Ten artykuł zawiera szczegółowy opis testu zakopanego jedzenia i eksperymentu z dyskryminacją zapachów społecznych, aby ocenić wpływ narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na funkcje węchowe u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Upośledzenie węchu jest poważnym problemem zdrowia publicznego i niezależnie przewiduje ryzyko chorób neurodegeneracyjnych. Narażenie na wdychane zanieczyszczenia środowiska może upośledzać wydzielanie węchu; W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania metod oceny wpływu narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na węch. Myszy są idealnymi modelami do eksperymentów węchowych ze względu na ich wysoko rozwinięty układ węchowy i cechy behawioralne. Aby ocenić wpływ narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na funkcję węchową u myszy, przedstawiono szczegółowy test zakopanej żywności i eksperyment z dyskryminacją zapachów społecznych, w tym przygotowanie eksperymentu, wybór i budowę obiektów eksperymentalnych, proces testowania i wskaźniki czasu. W międzyczasie omawiany jest sprzęt do pomiaru czasu, szczegóły operacyjne i środowisko eksperymentalne, aby zapewnić sukces testu. Siarczan jest stosowany jako zabieg w celu wykazania wykonalności podejścia eksperymentalnego. Protokół zapewnia prosty i przejrzysty proces operacyjny oceny wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe u myszy.
Wprowadzenie
Upośledzenie węchu stało się godnym uwagi problemem zdrowia publicznego i niezależnie wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób neurodegeneracyjnych. Stan ten może niekorzystnie wpływać na ogólne samopoczucie, przyczyniać się do rozwoju objawów depresyjnych i skutkować obniżeniem jakości życia. Jego wpływ jest wyraźnie widoczny w zmienionym postrzeganiu jedzenia, utrudnieniach w komunikacji społecznej i zwiększonych negatywnych uczuciach1. Różne czynniki, w tym choroba zatok przynosowych, infekcja górnych dróg oddechowych i urazowe uszkodzenie mózgu, zostały uznane za czynniki przyczyniające się do upośledzenia węchu u ludzi2. Warto zauważyć, że wdychalne zanieczyszczenia środowiska, takie jak PM2,5, których zakres szacuje się na od 2% do 16%, dostają się do organizmu przez wdychane powietrze, przechodzą przez jamę nosową i docierają do określonych regionów dedykowanych węchowi, w których się osadzają3,4,5,6,7. Ostatnie odkrycia wskazują, że wdychalne zanieczyszczenia środowiska, w tym PM2,5 i amoniak, mogą rzeczywiście uszkadzać węchowe neurony czuciowe8,9,10. Konieczna jest jednak dalsza walidacja, aby ustalić, czy takie uszkodzenie bezpośrednio prowadzi do dysfunkcji węchu. W związku z tym szczególnie ważna jest skrupulatna ocena wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe.
Obecnie, liczne laboratoria badawcze wykorzystują myszy jako alternatywny model kręgowców do eksperymentów behawioralnych mających na celu zrozumienie zmian w funkcji węchu11,12,13,14. Myszy zostały wybrane jako preferowany system modelowy do badania komunikacji chemicznej kręgowców i wykazują niezwykłą wrażliwość węchową, kluczową dla poszukiwania pożywienia i komunikacji społecznej15. Co więcej, stale rozwijający się wachlarz narzędzi do obserwacji i wpływania na zachowanie myszy sprawił, że gatunek ten jest wyjątkowo atrakcyjny do badań nad funkcjami węchu16.
