Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana perfuzja Langendorffa w celu wydłużenia czasu perfuzji przeszczepów serca gryzoni

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66815

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital, 2Shriners Children's Boston, 3Division of Cardiac Surgery, Corrigan Minehan Heart Center, Massachusetts General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje możliwość osiągnięcia dłuższych czasów perfuzji (4 h) mysich przeszczepów serca bez utraty funkcji poprzez zastosowanie niższych (30-35 mmHg) niż fizjologicznych (60-80 mmHg) ciśnień perfuzji podczas Langendorffa.

Streszczenie

Pomimo ważnych postępów w diagnostyce i leczeniu chorób sercowo-naczyniowych (CVD), dziedzina ta pilnie potrzebuje zwiększonej liczby badań i postępu naukowego. W rezultacie, innowacje, ulepszenia i/lub zmiana przeznaczenia dostępnego zestawu narzędzi badawczych mogą zapewnić lepsze warunki testowe dla postępu naukowego. Perfuzja Langendorffa jest niezwykle cenną techniką badawczą w dziedzinie badań CVD, która może być modyfikowana w celu dostosowania do szerokiego wachlarza potrzeb eksperymentalnych. To dostosowanie można osiągnąć, personalizując dużą liczbę parametrów perfuzji, w tym ciśnienie perfuzji, przepływ, perfuzację, temperaturę itp. Protokół ten pokazuje wszechstronność perfuzji Langendorffa i możliwość osiągnięcia dłuższych czasów perfuzji (4 godziny) bez utraty funkcji przeszczepu dzięki zastosowaniu niższych ciśnień perfuzji (30-35 mmHg). Osiągnięcie wydłużonych czasów perfuzji bez uszkodzenia przeszczepu i/lub utraty funkcji spowodowanej przez samą technikę może potencjalnie wyeliminować elementy zakłócające z wyników eksperymentalnych. W rezultacie, w warunkach naukowych, w których dłuższe czasy perfuzji są istotne dla potrzeb eksperymentalnych (tj. leczenia farmakologicznego, analizy odpowiedzi immunologicznej, edycji genów, konserwacji przeszczepów itp.), niższe ciśnienie perfuzji może być kluczem do sukcesu naukowego.

Wprowadzenie

Dziedzina badań sercowo-naczyniowych odnotowała istotny postęp w diagnostyce i leczeniu chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Jednak pomimo ogólnego spadku zachorowalności i śmiertelności, choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie1,2. Ten alarmujący fakt uwypukla potrzebę zwiększenia badań i postępu naukowego, który niewątpliwie zależy od dokładności i przewidywalności dostępnych narzędzi badawczych. W związku z tym istnieje ciągła potrzeba innowacji, ulepszeń i/lub zmiany przeznaczenia zestawu narzędzi badawczych. Na przykład perfuzja serca wsteczna lub Langendorffa, technika dostępna w tej dziedzinie od ponad wieku, może być łatwo zmodyfikowana, aby pokryć większy zakres potrzeb naukowych i osiągnąć szerszy zakres zastosowań.

Izolacja przeszczepu serca od reszty organizmu podczas perfuzji Langendorffa zapewnia ważny stopień kontroli nad szerokim wachlarzem parametrów eksperymentalnych, w tym temperaturą, roztworem krążącym, ciśnieniem perfuzji wieńcowej, itp.3,4,5,6,7. Manipulowanie tymi parametrami ułatwia symulację dużej liczby scenariuszy kardiologicznych, które można wykorzystać do dalszego postępu naukowego5,8,9,10. Wśród tych parametrów, ciśnienie perfuzji jest prawdopodobnie najczęściej pomijanym ustawieniem eksperymentalnym11.

Podczas Langendorffa ciśnienie perfuzyjne wykazuje bezpośrednią korelację z częstością akcji serca, szczytowym ciśnieniem skurczowym/rozkurczowym i zużyciem tlenu11. Ta korelacja zapewnia bezpośrednią i precyzyjną kontrolę nad ilością pracy wytwarzanej przez przeszczepy serca, które można dostosować do indywidualnych potrzeb eksperymentalnych. Pomimo tej cennej zdolności kontrolnej, dziedzina ta historycznie skłaniała się ku stosowaniu wyższych ciśnień perfuzji (60-80 mmHg), poddając wszystkie przeszczepy serca wysokiemu zapotrzebowaniu na pracę, niezależnie od potrzeb eksperymentalnych8,12,13,14,15. Konsekwencje tego niepotrzebnie wysokiego popytu na pracę wynikają z nadrzędnej zasady, że przepracowanie prowadzi do przedwczesnej porażki. Wydaje się, że jest to szczególnie prawdziwe w przypadku przeszczepów serca perfundowanych przez Langendorffa, ponieważ niefizjologiczny charakter tej metody i brak wsparcia rekonwalescencji obecny in vivo wydają się nasilać niepowodzenie przeszczepu. Ta przedwczesna utrata funkcji przeszczepu znacznie ogranicza czas perfuzji i eksperymentu. W rezultacie, w okolicznościach, w których dłuższe czasy perfuzji są bardziej istotne dla potrzeb eksperymentalnych (tj. leczenie farmakologiczne, analiza odpowiedzi immunologicznej, edycja genów, zachowanie przeszczepu itp.), można sobie pozwolić na mniejszą pracę serca w zamian za zwiększoną trwałość przeszczepu.

