Artykuł metodologiczny

Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

3 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opiera się na indukowanej przez LPS i ATP śmierci makrofagów THP-1 zróżnicowanych PMA. Używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V i 7-AAD w celu wykrycia śmierci komórki, wykorzystując całą komórkę i stosując skaningową mikroskopię elektronową do obserwacji morfologii błony komórkowej.

Streszczenie

Śmierć komórki jest podstawowym procesem we wszystkich żywych organizmach. Protokół ustanawia indukowane lipopolisacharydem (LPS) i trifosforanem adenozyny (ATP) indukowane przez lipopolisacharyd (LPS) i adenozynotrifosforan (ATP) zróżnicowane depozycję lipidów w modelu makrofagów ludzkiego monocytów (THP-1) w celu obserwacji śmierci komórki. LPS w połączeniu z ATP jest klasyczną metodą indukcji stanu zapalnego, często stosowaną do badania piroptozy, ale apoptoza i nekroptoza również reagują na stymulację przez LPS/ATP. W normalnych warunkach fosfatydyloseryna jest zlokalizowana tylko w wewnętrznej płatku błony komórkowej. Jednak we wczesnych stadiach pyroptozy, apoptozy i nekroptozy błona komórkowa pozostaje nienaruszona i wystawiona na działanie fosfatydyloseryny, aw późniejszych stadiach błona komórkowa traci swoją integralność. W tym przypadku zastosowano cytometrię przepływową do analizy podwójnego barwienia aneksyną V i 7-aminoaktynomycyną D (AAD) w celu wykrycia śmierci komórki z całych komórek. Wyniki pokazują, że znaczne komórki obumarły po stymulacji LPS/ATP. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej obserwujemy możliwe formy śmierci komórek w poszczególnych komórkach. Wyniki wskazują, że komórki mogą ulegać pyroptozie, apoptozie lub nekroptozie po stymulacji LPS/ATP. Protokół ten koncentruje się na obserwacji śmierci makrofagów po stymulacji LPS/ATP. Wyniki pokazały, że śmierć komórki po stymulacji LPS i ATP nie ogranicza się do piroptozy oraz że może również wystąpić apoptoza i apoptoza martwicza, co pomaga naukowcom lepiej zrozumieć śmierć komórki po stymulacji LPS i ATP oraz wybrać lepszą metodę eksperymentalną.

Wprowadzenie

Śmierć komórki jest podstawowym procesem fizjologicznym we wszystkich żywych organizmach. W ostatnich latach szeroko zakrojone badania wykazały, że śmierć komórki jest zaangażowana w odporność i równowagę w organizmie. Badanie śmierci komórek pomaga nam lepiej zrozumieć początek i rozwój chorób. Opisano kilka form zaprogramowanej śmierci komórki i zidentyfikowano kilka kluczowych celów w tych procesach. Piroptoza, apoptoza i nekroptoza to trzy genetycznie zdefiniowane ścieżki zaprogramowanej śmierci komórki zaangażowane w wewnętrzną równowagę i chorobę1.

Pyroptoza charakteryzuje się tworzeniem porów błonowych i uwalnianiem zawartości komórek. Aktywowane kaspazy lub granzymy rozszczepiają gasderminy, aby oddzielić swoje N-końcowe domeny, które następnie oligomeryzują, wiążą się z błoną i tworzą pory2,3,4. Por gasderminy zapewnia nietypowy kanał wydzielania przez błony komórkowe, co skutkuje reakcjami w dół komórek, w tym uwalnianiem zawartości i napływem jonów2,3,4. Ostatecznie komórki ostatecznie doświadczają pęknięcia błony plazmatycznej i lizy piroptotycznej ułatwionej przez ninjurin-15. W apoptozie aktywowane Bax i Bak tworzą oligomery na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i uwalniają cytochrom C, który jest regulowany przez równowagę między białkami proapoptotycznymi i antyapoptotycznymi z rodziny BCL-2, kaspazami inicjującymi (kaspaza-8, -9 i -10) oraz kaspazami efektorowymi (kaspaza-3, -6 i -7)1,6,7. Zmiany morfologiczne apoptozy obejmują pęcherzyki błonowe, kurczenie się komórek, fragmentację jądrową, kondensację chromatyny i tworzenie ciał apoptotycznych6,8. Kinaza 1 seryny/treoniny 1 oddziałująca z receptorem (RIPK3) i kinaza mieszana (MLKL) to dwa podstawowe składniki mechanizmu nekroptotycznego1. RIPK3 rekrutuje i fosforyluje MLKL, p-MLKL oligomeryzuje, łączy się z błoną komórkową, inicjuje perforację błony, powoduje napływ jonów, zwiększa osmolarność wewnątrzkomórkową i ostatecznie pękanie komórek6,9. Gasdermins i MLKL wiążą się z błoną plazmatyczną i pośredniczą odpowiednio w piroptozie i nekroptozie, podczas gdy BAX/BAK pośredniczy w apoptozie, wiążąc się z zewnętrzną błoną mitochondriów6.