W tym badaniu wykorzystaliśmy test zakopanego jedzenia i eksperyment z dyskryminacją zapachową, aby ocenić upośledzenie węchu w modelu mysim narażonym na wdychanie zanieczyszczeń środowiska. Aby zwiększyć precyzję oceny, zdecydowaliśmy się na najbardziej reprezentatywną metodę oceny funkcji węchu. Systematycznie udoskonalaliśmy tę metodę, aby zapewnić prostotę i przejrzystość, co pozwoliło nam skutecznie ocenić zakres dysfunkcji węchowych wywołanych przez wdychalne zanieczyszczenia środowiska.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użyliśmy samców myszy C57BL/6J (wiek: 6-8 tygodni; waga: 20-22 g) do wszystkich testów behawioralnych. Myszy poddano stałym warunkom (tj. temperatura, 23 ± 1 °C; wilgotność, 55% ± 5% i 12/12 godzinny cykl jasno-ciemny z włączonym światłem o 7:00). Wszystkie testy behawioralne zostały przeprowadzone w godzinach 10:00 – 17:00. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Profesjonalnej Komisji Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Qingdao. Po 1-tygodniowym okresie aklimatyzacji wszystkie myszy były narażone na wdychalne zanieczyszczenia środowiska.
1. Narażenie na zanieczyszczenia
- Podawanie donosowe przez wkroplenie
- Wdychalne zanieczyszczenia środowiska rozpuścić w 0,9% roztworze soli. Użyj jednorazowo 5% roztworu siarczanu, który, jak wykazano, powoduje dysfunkcję węchu17. W przypadku myszy kontrolnych podawać 0,9% normalnego roztworu soli fizjologicznej.
- Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1% pentobarbitalu sodu (57 mg/kg)18 i ocenić głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu. Ustaw mysz na plecach na pochyłej powierzchni, z głową skierowaną w dół.
- Za pomocą pistoletu do pipetowania podać 10 μl roztworu do jednego nozdrza myszy. Zawieś końcówkę pipety nad noskiem myszy, tak aby płyn kapał na nos, umożliwiając myszy naturalne wdychanie roztworu do jamy nosowej.
- Aby zapewnić dobre samopoczucie myszy i zapobiec potencjalnemu dyskomfortowi, powtórz inhalację dla drugiego nozdrza po 10 minutach przerwy.
- Po 3 dniach od podania donosowego przez wkroplenie myszom należy wykonać test zakopanego pokarmu.
2. Test zakopanego jedzenia
- Przeprowadzić deprywację pokarmu na 18-24 godziny przed badaniem, usuwając wszystkie granulki karmy z pojemnika na żywność w klatce domowej. Zmień materiały ściółkowe dla myszy. Nie wyjmuj butelki z wodą.
- Ułóż stół operacyjny zgodnie z poniższym opisem.
- Na 1 godzinę przed rozpoczęciem badania należy zabrać klatkę z myszami na salę operacyjną w celu odpoczynku.
- Zorganizuj salę operacyjną w tym okresie. Używaj i oznaczaj przezroczyste standardowe klatki na myszy z PVC jako A, ponieważ tworzą one znajome środowisko. Użyj i oznacz klatkę testową jako B, która jest przezroczystą standardową klatką dla wiewiórek z PVC. Oznacz wspólną klatkę używaną do umieszczania myszy po eksperymencie jako klatkę C.
- Przykryj klatki A i B 3 cm materiału ściółkowego i zmierz je linijką. Ułóż klatki obok siebie, zachowując odległość 0,5 m między każdą klatką (Rysunek 1).
- Zdefiniuj obszar doświadczalny jako obszar o promieniu 2 m, przy czym środek jest środkiem klatek. Określ obszar poza zakresem 2 m jako obszar obserwacji.
- Trzymaj klatkę C i klatki zawierające niebadane myszy jak najdalej od obszaru doświadczalnego.
- Zapisz czas potrzebny na znalezienie pożywienia zgodnie z poniższym opisem.
- Wybierz losowo pozycję w klatce B, zakop jedzenie 1 cm pod powierzchnią ściółki i wygładź powierzchnię ściółki.
- Umieść mysz w klatce A na 4 minuty. Przenieś myszy do klatki B po zakończeniu odmierzania czasu, włącz urządzenie wideo i wróć do obszaru obserwacji.