Ten protokół pokazuje możliwość wykorzystania niższych ciśnień perfuzji (30-35 mmHg) podczas Langendorffa, a także znaczący wpływ, jaki wywierają one na funkcję przeszczepu serca w czasie w porównaniu do wyższych ciśnień perfuzji (60-80 mmHg). Co więcej, odkrycia zawarte w tym manuskrypcie podkreślają znaczenie priorytetowego traktowania dostosowywania szerokiego wachlarza parametrów perfuzji w celu lepszego zaspokojenia potrzeb eksperymentalnych.

Protokół

To badanie jest prowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Massachusetts General Hospital.

1. Konstrukcja systemu

  1. Zmontuj system z trzema dwupłaszczowymi elementami, w tym pułapką bąbelkową, zbiornikiem, natleniaczem, pompą perystaltyczną i cyrkulatorem wody.
  2. Przymocuj wszystkie elementy z osłoną do jednego stojaka zaciskowego. Połącz elementy w kolejności za pomocą silikonowych rurek w dwóch różnych sekwencjach (Rysunek 1A).
    1. Sekwencja 1 - Wzór przepływu wody przez płaszcz (linie ciągłe w Rysunek 1A):
      1. Podłączyć odpływ cyrkulatora wody do dolnego wlotu płaszcza pułapki bąbelkowej za pomocą rurki 36 G. Gwarantuje to, że perfuzat będzie utrzymywany w odpowiedniej temperaturze (37 °C) przed dotarciem do serca, ponieważ woda będzie tracić ciepło podczas przepływu przez inne elementy systemu.
      2. Podłącz górny wlot płaszcza pułapki bąbelkowej do dolnego wlotu płaszcza zbiornika za pomocą rurki tego samego rozmiaru.
      3. Następnie połącz górny wlot płaszcza zbiornika z dolnym wlotem płaszcza natleniacza.
      4. Na koniec podłącz górny wlot natleniacza do dopływu cyrkulatora wody.
    2. Sekwencja 2 - Wzór przepływu perfuzatu przez system (linie przerywane w Rysunek 1A)
      1. Przymocuj złącza typu luer po obu stronach rurki 16 G. Przymocuj pierwszy koniec do podstawy zbiornika i przeprowadź go przez głowicę pompy perystaltycznej. Podłącz drugi koniec do jednego z wlotów silikonowej cewki w natleniaczu.
      2. Podłącz drugi kawałek rurki 16 G, wyposażony w złącza luer lock na obu końcach, na drugim wlocie silikonowej cewki natlenulatora do wlotu w pułapce pęcherzykowej z długim występem.
      3. Podłącz krótszy kawałek rurki 16 G, wyposażony w złącza typu luer, do nieużywanego wylotu pułapki bąbelkowej do trójdrogowego zaworu luer lock.
      4. Po przeciwnej stronie zaworu trójdrogowego połącz kawałek rurki 16 G z drugim zaworem luer na drugim końcu. Ten drugi zawór znajduje się bezpośrednio nad zbiornikiem. Podłącz przeciwną stronę zaworu do większej liczby wężyków 16 G, a następnie do czujnika ciśnienia.
      5. Podłącz rurkę o mniejszej średnicy ( ̃3,7 mm) do pionowego portu zaworu trójdrogowego za pomocą łącznika do kaniuli (angiocath 14 G). Perfuzat przepływa ze zbiornika do oksygenatora przez pułapkę pęcherzykową, a następnie wraca do zbiornika przez połączenie kaniuli aortalnej.

2. Przygotowanie perfuzatu

  1. Przygotować perfuzat bazowy, 0,96% bufor Krebsa-Henseleit, 9,915 mM dekstranu, 25 mM wodorowęglanu sodu, 1,054 mM albuminę surowicy bydlęcej, 1% paciorkowca, 0,13% insuliny, 0,02% hydrokortyzonu, 0,5% heparyny i 2,75 mM chlorku wapnia i uzupełnić do objętości wodą destylowaną.