Chociaż każda ścieżka ma określone mechanizmy i wyniki, prowadzą one do podobnych zmian na błonie komórkowej. W normalnych warunkach fosfatydyloseryna (PS) jest zlokalizowana tylko w wewnętrznej płatku błony komórkowej. Jednak we wczesnych stadiach pyroptozy, apoptozy i nekroptozy PS będzie odsłonięty poza błoną plazmatyczną. Kaspaza-3/kaspaza-7 aktywuje rodziny TMEM16 i XKR, co prowadzi do asymetrycznej błony komórkowej i eksternalizuje PS podczas apoptozy10. Napływ Ca2 + za pośrednictwem Gasderminy D i MLKL prowadzi do utraty symetrii dwuwarstwy fosfolipidowej na błonie komórkowej i ekspozycji PS. Ekspozycja następuje przed utratą integralności błony komórkowej11,12. Opierając się na podobnych zmianach w błonie tych trzech typów programowanej śmierci komórki, używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V / 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD) w celu wykrycia śmierci komórki. Aneksyna V, zależne od wapnia białko wiążące fosfolipidy, ma wysokie powinowactwo do PS, które może służyć jako czuła sonda do wykrywania odsłoniętych PS na powierzchni błony plazmatycznej13. 7-AAD to barwnik kwasu nukleinowego, który nie może przejść przez całą błonę komórkową. Jest podobny do jodku propidyny (PI), powszechnie stosowanego barwnika kwasu nukleinowego. Mają podobną charakterystykę fluorescencji, ale 7-AAD ma węższe spektrum emisji i mniej zakłóceń z innymi kanałami detekcji. Ze względu na te podobieństwa nie wystarczy rozróżnienie między piroptozą, apoptozą i nekroptozą. Użyliśmy cytometrii przepływowej do wykrycia śmierci komórek z całych komórek. Druga metoda służy do uchwycenia błony komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu obserwacji możliwych form śmierci komórki w poszczególnych komórkach.

Ustaliliśmy indukowaną lipopolisacharydem (LPS) i adenozynotrifosforanem (ATP) depozycję lipidów w modelu makrofagów ludzkiego monocytu (THP-1) indukowaną lipopolisacharydem (LPS) i adenozynotrifosforanem (ATP) w modelu makrofagów ludzkiego monocytu, aby obserwować śmierć komórki. Protokół ten koncentruje się na obserwacji śmierci komórki, a nie na badaniu mechanizmów.

Protokół

1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa

  1. Hoduj ludzką monocytową linię komórkową THP-1 w kompletnym pożywce hodowlanej RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 0,05 mM β-merkaptoetanolu. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonym powietrzem CO2 . Subhodowla komórek co 2-3 dni.
    UWAGA: THP-1 to komórka zawiesinowa, wybierz, aby zmienić połowę pożywki do podhodowli. Obserwując wiele fragmentów komórek pod mikroskopem świetlnym, wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki we wstępnie ogrzanej, świeżej, kompletnej pożywce do hodowli komórkowych.
  2. Używaj komórek (we fragmentach 4-10) w logarytmicznej fazie wzrostu we wszystkich eksperymentach. Gdy komórki są w dobrej kondycji i logarytmicznej fazie wzrostu, są okrągłe, jasne, gęste i bez grudek i fragmentów komórek pod mikroskopem świetlnym przy 100 x.

