Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66827

⸱

28 czerwca 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, 2Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 3Department of Anesthesiology, Pharmacology, & Therapeutics, Faculty of Medicine, University of British Columbia, 4Center of Metabolomics, Institute of Metabolic Disease, Baylor Scott & White Research Institute, 5Department of Physiology, Southern Illinois University, 6Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 7Department of Neuroscience, Carleton University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę zmniejszania spożycia kwasu foliowego lub choliny u samic myszy przed ciążą w celu zbadania wpływu diety matki na wyniki zdrowotne potomstwa.

Streszczenie

Żywienie matki w czasie ciąży i laktacji odgrywa ważną rolę w neurorozwoju potomstwa. Metabolizm jednowęglowy (1C), który koncentruje się wokół kwasu foliowego i choliny, a także innych witamin z grupy B, odgrywa kluczową rolę podczas zamykania cewy nerwowej rozwijającego się płodu. Jednak wpływ tych niedoborów żywieniowych matki w czasie ciąży na wyniki zdrowotne potomstwa po urodzeniu pozostaje stosunkowo nieokreślony. Co więcej, niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki mogą wpływać na inne wyniki zdrowotne u potomstwa - co czyni ten model cennym. Protokół ten ma na celu nakreślenie procedury wywoływania niedoboru metabolizmu 1C u samic myszy poprzez modyfikacje diety. Samice są umieszczane na diecie po odsadzeniu, do 2 miesiąca życia, na 4-6 tygodni przed kryciem i pozostają na diecie przez całą ciążę i laktację. Potomstwo tych samic może być oceniane pod kątem wyników zdrowotnych. Samice mogą być wielokrotnie wykorzystywane do generowania potomstwa, a tkanki od samic mogą być pobierane w celu zmierzenia metabolitu 1C. Protokół ten zawiera przegląd sposobów wywoływania niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wyników zdrowotnych potomstwa.

Wprowadzenie

Żywienie matki w czasie ciąży i laktacji odgrywa istotną rolę w rozwoju potomstwa. Metabolizm jednowęglowy (1C) to kluczowa sieć metaboliczna, która integruje sygnały odżywcze z biosyntezą, homeostazą redoks i epigenetyką. Kwas foliowy i cholina są głównymi składnikami 1C, które odgrywają ważną rolę w zamykaniu cewy nerwowej. Powszechnie zaleca się, aby kobiety suplementowały kwas foliowy i cholinę w okresie rozrodczym1. Chociaż kluczowa rola kwasu foliowego w rozwoju płodu jest wyraźnie ustalona, mechanizmy leżące u jego podstaw pozostają niejasne. Kobietom w okresie rozrodczym zaleca się przyjmowanie kwasu foliowego przed zajściem w ciążę, ponieważ zamknięcie cewy nerwowej następuje w pierwszym trymestrze ciąży2. Ciężarne matki, które mają niedobór kwasu foliowego lub innych składników 1C, takich jak cholina, mają większą częstość urodzenia potomstwa z wadami cewy nerwowej ze względu na wysokie zapotrzebowanie na syntezę nukleotydów i inne procesy wymagane we wczesnym okresie ciąży3.

Długoterminowy wpływ diety matki ubogiej w metabolizm 1C na wyniki zdrowotne potomstwa jest słabo poznany. Badania z naszych laboratoriów, a także inne, wykazały, że dieta matki uboga w kwas foliowy lub cholinę rzeczywiście wpływa na wyniki zdrowotne potomstwa po udarze niedokrwiennym mózgu przy użyciu modeli przedklinicznych4,5,6. Wpływ diety matki wykazano również w badaniach klinicznych, w których opisano mniejszą objętość mózgu i zmienione poziomy metylacji7. Teoria Rozwojowego Pochodzenia Zdrowia i Choroby (DOHaD) sugeruje, że potencjalne choroby przewlekłe są programowane w macicy8,9, a dieta matki odgrywa ważną rolę.

Ten protokół ma na celu nakreślenie metody zmiany spożycia 1C przez samice myszy przed ciążą, w celu zbadania wpływu żywienia matki na wyniki zdrowotne potomstwa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony, a wszystkie zwierzęta zostały wykorzystane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Midwestern (Protokół 2983). W badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 2 miesięcy (masa ciała, ~20 g). Ogólnie rzecz biorąc, można używać samic myszy w wieku rozrodczym10. Aby uniknąć skutków miotu, dla każdej diety należy użyć wielu samic11. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Zaopatrz się w dietę ubogą w kwas foliowy lub cholinę od komercyjnych producentów karmy dla gryzoni. Patrz Tabela 1, aby uzyskać szczegółową listę mikro- i makroelementów, w tym dokładną ilość kwasu foliowego lub choliny potrzebnej w diecie z niedoborami.
    UWAGA: Należy również zamówić odpowiednią dietę kontrolną; szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1. Diety te były oparte na AIN93G i zawierały zalecane składniki odżywcze dla gryzoni10.
  2. We współpracy z producentem określ kolorystykę diet, ponieważ może to pomóc w dystrybucji prawidłowych diet podczas badań eksperymentalnych. W tym badaniu użyto koloru zielonego dla diet z niedoborem kwasu foliowego, żółtego dla choliny i białego dla diety kontrolnej. Wszystkie są łatwe do odróżnienia.
    UWAGA: Nie ma ograniczeń w zużyciu wody. Woda nie zawiera kwasu foliowego, choliny ani innych metabolitów 1C.

2. Wywoływanie niedoboru kwasu foliowego lub choliny w diecie

  1. Przed umieszczeniem samic na diecie zważ wszystkie zwierzęta. Będzie ona określana jako masa wyjściowa.
  2. W zależności od indywidualnej konfiguracji klatki laboratoryjnej (wentylowana lub niewentylowana, patrz Tabela materiałów), wymieniaj lub uzupełniaj specjalne granulki dietetyczne dla każdej klatki kilka razy w tygodniu. Nie przepełniaj koszy na karmę w klatkach specjalną dietą, ponieważ może to prowadzić do pogorszenia jakości granulek w przypadku interakcji ze śliną zwierząt i zepsucia się z czasem.
    UWAGA: Upewnij się, że zapas diety jest przechowywany zgodnie z wytycznymi producenta i zużyty przed upływem daty ważności.
  3. Utrzymuj samice myszy na diecie przez 4-6 tygodni przed kryciem.
  4. Wprowadź samce myszy do klatek żeńskich w celu krycia. Upewnij się, że samce są umieszczane w klatkach dla samic po tym, jak samice były na specjalnej diecie przez co najmniej 4-6 tygodni. Wprowadź jednego samca do jednej klatki na jeden do kilku dni.
    UWAGA: W obecnym badaniu samce były trzymane z samicami przez cały czas trwania eksperymentu (~ 4 miesiące), aby zwiększyć liczbę młodych produkowanych, ponieważ krycie u myszy może nastąpić po urodzeniu12. Kobiety w wieku powyżej 6 miesięcy nie były wykorzystywane do żadnych badań.
  5. Codziennie sprawdzaj samice myszy pod kątem korka kopulacyjnego, który wskazuje, że doszło do rozmnażania.
  6. Zbieraj pomiary masy ciała samic myszy co tydzień, aby śledzić ich stan zdrowia i stan ciąży.
    UWAGA: Utrzymanie diety przez kobiety w okresie ciąży (~21 dni) i laktacji (~21 dni) jest bezpieczne.
  7. Kiedy potomstwo zostanie odsadzone od matki (~21 dni po urodzeniu), umieść je na diecie ubogiej w kwas foliowy i cholinę, a także na diecie kontrolnej. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji wyników.
    UWAGA: Podczas badania wpływu diety matki na wyniki zdrowotne potomstwa, zaleca się, aby potomstwo zostało umieszczone na diecie kontrolnej po odsadzeniu. Dieta kontrolna musi zawierać odpowiednią ilość witamin i składników odżywczych do przetrwania.
  8. Pod koniec badania (określając tygodniową wagę w celu monitorowania ogólnego stanu zdrowia samic utrzymywanych na diecie z niedoborem kwasu foliowego lub choliny), należy poddać matki eutanazji za pomocą przedawkowania CO2 (dawka, 10%-30% przemieszczenia objętości na minutę, zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) i pobrać tkanki (krok 3) w celu potwierdzenia niedoborów w diecie.

3. Pobieranie tkanek do pomiarów 1C i pokrewnych metabolitów

UWAGA: Podczas eutanazji zwierząt ważne jest, aby upewnić się, że zwierzęta nie reagują na uszczypnięcie palca u nogi. Gdy zwierzęta przestaną reagować, można rozpocząć sekcję tkanek. Tkanka, która zostanie poddana sekcji, musi być wcześniej określona13,14, a materiały muszą być przygotowane. Materiały te obejmują rurki do przechowywania, odpowiednie narzędzia do preparowania oraz suchy lód lub ciekły azot.

  1. Zbierz tkanki krwi i wątroby zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami15,16.
    1. Zbierz ~500-1000 μL krwi za pomocą nakłucia serca, wykonując poniższe czynności. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z Parasuraman et al.17:
      1. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V przez skórę i ścianę brzucha. Odsuń narządy jamy brzusznej na bok i wprowadź igłę przez przeponę do serca, aby pobrać próbkę krwi.
      2. Umieść próbki krwi w probówkach pokrytych EDTA. Probówkę można pozostawić w temperaturze pokojowej do czasu pobrania wszystkich próbek.
    2. Odwirować próbki krwi w wirówce o stężeniu 1000-2000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C w celu wyizolowania osocza krwi. Zebrać osocze do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, a następnie przechowywać ją w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    3. Aby usunąć wątrobę, otwórz jamę brzuszną i przeprowadź sekcję całej wątroby zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem15.
      1. Po wyjęciu wątroby z jamy ciała pokrój tkankę na mniejsze kawałki małymi nożyczkami i zamroź je za pomocą suchego lodu lub ciekłego azotu.
        UWAGA: Zamrożone kawałki tkanki można umieścić w kriogenicznej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego badania było zbadanie wpływu niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie matek na wyniki zdrowotne potomstwa. Co tydzień wyznaczano masę ciała, aby monitorować ogólny stan zdrowia samic utrzymywanych na dietach z niedoborem kwasu foliowego lub choliny. W naszych poprzednich pracach nie zaobserwowano zmian w masie ciała pomiędzy grupami dietetycznymi matek4. Rycina 1 przedstawia masę wyjściową i tygodniową samic utrzymywanych na diecie kontrolnej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas wdrażania tego protokołu w laboratoriach badawczych istnieje kilka ważnych uwag, które badacze muszą wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem eksperymentów. Po pierwsze, w produkcji diety należy zapewnić wystarczającą ilość czasu na wyprodukowanie diety przed rozpoczęciem badania eksperymentalnego. Czas realizacji może się różnić w zależności od firmy, należy również wziąć pod uwagę wysyłkę diety. Samice myszy w wieku rozrodczym (~2-2,5 miesiąca) można wprowadzić na dietę 4-6 tygodni przed kryciem

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 mlSamice myszy Eppendorf
C57BL/6 CharlesRiver27Myszy można również hodować w domu.
Dieta z niedoborem cholinyEnvigoTD.06119
Dieta kontrolnaEnvigoTD.190790
Probówki EDTA Dieta
z niedoborem kwasu foliowegoEnvigoTD.01546
Pryzmathttps://www.graphpad.com/features
Chusta dla gryzoniLab Products, LLCOne KlatkaWentylowane stojaki i Koszyki
Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)SCIEX, Framingham, MA5500 QTrap
Ultra-sprawna chromatografia cieczowa (UPLC)Shimadzu, Columbia, MD, USANexera
GraphPad

Bibliografia

  1. Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
  2. Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
  3. Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
  4. Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
  5. Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
  6. Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
  7. Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
  8. Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
  9. Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
  10. Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
  11. Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
  12. Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
  13. Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
  14. The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
  15. Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms. STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).
  16. Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  17. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  18. Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
  19. Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
  20. Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
  21. Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Odżywianie matkiniedobór kwasu foliowegoniedobór cholinymetabolizm jednego węglazamknięcie rurki neuralnejdieta matkineuronauka behawioralnanarzędzia epigenetycznepomiary metabolitów
Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.