3. Konfiguracja systemu perfuzyjnego

  1. Podłącz dwie strzykawki o pojemności 10 ml do górnego i bocznego otworu wentylacyjnego pułapki bąbelkowej.
  2. Dodaj perfuzat bazowy (75 ml) do zbiornika. Włączyć pompę perystaltyczną i ustawić cyrkulator wody na 37 °C.
  3. Podłącz przewód tlenowy (95%O2 i 5% CO2) do trzeciego wlotu natleniacza i natlenić perfuzat do minimum pO2 400 mmHg.
  4. Przymocować port iniekcyjny do pionowego portu zaworu trójdrogowego bezpośrednio za pułapką pęcherzyków. Podłączyć igłę do infuzji ze skrzydełkami ze strzykawką o pojemności 1 ml do portu iniekcyjnego (używanego do pobierania próbek). Delikatnie postukać w port iniekcji lub pobrać perfuzat za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki wprowadzone do obwodu.
  5. Gdy perfuzat zasadowy osiągnie temperaturę i poziom tlenu, należy wykonać wstępny odczyt parametrów biochemicznych, aby zapewnić prawidłowe stężenie jonów (Tabela 1) i prawidłowe natlenienie.
    UWAGA: Poziomy jonów i pH należy odczytać po dogrzaniu roztworu do temperatury (37 °C) i natlenieniu odpowiednią mieszanką gazów (95%O2, 5% CO2).
  6. Wyzeruj czujnik ciśnienia, odpinając podłączoną rurkę i pozwól, aby przepływ perfuzatu przez otwarty czujnik i kaniulę się zrównoważył. Po wyrównaniu naciśnij przycisk zerowy w pudełku czujnika i ponownie clamp rurkę. Zapisuj ciśnienie podstawowe przed podłączeniem serca do systemu dla przepływów w zakresie od 1 ml/min do 15 ml/min.
  7. Perfuzja niskociśnieniowa
    1. Kroplówka z adenozyną: Wykonać początkowy zapas adenozyny w 20 mM w podstawowym perfuzacie. Rozpuść adenozynę, umieszczając probówkę w ciepłej łaźni wodnej i mieszając przez inwersję.
    2. Rozcieńczyć podstawową adenozynę do dawki 0,06 mg/ml w perfuzacie zasadowym i dodać do strzykawki o pojemności 50 ml.
    3. Do strzykawki o pojemności 50 ml należy podłączyć igłę do infuzji ze skrzydełkami i podłączyć ją do portu iniekcyjnego w zaworze trójdrogowym. Przymocować strzykawkę do pompy strzykawkowej i ustawić jej prędkość infuzji 166,6 μl/min.
      UWAGA: Bąbelki są uwalniane z portu infuzyjnego poprzez lekkie stuknięcie lub przesunięcie portu.
  8. Perfuzja wysokociśnieniowa:
    1. Izolacja upakowanych krwinek czerwonych (pRBC):
      1. Zbierz 10-12 ml pełnej krwi szczura przez nakłucie serca szczura dawcy.
      2. Odwirować krew o stężeniu 2000 x g przez 10 minut.
      3. Usunąć warstwę plazmy i kożucha za pomocą pipetowania.
      4. Zawiesić pRBC w perfuzacie bez chlorku wapnia w stosunku 1:1 (np. 5 ml pRBC: 5 ml perfuzatu) przez mieszanie inwersyjne.
      5. Powtórz kroki 3.8.1.2-3.8.1.4 dwukrotnie, co daje w sumie 3 prania.
      6. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić komórki w perfuzacie w stosunku 1:1 i dodać mieszaninę do systemu perfuzyjnego, zawierającego już 75 ml perfuzatu zasadowego.
    2. Pozwól komórkom równomiernie rozprowadzić się w systemie i zmierz hematokryt perfuzatu za pomocą maszyny hematologicznej. Hematokryt waha się od 5% do 7%.

4. Przygotowanie do pobrania przeszczepu serca

  1. Całkowicie zagruntuj system perfuzyjny przed rozpoczęciem pobierania, aby zminimalizować czas zimnego niedokrwienia.
  2. Przygotuj narzędzia chirurgiczne. Narzędzia chirurgiczne obejmują niebieskie podkładki, taśmę chirurgiczną, jedwabne szwy 5-0, waciki, strzykawki z solą fizjologiczną (50 ml i 10 ml), nożyczki operacyjne, kleszcze, mikronożyczki, mikrokleszcze, zacisk Halsteada, 30 U heparyny, rurkę 16 G do płukania portalu, rurkę 14 G do kanaulacji serca, 16 G angiocath, modyfikowaną angiocath 14 G z mankietem, czujnik ciśnienia, wiaderko na lód z lodem, szalka Petriego 47 mm, gaza.
  3. Utwórz zmodyfikowaną kaniulę, wkładając cienki pierścień rurki (średnica wewnętrzna [ID] 0,167 mm, średnica zewnętrzna [OD] 2,42 mm) do kaniuli 14 G, tworząc efekt mankietu.
    1. Wyjmij igłę z kaniuli i dodaj kroplę super kleju poniżej pierścienia. Ostrożnie wsuń pierścień na 1/4 cala powyżej podstawy kaniuli. Pozostaw klej do wyschnięcia przed użyciem.
    2. Przytnij kaniulę jak najbliżej mankietu pod kątem i usuń ostre krawędzie.
  4. Napełnij strzykawkę o pojemności 60 ml heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej (0,03 U/ml) w celu przepłukania żyły wrotnej. Podłączyć strzykawkę do czujnika ciśnienia, a następnie do rurki płuczącej 16 G.
  5. Podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml z heparynizowaną solą fizjologiczną (0,03 j./ml) do probówki 14 G. Podłącz drugi koniec rurki do kaniuli aortalnej i przepłucz, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  6. Umieść kaniulę aorty na szalce Petriego o średnicy 47 mm z gazą i wypełnioną solą fizjologiczną. Pozostaw szalkę Petriego na lodzie, aż serce zostanie podłączone do systemu perfuzyjnego.