2. Różnicowanie komórek THP-1

  1. Przygotować roztwór podstawowy PMA o stężeniu 1 mM (rozpuścić 1 mg PMA w 1,62 ml dimetylosulfotlenku). Rozcieńczyć roztwór podstawowy PMA kompletną pożywką do hodowli komórkowych do końcowego stężenia roboczego 100 nM.
  2. Zebrać komórki z naczynia hodowlanego do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić komórki 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej PMA.
  3. Otwórz licznik komórek i oprogramowanie liczące. Odpipetować 20 μl zawiesiny komórek do płytki licznika komórek i włożyć ją do płytki licznika komórek. Kliknij Podgląd B1, obróć pokrętło w prawym dolnym rogu instrumentu i dostosuj ogniskową, aby komórki z jasnym środkiem miały wyraźne kontury na oprogramowaniu. Kliknij przycisk Liczba, aby rozpocząć liczenie.
  4. Na podstawie wyników zliczania użyj kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej PMA, aby dostosować gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml. Komórki nasienne na płytce 6-dołkowej inkubować na płytce przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed rozpoczęciem dalszego zaprawiania.

3. Leczenie komórek THP-1

  1. Przygotować roztwór podstawowy LPS o stężeniu 1 mg/ml (rozpuścić 1 mg LPS w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)). Rozcieńczyć roztwór podstawowy LPS pożywką niezawierającą surowicy do końcowego stężenia roboczego 1 μg/ml. Przygotować roztwór podstawowy Na2ATP o stężeniu 500 mM (rozpuścić 0,3026 g ATP w 1 ml PBS).
  2. Odessać pożywkę zawierającą PMA ze studzienek i przemyć PBS 1x. Dodać pożywkę bez surowicy do grupy kontrolnej i pożywkę bez surowicy zawierającą LPS do grupy modelowej. Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przed przystąpieniem do dalszej obróbki.
  3. Po 6 godzinach dodać roztwór podstawowy ATP do grupy modelowej do końcowego stężenia roboczego 500 nM. Przed kontynuowaniem inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .

4. Analiza cytometrii przepływowej (Metoda 1)

  1. Przygotowanie próbek doświadczalnych
    1. Wysiewaj i inkubuj komórki na płytkach 6-dołkowych zgodnie z krokiem 2. Ustal cztery grupy kontrolne bez leczenia: jedną kontrolę bez barwienia, dwie kontrole z pojedynczym barwieniem (po jednej dla każdej barwienia) i jedną kontrolę z podwójnym barwieniem. Ustal jedną grupę leczenia i traktuj zgodnie z krokiem 3.
    2. Po zabiegu odessać cały supernatant ze studzienek i przemyć PBS 2x. Dodać 500 μl 0,05% trypsyny (bez EDTA) do każdej studzienki i inkubować w inkubatorze przez 30 s.
    3. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 do każdej studzienki, aby zatrzymać odrywanie komórek i zebrać komórki do probówki o pojemności 5 ml. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj 1 ml PBS w celu ponownego zawieszenia komórek. Umieścić probówki z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 3 minuty. Odwirować wszystkie próbki o masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Rozcieńczyć 200 μL 5x buforu wiążącego z 800 μl wody destylowanej do 1x buforu wiążącego. Dodaj 100 μl 1x buforu wiążącego, aby ponownie zawiesić komórki i przenieś komórki do probówki o pojemności 5 ml.
    6. Dodać 5 μl roztworu aneksyny V-PE do jednej probówki z komórkami grupy kontrolnej na 10 minut i 5 μl roztworu 7-AAD do innej probówki z komórkami grupy kontrolnej przez 5 minut (oddzielnie jako pojedyncze kontrole barwienia). Delikatnie zmieszaj każdą probówkę, aby wymieszać barwnik i inkubować próbki w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Dodać 400 μl PBS do każdej probówki i delikatnie przetrząsnąć, aby zakończyć inkubację.
    7. Dodać 5 μl roztworu aneksyny V-PE do pozostałych probówek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zmieszaj każdą probówkę, aby wymieszać barwnik i inkubować próbki w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po 5 minutach dodać 5 μl roztworu 7-AAD przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 400 μl PBS do każdej probówki i delikatnie przetrząsnąć, aby zakończyć inkubację.
    8. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą nylonowej siatki o grubości 35 μm, która jest częścią probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml. Umieść probówkę na lodzie i poczekaj na testy. Delikatnie wymieszaj przed testem, a następnie włóż go do urządzenia.
  2. Cytometria przepływowa
    1. Do testów należy użyć cytometru przepływowego do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometru przepływowego i potwierdź działanie detektora i lasera. Kliknij Cytometr i wybierz Uruchomienie Fluidics, poczekaj, aż system będzie gotowy. Wyklucz pęcherzyki komory przepływowej, klikając Cytometr > Tryby czyszczenia > Komórka De-Gas Flow.
    2. Kliknij Eksperyment, wybierz kolejno Nowy folder, Eksperyment, Próbka, Probówka i Edytuj nazwę. Strzałka w kształcie pięciokąta przed rurką zmienia kolor na zielony, gdy się zaświeci.
    3. Kliknij ikonę Cytometer FACSCelesta (ikona skrótu), wybierz Parametr, a następnie wybierz sygnał FSC, SSC i PE. Kliknij ikonę Arkusza globalnego (ikona skrótu), aby ustalić histogram PE. W przypadku cytometru przepływowego używanego w tym badaniu należy użyć PE dla aneksyny V przy długości fali 586 nm i wykreślić wykres na osi X; PerCP-Cy5.5 dla 7-AAD przy 700 nm i wykreślić na osi Y.
    4. Najpierw wprowadzić niezabarwioną próbkę kontrolną do przyrządu. Kliknij ikonę panelu pozyskiwania (ikona skrótu), zdobądź co najmniej 10 000 zdarzeń z żądanej populacji. Wyklucz zanieczyszczenia za pomocą bramki (P1) na wykresie punktowym FSC-A i SSC-A. Dostosuj natężenie przepływu do średniej prędkości i rejestruj dane. Dostosuj napięcie, aby umieścić populację komórek na przekątnej histogramu FSC/SSC i kliknij Uruchom ponownie. Dostosuj natężenie przepływu do średniej prędkości i rejestruj dane.
    5. Kliknij Następna probówka, uruchom pojedyncze kontrolki barwienia Aneksyny V i 7-AAD, aby dostosować kompensację. Uruchom pozostałe probówki i zbierz dane.

