Method Article

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowe badanie nieuszkodzonych ludzkich serc odrzuconych do przeszczepu daje unikalną okazję do przeprowadzenia analiz strukturalnych w skali mikroskopowej i makroskopowej. Techniki te obejmują oczyszczanie tkanek (zmodyfikowane obrazowanie trójwymiarowe (3D) narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem) z wykorzystaniem znakowania immunologicznego) oraz barwienie immunohistochemiczne. Procedury badania mezoskopowego obejmują preparację stereoskopową i tomografię mikrokomputerową (CT). Procedury badań makroskopowych obejmują preparację ogólną, fotografię (w tym anaglify i fotogrametrię), tomografię komputerową i druk 3D fizycznie lub wirtualnie wypreparowanego lub całego serca. Przed badaniem makroskopowym można wykonać fiksację ciśnieniowo-perfuzyjną w celu zachowania architektury 3D i fizjologicznie istotnej morfologii serca. Zastosowanie tych technik w połączeniu do badania ludzkiego serca jest wyjątkowe i kluczowe dla zrozumienia związku między różnymi cechami anatomicznymi, takimi jak naczynia wieńcowe i unerwienie mięśnia sercowego w kontekście architektury 3D serca. Protokół ten szczegółowo opisuje metodologie i zawiera reprezentatywne wyniki ilustrujące postęp w badaniach anatomii ludzkiego serca.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ funkcja podąża za formą, zrozumienie architektury serca jest podstawą do docenienia jego fizjologii. Chociaż liczne badania ujawniły anatomię serca w skali od mikro do makro1,2,3, wiele pytań pozostaje nierozwiązanych, zwłaszcza tych związanych z anatomią ludzkiego serca. Dzieje się tak po części dlatego, że podstawowe badania skupiające się na anatomii funkcjonalnej zazwyczaj wykorzystywały serca zwierząt4,5,6, które często różnią się od ludzkich serc1,7,8. Co więcej, każde pojedyncze badanie, nawet te z wykorzystaniem próbek ludzkiego serca, ma tendencję do koncentrowania się na bardzo specyficznych strukturach, co utrudnia zastosowanie wyników w kontekście całego serca. Jest to tym bardziej istotne, jeśli skoncentrowane struktury znajdują się w mikro- lub mezoskalach, takich jak perinexus9 i ganglionated plexus10.

W tym kontekście, systemowe badanie strukturalne ludzkiego serca odrzuconego do przeszczepu stanowi unikalną i rzadką okazję do uzyskania kompleksowego atlasu struktur serca w skali mikroskopowej i makroskopowej11. Protokoły badań mikroskopowych obejmują oczyszczanie tkanek (zmodyfikowane obrazowanie trójwymiarowe (3D) narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, iDISCO+)12,13 oraz barwienie immunohistochemiczne. Protokoły badań mezoskopowych obejmują preparację stereoskopową, makrofotografię i tomografię mikrokomputerową (CT). Protokoły badań makroskopowych obejmują sekcję grubą14, fotografię (w tym anaglify i fotogrametrię)15,16,17, CT, wirtualna sekcja18 oraz druk 3D fizycznie lub wirtualnie wypreparowanego lub całego serca17. W ramach przygotowań do badania makroskopowego wykonuje się fiksację ciśnieniowo-perfuzyjną w celu utrzymania architektury 3D i fizjologicznie istotnej morfologii serca14,19,20,21. Połączone zastosowanie tych technik jest unikalne i kluczowe dla skorelowania różnych cech anatomicznych w kontekście architektury 3D ludzkiego serca.

Ponieważ możliwość uzyskania niepatologicznej próbki ludzkiego serca jest bardzo ograniczona, opisane tutaj podejście wieloskalowe maksymalizuje wykorzystanie próbki. Stosując różne procedury opisane poniżej, reprezentatywne wyniki zilustrują czytelnikowi, w jaki sposób wyniki mogą być wykorzystane do wielu celów, w tym do odkrycia w badaniach naukowych11 (kompleksowe analizy unerwienia serca, rozmieszczenie splotów zwojowych), poprawa procedur klinicznych (symulacja dla podejść chirurgicznych i interwencyjnych) oraz edukacja anatomiczna (prawdziwa demonstracja 3D anatomii serca).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wykorzystało pozbawione elementów identyfikujących próbki tkanek pobrane z ludzkich serc niezawodnych dawców i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA). Próbki pobrano z niewydolnych serc, które zostały odrzucone do przeszczepu. Serca poddano perfuzji ciśnieniowej, utrwalono w 4% paraformaldehydzie (PFA) i zobrazowano przed przetworzeniem tkanek zgodnie z następującymi metodami. Rysunek 1 podsumowuje schemat blokowy kolejności badania. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Badanie w mikroskali

  1. Oczyszczanie tkanek przy użyciu zmodyfikowanego protokołu obrazowania 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem z obsługą znakowania immunologicznego (iDISCO+).