5. Pobieranie przeszczepów serca

  1. Znieczulić szczury w komorze anestezjologicznej 3% izofluranem.
  2. Gdy odruchy nie zostaną zauważone, wyjmij szczura z komory, umieść go w przestrzeni operacyjnej i podawaj ciągły izofluran (3%) przez maskę na twarz.
  3. Wykonaj test szczypania palca u nogi, a następnie heparynizować zwierzę przez żyłę prącia za pomocą 30 j. heparyny.
  4. Ogol szczura na całym brzuchu i górnej części klatki piersiowej. Usuń wióry futrzane z pola operacyjnego. Zaklej taśmą każdą kończynę, aby upewnić się, że podczas operacji nie ma ruchu.
  5. Ponownie wykonaj test szczypania palców u stóp, aby potwierdzić brak odruchów. Następnie wykonaj poziome nacięcie w linii środkowej w skórze dolnej części brzucha, odsłaniając mięśnie brzucha.
  6. Wykonaj drugie poziome nacięcie w linii środkowej w mięśniach brzucha, odsłaniając narządy wewnętrzne.
  7. Odsłoń mostek, zabezpiecz go hemostatem i cofnij czaszkowo, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną. Kankaniuluj żyłę wrotną za pomocą angiokatu o rozmiarze 16.
  8. Podłącz strzykawkę o pojemności 60 ml z heparynizowaną solą fizjologiczną do angiocath i wykonaj nacięcie w żyle głównej dolnej i aorcie brzusznej w celu wentylacji. Przepłukać pełną ilość soli fizjologicznej przez żyłę wrotną.
    UWAGA: Ciśnienie spłukiwania powinno utrzymywać się na poziomie około 10 mmHg.
  9. Wykonaj poziome nacięcie w przeponie, a następnie proksymalne przecięcie przez żebra po obu stronach mostka, aby odsłonić jamę piersiową.
  10. Wyjmij serce z jamy i natychmiast umieść je na szalce Petriego z solą fizjologiczną na lodzie.
  11. Zidentyfikuj łuk aorty, zaciśnij za pomocą hemostatów i odsłoń aortę zstępującą, czyszcząc pozostałą tkankę łączną.
  12. Wykonaj poziome cięcie w połowie wysokości aorty zstępującej i kaniuluj za pomocą 14 G angiocath.
    UWAGA: Nie naruszaj zastawki aortalnej kaniulą.
  13. Zabezpiecz kaniulę za pomocą szwu nad mankietem i zwolnij hemostat.
  14. Niech serce pozostanie na lodzie, dopóki nie zostanie umieszczone w systemie perfuzyjnym.

6. Inicjacja perfuzji

  1. Ustaw przepływ pompy perystaltycznej na 1,0 ml/min.
    UWAGA: Kaniula aorty jest zawsze obsługiwana pod kątem 90° w stosunku do serca, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków do naczyń wieńcowych (Rysunek 1B).
  2. Zważ serce za pomocą kaniuli przed podłączeniem serca do systemu.
    UWAGA: Kaniula aorty powinna być całkowicie wolna od pęcherzyków powietrza.
  3. Podłącz kaniulę do złącza w systemie i uruchom timer.
  4. Gdy serce w pełni się skurczy, zwiększaj przepływ o 0,2 ml/min, uważnie obserwując ciśnienie.
  5. Zatrzymaj wzrost przepływu po osiągnięciu żądanego ciśnienia lub do momentu osiągnięcia minimum 3,5 ml/min.
    1. Perfuzja niskociśnieniowa
      1. W przypadku ciśnień w zakresie 30-35 mmHg należy użyć przepływu 4,5 ml/min.
      2. Uruchomić pompę strzykawkową z adenozyną.
    2. Perfuzja wysokociśnieniowa
      1. W przypadku ciśnień w zakresie 70-80 mmHg należy użyć minimalnego przepływu 5,0 ml/min.
      2. Uruchomić pompę strzykawkową z adenozyną.

7. Balon dokomorowy:

  1. Przymocuj mały (50 μl) balon lateksowy do cewnika balonowego (o średnicy 2 mm, długości 15 cm) ze zwężającą się końcówką (o średnicy 1,4 mm).
  2. Podłącz cewnik do czujnika ciśnienia za pomocą złącza luer lock i przymocuj cały zestaw do stojaka zaciskowego.
  3. Napełnij balon/cewnik/czujnik ciśnienia około 200 μl soli fizjologicznej za pomocą strzykawki przymocowanej do górnego końca czujnika ciśnienia i usuń pęcherzyki z wnętrza czujnika, cewnika i balonu.
  4. Skalibruj czujnik ciśnienia za pomocą ciśnieniomierza.
  5. Wykonaj małe poziome nacięcie nad lewym przedsionkiem. Opróżnij balon, przeciągając strzykawkę w górnej części czujnika ciśnienia i wkładając ją do lewej komory.
  6. Zainicjuj akwizycję danych i napompuj balon, aż ciśnienie rozkurczowe wskaże 0 mmHg.