5. Obrazowanie SEM (Metoda 2)

  1. Przygotowanie próbek doświadczalnych
    1. Wysiewać i inkubować komórki na płytkach 6-dołkowych zgodnie z krokiem 2 i traktować zgodnie z krokiem 3.
    2. Po zabiegu odessać cały supernatant ze studzienek i przemyć 2x PBS. Dodaj 500 μl 0,05% trypsyny (bez EDTA) do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze przez 30 sekund.
    3. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 do każdej studzienki, aby zatrzymać odrywanie komórek i zebrać komórki do probówki o pojemności 5 ml. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Utrwalić komórki za pomocą 500 μl utrwalacza do mikroskopu elektronowego (2,5% dialdehydu glutarowego, 100 mM soli fosforu) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj roztwór ałunu chromowego: Dodać 1,0 g żelatyny do 100 ml ultraczystej wody, podgrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C i równomiernie wymieszać. Dodaj 0,05 g glinu chromowego, równomiernie wymieszaj i przefiltruj bibułą filtracyjną. Zanurzyć czyste szkło nakrywkowe w roztworze ałunu chromowego na 2 godziny w temperaturze 37 °C i wysuszyć w suszarce o temperaturze 37 °C do późniejszego użycia.
      UWAGA: Celem jest zapobieżenie odłączaniu się komórek podczas eksperymentu.
    6. Zbierz komórki z roztworu stałego. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 μl PBS i delikatnie zdmuchnij komórki. Zawiesinę ogniw należy upuścić na szkiełko nakrywkowe, odstawić na 5 minut. Odessać cały supernatant i przemyć 3x PBS przez 5 minut za każdym razem.
      UWAGA: Operację należy wykonać delikatnie, aby zapobiec odłączeniu się komórek. Nie potrząsaj energicznie, poruszaj się powoli i powoli dodawaj płyn wzdłuż ściany.
    7. Dodać 500 μl 1% wiązania kwasu osmowego przez 1 godzinę. Odessać cały supernatant i przemywać 3x PBS przez 5 minut za każdym razem.
    8. Próbki należy odwadniać kolejno w serii stężeń etanolu (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) przez 15 minut na roztwór EtOH.
      UWAGA: Okulary nakrywkowe można przechowywać w 100% EtOH przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale powinny one wyschnąć tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć nadmiernego odwodnienia.
    9. Włączyć osuszacz punktu krytycznego, otworzyć zbiornikCO2, schłodzić komorę do 10 °C. Szybko owinąć próbkę bibułą filtracyjną, gdy ciśnienie w komorze wynosi 0 psi i włożyć ją do komory.
    10. Otwórz zawór wlotowy, obserwuj przez okienko obserwacyjne CO2, podnieś poziom cieczy CO2 między dwiema czerwonymi liniami (nie przekraczaj górnej granicy), zamknij zawór wlotowy. Moczyć próbkę przez 10 minut. Otwórz jednocześnie zawory wlotowe i wylotowe, aby wyrównać CO2 przez 1 minutę (ciekły CO2 wypiera EtOH). Zamknij zawór wydechowy, aby podnieść poziom cieczy CO2 do określonej pozycji, zamknij zawór wlotowy.
    11. Ustawić temperaturę na 35 °C i ciśnienie na 1250 psi. Gdy temperatura i ciśnienie ustabilizują się, rozhermetyzuj przy 100 psi/min. Wyjąć próbkę, gdy ciśnienie w komorze wynosi zero i wyłączyć urządzenie.
    12. Zamontuj próbki na aluminiowych uchwytach próbek SEM za pomocą taśmy przewodzącej. Za pomocą napylarki napylającej próbki należy pokryć warstwę (2-5 nm) złota.
  2. Obrazowania
    1. Do obrazowania należy użyć SEM o wysokiej rozdzielczości z emisją zimnego pola. Ustaw napięcie przyspieszające SEM na 3 kV. Ustaw odległość roboczą na 10 mm. Ustaw powiększenie na 1,000x, aby obserwować panoramę. Ustaw powiększenie na 5 000x i 20 000x, aby zlokalizować błonę plazmatyczną i zobrazować próbkę.
      UWAGA: Proces wizualizacji makrofagów THP-1 zróżnicowanych pod kątem PMA za pomocą SEM jest podobny do innych typów komórek i tkanek i zależy od zastosowanych instrumentów. Klasa reference14 udostępnia szczegółowy protokół SEM wraz z towarzyszącymi filmami.

Wyniki

Próbki komórek potraktowano zgodnie z opisem w protokole, a następnie wykonano detekcję metodą cytometrii przepływowej. Komórki prawidłowe nie ulegają barwieniu Aneksyną V i 7-AAD (Annexin V-/7-AAD-). we wczesnych etapach piroptozy, apoptozy i nekroptozy PS jest eksponowane i wiąże się z Aneksyną V, jednak błona komórkowa pozostaje nienaruszona, co wyklucza wnikanie 7-AAD z przestrzeni zewnątrzkomórkowej (Annexin V+/7-AAD-). W późniejszych etapach błona komórkowa traci swoją integralność, a komórki są jednocześnie barwione Aneksyną V i 7-AAD, co daje wyniki podwójnie dodatnie (Annexin V+/7-AAD+). Komórki nekrotyczne były barwione wyłącznie 7-AAD (Annexin V-/7-AAD+). Rycina 1 pokazuje, że po stymulacji LPS/ATP liczba komórek w regionie Q2 znacznie wzrosła, co wskazuje na śmierć komórkową.

Stosujemy SEM do obrazowania powierzchni błony plazmatycznej, co pozwala na bezpośrednią obserwację charakterystyki błony pojedynczej komórki. Rysunek 2A przedstawia komórki kontrolne, Rycina 2B-D przedstawiają komórki po stymulacji LPS/ATP. Zaobserwowaliśmy komórki o cechach pyroptozy, w tym pęcherzykowanie błony oraz przerwanie ciągłości błony (Rysunek 2B), komórki o cechach apoptozy, w tym z pęcherzykowaniem błony komórkowej i skurczem komórki (Rycina 2C), oraz komórki o cechach nekroptozy, w tym pęcznienie komórek i pękanie błony (Rysunek 2D).