    1. Wypreparuj 4% tkankę utrwaloną PFA za pomocą skalpela, aby zmieściła się w komorze 3 mm × 16 mm × 25 mm do mikroskopii konfokalnej. Aby zobrazować grubsze tkanki, na szkiełku można umieścić dodatkowe komory i/lub przekładki.
    2. Próbki odwadniać za pomocą serii stopniowanego metanolu (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% i 100% MeOH w dejonizowanymH2O[obj./ob.]) przez 1 godzinę każda w temperaturze pokojowej (RT) z mieszaniem.
    3. Myć 100% MeOH przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zanurzyć w 66% dichlorometanie/33% MeOH w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez noc.
    4. Następnego dnia umyć dwukrotnie w MeOH (100%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, schłodzić w temperaturze 4 °C i potraktować 5% H2O2 w MeOH (obj. / obj.) przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Ponownie hydratem za pomocą stopniowanych serii MeOH (80%, 60%, 40% i 20% MeOH) i myć w 0,01 mol/l PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    6. Chusteczki myć dwukrotnie w 0,01 mol/L PBS z 0,2% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Przygotuj się do znakowania immunologicznego przez przenikanie w 0,01 mol/l PBS, 20% dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,2% Triton X-100 i 0,3 mol/l glicyny przez 2 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    8. Blokować 0,01 mol/l PBS z 10% DMSO, 0,2% Triton X-100 i 5% normalną surowicą osła przez kolejne 2 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    9. Oznaczyć pierwszorzędowym przeciwciałem zgodnym z MeOH sprzężonym z fluoroforami rozcieńczonymi w 0,01 mol/l PBS z 10 mg/ml heparyny (PTwH), 0,2% Tween-20, 5% DMSO i 3% normalną surowicą osła przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    10. Uzupełnić roztwór przeciwciał i inkubować przez kolejne 3-4 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    11. Po 1-tygodniowej inkubacji w roztworze przeciwciała pierwotnego przemyć 4 do 5 razy w PTwH przez noc w temperaturze pokojowej.
    12. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforami rozcieńczonymi w PTwH, 3% normalnej surowicy osła przez 3 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    13. Uzupełnić roztwór przeciwciała drugorzędowego, inkubować przez kolejne 3 dni w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    14. Po 6-dniowej inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych przemyć PTwH 4-5 razy przez noc w temperaturze pokojowej.
    15. Odwodnić za pomocą stopniowanej serii MeOH (20%, 40%, 60%, 80%, 100% i 100% MeOH). Próbka może być przechowywana przez noc w temperaturze pokojowej.
    16. Inkubować w 66% dichlorometanie/33% MeOH przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    17. Płukać dwukrotnie w 100% dichlorometanie przez 15 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    18. Inkubować i przechowywać próbki w eterze benzylowym. Napełnij rurkę, aby zminimalizować utlenianie próbki przez powietrze.
  2. Obrazowanie próbki oczyszczonej z tkanek
    1. Przymocuj komorę zawierającą klej do szkiełka i nałóż lakier do paznokci na obwodzie komory. W przypadku grubszych tkanek na szkiełku można umieścić dodatkowe komory i/lub przekładki.
    2. Umieść oczyszczoną tkankę w komorze, napełnij eterem benzylowym i nałóż szkiełko nakrywkowe.
    3. Nałóż lakier do paznokci wokół szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać uszczelnienie.
    4. Uzyskuj obrazy kafelków i stosów Z za pomocą pionowego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z soczewką 5x lub 10x, aby obrazować na głębokości do odległości roboczej soczewki.
    5. Obraz w rozdzielczości 1024 x 1024 z wykorzystaniem linii laserowych odpowiednich dla widm emisyjnych użytych fluoroforów. Autofluorescencja mięśni jest widoczna przy użyciu linii laserowej o długości fali 488 nm.
