieważ obecne protokoły witryfikacji znacznie się różnią. Różnice te obejmują wybór krioprotektantu lub kombinacji środków ochronnych, ich stężenie, skład pożywek dostępnych bez recepty, wielkość fragmentów tkanek oraz urządzenie używane jako nośnik tkanek. W związku z tym nie ma ustandaryzowanego protokołu ocieplenia.

Ponieważ autorzy znaleźli metodę, która daje przekonujące wyniki pod względem obsługi, żywotności, początku apoptozy, uwalniania czynników angiogennych, a nawet raportu o porodzie po reimplantacji9,27, bardzo szczegółowy opis protokołu jest dostarczany. Opisana metoda oferuje ważny i skuteczny protokół, który może przyczynić się do standaryzacji witryfikacji tkanki jajnikowej.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki w Szpitalu Uniwersyteckim w Bonn (007/09). Od każdego pacjenta uzyskano pisemną świadomą zgodę. Grupę badaną stanowiła ludzka tkanka jajnikowa od 50 pacjentek o średnim wieku 27,4 lat przed krioprezerwacją, jak wskazano na rysunku Ryc. 1. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie urządzeń załadowczych

  1. Przygotuj nożyczki chirurgiczne i metalowe siatki do dostosowania. Pokrój oczka na paski o wymiarach 25 mm x 8 mm, jak pokazano w Rysunek 2A.
  2. Umieść niestandardowe metalowe siatki w pojemniku do sterylizacji i autoklawie na 2 godziny ( Rysunek 2B). Po sterylizacji w autoklawie umieścić pojemnik do sterylizacji i fiolki o pojemności 1,8 ml pod stołem z przepływem laminarnym.
  3. Włącz naświetlanie ultrafioletem (UV) ławki laminarnej na 30 minut w celu dodatkowej sterylizacji przy długości fali 254 nm.
  4. Otwórz pojemnik do sterylizacji, wyjmij metalowe kratki i włóż je do nakrętek fiolek o pojemności 1,8 ml, jak pokazano w Rysunek 2C. Zamknąć fiolki 1,8 ml.
    UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.

2. Przygotowanie podłoża do witryfikacji

  1. Przygotować jedną pipetę serologiczną o pojemności 10 ml, jedną elektroniczną pipetę i trzy probówki o pojemności 50 ml do roztworu do witryfikacji 1 (VS1), roztworu do witryfikacji 2 (VS2) i roztworu do witryfikacja 3 (VS3), a także do zapisywania daty przygotowania. Włącz promieniowanie ultrafioletowe (UV) stołu z przepływem laminarnym w celu dodatkowej sterylizacji.
  2. W przypadku VS1 (15 ml) należy odpipetować 12 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 1,5 ml SSS (suplementu zastępczego surowicy) i 1,5 ml glikolu etylenowego do jednej probówki o pojemności 50 ml.
  3. W przypadku VS2 (15 ml) należy odpipetować 10,5 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 3 ml glikolu etylenowego i 1,5 ml SSS do jednej probówki o pojemności 50 ml.
  4. W przypadku VS3 należy odpipetować 8,5 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 5,25 ml glikolu etylenowego i dodać 2,57 g sacharozy i 0,75 g poliwinylopirolidonu (PVP) do jednej probówki o pojemności 50 ml. Zobacz Rysunek 3, aby uzyskać szczegółowe informacje. Wymieszaj wszystkie roztwory, wirując z prędkością 3 000 obr./min.
    UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem dezynfekującym, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.

3. Przygotowanie do witryfikacji

  1. Stół z przepływem laminarnym należy czyścić środkiem do dezynfekcji powierzchni w jednorazowych rękawicach laboratoryjnych; zalecane są rękawice bezpudrowe.
  2. Przygotuj jedną płytkę 6-dołkową, sitko do komórek, skalpel, pęsetę, jeden dziurkacz do biopsji 2 mm i dwie naczynia okrągłodenne 90 mm. Przygotuj również podłoże: roztwór konserwujący do przeszczepu tkanek i VS1-3. Odpipetować 5 ml każdego schłodzonego roztworu (VS1-3) do oddzielnych studzienek i odczekać 30 minut, aż roztwory osiągną temperaturę pokojową.
  3. Sterylizować ciekły azot za pomocą automatycznego systemu naświetlania promieniami UV; alternatywnie można użyć promieniowania UV z okapu o przepływie laminarnym przez 120 minut.