Wyniki cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe i wykres słupkowy analizujący aktywację komórek w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą LPS/ATP.
Rycina 1: Wykrywanie podwójnego barwienia Annexin V/7-AAD przy użyciu cytometrii przepływowej. (A) Barwienie negatywne dla Annexin V i negatywne dla 7-AAD (Q4), podwójne barwienie pozytywne dla Annexin V i negatywne dla 7-AAD (Q3), barwienie pozytywne dla Annexin V i pozytywne dla 7-AAD (Q2) oraz barwienie negatywne dla Annexin V i pozytywne dla 7-AAD (Q1). (B) Dane ilościowe dla (A). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n=3), nieparzysty test t, **p < 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikrografie SEM komórek w warunkach kontrolnych oraz LPS/ATP, podkreślające zmiany strukturalne.
Rycina 2: Obrazy z mikroskopii elektronowej skaningowej makrofagów THP-1 zróżnicowanych za pomocą PMA. (A) Grupa kontrolna, powiększenie 5,000x/20,000x. (B, C, D) Grupa LPS/ATP wykazuje pęcherzykowanie błony, przerwanie błony (↑), obrzęk komórek (↑) oraz kurczenie się komórek (↑) przy powiększeniu 5,000x/20,000x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym manuskrypcie zastosowano dwie metody do wykrywania śmierci makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP. Zastosowano podwójne barwienie aneksyną V/7-AAD, a wyniki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej z barwienia ogólnego. Podobnie jak w przypadku innych analiz cytometrii przepływowej, grupa niebarwionych komórek i dwie grupy pojedynczych komórek zostały skonfigurowane w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Wyniki pokazują, że po stymulacji LPS/ATP kilka komórek utraciło integralność błony, co wskazuje, że mogło dojść do śmierci komórki. Ta metoda wykrywania pozwala nam ocenić śmierć komórek z całych komórek. Warto zauważyć, że podwójne barwienie Aneksyną V/7-AAD nie jest wystarczające do rozróżnienia między piroptozą, apoptozą i nekroptozą. We wczesnych stadiach tych trzech form PS będzie wystawiony na zewnątrz błony plazmatycznej, a barwienie aneksyną V jest dodatnie. Integralność błony zostaje utracona w późnym stadium tych trzech form, a wyniki barwienia wykazują podwójnie dodatnie barwienie. Dlatego użyliśmy SEM, aby dalej obserwować możliwe formy śmierci komórki, które mogą wystąpić.

W apoptozie dochodzi do tworzenia się porów BAX/BAK na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, a następnie kurczenia się komórek i pęcherzenia błony komórkowej. Nekroptoza wykorzystuje MLKL do otwierania porów w błonie komórkowej, podczas gdy sygnał piroptozy aktywuje gasderminę do tworzenia porów w błonie komórkowej. Warto zauważyć, że zarówno piroptozy, jak i nekroptozie towarzyszy pęknięcie błony komórkowej w końcowym etapie. Jednak pory gasederminy są znacznie większe niż pory MLKL, więc pory gasderminy nie mają selektywności jonowej. Komórki nekroptotyczne wykazują znaczny obrzęk morfologii15. Ostatecznie kończą się pęknięciem błony. Niezależnie od szlaku sygnałowego poprzedzającego aktywację przepuszczalności błony komórkowej, zmiany w błonie komórkowej towarzyszą tym trzem formom śmierci komórki. Użyliśmy SEM do dalszej obserwacji błony komórkowej, która zapewnia intuicyjny sposób badania śmierci komórki. Zaobserwowaliśmy cechy piroptozy, w tym pęcherzyki błonowe i błonę pękającą oraz nekroptozę, w tym obrzęk komórek i błonę pękającą, zgodne z cechami badanymi przez poprzednich badaczy15. Zaobserwowaliśmy pęcherzyki błonowe i kurczenie się komórek, zgodne z charakterystyką apoptozy badaną przez poprzednich badaczy16.

W poprzednich badaniach połączenie LPS i ATP było często stosowane do wywoływania piroptozy. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy cechy apoptozy i nekroptozy. Chociaż wszystkie trzy formy mogą wystąpić w śmierci komórki wywołanej przez LPS/ATP, wcześniejsze badania wykazały, że piroptoza pozostaje dominującym sposobem śmierci. LPS jest jednym z najbardziej scharakteryzowanych wzorców molekularnych związanych z patogenami. ATP uwalniane z umierających komórek, ma wysokie stężenie w komórce. Zewnątrzkomórkowe ATP jest jednym z niebezpiecznych wzorców molekularnych17. LPS/ATP to klasyczna dwuetapowa metoda stymulacji w celu wywołania piroptozy. Badania wykazały, że dodanie ATP do komórek stymulowanych przez LPS może szybko aktywować kaspazę-118, podczas gdy wyciszenie genu kaspazy-1 może znacząco odwrócić śmierć komórki wywołaną przez LPS / ATP19. W poprzednich badaniach stwierdziliśmy również indukowaną przez LPS / ATP aktywację apoptotycznych i nekroptotycznych białek docelowych 20,21. Chociaż LPS/ATP jest klasycznym induktorem piroptozy, może również indukować apoptozę i nekroptozę.

W rzeczywistości te trzy formy często nie istnieją niezależnie, a przesłuchy między etapami sygnału. Na przykład białka gasderminy celują w mitochondria, aby promować uwalnianie cytochromu c w celu wzmocnienia mitochondrialnego szlaku apoptotycznego22. Aktywacja kaspazy-3 może rozszczepić gasderminę E, a następnie wywołać piroptozę23. Badanie sugeruje, że sygnalizacja MLKL / PIPK3 jest zaangażowana w aktywację inflamasomów NLRP324. Ta złożona interakcja doprowadziła do koncepcji PANoptosis, zdefiniowanej jako zapalny szlak zaprogramowanej śmierci komórki regulowany przez kompleks PANoptosome z kluczowymi cechami piroptozy, apoptozy i / lub nekroptozy, których nie można wyjaśnić samodzielnie przez żaden z tych zaprogramowanych szlaków śmierci komórki25. Gdy zaproponowano koncepcję PANoptosis, naukowcy opisali występowanie zaprogramowanej śmierci komórki w bardziej kompleksowy sposób, co również podkreśla złożoność programowanej śmierci komórki. Wskazuje to jednocześnie na ograniczenia tej metody badawczej. Chociaż piroptoza jest uważana za dominującą w śmierci komórki wywołanej przez LPS/ATP, nie można określić proporcji tych form śmierci ani tego, czy wszystkie istnieją, nawet obejmując inne formy zaprogramowanej śmierci. Może to być obszar do zbadania w przyszłości.

Protokół ten opiera się na śmierci makrofagów wywołanej przez LPS i ATP. Opisaliśmy metodę testowania od całości do jednostki, która ma również zastosowanie do innych modeli i komórek. Wyniki wskazują, że komórki mogły zostać poddane pyroptozie, apoptozie lub nekroptozie, która nie ogranicza się do piroptozy, pomagając naukowcom lepiej zrozumieć śmierć komórki po stymulacji LPS i ATP oraz wybrać lepszą metodę eksperymentalną. W poprzednich badaniach podwójne barwienie aneksyną V / 7-AAD lub aneksyną V / PI było powszechnie stosowane do wskazania wystąpienia apoptozy26, 27, niektórzy badacze używali go również do badania apoptozy28. W rzeczywistości nie możemy rozróżnić między trzema typami śmierci komórek poprzez te podwójne barwienie. Protokół ten przypomina badaczom, zwłaszcza początkującym, że podwójne barwienie aneksyną V/7-AAD lub aneksyną V/PI nie może określić jakościowo typu śmierci komórki. Może jedynie pokazywać uszkodzenie i śmierć komórki jako całość lub wskazywać, że komórka mogła przejść jakąś formę śmierci. W bardziej ukierunkowanych badaniach konieczne jest wprowadzenie grupy kontrolnej, która hamuje inne zgony, aby pokazać, że definitywnie śmierć programowa jest na wyciągnięcie ręki. Podobnie, dalsze badania mechanistyczne będą dotyczyły krytycznych celów różnych zaprogramowanych zgonów.