    6. Upewnij się, że rozmiar kroku osi z jest proporcjonalny do próbkowania Nyquist na podstawie apertury numerycznej określonego objective11.
    7. Łącz obrazy i korzystaj z oprogramowania do wizualizacji 3D.
    8. Twórz figury, korzystając z obrazów projekcji maksymalnej intensywności (MIP) stosów Z dla pojedynczych i połączonych kanałów (Rysunek 2).
  3. Immunohistochemia
    UWAGA: Po zatopieniu tkanki w parafinie22, następująca procedura jest stosowana do tworzenia preparatów do badania immunohistochemicznego.
    1. Przygotowanie roztworu do dopasowania współczynnika załamania światła (RIMS).
      1. Przygotować bufor fosforanowy o stężeniu 0,1 mol/l, dodając 10,9 gNa2HPO4 (bezwodnego) i 3,1 g NaH2PO4 (monohydrat) do dejonizowanegoH2O do całkowitej objętości 1 l (pH 7.4). Przefiltrować-wysterylizować roztwór i przechowywać go w temperaturze pokojowej.
      2. Rozcieńczyć bufor fosforanowy do 0,02 mol/l.
      3. Rozpuścić Histodenz w 30 ml buforu fosforanowego o stężeniu 0,02 mol/l, mieszając roztwór przez 10 minut za pomocą mieszadła magnetycznego w końcowej butelce do przechowywania, która może być szczelnie zamknięta w celu zminimalizowania parowania i zanieczyszczenia.
      4. Dodać azydek sodu do całkowitego stężenia 0,01% (w/v) i dostosować pH do 7,5 za pomocą NaOH.
      5. Dostosuj RI poprzez zmianę końcowego stężenia Histodenz.
      6. Przechowuj RIMS w RT przez miesiące. Wyrzucić w przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
        UWAGA: NIE sterylizować w autoklawie żadnych roztworów zawierających azydek sodu.
    2. Przygotowanie preparatów do badania immunohistochemicznego
      1. Twórz skrawki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Nałóż przekrój tkanki na naładowane szkiełka.
      2. Usunąć parafinę, inkubując szkiełka w >75% ksylenie przez 10 minut. Przenieś szkiełka do drugiego pojemnika z ksylenem na dodatkowe 10 minut.
      3. Usunąć ksylen, zanurzając szkiełka w 100% EtOH na 10 min, następnie w 95% EtOH na 5 min i 70% EtOH na 5 min.
      4. Płukać szkiełka dejonizowanymH2Oprzez 5 minut.
      5. Zanurz szkiełka w buforze do pobierania antygenu na 25 minut w temperaturze 90-95°C.
      6. Pozostawić pojemnik do ostygnięcia do temperatury suchej temperatury przez 1 godzinę z mieszaniem.
      7. Zanurzyć szkiełka w buforze do namaczania (0,01 mol/L PBS + 0,4% Triton X-100) na 30 minut w temperaturze 4°C.
      8. Owiń tkankę za pomocą wstrzykiwacza PAP. Dodaj PBS do każdego szkiełka i umieść go w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu.
      9. Myć szkiełka preparatem PBS w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 5 min.
      10. Blok z buforem blokującym (0,01 mol/L PBS + 10% Donkey Serum + 0,1% TX-100) przez 1 h z mieszaniem.
      11. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4°C.
      12. Następnego dnia pozwól szkiełkom rozgrzać się do temperatury RT przez 15 minut.
      13. Umyć szkiełka 3 razy 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 przez 5 minut.
      14. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
      15. Umyć szkiełka 3 razy 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 przez 5 minut.
      16. Umyć szkiełka 3 razy roztworem PBS o stężeniu 0,01 mol/l przez 5 minut.
      17. Umieść 1 kroplę RIMS za pomocą zakraplacza i nałóż szkiełko nakrywkowe.
      18. Nałóż lakier do paznokci wokół szkiełka nakrywkowego, aby stworzyć uszczelnienie.
      19. Jako kontrolę ujemną należy przeprowadzić próbkę bez przeciwciała pierwszorzędowego, aby wykazać brak specyficznego barwienia.
    3. Obrazowanie preparatów barwionych immunologicznie
      1. Zobrazuj szkiełka za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z soczewkami obiektywowymi 10x, 20x i 40x.
      2. Obraz w rozdzielczości 1024 x 1024 z wykorzystaniem linii laserowych odpowiednich dla widm emisyjnych zastosowanych przeciwciał drugorzędowych.