8. Pobieranie próbek

  1. Zbieraj tętno, przepływ w aorcie i ciśnienie wieńcowe po pierwszych 20 minutach perfuzji, a następnie co godzinę.

9. Koniec/sprzątanie

  1. Pod koniec perfuzji wyjmij serce z systemu i zważ je w celu oszacowania obrzęku.
  2. Przeciąć wierzchołek serca przez cięcie obwodowe i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie w celu przeprowadzenia analiz po perfuzji.
  3. Wytnij obwodowy kawałek serca do obrazowania histologicznego i barwienia. Wyrzuć resztę serca i kaniuli.
  4. Przepłukać wszystkie elementy systemu, dodając duże ilości wody dejonizowanej (DI) do zbiornika i uruchamiając pompę perystaltyczną. Zbierz wodę do zewnętrznego wiadra.
  5. Powtórz krok 9.4 dwa do trzech razy.
  6. Dokładnie wypłucz wszystkie porty próbki i rurki czujnika ciśnienia.
  7. Napełnij zbiornik 600 ml wody DI i 3 ml laboratoryjnej pompy detergentowej w całym systemie.
  8. Wyłącz podgrzewacz wody, zbiornik tlenu i pompę perystaltyczną.

Wyniki

Serca dorosłych samców szczurów szczepu Lewis (masa ciała 250-300 g) pobrano i poddano perfuzji pod wysokim (70-80 mmHg) lub niskim (30-35 mmHg) ciśnieniem perfuzyjnym (n = 3 na grupę). Wpływ ciśnienia perfuzyjnego na ogólną funkcję i stan zdrowia serca określono poprzez pomiar częstości akcji serca, stopnia obrzęku oraz funkcji lewej komory.

Stwierdzono wyraźną korelację między częstotliwością akcji serca a ciśnieniem perfuzyjnym (Rysunek 2). Częstotliwość akcji serca była statystycznie wyższa w sercach poddanych wysokiemu ciśnieniu w porównaniu z sercami poddanymi niskiemu ciśnieniu we wszystkich punktach czasowych, z wyjątkiem pierwszego (60 min, Rysunek 2A,B). Co ciekawe, serca poddane niskiemu ciśnieniu wydają się przechodzić okres adaptacji na początku perfuzji, podczas którego stabilizacja częstotliwości akcji serca i osiągnięcie poziomów utrzymujących się przez resztę procesu perfuzji zajęło około 30 min (Rysunek 2A). Zaobserwowano również znaczną różnicę w ciśnieniu tętna lewej komory (LVPP) pomiędzy grupami, przy czym LVPP w sercach poddanych wysokiemu ciśnieniu było statystycznie wyższe niż w sercach poddanych niskiemu ciśnieniu w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3B). To utrzymujące się wysokie zapotrzebowanie na pracę doprowadziło do stopniowej utraty funkcji w sercach poddanych wysokiemu ciśnieniu, co objawiało się statystycznym spadkiem LVPP po 2 h perfuzji (Rysunek 3A,B). Z kolei w sercach perfundowanych pod niskim ciśnieniem nie wystąpiła utrata funkcji, a LVPP pozostało niezmienione przez cały czas perfuzji (Rysunek 3A,B). Podobnie jak w przypadku LVPP, serca poddane wysokiemu ciśnieniu wykazywały wyższą kurczliwość (dP/dtmax) i rozkurczliwość (dP/dtmin) mięśnia sercowego przez cały czas perfuzji w porównaniu z sercami poddanymi niskiemu ciśnieniu (Rysunek 3C,D). Odpowiednio, serca poddane wysokiemu ciśnieniu ulegały stopniowej utracie kurczliwości i zdolności do rozkurczu, przy czym oba parametry były statystycznie wyższe po 1 h perfuzji w porównaniu z ostatnią godziną perfuzji. Z kolei kurczliwość i zdolność do rozkurczu mięśnia sercowego były porównywalnie niskie w grupie o niskim ciśnieniu i pozostały niezmienione przez 4 h czasu perfuzji (Rysunek 3C,D). Poza efektami funkcjonalnymi, wysokie ciśnienia perfuzyjne w dłuższych okresach czasu nasilają również retencję płynu śródmiąższowego w przeszczepach serca, prowadząc do obrzęku. Obrzęk ten został półilościowo określony jako procentowa zmiana masy, co wykazało, że serca poddane wysokiemu ciśnieniu miały statystycznie wyższy przyrost masy w porównaniu z sercami perfundowanymi pod niskim ciśnieniem (Rysunek 2C).

Schemat statycznej równowagi systemu perfuzyjnego; pułapka pęcherzykowa, pompa, oksygenator, monitor ciśnienia.
Rysunek 1: Konfiguracja systemu perfuzyjnego. (A) Ogólny schemat układu perfuzyjnego. Linie przerywane reprezentują kolejność łączenia komponentów systemu w celu optymalizacji krążenia perfuzyjnego. Ciągłe, kolorowe linie reprezentują kolejność łączenia komponentów w celu optymalizacji temperatury perfuzu. (B) Prawidłowy sposób obchodzenia się z sercem po kaniulacji, aby zapobiec opróżnieniu cewnika i przedostaniu się powietrza do tętnic wieńcowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres reakcji częstotliwości akcji serca i wykres słupkowy, eksperyment stresu niskiego i wysokiego ciśnienia, analiza statystyczna.
Rycina 2: Wpływ ciśnienia na częstotliwość akcji serca i obrzęk. (A) Częstotliwość akcji serca uzyskana z pomiarów balonem wewnątrzkomorowym. Linia ciągła reprezentuje medianę grup eksperymentalnych. Obszar zacieniowany to rozstęp międzykwartylowy. (B) Pole pod krzywą (AUC) dla danych dotyczących częstotliwości akcji serca dla każdej godziny perfuzji. (C) Procentowy przyrost masy po 4 h perfuzji przy niskim i wysokim ciśnieniu. Wszystkie dane przedstawiono jako mediana ± rozstęp międzykwartylowy (IQR). *p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres funkcji serca i wykresy słupkowe; niskie vs wysokie ciśnienie; analiza tętna LV, kurczliwości i rozkurczu.
Rycina 3: Wpływ ciśnienia na funkcję lewej komory. (A) Maksymalne ciśnienie skurczowe przedstawione w funkcji czasu, oznaczone jako ciśnienie tętna lewej komory (LVPP). Linia ciągła przedstawia medianę grup eksperymentalnych. Obszar zacieniowany to rozstęp międzykwartylowy. (B) Pole pod krzywą LVPP (AUC) dla każdej godziny perfuzji. (C) Kurczliwość mięśnia sercowego określona na podstawie maksymalnej pochodnej impulsu ciśnienia. (D) Rozkurcz mięśnia sercowego określony na podstawie minimalnej pochodnej impulsu ciśnienia. Wszystkie dane przedstawiono jako mediana ± rozstęp międzykwartylowy. *p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

JonStężenie (mmol/L)
Na+135–145
K+<6,00
Ca+21,0–1,3
Cl–96–106

Tabela 1: Akceptowalny zakres stężenia jonów w perfuzacie.

Dyskusja

Perfuzja metodą Langendorffa jest niezwykle elastyczną techniką, która pozwala na znaczne dostosowanie i modyfikację w celu zaspokojenia szerokiego zakresu potrzeb eksperymentalnych. Takie dopasowanie jest możliwe dzięki dużej możliwości regulacji większości parametrów perfuzji, w tym ciśnień perfuzyjnych. Ze względu na retrogradny charakter perfuzji Langendorffa, ciśnienia perfuzyjne są równoważne ciśnieniom perfuzji wieńcowej, które odgrywają kluczową rolę w funkcji serca. Znane jest, że ciśnienia perfuzji wieńcowej (CPP) bezpośrednio kontrolują pracę serca, ponieważ szeroki wachlarz wskaźników kardiologicznych (np. ciśnienie w lewej komorze, kurczliwość (dP/dtmax), napięcie ściany, sztywność komory) jest bezpośrednio proporcjonalny do CPP16,17,18. Historycznie w badaniach stosowano ciśnienia perfuzyjne, a w rzeczywistości CPP, w zakresie od 60 mmHg do 80 mmHg w próbie odwzorowania warunków fizjologicznych5,8,15,19,20,21. Jednak niefizjologiczny charakter retrogradnej perfuzji maszynowej ex vivo, w połączeniu z wysokim zapotrzebowaniem na pracę, prowadzi do stopniowej utraty funkcji serca (Rycina 3). Z kolei niższe ciśnienia perfuzyjne (30-35 mmHg), mimo że nie odzwierciedlają one dokładnie warunków fizjologicznych serca szczura in vivo, wrodzenie zmniejszają zapotrzebowanie na pracę serca i pozwalają na wydłużenie czasu perfuzji (4 h) bez utraty funkcji w czasie (Rycina 3) oraz zmniejszają obrzęk przeszczepu (Rycina 2C). Stosowanie niższych ciśnień perfuzyjnych, choć oznacza odejście od fizjologicznego CPP, wydaje się zapewniać istotne korzyści w porównaniu do stosowania fizjologicznych ciśnień perfuzyjnych, ponieważ wyeliminowanie istniejącej, zależnej od techniki utraty funkcji podczas perfuzji Langendorffa przekształca tę technikę w bardziej dokładny i przewidywalny system modelowy o znacznym potencjale dla rozwoju badań nad układem sercowo-naczyniowym. W szczególności coraz ważniejsze w walce z chorobami układu krążenia (CVDs) stają się obszary badawcze, które przynoszą korzyści i/lub wymagają wydłużonego czasu perfuzji w celu osiągnięcia istotności naukowej (np. terapie lekowe, analiza odpowiedzi immunologicznej, edycja genów, normotermiczna konserwacja przeszczepów itp.).

Perfuzja Langendorffa jest bezsprzecznie niezbędnym narzędziem w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym. W związku z tym, obok istotnych korzyści, jakie ta technika naukowa przynosi społeczności badawczej, wiąże się ona ze znacznym poziomem złożoności naukowej. W efekcie w protokole tym istnieje kilka krytycznych etapów, które wymagają starnej standaryzacji, przede wszystkim w celu uniknięcia uszkodzenia przeszczepu serca przed, w trakcie i bezpośrednio po rozpoczęciu perfuzji. Pierwsza szansa na uszkodzenie przeszczepu pojawia się w sposób niepozorny podczas płukania żyły wrotnej. Płukanie to roztworem soli fizjologicznej z heparyną ma na celu usunięcie z przeszczepu serca jak największej ilości krwi pełnej i realizuje dwa cele. Po pierwsze, służy jako metoda eutanazji poprzez upuszczenie krwi. Po drugie, minimalizuje ryzyko koagulacji w obrębie przeszczepu serca podczas pobierania, kaniulacji i transportu, ponieważ krew pełna szczura charakteryzuje się niezwykle krótkim czasem krzepnięcia22,23. Jednak po setkach udanych perfuzji serca okazało się, że ciśnienie przyłożone do organizmu szczura podczas płukania ma kluczowe znaczenie, a optymalne ciśnienie płukania wynosi około 10 mmHg. Wyższe ciśnienia płukania żyły wrotnej wydają się prowadzić do uszkodzenia naczyń krwionośnych przeszczepu serca, co skutkuje zwiększonym oporem naczyniowym (Wzór na obliczenie oporu, R=Ciśnienie perfuzyjne/Przepływ perfuzyjny, równanie z fizjologii medycznej.). Wyższy opór naczyniowy w efekcie sprawia, że docelowe ciśnienia perfuzyjne są osiągane przy niższych przepływach. Ta nierównowaga między ciśnieniem a przepływem wieńcowym przekłada się na generowane ciśnienie tętna lewej komory (LVPP), co prowadzi do znacznej zmienności wyników.