- Gdy mysz podniesie blok jedzenia przednią łapą, zatrzymaj nagrywanie wideo. W niektórych przypadkach można zobaczyć myszy jedzące z głowami pochylonymi nad jedzeniem. Takie zachowanie wskazuje również na powodzenie próby, nawet jeśli mysz nie trzyma jedzenia przednią łapą.
- Rejestruj dane. Zapisz czas od kontaktu z matą na dnie klatki B do momentu znalezienia pożywienia dla każdej myszy. Jeśli myszy nie znajdą pożywienia po 4 minutach, zapisz czas znalezienia jako czas opóźnienia wynoszący 240 s.
- Po teście umieść mysz w klatce C.
- Wyjmij paszę z klatki B i umieść ją w szczelnie zamkniętej torbie. Włóż karmę do klatki B i przetestuj następną mysz po zmianie materiału ściółki, jak opisano poniżej.
- W przypadku myszy trzymanych w tej samej klatce należy przeprowadzić badanie z użyciem tego samego zestawu materiałów ściółkowych w klatce B. W przypadku myszy w różnych klatkach wyczyść klatkę alkoholem i wymień materiały ściółkowe.
- Po eksperymencie dodaj myszom paszę i wodę. Przeprowadź eksperyment z dyskryminacją społeczną 1 dzień później.
UWAGA: Maski muszą być noszone przez cały proces, a przezroczyste rękawiczki muszą być zmieniane po zakończeniu eksperymentu przez każdą mysz, aby w jak największym stopniu uniknąć przenikania zapachu. Utrzymuj amplitudę ruchów tak niską, jak to możliwe, aby uniknąć stresu myszy.
3. Eksperyment z dyskryminacją społeczną
- Zbieranie moczu
- Oddzielnie zbierz mocz dojrzałych płciowo samców i samic myszy i podziel je na probówki w równych objętościach19. Zapakuj 2 ml probówek do mikrowirówek z 300 μl moczu w każdej probówce.
- Przechowywać próbki w temperaturze -80 ° C do czasu użycia. Wstrząśnij probówkami, aby równomiernie rozprowadzić próbkę po rozmrożeniu. Nie rozmrażać i nie zamrażać próbki wielokrotnie.
- Ułóż stół operacyjny zgodnie z poniższym opisem.
- Na 1 godzinę przed rozpoczęciem badania zabierz klatkę z myszami na salę operacyjną, aby odpoczęły. Pozwól, aby próbka moczu osiągnęła temperaturę pokojową.
- W tym okresie należy zorganizować salę operacyjną zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.5.
- Zapisz czas potrzebny do znalezienia moczu zgodnie z poniższym opisem.
- Wykonaj rowek z taśmą wokół każdego z dwóch szerokich boków klatki B wystarczająco duży, aby pomieścić probówkę do mikrowirówki zawierającą 300 μl moczu męskiego i żeńskiego. Umieść probówki i na razie trzymaj dwie osłony probówek zamknięte.
- Umieść mysz w klatce A i ustaw odliczanie na 4 minuty. Otwórz dwie rurki klatki B na końcu odmierzania czasu.
- Przenieś mysz do środkowej pozycji klatki B, w tej samej odległości od dwóch rurek, a następnie włącz sprzęt do nagrywania wideo i delikatnie i powoli wycofaj się do obszaru obserwacji.
- Kiedy mysz wącha ściankę/usta rurki lub nawet wewnątrz rurki, rurka jest z powodzeniem wąchana. W tym momencie naciśnij stoper i zapisz czas jako czas wąchania rurki (M s), a następnie kontynuuj rejestrowanie czasu przebywania (X s), aż mysz odsunie się od rurki.
- Kontynuuj odmierzanie czasu wąchając drugą rurkę. Kiedy mysz wącha ściankę/usta rurki lub nawet wewnątrz rurki, rurka jest z powodzeniem wąchana. Naciśnij stoper i zarejestruj czas potrzebny na powąchanie drugiej rurki (N s), a następnie kontynuuj rejestrowanie czasu przebywania (Y s), aż mysz odsunie się od rurki.