      3. Twórz figury, korzystając z obrazów projekcji maksymalnej intensywności (MIP) stosów Z dla pojedynczych i połączonych kanałów (Rysunek 3).

2. Badanie w skali mezologicznej

  1. Stereoskopowa sekcja
    1. Wykonaj delikatne sekcje, koncentrując się na małych lub cienkich strukturach, takich jak węzeł przedsionkowo-komorowy, tętnica węzła przedsionkowo-komorowego i splot nerwu sercowego (w skali submilimetrowej do milimetrowej) za pomocą powiększającej lampy biurkowej z zaciskiem, teleskopów chirurgicznych lub mikroskopu stereoskopowego.
  2. Mikrotomografia komputerowa
    UWAGA: Obrazowanie CT wykonuje się po perfuzji ciśnieniowej i stabilizacji oraz na dowolnym etapie sekcji za pomocą mikropozytonowej tomografii emisyjnej (PET)/tomografu komputerowego (Ryc. 4).
    1. Rozgrzej źródło promieniowania rentgenowskiego CT przez 25 minut przed obrazowaniem próbki.
    2. Umieść próbkę serca na łóżku skanera.
    3. Przesuń łoże skanera do pozycji poziomej 544 mm i pionowej 14 mm, aby wyśrodkować serce w polu widzenia CT (FOV).
    4. Uzyskanie obrazu CT przy 80 kVp, 150 μA, z 720 projekcjami podczas 1 minuty skanowania w rozdzielczości przestrzennej 200 μm.
    5. Zrekonstruuj dane CT z polem widzenia 12 cm x 12 cm x 10 cm i matrycą wokseli 600 x 600 x 500 i zapisz jako plik DICOM.

3. Badanie w skali makro

  1. Perfuzja ciśnieniowa i utrwalanie
    UWAGA: Autorzy modyfikują wcześniej opisane techniki perfuzji ciśnieniowej i stabilizacji ciśnienia i stosują je do niezawodnych ludzkich serc odrzuconych do przeszczepu14,19,20,21.
    1. Do utrwalania perfuzyjnego należy używać pomp o wysokim przepływie. Użyj 100% etanolu14, 4% PFA lub 10% formaliny jako utrwalacza.
      UWAGA: Serce jest odzyskiwane z aortą wstępującą, tułowiem płucnym i obiema żyłami głównymi, a żyły płucne są wycięte tak dystalnie, jak to możliwe i dostarczane w University of Wisconsin solution23.
    2. Użyj dwóch kaniul chirurgicznych 20-24 Fr do perfuzji prawego i lewego serca. W przypadku perfuzji prawego serca należy kanulować żyłę główną górną i umieścić otwór wentylacyjny w pniu płucnym lub tętnicy płucnej za pomocą przeciętych na pół plastikowych strzykawek o pojemności 12-30 ml z końcówkami Luer-Lock przymocowanymi do trójdrożnych kurków.
    3. Niedrożność żyły głównej dolnej i drugiej tętnicy płucnej należy zatkać sznurkiem po włożeniu odpowiedniej wielkości zamkniętej, przeciętej na pół plastikowej strzykawki lub probówki wirówkowej o pojemności 1,5-5,0 ml.
      1. W celu perfuzji skierowanej do przodu lewego serca należy kanulować jedną z żył płucnych i umieścić otwór wentylacyjny na dystalnym końcu aorty za pomocą przeciętych na pół plastikowych strzykawek o pojemności 12-30 ml z końcówkami Luer-Lock przymocowanymi do trójdrożnych kurków.
      2. Aby uzyskać wsteczną perfuzję lewego serca, należy kanulować jedną z gałęzi łuku aorty i umieścić otwór wentylacyjny w innej gałęzi łuku aorty. Umieść końcówki kaniul w obu komorach.
    4. Za pomocą sznurka należy zatkać inne otwory naczyń po włożeniu odpowiedniej wielkości zablokowanej na pół plastikowej strzykawki lub probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5-5,0 ml. Użyj cienkiej gazy, aby przykryć część wprowadzającą strzykawki/rurki/kaniule, aby zapobiec wyciekom i ślizganiu się. Napraw duże nieszczelności za pomocą szwów, opaski lub zbrylania. Dopuszczalne są małe wycieki.