4. Witryfikacja tkanek

  1. Przygotuj tkankę kory jajnika, usuwając rdzeń. Ponieważ kora jest zwykle twardsza niż rdzeń, można je łatwo odróżnić i rozdzielić.
    1. Wytnij tkankę kory jajnika na pożądane kształty (10 mm x 5 mm do przeszczepu; 2 mm x 2 mm stemple do liczenia żywotnych pęcherzyków przed i po witryfikacji), jak wskazano w Rysunek 4A.
      UWAGA: Unikaj uszkodzenia tkanki przez zbyt mocne naciskanie i obchodź się z nią ostrożnie. Próbki tkanek mogą się różnić w zależności od pacjenta.
  2. Umieść sitko do komórek w pierwszym dołku płytki 6-dołkowej z VS1. Równoważyć tkankę kory jajnika przez 5 minut w 5 ml VS1 w dołku 1 na 6-dołkowej płytce za pomocą sitka komórkowego.
    1. Następnie przenieś sitko komórkowe z tkanką kory mózgowej do dołka 2 zawierającego 5 ml VS2 i równoważ przez 5 minut. Na koniec zrównoważ przez 6 minut w 5 ml VS3, jak wskazano w Rysunek 3 i Tabela 1.
  3. Otwórz przygotowane kriowialisty. Napełnij fiolki wysterylizowanym ciekłym azotem i umieść je w naczyniu kriogenicznym Dewara wypełnionym ciekłym azotem. Załaduj próbki tkanek na metalową siatkę urządzenia do witryfikacji w ciągu 1 minuty (Rysunek 4B, C).
    1. Umieść próbki tkanek załadowane na metalową siatkę do ciekłego azotu w przygotowanych kriowiach na bazie siatki (Rysunek 4D).
      UWAGA: Szybkie zamrożenie tkanki załadowanej na metalową siatkę ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej metody. Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.

5. Przygotowanie podłoża do szybkiego nagrzewania

  1. Przygotuj roztwory zgodnie z opisem w Rysunek 5 i Tabela 2. Zważyć sacharozę jako roztwór do szybkiego nagrzewania (RWS) i roztwór równowagowy (ES) i przenieść je do probówki. Dodać pożywkę do badania oocytów (uzupełnioną przez producenta albuminą surowicy ludzkiej) za pomocą pipety serologicznej i przyrządu do pipetowania. Dodać SSS i sacharozę zgodnie z tabelą 2.
  2. Zamknąć probówki i pozostawić je na wytrząsarce do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.

6. Przygotowanie do szybkiego ocieplenia

  1. Na dzień przed szybkim podgrzaniem przygotuj materiały eksploatacyjne i odkaż je za pomocą światła UV w ławie laminarnej: Przygotuj zlewkę na próbkę do RWS, płytkę 6-dołkową dla ES, RS1 i RS2 oraz zlewkę na próbkę do transportu tkanek po szybkim podgrzaniu. Umieść sterylne, jednorazowe pęsety, sprzęt do pipetowania i inne materiały eksploatacyjne na stole z przepływem laminarnym.
  2. Rozgrzej płytę grzewczą do temperatury 37,2 °C. Inkubować RWS w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Przygotuj sterylną 6-dołkową płytkę z 6 ml ES, 6 ml RS dla "RS1" i kolejne 6 ml RS dla "RS2" w ławce laminarnej. Zapoznaj się z Rysunek 5 dla schematycznej ilustracji płytki 6-dołkowej. Pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed ogrzaniem tkanki.
  4. Przenieść RWS do sterylnej zlewki na próbkę w sterylnych warunkach i umieścić ją na płycie grzewczej. RWS powinien być utrzymywany w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Szybkie ocieplenie wymaga szybkiego tempa nagrzewania. Bardzo ważne jest, aby utrzymać RWS w temperaturze 37 °C, aby zapewnić powodzenie pierwszego kroku.