Ponadto, w trakcie przygotowań do eksperymentu, stwierdziliśmy, że obecnie istnieje wiele szczegółowych procedur eksperymentalnych dla SEM komórek adherentnych, z niewielkim opisem komórek zawieszonych. W tym miejscu przedstawiamy bardziej szczegółowy opis metody przygotowania próbki do komórek zawieszonych. Krok 5.5 jest niezbędnym krokiem, aby pomóc w unieruchomieniu zawieszonych komórek na szkiełkach komórkowych. Kolejne operacje należy wykonywać delikatnie, aby zapobiec oderwaniu się komórek. Oprócz roztworu ałunu chromowego, poli-L-lizyna może również unieruchamiać komórki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wyrażamy naszą wielką wdzięczność Jiayi Sun i Lu Yangowi z Innowacyjnego Instytutu Medycyny Chińskiej i Farmacji, Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu, za pomoc w cytometrii przepływowej, Cuiping Chen z Państwowego Kluczowego Laboratorium Południowo-Zachodniej Medycyny Chińskiej, za pomoc w skaningowej mikroskopii elektronowej. Praca ta była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych [82104491], Fundację Nauk Przyrodniczych w Syczuanie [2023NSFSC0674] oraz Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich [2021M693789].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% roztwór enzymu trzustkowego (bez EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennejCORNING352235
5 mlLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
płytka 6-dołkowa Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Aneksyna V-PE / 7-AAD zestaw do analizy apoptozyAbsin (Szanghaj) Technologia biologiczna co.ltdabs50007Aneksyna V-PE, 7-AAD, 5 razy; Bufor wiążący, roztwór kontroli pozytywnej apoptozy
inkubator CO2Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Celometr K2 Licznik komórek fluorescencyjnychNexcelom Bioscience LLCCelometr K2
Celometr SD100 Komory licząceNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
WirówkaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
Ałun chromu Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.
szkła nakrywkowe, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
suszarka punktu krytycznegoQuorum TechnologiesK850
dimetylosulfotlenekBOSTER Technologia biologiczna co.ltdPYG0040
mikroskop elektronowy utrwalaczServicebio Technology co., ltd G11022,5% dialdehyd glutarowy, 100 mM sole fosforu
waga elektronicznaSHIMADZUATX124
absolut etanoluChengdu Kelong Chemical Co., Ltdcytometr
Becton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowejBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Oprogramowanie
żelatynaGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Skaningowy mikroskop elektronowy o wysokiej rozdzielczości z emisją w zimnym poluTITACHIRegulus 8100
ludzka monocytowa linia komórkowa THP-1Procell Nauki przyrodnicze& Technologia Co., Sp. z o.o.CL0233
 Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolisacharyd Beijing Solarbio Nauka & Technology Co., Ltd. L8880LPS pochodzi od Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. A8270
octan forbolu-12-mirystynianu-13 Beijing Solarbio Nauka & Technology Co., Ltd. P6741
sól fizjologiczna buforowana fosforanamiServicebio Technology co., ltd G4202
PipetaEppendorf AGN/A
końcówki do pipet, 10 μ LServicebio Technology co., ltd T-10PL
, 1 ml Servicebio Technology co., ltd T-1250L
, 200 μ LServicebio Technology co., ltd T-200L
RPMI-1640 kompletne podłoże hodowlaneProcell Life Science& Technologia Co., Sp. z o.o.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05 mM β-merkaptoetanol + 1% P/S
RPMI-1640 pożywka hodowlana Szanghaj  Podstawowe media  Technologie Co., Sp. z o.o.
płyn do osłonekBECKMAN COULTER8546733
powlekarka napylającaCressington Scientific Instruments Ltd108
termostatyczna łaźnia wodnaGUOHUA Electric Appliance CO., Ltd HH-1
Naczynie do hodowli komórkowych PA04354 przepływowy 2021033102 Mikroskop odwrócony Końcówki do pipet Końcówki do pipet K211104

Bibliografia

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stymulacja LPS i ATPróżnicowanie PMAśmierć komórkipiroptozaapoptozanekroptozacytometria przepływowaskaningowa mikroskopia elektronowabarwienie aneksyną V
Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.