    5. Zawieś serce w plastikowym pojemniku.
    6. Podłącz rurkę z miękkiego tworzywa sztucznego 22-24 Fr do każdej kaniuli i włóż drugi koniec rurki do pojemnika wypełnionego utrwalaczem.
    7. Krążyć utrwalacz przez obwody prawego i lewego serca za pomocą pompy o wysokim przepływie ustawionej na około 100-300 ml/min dla prawego serca i 200-400 ml/min dla lewego serca, aby osiągnąć odpowiednio około 20 mmHg w prawej komorze i 80 mmHg w lewej komorze.
    8. Utrzymywać perfuzję w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    9. Umyć serce roztworem PBS o stężeniu 0,01 mol/l przez 30 minut z czterokrotnym mieszaniem.
    10. Przechowywać serce w 0,01 mol/l PBS/0,02% azydku sodu w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Utrwalanie ciśnienie-perfuzja jest skuteczne tylko w przypadku świeżego serca, a nie w przypadku serca odzyskanego z zabalsamowanego ciała.
  2. Gruba sekcja
    1. Wykonaj sekcję progresywną z nagraniami fotograficznymi na każdym etapie sekcji.
    2. Aby zachować znaczenie kliniczne, należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć zniekształcenia/deformacji jakichkolwiek struktur w celu utrzymania fizjologicznej morfologii serca.
    3. Obrazuj struktury docelowe przy użyciu klinicznie istotnej orientacji, takiej jak prawa przednia orientacja skośna.
  3. fotografia
    1. Umieść perfuzję ciśnieniową i nieruchome serce na statywie z platformą zamontowaną za pomocą wielu zębów i możliwością obrotu o 360stopni.
    2. Sfotografuj serce za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej (Rysunek 5)24, korzystając z wielu paneli świetlnych z diodami elektroluminescencyjnymi ustawionych na C-Stand i szerokiej czarnej tkaniny tła duvetyn.
    3. Fotografuj za pomocą obiektywu o długiej ogniskowej (200 mm) w odległości roboczej 4-6 stóp, aby zminimalizować zniekształcenia obiektu14.
  4. Anaglify
    1. Aby wyświetlić obrazy anaglificzne, zrekonstruuj parę zdjęć lub obrazów renderowanych objętościowo z zestawów danych CT z różnicą 10° kąta obrotu w płaszczyźnie poziomej.
    2. Przekonwertuj zestaw tych dwuwymiarowych (2D) obrazów, określanych jako stereogram, na anaglify za pomocą freeware16.
    3. Aby wyświetlić anaglif użyj czerwonych/błękitnych okularów.
  5. Fotogrametria
    UWAGA: Fotogrametria to nauka stosowana polegająca na generowaniu trójwymiarowej rekonstrukcji powierzchni renderowanej z wielu dwuwymiarowych zdjęć wykonanych pod różnymi kątami17.
    1. Zawieś próbkę na stojakach C lub umieść ją na stole obrotowym, aby uzyskać setki wielokierunkowych zdjęć za pomocą smartfona.
    2. Wygeneruj model 3D w formacie FBX za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.
  6. Tomografia komputerowa
    UWAGA: Tomografia komputerowa może być wykonywana po perfuzji ciśnieniowej i stabilizacji oraz na każdym etapie rozwarstwienia.
    1. Zawiesić próbkę serca na prętach umieszczonych w poprzek górnej części pojemnika. Aby zapobiec kołysaniu się serca podczas skanowania, podeprzyj podstawę serca plastikowymi zębami zamocowanymi na dnie pojemnika. W ten sposób powietrze będzie służyć jako negatywny kontrast.
    2. Tomografię komputerową należy wykonać za pomocą dostępnego na rynku wielodetektorowego tomografu komputerowego o następujących parametrach: napięcie lampy 120 kV, prąd lampy 800-900 mA i obrót suwnicy 280 ms. Produkt długości dawki wynosi zwykle 500-1200 mGy.cm.
    3. Zrekonstruuj dane obrazu osiowego, korzystając z następujących parametrów: grubość przekroju 0,6 mm, interwał przyrostowy 0,3 mm, jak najmniejsze pole widzenia (zwykle 100-200 mm) i matryca 512 × 512.
  7. Wirtualna sekcja zwłok
    1. Analizuj obrazy tomografii komputerowej za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do generowania wirtualnych obrazów sekcyjnych.