7. Szybkie ocieplenie tkanki jajnikowej

  1. Przetransportować kriokonserwowane fiolki zawierające zeszkloną tkankę kory jajnika w ciekłym azocie do stołu laminarnego. Otworzyć fiolki, gdy są częściowo zanurzone w ciekłym azocie. Szybko zanurzyć siatkę z zeszkloną tkanką w RWS i pozostawić tkankę tam na 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Jest to najbardziej krytyczny krok podczas szybkiego ocieplenia i musi być przeprowadzony bez zwłoki.
  2. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę do ES i inkubuj ją przez 3 minuty, delikatnie potrząsając nią na kołyszącym się shakerze.
  3. Płucz chusteczkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut za pomocą RS1 i RS2 na bujanym shakerze, jak pokazano na Rysunek 5.
  4. Przenieść podgrzaną tkankę do sterylnej zlewki na próbkę zawierającej 5 ml roztworu konserwującego do przeszczepienia tkanki, która powinna być przechowywana w temperaturze 4 °C w celu transportu do miejsca przeszczepienia.
    UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.

8. Określenie żywotności pęcherzyków

  1. Doprowadź dimetylosulfotlenek (DMSO) do temperatury pokojowej przez noc, aby uzyskać stan ciekły. Odpipetować 100 μl DMSO do jednej fiolki kalceiny i ponownie zawiesić w celu rozpuszczenia kalceiny. Pobrać pipetą 3 μl rozpuszczonej kalceiny na dno jednej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C.
  2. Umieścić 0,007 g kolagenazy w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Dodać 997 μl DPBS do wstępnie poddanego i zamrożonego 3 μl kalceiny w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić do rozpuszczenia kalceiny. Dodać 0,007 g kolagenazy, aby uzyskać 1000 μl roztworu roboczego.
  4. Użyć 500 μl roztworu roboczego do wytrawienia dwóch kawałków 2 mm fragmentów kory jajnikowej przez 90 minut w temperaturze 37 °C, osłoniętych przed światłem, w naczyniu 4-dołkowym. Po 60 minutach i 70 minutach należy kilkakrotnie zawiesić roztwór. Na koniec określ żywotność pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano na Rysunek 6.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia procedury przygotowania mediów do witryfikacji, urządzeń do załadunku, witryfikacji, przygotowania mediów do szybkiego ogrzewania, szybkiego ogrzewania oraz oceny żywotności pęcherzyków. Bezpośrednie porównanie żywotności pęcherzyków i czynników angiogennych pomiędzy powolnym zamrażaniem a witryfikacją zostało zwalidowane i opublikowane31,32.

Ogólną skuteczność opisanego protokołu witryfikacji oceniono poprzez porównanie liczby żywych mieszków przed i po witryfikacji oraz szybkim ogrzewaniem. Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1, a wyniki zaprezentowano na Rysunku 6. U 50 pacjentek zaobserwowano średnią liczbę 77,98 żywych mieszków przed witryfikacją i 62,99 po witryfikacji/szybkim ogrzewaniu, co odpowiada przeżywalności na poziomie 80,8%. Różnica ta nie była istotna statystycznie zgodnie z testem Wilcoxona33.

Metalowe siatki są indywidualnie przycinane ostrymi nożyczkami do rozmiaru 25 mm x 8 mm, który pasuje do nakrętek probówek kriogenicznych o pojemności 1.8 mL, jak pokazano na Rysunku 2A,C. Po sterylizacji za pomocą autoklawowania parowego, siatki i nakrętki probówek 1.8 mL są montowane pod laminarnym przepływem powietrza, zgodnie z Rysunkiem 2B. Taki układ zapewnia stabilne utrzymanie w nakrętce bez konieczności podejmowania dodatkowych działań i oferuje wystarczającą powierzchnię dla tkanek o różnych rozmiarach. Zazwyczaj witryfikuje się fragmenty tkanek o wymiarach 5 mm x 10 mm do transplantacji oraz fragmenty o średnicy 2 mm do oceny liczby żywych mieszków po szybkim rozmrażaniu. Oba rozmiary idealnie mieszczą się na metalowych siatkach.

Równoważenie z roztworami do witryfikacji (VS1, VS2 i VS3) przeprowadza się w płytce 6-dołkowej na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej pod laminarnym przepływem powietrza, jak pokazano na Rysunku 3. Ramy czasowe przedstawione na schemacie zapewniają skuteczne pobieranie krioprotektora etylenoglikolu. Zaleca się stosowanie płytki 6-dołkowej zamiast pojedynczych naczyń, ponieważ ułatwia to szybkie przenoszenie tkanki między roztworami i pomaga zapobiec pomyłkom.

W celu szybkiej wertykalnej witryfikacji w ciekłym azocie, tkankę kory jajnika tnie się na odpowiednie fragmenty (Ryc. 4A). Próbki kory jajnika umieszcza się w urządzeniach do ładowania (Ryc. 4B,C) i zanurza pionowo w ciekłym azocie (Ryc. 4D), aby poprzez witryfikację uzyskać szklisty stan agregacji. Wybrane metalowe siatki umożliwiają pionowe operowanie tkanką, co przedstawiono na Ryc. 4D. Ponadto metalowe siatki charakteryzują się wysoką przewodnością cieplną, co zapewnia szybkie tempo chłodzenia od 22 °C do -196 °C, co jest krytycznie istotnym etapem procesu witryfikacji.

W celu szybkiego ogrzewania, RWS przygotowuje się w sterylnym kubku w temperaturze 37 °C. ES, RS1 oraz RS2 przygotowuje się w płytce 6-dołkowej na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej, jak pokazano na Rysunku 5. Duża objętość wstępnie ogrzanego RWS zapobiega nadmiernemu ochłodzeniu roztworu po dodaniu witryfikowanej tkanki i zapewnia stale ciepłe środowisko dla tkanki przez cały proces szybkiego ogrzewania.

Aby ocenić i zapewnić wysokie standardy jakości, wycinki biopsyjne o wymiarach 2 mm x 2 mm barwi się kalceiną przed witryfikacją oraz po szybkim ogrzewaniu, aby określić żywotność pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej34,35 (Rysunek 6). Żywotne pęcherzyki emitują zieloną fluorescencję przy 495 nm po wewnątrzkomórkowym pobraniu kalceiny. Alternatywnie żywotność pęcherzyków (Tabela 3) można ocenić przy użyciu barwników czerwieni neutralnej36.

Postępując zgodnie z opisanymi w niniejszym protokole krokami, tkanka jajnika zostaje przekształcona w szklisty stan agregacji, co sprzyja wysokiemu wskaźnikowi przeżywalności po szybkim ogrzewaniu, co potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Schemat próbki kory jajnika; szczegółowy proces hodowli tkankowej i badania żywotności biopsji.
Rysunek 1: Projekt badania. Próbki kory jajnika od 50 pacjentek badano przed (świeżo) oraz po witryfikacji i szybkim ogrzewaniu w celu określenia liczby żywych pęcherzyków. W każdej grupie dwa fragmenty tkanki o średnicy 2 mm hodowano przez 24 h przed oceną liczby pęcherzyków. Tkankę trawiono kolagenazą i barwiono kalceiną w celu oceny żywotności. Liczbę żywych pęcherzyków określono przy użyciu mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces przygotowania próbek z użyciem wyciągu dymów; narzędzia i sprzęt ochronny w konfiguracji eksperymentu laboratoryjnego.
Rysunek 2: Przygotowanie urządzeń do załadunku. Metalowe siatki zostały docięte do rozmiaru 8 mm x 25 mm (A). Dostosowane metalowe siatki zostały wysterylizowane w autoklawie (B). Sterylne siatki metalowe zostały następnie włożone do nakrętek fiolek o pojemności 1.8 mL, przygotowując je do użycia (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu filtracji próżniowej ze zmiennymi objętości i czasu dla analizy rozdziału próbek.
Rycina 3: Przygotowanie roztworów do witryfikacji. Roztwory do witryfikacji (VS) zostały przygotowane i przeniesione do płytki 6-dołkowej. Dołki wskazują objętość każdego roztworu oraz poszczególne czasy inkubacji zastosowane w protokole witryfikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces hodowli tkankowej z użyciem szalki Petriego; manipulowanie próbkami za pomocą pincety; metoda biologii molekularnej.
Rycina 4: Obróbka i witryfikacja kory jajnika. Tkanka kory jajnika została przygotowana do krio konserwacji poprzez usunięcie rdzenia i pocięcie tkanki na fragmenty o wymiarach 5 mm x 10 mm (A). Po inkubacji w roztworach witryfikacyjnych przedstawionych na Rycini 3, tkankę umieszczono w urządzeniu do załadunku witryfikacyjnego (B,C). W celu szybkiej pionowej witryfikacji próbek kory jajnika, nakrętki z załadowaną tkanką zostały szybko zanurzone w sterylnym ciekłym azocie (D). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu chromatograficznego pokazujący czasy i objętości płukania oraz interakcji z próbką.
Rysunek 5: Przygotowanie roztworów do szybkiego ogrzewania. Przygotowano roztwór do szybkiego ogrzewania (RWS), roztwór do równoważenia (ES) oraz roztwory do płukania (RS) 1 i 2, a następnie przeniesiono je do płytki 6-dołkowej. Naczynia i dołki wskazują objętość każdego roztworu oraz odpowiadające im czasy inkubacji. Należy zwrócić uwagę, że RWS jest utrzymywany w temperaturze 37.2 °C na płycie grzewczej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiają agregaty komórek, wskazując poziomy ekspresji białek, wyniki eksperymentu.
Rysunek 6: Ocena żywotności. Aby ocenić liczbę żywotnych pęcherzyków, fragmenty tkanki o średnicy 2 mm poddano trawieniu kolagenazą i barwieniu kalceiną. Reprezentatywne obrazy przedstawiają (A) barwienie kalceiną 3 odzyskanych pęcherzyków przed witryfikacją. (B) Odzyskany żywotny pęcherzyk po witryfikacji i szybkim ogrzewaniu. (C) Odzyskany żywotny pęcherzyk przed powolnym zamrażaniem. (D) Odzyskane żywotne pęcherzyki po powolnym zamrażaniu i rozmrażaniu. Żywotność pęcherzyków jest wskazana przez kalceinę, zielony barwnik fluorescencyjny, który emituje zieloną fluorescencję przy 495 nm po enzymatycznej konwersji przez żywe komórki. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

VS 1 (15 mL)Glikol etylenowy10%1.5 mL
SSS10%1.5 mL
G-MOPS+12 mL
VS 2 (15 mL)Glikol etylenowy20%3 mL
SSS10%1.5 mL
G-MOPS+10.5 mL
VS 3 (15 mL)Glikol etylenowy35%5.25 mL
SSS10%1.5 mL
Sacharoza0.5 mol/L2.57 g
PVP5 % (w/v)0.75 g
G-MOPS+do 15 mL

Tabela 1: Skład roztworów do witryfikacji (VS).

RWS (30 ml)Sacharoza0,8 mol/L
8,22 g
SSS10%3 ml
G-MOPS+do 30 ml
ES (15 ml)Sacharoza0,4 mol/L2,05 g
SSS10%1,5 ml
G-MOPS+do 15 mL
RS 1&2 (15 ml)SSS10%1,5 ml
G-MOPS+do 15 ml

Tabela 2: Skład roztworu do szybkiego ogrzewania (RWS), roztworu wyrównawczego (ES) i roztworów płuczących (RS). Tabela ta przedstawia składniki i stężenia dla roztworu do szybkiego ogrzewania (RWS), roztworu wyrównawczego (ES) oraz roztworów płuczących (RS) stosowanych podczas obróbki po witryfikacji.

ParametrŚwieżyOdstępSzybkie ogrzewanie po witryfikacjiPrzedziałn*Pwartość p
SDSD
Liczba żywych mieszków [n]77.980-38662.990.5-349500.130
77.9580.02
*test Wilcoxona

Tabela 3: Reprezentatywne wyniki żywotności mieszyków. Tabela ta przedstawia wyniki ocen żywotności mieszyków przed kriokonserwacją i po szybkim ogrzewaniu. Do policzenia liczby żywych mieszyków przed i po witryfikacji/szybkim ogrzewaniu wykorzystano dwa fragmenty tkanki o średnicy 2 mm na pacjentkę. Pary próbek tkanek od 50 pacjentek przeanalizowano przy użyciu testu Wilcoxona.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono protokół wysokoprzepustowej witryfikacji tkanki ludzkiej kory jajnika, odpowiedni do rutynowych zabiegów klinicznych. Podobnie jak w przypadku witryfikacji oocytów lub zarodków, pomyślne zastosowanie procedury wymaga szczegółowego przestrzegania protokołu dotyczącego temperatury roztworów witryfikacyjnych i rozgrzewających, a także okresu równowagi. Niezbędna jest również zgodność z dyrektywami UE w sprawie tkanek37 dotyczącymi jakości powietrza i sterylności.

W wyniku zabiegu witryfikacji uzyskuje się stan niekrystaliczny, amorficzny lub szklisty. Ogólnie rzecz biorąc, witryfikacja jest wszechstronnym procesem o znaczących implikacjach w różnych dziedzinach nauki i technologii. Podstawową zaletą witryfikacji jest jej zdolność do przekształcania tkanki w stan szklisty, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się kryształków lodu 38,39,40, które mogą negatywnie wpływać na integralność tkanki i jej składników.

Suplementacja środków krioprotekcyjnych (CPA) poliwinylopirolidonem (PVP) pozwala na zmniejszenie stężenia CPA bez pogorszenia jakości roztworów witryfikacyjnych41,42. Ponadto zastosowanie siatek metalowych zapewnia wysoką przewodność cieplną w porównaniu z systemami nośnymi na bazie tworzyw sztucznych. Struktura siatki ułatwia również przyleganie do powierzchni, zapewniając bezpieczną kriokonserwację próbek tkanek i małych stempli kory do pomiaru jakości. Jeśli używane są naczynia kriogeniczne innych producentów, ważne jest, aby wcześniej przetestować rozmiar metalowych siatek, aby zapewnić stabilność i odpowiednią przyczepność w pokrywie krionaczynia, a także dobre dopasowanie do naczynia.

Kluczowe kroki zapewniające pomyślną witryfikację obejmują szybką witryfikację poprzez zanurzenie tkanki w wysterylizowanym ciekłym azocie i natychmiastowe szybkie rozgrzanie, aby uniknąć niepożądanych wyników. Pod względem opłacalności witryfikacja tkanek jest mniej wymagająca w porównaniu z procedurą powolnego zamrażania, co może mieć wpływ na planowanie rozmieszczenia personelu. Dodatkowo witryfikacja eliminuje konieczność zakupu i serwisowania sprzętu wymaganego do powolnego zamrażania.

Pomiary biologiczne i metaanalizy wykazały porównywalność, a nawet zalety witryfikacji w porównaniu z powolnym zamrażaniem43 . Jednak różnice w wynikach po witryfikacji można przypisać brakowi standaryzacji zarówno w urządzeniu do witryfikacji, jak i w protokole, w tym w zastosowanych roztworach, które różnią się w zależności od badania. Przyszłe badania powinny zbadać potencjał hodowli pęcherzyków z witryfikowanej/szybko ogrzewanej tkanki do monitorowania wzrostu in vitro, co z powodzeniem wykazano w tkance jajnika myszy przez kilka grup 44,45,46,47,48,49,50.

Podsumowując, witryfikacja tkanki jajnikowej jest znaczącą alternatywą dla powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania, popartą pięcioma udanymi porodami zgłoszonymi przez Suzuki51 (Japonia), Silber52 (USA) i Sänger53 (Niemcy). W przeciwieństwie do dostępnych na rynku pożywek do witryfikacji i zestawów do komórek, istnieje niewiele zatwierdzonych przez FDA/CE systemów do tkanki jajnika, co może ograniczać ich zastosowanie w warunkach klinicznych. W związku z tym zaleca się opracowanie zatwierdzonych przez FDA/CE zestawów i pożywek do witryfikacji i szybkiego podgrzewania tkanki jajnikowej30.

Podziękowania

Dziękujemy Carze Färber za korektę; Katharinie Wollersheim, Martinowi Mahlbergowi, Lei Korte i Jasmin Rebholz za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki 1,8 mlVWR International GmbH479-6837
Pipeta serologiczna 10 mlSarstedt86.1254.001
Płytka 4-dołkowaGynemedGYOOPW-FW04
50 ml ProbówkaSarstedt62.559.001
Płytki 6-dołkoweSarstedt83.3920
Bacillol AFHartmann973385
Calcein AMMerck17783
Kolagenaza typ 1AMerckC2674
Kriosure DMSOWAK ChemieWAK-DMSO-10
CustodiolDr. Franz Kö hler Chemie00867288
DPBS CTSGibco Life technologiesA12856-01
ErgoOne Pipet aidStarlabS7166-0010
Glikol etylenowyPojemnik do sterylizacji Sigma Aldrich102466
EurondaEuronda282021
G-MOPS+Vitrolife10130
Metal siatkiSigma AldrichS0770
Nożyczki Metzenbaumświat precyzyjne instrumenty501262102
N-Bath SystemNterilizerN-Bath 3.0
Poliwinylopirolidon (PVP)SAGEART-4005
Suplement zastępczy surowicy (SSS)Fujifilm Irvine scientific99193
Sterylny kubekSarstedt75.562.105
Kleszcze sterylneCarl RothKL05.1
SacharozaMerckS0389

Bibliografia

  1. Rezazadeh Valojerdi, M., Eftekhari-Yazdi, P., Karimian, L., Hassani, F., Movaghar, B. Vitrification versus slow freezing gives excellent survival, post-warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos. J Assist Reprod Genet. 26 (6), 347-354 (2009).
  2. Levi-Setti, P. E., Patrizio, P., Scaravelli, G. Evolution of human oocyte cryopreservation: Slow freezing versus vitrification. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2 (6), 445-450 (2016).
  3. Glujovsky, D., et al. Vitrification versus slow freezing for women undergoing oocyte cryopreservation. Cochrane Database Syst Rev. 9, CD010047(2014).
  4. AbdelHafez, F. F., Desai, N., Abou-Setta, A. M., Falcone, T., Goldfarb, J. Slow freezing, vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: A systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 20 (2), 209-222 (2010).
  5. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryo-preserving ovarian tissue. Reprod Biomed Online. 23, 160-186 (2011).
  6. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21, 407-426 (1984).
  7. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67 (6), 1671-1680 (2002).
  8. Schallmoser, A., et al. Comparison of angiogenic potential in vitrified vs. slow frozen human ovarian tissue. Sci Rep. 13 (1), 12885(2023).
  9. Schallmoser, A., et al. The effect of high-throughput vitrification of human ovarian cortex tissue on follicular viability: A promising alternative to conventional slow freezing. Arch Gynecol Obstet. 307 (2), 591-599 (2023).
  10. Jadoul, P., et al. Efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation: Lessons learned from 545 cases. Hum Reprod. 32 (5), 1046-1054 (2017).
  11. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med. 353, 318-321 (2005).
  12. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, 467-474 (2016).
  13. Hoekman, E. J., et al. Ovarian tissue cryopreservation: Low usage rates and high live-birth rate after transplantation. Acta Obstet Gynecol Scand. 00, 1-9 (2019).
  14. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. 86 Successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34, 325-336 (2017).
  15. Anderson, R. A., et al. The ESHRE guideline group on female fertility preservation, ESHRE guideline: Female fertility preservation. Hum Reprod Open. 2020 (4), hoaa052(2020).
  16. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  17. Keros, V., et al. Vitrification versus controlled rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum Reprod. 24, 1670-1683 (2009).
  18. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L., Luo, S., Li, S. W. Needle immersed vitrification can lower the concentration of cryoprotectant in human ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 94, 2323-2328 (2010).
  19. Fabbri, R., et al. Good preservation of stromal cells and no apoptosis in human ovarian tissue after vitrification. Biomed Res Int. 2014, 673537(2014).
  20. Chang, H. J., et al. Optimal condition of vitrification method for cryopreservation of human ovarian cortical tissues. J Obstet Gynaecol Res. 37 (8), 1092-1101 (2011).
  21. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2020).
  22. Fabbri, R., et al. Morphological, ultrastructural and functional imaging of frozen/thawed and vitrified/warmed human ovarian tissue retrieved from oncological patients. Hum Reprod. 31 (8), 1838-1849 (2023).
  23. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L. L., Li, S. W. In vitro culture thawed human ovarian tissue: NIV versus slow freezing method. Cryo Letters. 34 (5), 520-526 (2013).
  24. Locatelli, Y., et al. In vitro survival of follicles in prepubertal ewe ovarian cortex cryopreserved by slow freezing or non-equilibrium vitrification. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1823-1835 (2017).
  25. Nikiforov, D., et al. Innovative multi-protectoral approach increases survival rate after vitrification of ovarian tissue and isolated follicles with improved results in comparison with conventional method. J Ovarian Res. 11 (1), 65(2018).
  26. Wang, T., et al. Human single follicle growth in vitro from cryopreserved ovarian tissue after slow freezing or vitrification. Human Reprod. 31 (4), 763-773 (2016).
  27. Lee, S., et al. Comparison between slow freezing and vitrification for human ovarian tissue cryopreservation and xenotransplantation. Int JMol Sci. 20 (13), 3346(2019).
  28. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  29. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprod Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  30. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed Online. 49 (1), 103940(2024).
  31. Sugishita, Y., et al. Quantification of residual cryoprotectants and cytotoxicity in thawed bovine ovarian tissues after slow freezing or vitrification. Hum Reprod. 37 (3), 522-533 (2022).
  32. Abir, R., et al. Attempts to improve human ovarian transplantation outcomes of needle-immersed vitrification and slow-freezing by host and graft treatments. J Assist Reprod Genet. 34 (5), 633-644 (2017).
  33. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  34. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Arch Gynecol Obstet. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  35. Kristensen, S. G., et al. A simple method to quantify follicle survival in cryopreserved human ovarian tissue. Hum Reprod. 33 (12), 2276-2284 (2018).
  36. Mortimer, D. A critical assessment of the impact of the European Union Tissues and Cells Directive (2004) on laboratory practices in assisted conception. Reprod Biomed. 11 (2), 162-176 (2005).
  37. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. Reprod Biomed. 23 (2), 160-186 (2011).
  38. Fahy, G. M. Vitrification: A new approach to organ cryopreservation. Transplantation: Approaches to Graft Rejection. Meryman, H. T. , Alan R. Liss. New York, USA. 305-335 (1986).
  39. Kattera, S., Chen, C. Cryopreservation of embryos by vitrification: Current development. Int Surg. 91 (5 Suppl), S55-S62 (2006).
  40. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reprod Biomed. 9, 680-691 (2004).
  41. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67, 1671-1680 (2002).
  42. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  43. Hasegawa, A., Hamada, Y., Mehandjiev, T., Koyama, K. In vitro growth and maturation as well as fertilization of mouse preantral oocytes from vitrified ovaries. Fertil Steril. 81 (Suppl 1), 824-830 (2004).
  44. Segino, M., et al. In vitro culture of mouse GV oocytes and preantral follicles isolated from ovarian tissues cryopreserved by vitrification. Hum Cell. 16 (3), 109-116 (2003).
  45. Kagawa, N., et al. Production of the first offspring from oocytes derived from fresh and cryopreserved pre-antral follicles of adult mice. Reprod Biomed. 14 (6), 693-699 (2007).
  46. Haidari, K., et al. The effects of different concentrations of leukemia inhibitory factor on the development of isolated preantral follicles from fresh and vitrified mouse ovaries. Iran Biomed J. 10, 4(2006).
  47. Haidari, K., Salehnia, M., Rezazadeh Valojerdi, M. The effect of leukemia inhibitory factor and coculture on the in vitro maturation and ultrastructure of vitrified and nonvitrified isolated mouse preantral follicles. Fertil Steril. 90 (6), 2389-2397 (2008).
  48. Lin, T. C., et al. Comparison of the developmental potential of 2-week-old preantral follicles derived from vitrified ovarian tissue slices, vitrified whole ovaries and vitrified/transplanted newborn mouse ovaries using the metal surface method. BMC Biotechnol. 8, 38(2008).
  49. Wang, X., Catt, S., Pangestu, M., Temple-Smith, P. Live offspring from vitrified blastocysts derived from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice. Reproduction. 138 (3), 527-535 (2009).
  50. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  51. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprodu Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  52. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  53. Parmegiani, L., et al. Testing the efficacy and efficiency of a single "universal warming protocol" for vitrified human embryos: prospective randomized controlled trial and retrospective longitudinal cohort study. J Assist Reprod Gen. 35 (10), 1887-1895 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Witryfikacja tkanki jajnikazachowanie płodnościprotokół kriokonserwacjiszybkie ogrzewaniewitryfikacja na siatce metalowejżywotność pęcherzykówbarwienie kalceinąmikroskopia fluorescencyjnapowolne mrożenie
Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.