- Przenieś mysz do klatki C pod koniec eksperymentu.
- Zmieniaj rurki moczowe i materiał ściółki klatki B po każdym teście na myszach. Umieść zużyty mocz myszy w czystej torbie zgodnie z płcią.
- Zmień rękawiczki i przetestuj następną mysz zgodnie z powyższym opisem.
- Przeprowadź eksperyment w laboratorium bez specjalnego zapachu, takiego jak silne zapachy lub zapach jedzenia, jeśli występują, dokładnie przewietrz przed eksperymentem. Unikaj produktów osobistych, które wydzielają silne zapachy. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić rękawiczki i maski, aby w jak największym stopniu uniknąć przenikania zapachów. Utrzymuj amplitudę ruchów tak niską, jak to możliwe, aby uniknąć stresu myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wdychane zanieczyszczenia środowiskowe upośledzają funkcję węchu u myszy. Wykazano, że cynk atmosferyczny emitowany przez spalarnie i pojazdy silnikowe jest zanieczyszczeniem wdychanym, które może prowadzić do alergicznego zapalenia płuc20. Siarczan cynku jest uważany za jeden z typowych związków powodujących dysfunkcję węchu21. W związku z tym zastosowano siarczan cynku jako czynnik narażenia podawany myszom poprzez instylację donosową, a testowanie przeprowadzono za pomoc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiono dwa podstawowe protokoły przeznaczone do szybkiej oceny zaburzeń węchu u myszy. Różne wdychalne zanieczyszczenia środowiska powodują różne poziomy dysfunkcji węchu u myszy. Test zakopanego pokarmu służy do oceny zdolności do wykrywania lotnych zapachów, podczas gdy eksperyment z dyskryminacją zapachów społecznych ocenia zdolność zwierzęcia do rozpoznawania i różnicowania różnych zapachów społecznych. Protokół ten służy do oceny toksycznego wpływu zanieczyszczeń środowiska na funkcję węchu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była finansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82204088, 82273669) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Shandong, Chiny (ZR2021QH209).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5-10 &m; L regulowana mikropipeta | Eppendorf, Niemcy | 3123000225 | Wkraplanie donosowe |
| 0,9% roztwór soli fizjologicznej | Solarbio | 7647-14-5 | Rozpuszczanie zanieczyszczeń |
| Bezwodny siarczan cynku | Macklin | 7733-02-0 | Wystaw myszy |
| Probówka wirówkowa (2 ml) | Biosharp Incorporated | BS-20-M | Umieść mocz |
| Waga elektroniczna | Changzhou Ohaus Co. | EX125DZH | Waga, środki znieczulające i zanieczyszczenia |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 8.0.1 | analiza statystyczna |
| Ręczny detektor pyłu | TSI Wbudowany | DuatTrak  8532 | Myszy narażone na wdychanie |
| Sprzęt do nagrywania wideo | Apple Inc. | iPhone 6s Plus | Zarejestrowano czas aktywności myszy |
| Mikser wirowy | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co. | Wir-5 | Wymieszaj roztwór |
Bibliografia
- Schäfer, L., Schriever, V. A., Croy, I. Human olfactory dysfunction: causes and consequences. Cell Tissue Res. 383 (1), 569-579 (2021).
- Keller, A., Malaspina, D. Hidden consequences of olfactory dysfunction: a patient report series. BMC Ear Nose Throat Disord. 13 (1), 8(2013).
- Schroeter, J. D., et al. Application of physiological computational fluid dynamics models to predict interspecies nasal dosimetry of inhaled acrolein. Inhal Toxicol. 20 (3), 227-243 (2008).
- Schroeter, J. D., Garcia, G. J., Kimbell, J. S. A computational fluid dynamics approach to assess interhuman variability in hydrogen sulfide nasal dosimetry. Inhal Toxicol. 22 (4), 277-286 (2010).
- Keyhani, K., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Numerical simulation of airflow in the human nasal cavity. J Biomech Eng. 117 (4), 429-441 (1995).
- Hahn, I., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Velocity profiles measured for airflow through a large-scale model of the human nasal cavity. J Appl Physiol. 75 (5), 2273-2287 (1993).
- Zhang, Z., et al. Exposure to particulate matter air pollution and Anosmia. JAMA Netw Open. 4 (5), e2111606(2021).
- Ekström, I. A., et al. Environmental air pollution and olfactory decline in aging. Environ Health Perspect. 130 (2), 27005(2022).
- Adams, D. R., et al. Nitrogen dioxide pollution exposure is associated with olfactory dysfunction in older U.S. adults. Int Forum Allergy Rhinol. 6 (12), 1245-1252 (2016).
- Prah, J. D., Benignus, V. A. Decrements in olfactory sensitivity due to ozone exposure. Percept Mot Skills. 48 (1), 317-318 (1979).
- Shi, Z., et al. Chronic exposure to environmental pollutant ammonia causes damage to the olfactory system and behavioral abnormalities in mice. Environ Sci Technol. 57 (41), 15412-15421 (2023).
- Hernández-Soto, R., et al. Chronic intermittent hypoxia alters main olfactory bulb activity and olfaction. Exp Neurol. 340, 113653(2021).
- Islam, S., et al. Odor preference and olfactory memory are impaired in Olfaxin-deficient mice. Brain Res. 1688, 81-90 (2018).
- Wang, H., et al. Inducible and conditional activation of ERK5 MAP kinase rescues mice from cadmium-induced olfactory memory deficits. Neurotoxicology. 81, 127-136 (2020).
- Chamero, P., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. From genes to social communication: molecular sensing by the vomeronasal organ. Trends Neurosci. 35 (10), 597-606 (2012).
- Mohrhardt, J., et al. Signal detection and coding in the accessory olfactory system. Chem Senses. 43 (9), 667-695 (2018).
- Liu, X., et al. Type 3 adenylyl cyclase in the MOE is involved in learning and memory in mice. Behav Brain Res. 383, 112533(2020).
- Li, X., et al. Polyhexamethylene guanidine aerosol triggers pulmonary fibrosis concomitant with elevated surface tension via inhibiting pulmonary surfactant. J Hazard Mater. 420, 126642(2021).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8, Unit 8.24 (2009).
- Huang, K. L., et al. Zinc oxide nanoparticles induce eosinophilic airway inflammation in mice. J Hazard Mater. 297, 304-312 (2015).
- Burd, G. D. Morphological study of the effects of intranasal zinc sulfate irrigation on the mouse olfactory epithelium and olfactory bulb. Microsc Res Tech. 24 (3), 195-213 (1993).
- Zou, J., et al. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. 63, 1-21 (2015).
- Ryalls, J. M. W., et al. Anthropogenic air pollutants reduce insect-mediated pollination services. Environ Pollut. 297, 118847(2022).
- Schiffman, S. S. Livestock odors: implications for human health and well-being. J Anim Sci. 76 (5), 1343-1355 (1998).
- Albrechet-Souza, L., Gilpin, N. W. The predator odor avoidance model of post-traumatic stress disorder in rats. Behav Pharmacol. 30, 2 and 3-Spec Issue 105-114 (2019).
- Davies, D. A., et al. Inactivation of medial prefrontal cortex or acute stress impairs odor span in rats. Learn Mem. 20 (12), 665-669 (2013).
- Landers, M. S., Sullivan, R. M. The development and neurobiology of infant attachment and fear. Dev Neurosci. 34 (2-3), 101-114 (2012).
- Drobyshevsky, A., et al. Antenatal insults modify newborn olfactory function by nitric oxide produced from neuronal nitric oxide synthase. Exp Neurol. 237 (2), 427-434 (2012).
- Arbuckle, E. P., et al. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Exp. (99), e52615(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