      UWAGA: Wirtualna sekcja jest modyfikacją procesu renderowania objętości, w którym punkt ciężkości jest przenoszony na ściany komór i naczyń sercowych18. W tym procesie ręczne progowanie praktycznie usuwa rozszerzoną komorę z oryginalnych zestawów danych.
    2. Wizualizuj niewzmocnione ściany, przegrody i zawory za pomocą wirtualnej sekcji, aby uzyskać obrazy podobne do grubej sekcji. W przeciwieństwie do grubej sekcji próbek serca, płaszczyzny cięcia podczas wirtualnej sekcji są praktycznie nieograniczone. Prawie każdy widok można odtworzyć, aby w razie potrzeby zwizualizować interesujące struktury.
  8. Druk 3D
    1. Otwórz kompatybilny plik próbki serca w oprogramowaniu drukarki 3D.
    2. Użyj profilu 0,10 mm Fast DETAIL dla ustawień druku w drukarce 3D i zmniejsz prędkość drukowania do 20 mm/s. Włącz opcję Generuj materiał podporowy.
    3. Użyj profilu filamentu TPU dla "Ustawień filamentu" w drukarce 3D.
    4. Użyj profilu dyszy Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 do "Ustawień drukarki" w drukarce.
    5. Po zakończeniu krojenia zapisz plik BGCODE na dysku flash USB w celu wydrukowania 3D.
    6. Użyj filamentu TPU o średnicy 1,75 mm do drukowania 3D próbki ludzkiego serca. Przed drukiem 3D należy wysuszyć filament TPU przez 6 godzin za pomocą suszarki do filamentów.
    7. Aby zmniejszyć naprężenie filamentu podczas drukowania 3D, umieść szpulę filamentu na uchwycie szpuli z wbudowanym łożyskiem, aby ułatwić obracanie szpuli filamentu. Wykonuj druk 3D za pomocą dostępnej na rynku drukarki 3D z teksturowaną blachą stalową malowaną proszkowo.
    8. Ostrożnie usuń materiały podporowe po zakończeniu drukowania 3D.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w mikroskali
Zastosowanie oczyszczania tkanek umożliwia obrazowanie większych objętości tkanek w 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej. W sercu można uwidocznić zwoje zawierające neurony sercowe i neuronalny wzór unerwienia mięśnia sercowego (Ryc. 2). Rysunek 3 pokazuje konfokalny obraz mięśnia sercowego ludzkiej lewej komory immunologicznie wybarwionej pod kątem komórek nerwów i mięśni gładkich. Zauważono, że naczynia krwionośne przechodzą przez mięsień sercowy i identyfikowane są liczne włókna nerwowe, zarówno w połączeniu z naczyniami krwionośnymi, jak i niezależnie od nich.

Badania w skali mezo- i makro<br /> W przypadku stosowania absolutnego etanolu do 24-godzinnej perfuzji ciśnieniowej i utrwalania, naturalny kolor próbki jest wybielany, tkanka jest odwodniona25, a elastyczność jest znacznie zmniejszona. Z drugiej strony, po utrwaleniu za pomocą PFA i formaliny, naturalny kolor i elastyczność są niezwykle zachowane. Z tych powodów PFA lub formalina są głównie używane jako preferowany utrwalacz.