Kolejnym przypadkiem możliwego uszkodzenia przeszczepu serca jest moment podłączenia przeszczepu do systemu poprzez wprowadzenie pęcherzyków powietrza do tętnic wieńcowych. Pęcherzyki powietrza mogą zostać łatwo wprowadzone w wyniku niewłaściwego obchodzenia się z kanulowanym sercem (Rysunek 1B) lub niewłaściwego usuwania pęcherzyków z systemu perfuzji przed pułapką pęcherzykową24. Ze względu na retrogradowy charakter tej konfiguracji, wprowadzenie powietrza doprowadzi do zatorowości powietrznej serca, co skutkuje uszkodzeniami niedokrwiennymi, migotaniem i, bardzo często, śmiercią przeszczepu. Ostatnim krytycznym krokiem zapewniającym powodzenie protokołu jest rozpoczęcie perfuzji. W przeciwieństwie do zdecydowanej większości publikacji opisujących wykorzystanie metody Langendorffa, rozpoczęcie perfuzji w tym protokole odbywa się przy stosunkowo niskich przepływach (1 mL/min) z przyrostami stopniowymi (+0,2 mL/min), co gwarantuje pełną kontrolę nad ciśnieniem perfuzji5,8,15,19,20,21. Ten stopniowy wzrost przepływu, a tym samym ciśnienia, jest krytyczny, ponieważ gwałtowne zmiany ciśnienia nieodwracalnie zwiększają opór naczyniowy i zaburzają delikatną równowagę między przepływem a ciśnieniem.

Wysoki opór naczyniowy w perfuzjach Langendorffa z kontrolą ciśnienia ma istotne znaczenie, ponieważ docelowe ciśnienia perfuzyjne są osiągane przy niższych przepływach, co prowadzi do niedoperfuzji przeszczepów. Duża zależność od tej idealnej równowagi między przepływem a ciśnieniem jest prawdopodobnie największym ograniczeniem tego protokołu, gdyż każde wcześniejsze uszkodzenie przeszczepu, zamierzone (np. przedłużona konserwacja w chłodzie, niedokrwienie na ciepło, zawał mięśnia sercowego itp.) lub niezamierzone, prowadzi do zwiększenia oporu naczyniowego. W praktyce protokół ten jest szczególnie przydatny w badaniach, w których eksperyment rozpoczyna się po zainicjowaniu perfuzji (np. podawanie leków, analiza odpowiedzi immunologicznej, edycja genów, normotermiczna konserwacja przeszczepów itp.), a nie przed nią. Ograniczenie to jest doskonałym przykładem na to, że jedna metoda Langendorffa nie spełnia wszystkich potrzeb i należy zwrócić szczególną uwagę na dostosowanie parametrów perfuzji, aby lepiej odpowiedzieć na wymagania eksperymentalne.

Oświadczenia

SNT posiada wnioski patentowe związane z tym badaniem i zasiada w Naukowej Radzie Doradczej Sylvatica Biotech Inc., firmy zajmującej się rozwojem technologii konserwacji narządów. Wszystkie konkurujące ze sobą interesy są zarządzane przez MGH and Partners HealthCare zgodnie z ich polityką przeciwdziałania konfliktowi interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez hojne fundusze dla S.N.T. z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (K99/R00 HL1431149; R01HL157803) oraz Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (18CDA34110049). Z wdzięcznością dziękujemy również za dofinansowanie ze strony amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia (R01DK134590; R24OD034189), National Science Foundation (EEC 1941543), Harvard Medical School Eleanor and Miles Shore Fellowship, Polsky Family Foundation, Claflin Distinguished Scholar Award w imieniu Komitetu Wykonawczego MGH ds. Badań oraz Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-0 Szyjdrobne narzędzia naukowe18020-50
14 G AngiocathBecton Dickinson381867
16 G AngiocathBecton Dickinson381957
24 mm Adaptery do komory sercaCewnik balonowy Radnoti140132
 Radnoti170423
BD  Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową - 10 mlFisher Scientific14-823-16E
BD  Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową - 1 mlFisher Scientific14-823-434
BD  Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową - 50 mlFisher Scientific14-820-11
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
Komora zgodności pułapki bąbelkowejRadnoti130149
Chlorek wapniaSigmaC7902
Uchwyt zaciskowyUnited ScienticRTCLMP1
DextranSigma31389
Przedłużacz DIN8IworxSKU  Rurki stożkowe C-DIN-EXT
FALCON High Clarity 50 mlFisher Scientific14-432-22
GSC Go Science Crazy  Żeliwny stojak na pierścień nośnyFisher ScientificS13748
Serce  KomoraRadnoti140160
Podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna ColeParmerN/A
Heparyna sodowa do wstrzykiwańMedplusG-0409-2720-0409-2721
HydrokortyzonSolu-CortefMGH Apteka
InsulinaHumulin RMGH Apteka
Inwazyjny czujnik ciśnienia krwi wypełniony płynemIworxKod produktu  System akwizycji danych BP-10x
IworxIX-RA-834
Bufor Krebs-HenseleitSigmaK3753
Balon ciśnieniowy lewej komoryRadnoti170404
Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load II do przewodów precyzyjnych, obudowa PPS, wirnik SSVWRMFLX77200-60
Masterflex L/S Standardowe cyfrowe systemy pompoweMembranowaMFLX07551-30
Radnoti130144
Penicylina-StreptomycynaRurki polietylenowe ThermoFisher Scientific15140122
Fisher Scientific14-170-12H-16
MFLX96410-16
Sigma5761
Standardowa pompa strzykawkowa PHD ULTRA CPHarvard Aparatus88-3015
Rurka transferowa TygonVWRMFLX95702-03
komora natleniająca VWR Rurka pompy precyzyjnej Plastikronian sodu VWR

Bibliografia

  1. Cardiovascular Diseases (cvds). World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds) (2021).
  2. Amini, M., Zayeri, F., Salehi, M. Trend analysis of cardiovascular disease mortality, incidence, and mortality-to-incidence ratio: Results from global burden of disease study 2017. BMC Public Health. 21 (1), 401(2021).
  3. Aune, S. E., Yeh, S. T., Zelinski, D. P., Angelos, M. G. Measurement of hydrogen peroxide and oxidant stress in a recirculating whole blood-perfused rat heart model. Resuscitation. 82 (2), 222-227 (2011).
  4. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. Int J Basic Clin Pharmacol. 4 (6), 1314-1322 (2015).
  5. Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. (101), e52908(2015).
  6. Vervoorn, M., et al. Extended normothermic ex situ heart perfusion without functional decline. J Heart Lung Transplant. 43 (4), S156(2024).
  7. Moeslund, N., et al. Ex-situ oxygenated hypothermic machine perfusion in donation after circulatory death heart transplantation following either direct procurement or in-situ normothermic regional perfusion. J Heart Lung Transplant. 42 (6), 730-740 (2023).
  8. Testai, L., Martelli, A., Cristofaro, M., Breschi, M. C., Calderone, V. Cardioprotective effects of different flavonoids against myocardial ischaemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Pharm Pharmacol. 65 (5), 750-756 (2013).
  9. Watanabe, M., Okada, T. Langendorff perfusion method as an ex vivo model to evaluate heart function in rats. Methods Mol Biol. 1816, 107-116 (2018).
  10. Chang, X., et al. Cardioprotective effects of salidroside on myocardial ischemia-reperfusion injury in coronary artery occlusion-induced rats and Langendorff-perfused rat hearts. Int J Cardiol. 215, 532-544 (2016).
  11. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212 (4), 804-814 (1967).
  12. Matsuura, H., et al. Positive inotropic effects of atp released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion. Front Cell Dev Biol. 9, 597997(2021).
  13. Louradour, J., et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex-vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 10, 1293032(2023).
  14. Ueoka, A., et al. Testosterone does not shorten action potential duration in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Heart Rhythm. 19 (11), 1864-1871 (2022).
  15. Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94 (1), 54-70 (2009).
  16. Abel, R. M., Reis, R. L. Effects of coronary blood flow and perfusion pressure on left ventricular contractility in dogs. Circ Res. 27 (6), 961-971 (1970).
  17. Arnold, G., Morgenstern, C., Lochner, W. The autoregulation of the heart work by the coronary perfusion pressure. Pflugers Arch. 321 (1), 34-55 (1970).
  18. Iwamoto, T., Bai, X. J., Downey, H. F. Coronary perfusion related changes in myocardial contractile force and systolic ventricular stiffness. Cardiovasc Res. 28 (9), 1331-1336 (1994).
  19. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: Impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 21 (3), 286-295 (2016).
  20. Headrick, J. P., Peart, J., Hack, B., Flood, A., Matherne, G. P. Functional properties and responses to ischaemia-reperfusion in Langendorff perfused mouse heart. Exp Physiol. 86 (6), 703-716 (2001).
  21. Noly, P. E., Naik, S., Tang, P., Lei, I. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. (190), e64384(2022).
  22. Garcia-Manzano, A., Gonzalez-Llaven, J., Lemini, C., Rubio-Poo, C. Standardization of rat blood clotting tests with reagents used for humans. Proc West Pharmacol Soc. 44, 153-155 (2001).
  23. Lewis, J. H., Van Thiel, D. H., Hasiba, U., Spero, J. A., Gavaler, J. Comparative hematology and coagulation: Studies on rodentia (rats). Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 82 (1), 211-215 (1985).
  24. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ci nienie perfuzyjneserce gryzoniabadania sercowo naczynioweparametry perfuzjiizolacja sercakonserwacja przeszczepupompa perystaltyczna

Powiązane artykuły