Rysunek 6 pokazuje reprezentatywne obrazy grubej sekcji, wirtualnej sekcji, modelu wielokąta STL i drukowania trójwymiarowego. Rysunek 7 pokazuje reprezentatywne obrazy anaglifów utworzone zarówno z ogólnych, jak i wirtualnych obrazów sekcji. Percepcję głębi można uzyskać za pomocą okularów anaglificznych. Pojedynczy model fotogrametryczny może być obserwowany z prawie wszystkich kierunków za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania i demonstruje złożone cechy anatomiczne istotne dla rutynowych przezcewnikowych zabiegów serca. Dzięki zastosowaniu tych technik do serca przygotowanego za pomocą perfuzji ciśnieniowej i fiksacji, trójwymiarowe informacje o sercu mogą być prawie wiecznie zachowane cyfrowo lub fizycznie i udostępniane bez ograniczeń. Rysunek 8 pokazuje wydruki 3D w 50% skali replikowane z wypreparowanych serc odrzuconych do przeszczepu.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Oczyszczony z tkanek fragment przedsionka prawego człowieka. (A) Prawy tylny skośny widok prawego przedsionka człowieka z wypreparowanym splotem zwojowym prawego przedsionka (RAGP) w celu oczyszczenia tkanki. (B) Próbka RAGP przed i po usunięciu tkanek. (C) Projekcja maksymalnej intensywności oczyszczonej przez iDISCO+ części ludzkiego RAGP wykazującej zwoje (groty strzałek) barwione immunologicznie produktem genu białka markera panneuronalnego 9,5 (PGP9,5). Podziałki mają 1 cm (A), 5 mm (B) i 500 μm (C). Ten rysunek jest zaadaptowany z Hanna et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Preparaty immunologiczne lewej komory człowieka. Obraz konfokalny z wycinka mięśnia sercowego lewej komory człowieka wybarwionego immunologicznie genem markera panneuronalnego produktu genu 9,5 (PGP9,5) i markerem komórek mięśni gładkich α-aktyną mięśni gładkich (αSMA). Autofluorescencja mięśni jest widoczna za pomocą linii lasera o długości fali 488 nm (kolor zielony). Podziałka wynosi 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mikrokomputerowe obrazowanie tomograficzne próbek serca. (A) Mikrotomografia komputerowa do obrazowania próbek serca. (B) Interfejs użytkownika do obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ustawienie studia fotograficznego w Centrum Zaburzeń Rytmu Serca UCLA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Gruba sekcja (u góry po lewej), wirtualna sekcja (u góry po prawej), model wielokąta STL (na dole po lewej) i trójwymiarowe wydruki (na dole po prawej) obrazy kompleksu zastawkowego aorty i mitralu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Anaglify dużego rozwarstwienia (po lewej) i wirtualnego rozwarstwienia (po prawej) kompleksu zastawek aorty i mitralnej. Okulary anaglificzne (czerwone/cyjan) są niezbędne do uzyskania percepcji głębi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Trójwymiarowe drukowanie próbek serca. (A) Trójwymiarowa drukarka (3D) do drukowania 3D próbek serca z filamentem TPU. (B) Reprezentatywne odciski 3D serca wykonane przy użyciu metod opisanych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia kompleksową linię produkcyjną do analizy próbek uzyskanych z całych ludzkich serc. Reprezentatywne wyniki wskazują na badania anatomiczne w skali mikro i makro przeprowadzane rutynowo dla pojedynczego serca. Ponieważ próbka ludzkiego serca jest niezwykle cenna, podejście wieloskalowe jest idealne i skuteczne, aby nie marnować żadnych części próbki poprzez stosowanie wielu protokołów do różnych celów, w tym odkryć w badaniach naukowych, poprawy procedur klinicznych i edukacji anatomicznej z zachowaniem korelacji anatomicznej w kontekście całego serca.

Jeśli chodzi o badania w mikroskali, barwienie immunologiczne i mikroskopia mogą być stosowane w celu zrozumienia cytoarchitektury próbek ludzkiego serca. W tym miejscu wykazano zastosowanie oczyszczania tkanek i immunohistochemii do badania neuroanatomii serca w skali komórkowej. Zastosowanie tych technik jest pomocne w charakterystyce układu nerwowego serca i wzorców unerwienia mięśnia sercowego w odniesieniu do interesujących struktur, takich jak układ przewodzenia serca i komory serca. Chociaż uzyskuje się doskonałą rozdzielczość przestrzenną, stosowanie mikroskopii konfokalnej, szczególnie w przypadku próbek oczyszczonych z tkanek, jest czasochłonne. Mikroskopia Lightsheet może być stosowana w celu skrócenia czasu akwizycji obrazu kosztem rozdzielczości przestrzennej.

Jeśli chodzi o badania w skali mezo- i makro, rozdzielczość przestrzenna mikrotomografów komputerowych w instytucji autorów waha się od 10 do 200 μm. Wielkość próbki jest ograniczona do 20 mm w przypadku skanowania 10 μm i 120 mm w przypadku skanowania 100-200 μm. Mikrotomografy komputerowe w instytucji autorów nie są w stanie pomieścić całego serca. Tak więc w instytucji autorów skan całego serca wymaga użycia klinicznego tomografu komputerowego o rozdzielczości przestrzennej 600 μm, chociaż postępy pozwoliły na opracowanie mikrotomografów komputerowych, które mogą obrazować całe serce2. Rozwój technologiczny, taki jak tomografia komputerowa zliczająca fotony, z pewnością poszerzy dalsze możliwości. Poprawa rozdzielczości przestrzennej pliku STL powinna być pierwszym krokiem do dalszej poprawy jakości druku 3D. Wyższy koszt druku 3D ogranicza zastosowanie tej techniki do rutynowej praktyki klinicznej. Obrazy fotogrametryczne generowane za pomocą dowolnej aplikacji na smartfony są łatwe do wywołania i mają akceptowalną jakość, ale będą wymagały dalszych zaawansowanych, ale kosztownych i czasochłonnych systemów w celu poprawy rozdzielczości26. Do wizualizacji w 3D, rozszerzona rzeczywistość z dedykowanym nakryciem głowy27,28 i monitorami holograficznymi29 są dodatkowymi narzędziami, ale są również ograniczone wyższymi kosztami.

Podsumowując, dzięki kompleksowym analizom strukturalnym w skalach mikroskopowych i makroskopowych, anatomia każdej struktury w mikroskali i jej wkład funkcjonalny mogą być zrozumiane w kontekście całego serca. Wraz z rozwojem obrazowania w wysokiej rozdzielczości dramatycznie zwiększa się odległość między anatomią w mikro i makroskali. Eksperci w dziedzinie analizy kardiomiocytów pod mikroskopem elektronowym mogą nie być zaznajomieni z liczbą płatków mitralnych i odwrotnie. Aby ułatwić kompleksowe zrozumienie morfologii serca, naukowcy muszą nadal badać dalsze szczegóły każdego drzewa, zachowując jednocześnie widok z lotu ptaka na cały las.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy osobom, które ofiarowały swoje ciała na rzecz rozwoju edukacji i badań. Jesteśmy wdzięczni Fundacji OneLegacy, która stała się podstawą do pozyskania serc dawców na potrzeby badań. Jesteśmy również wdzięczni Anthony'emu A. Smithsonowi i Arvinowi Roque-Verdeflorowi z UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) za ich wsparcie w pozyskiwaniu danych z tomografii komputerowej. Projekt ten był wspierany przez UCLA Amara Yad Project. Jesteśmy wdzięczni doktorom Kalyanamowi Shivkumarowi i Olujimi A. Ajijola za stworzenie i utrzymanie linii badawczej ludzkiego serca. Jesteśmy wdzięczni naszej Kierowniczce ds. Badań, Amiksha S. Gandhi, za jej zaangażowanie we wspieranie naszych projektów. Praca ta była możliwa dzięki wsparciu z grantów NIH OT2OD023848 & P01 HL164311 oraz grantu Leducq 23CVD04 dla Kalyanam Shivkumar, American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 dla PH oraz UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). Skaner GNEXT microPET/CT użyty w tym badaniu został sfinansowany z grantu NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP3813
Przeglądarka 3DMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
Obiektyw AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-EDNikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 przeciwciałoSigma-AldrichC6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8,0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (produkt genu białka 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (ylaza hydrox tyrozyny)Abcamab1542
Anti-VAChT (pęcherzykowy transporter acetylocholiny)Systemy synaptyczne139 103
Eter benzylowySigma-Aldrich108014
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503-10G
Filament do drukarki 3D Gepard (95A), 1,75 mmSzkiełko
, 22 mm x 30mm, nr 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DichlorometanSigma-Aldrich270997-100ML
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418-500ML
Etanol, 100%Decon laboratories2701
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Roztwór nadtlenkuwodoru Sigma-AldrichH1009-500ML
Oprogramowanie do obrazowaniaZeissZEN (black edition)
Oprogramowanie do obrazowaniaOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
Silnik KIRIKIRI Innovation
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM 880
LEAD-2 - pionowy i Wielokanałowa pompa perystaltycznaLONGER
Lightview XL Metanol Brightech
(certyfikowany ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Oryginalna drukarka 3D Prusa MK4Prusa Research
Długopis PAPAbcamab2601
Paraformaldehyd, 32%Mikroskopia elektronowa Nauki15714-S
Polycam Polycam
Przeciwciało
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Przeciwciało
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Azydek sodu, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, Projekty dla wizyjnego
systemu stereomikroskopu SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerDarmowe oprogramowanie opracowane przez Masuji Suto
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe, wstępnie oczyszczoneFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
KsylenSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN
nakrywkowe NinjaTekpierwotnewtórne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles