Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja paleoklimatu i paleoekologii lądu za pomocą skamieniałych liści przy użyciu cyfrowej fizjonomii liści i masy liści na obszar

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66838

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Washington, 2Department of Paleobiology, National Museum of Natural History, Smithsonian Institution, 3Department of Geology and Geophysics, Program in Ecology, University of Wyoming, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan Herbarium, 5Department of Earth and Environmental Sciences, Wesleyan University, 6Department of Geosciences, Baylor University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół pokazuje cyfrowy pomiar i analizę ciągłych cech fizjonomicznych liści na skamieniałych liściach w celu rekonstrukcji paleoklimatu i paleoekologii przy użyciu metod rekonstrukcji cyfrowej fizjonomii liści i masy liści na obszar.

Streszczenie

Klimat i środowisko silnie wpływają na wielkość, kształt i uzębienie (fizjonomię) liści roślin. Relacje te, szczególnie u zdrewniałych niejednoliściennych roślin okrytozalążkowych, zostały wykorzystane do opracowania opartych na liściach wskaźników zastępczych dla paleoklimatu i paleoekologii, które zostały zastosowane do rekonstrukcji starożytnych ekosystemów lądowych w ciągu ostatnich ~ 120 milionów lat historii Ziemi. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że relacje te zostały udokumentowane u żywych roślin, są one ważne dla zrozumienia aspektów ewolucji roślin i tego, jak rośliny reagują na zmiany klimatyczne i środowiskowe. Aby przeprowadzić tego typu analizy na roślinach nowoczesnych i kopalnych, fizjonomia liści musi być dokładnie zmierzona przy użyciu powtarzalnej metodologii. Protokół ten opisuje komputerową metodę pomiaru i analizy różnych zmiennych fizjonomicznych liści we współczesnych i kopalnych liściach. Metoda ta pozwala na pomiar cech fizjonomicznych liści, w szczególności zmiennych związanych z ząbkowaniem liści, powierzchnią liścia, rozwarstwieniem liścia i liniowością, które są wykorzystywane w cyfrowym proxy fizjonomii liści do rekonstrukcji paleoklimatu, a także szerokości ogonków liściowych i powierzchni liści, które są wykorzystywane do rekonstrukcji masy liści na obszar, paleoekologicznego wskaźnika zastępczego. Ponieważ ta cyfrowa metoda pomiaru cech liści może być stosowana do roślin kopalnych i żywych, nie ogranicza się do zastosowań związanych z rekonstrukcją paleoklimatu i paleoekologii. Może być również używany do badania cech liści, które mogą być pouczające dla zrozumienia funkcji morfologii liści, rozwoju liści, filogenetycznych relacji cech liści i ewolucji roślin.

Wprowadzenie

Liście są podstawowymi jednostkami produkcyjnymi, które ułatwiają wymianę energii (np. światła, ciepła) i materii (np. dwutlenku węgla, pary wodnej) między rośliną a otaczającym ją środowiskiem1,2. Aby spełniać te funkcje, liście muszą mechanicznie podtrzymywać własny ciężar wbrew grawitacji w nieruchomym i wietrznym powietrzu 3,4. Ze względu na te nieodłączne powiązania, kilka aspektów rozmiaru, kształtu i uzębienia liści (fizjonomia) odzwierciedla szczegóły ich funkcji i biomechaniki oraz zapewnia wgląd w ich środowisko i ekologię. Wcześniejsze prace pozwoliły określić ilościowo relacje między fizjonomią liści, klimatem i ekologią we współczesnym świecie, aby ustalić wskaźniki zastępcze, które można zastosować do zbiorowisk skamieniałych liści5,6. Te dane zastępcze dają ważne możliwości rekonstrukcji paleoklimatu i paleoekologii oraz przyczyniają się do lepszego zrozumienia złożonych wzajemnych oddziaływań między różnymi systemami planety na przestrzeni jej historii. W tym artykule szczegółowo opisano metody niezbędne do wykorzystania dwóch wskaźników zastępczych: 1) metody rekonstrukcji masy liści na obszar w celu wyjaśnienia paleoekologii oraz 2) cyfrowej fizjonomii liści w celu rekonstrukcji paleoklimatu.

Sucha masa liści na powierzchnię (M A) jest często mierzoną cechą roślin zarówno w neo- jak i paleobotanice. Podstawową wartością MA, szczególnie w przypadku rekonstrukcji skamieniałości, jest to, że jest ona częścią spektrum ekonomii liści, skoordynowanej osi dobrze skorelowanych cech liści, która obejmuje szybkość fotosyntezy liści, długowieczność liści i zawartość składników odżywczych w liściach według masy7. Zdolność do rekonstrukcjiMA ze skamieniałości daje wgląd w te inaczej niedostępne procesy metaboliczne i chemiczne, a ostatecznie może ujawnić przydatne informacje na temat strategii ekologicznej roślin i funkcji ekosystemu.

Royer et al.5 opracowali metodę szacowania MA zdrewniałych, niejednoliściennych (dwuliściennych) skamieniałych liści okrytozalążkowych na podstawie powierzchni blaszki liściowej i szerokości ogonka liściowego. Teoretycznie ogonek liściowy działa jak wspornik, utrzymując ciężar liścia w optymalnej pozycji3,4. Pole przekroju ogonka liściowego, które stanowi najważniejszy składnik wytrzymałości belki, powinno być zatem silnie skorelowane z masą liścia. Upraszczając kształt ogonka liściowego do cylindrycznej rurki, pole przekroju poprzecznego ogonka liściowego można przedstawić za pomocą kwadratu szerokości ogonka, co pozwala na oszacowanie masy liścia na podstawie dwuwymiarowej skamieniałości (więcej szczegółów można znaleźć w Royer et al.5). Powierzchnię liści można mierzyć bezpośrednio. Razem, szerokość ogonka kwadratowa podzielona przez powierzchnię liścia (tj. metryka ogonka; Tabela 1) stanowi dobry wskaźnik zastępczy dla skamieniałości MA i pozwala paleobotanikom wkroczyć w nowoczesną ekologię opartą na cechach. Metody rekonstrukcji MA zostały również rozszerzone na nagonasienne szerokolistne i ogonkowe nagonasienne5,8, zielne okrytozalążkowe 8 i ferns9, które dały relacje różniące się od relacji obserwowanych dla drzewiastych okrytozalążkowych dwuliściennych roślin okrytozalążkowych i między sobą. Rozszerzony zestaw danych drzewiastych dwuliściennych i nowe równania regresji do rekonstrukcji wariancji i średniej MA na poziomie miejsca pozwalają wnioskować o różnorodności strategii ekonomicznych liści i o tym, jakie strategie są najbardziej rozpowszechnione wśród drzewiastych dwuliściennych roślin okrytozalążkowych we florach kopalnych10.

Związek między fizjonomicznymi cechami liści a ich klimatem jest obserwowany od ponad wieku11,12. W szczególności fizjonomia zdrewniałych liści okrytozalążkowych roślin okrytozalążkowych jest silnie skorelowana z temperaturą i wilgotnością13. Ta zależność stała się podstawą dla wielu jednowymiarowych14,15,16,17 i wielowymiarowych6,18,19,20,21,22 Fizjonomiczne wskaźniki zastępcze liści dla paleoklimatu lądowego. Zarówno jednowymiarowe, jak i wielowymiarowe metody paleoklimatyczne fizjonomicznej liści były szeroko stosowane do zdominowanej przez rośliny okrytozalążkowe flory kopalnej na wszystkich kontynentach obejmujących ostatnie ~120 milionów lat historii Ziemi (od kredy do współczesności)23.

Dwie podstawowe obserwacje wykorzystywane w fizjonomicznych wskaźnikach paleoklimatycznych liści to 1) związek między rozmiarem liścia a średnim rocznym opadem (MAP) oraz 2) związek między zębami liści (tj. zewnętrznymi rzutami brzegu liścia) a średnią roczną temperaturą (MAT). W szczególności średni rozmiar liści wszystkich zdrewniałych gatunków okrytozalążkowych okrytozalążkowych na danym stanowisku jest dodatnio skorelowany z MAP, a odsetek zdrewniałych gatunków okrytozalążkowych okrytozalążkowych w miejscu z ząbkowanymi liśćmi, oprócz wielkości i liczby zębów, ujemnie koreluje z MAT6,12,13,14,15,16,24.

Funkcjonalny związek między tymi relacjami między fizjonomią liści a klimatem jest silnie wspierany zarówno przez teorię, jak i obserwację1,2,25. Na przykład, chociaż większe liście zapewniają większą powierzchnię fotosyntetyczną, wymagają większego wsparcia, tracą więcej wody w wyniku transpiracji i zatrzymują więcej ciepła odczuwalnego dzięki grubszej warstwie granicznej 1,26,27. Tak więc większe liście są bardziej powszechne w wilgotniejszym, cieplejszym środowisku, ponieważ utrata wody w wyniku zwiększonej transpiracji skutecznie chłodzi liście i jest mniej problematyczna. Natomiast mniejsze liście w bardziej suchym, gorącym klimacie zmniejszają straty wody i pozwalają uniknąć przegrzania, zwiększając odczuwalne straty ciepła28,29. Szczegóły dotyczące tego, jakie czynniki lub ich kombinacja najsilniej przyczyniają się do wyjaśnienia powiązań funkcjonalnych, pozostają zagadkowe w przypadku innych cech liści. Na przykład, zaproponowano kilka hipotez wyjaśniających związek między zębami liści a MAT, w tym chłodzenie liści, wydajne pakowanie pąków, zwiększone wsparcie i zaopatrzenie cienkich liści, gutacja przez hydatody i zwiększona produktywność na początku sezonu30,31,32,33.

Większość wskaźników paleoklimatycznych fizjonomicznych liści opiera się na kategorycznym podziale cech liści, a nie na ilościowych pomiarach zmiennych ciągłych, co prowadzi do kilku potencjalnych niedociągnięć. Podejście kategoryczne wyklucza włączenie bardziej szczegółowych informacji uzyskanych w wyniku ciągłych pomiarów, które są silnie skorelowane z klimatem (np. liczba zębów, liniowość liści), co może zmniejszyć dokładność szacunków paleoklimatycznych6,20,34. Dodatkowo, w niektórych metodach oceny cech liści, cechy oceniane kategorycznie mogą być niejednoznaczne, co prowadzi do problemów z odtwarzalnością, a niektóre cechy mają ograniczone dowody empiryczne na poparcie ich funkcjonalnego związku z klimatem6,15,16,35,36.

Aby zaradzić tym niedociągnięciom, Huff et al.20 zaproponowali cyfrowy pomiar ciągłych cech liści metodą znaną jako cyfrowa fizjonomia liści (DiLP). Kluczową przewagą DiLP nad poprzednimi metodami jest jego oparcie na cechach, które 1) mogą być wiarygodnie mierzone u wszystkich użytkowników, 2) mają ciągły charakter, 3) są funkcjonalnie powiązane z klimatem oraz 4) wyświetlają plastyczność fenotypową między sezonami wegetacyjnymi6,37. Doprowadziło to do dokładniejszych szacunków MAT i MAP niż poprzednie metody paleoklimatyczne fizjonomicznej liści6. Ponadto metoda ta uwzględnia niedoskonały charakter zapisu kopalnego, dostarczając kroków w celu wyjaśnienia uszkodzonych i niekompletnych liści. Metoda DiLP została z powodzeniem zastosowana do szeregu skamieniałych flor z wielu kontynentów obejmujących szeroki zakres czasu geologicznego6,38,39,40,41,42.

Poniższy protokół jest rozszerzeniem tego opisanego we wcześniejszym work5,6,20,34. Wyjaśnione zostaną procedury niezbędne do rekonstrukcji paleoklimatu i paleoekologii na podstawie zdrewniałych liści okrytozalążkowych roślin okrytozalążkowych przy użyciu metod rekonstrukcji DiLP iM A (patrz Tabela 1 w celu wyjaśnienia zmiennych mierzonych i obliczanych przy użyciu tego protokołu). Ponadto protokół ten zawiera kroki do rejestrowania i obliczania cech liści, które nie są uwzględnione w analizie DiLP lubMA, ale które są łatwe do wdrożenia i zapewniają użyteczne charakterystyki fizjonomii liści (Tabela 1). Protokół ma następujący format: 1) Obrazowanie skamieniałych liści; 2) cyfrowe przygotowanie liści, podzielone na pięć możliwych scenariuszy przygotowania; 3) cyfrowy pomiar liścia, zorganizowany w te same pięć możliwych scenariuszy przygotowania; oraz 4) Analizy DiLP i MA przy użyciu pakietu R dilp10.

Protokół rekonstrukcjiM A jest wbudowany w protokół DiLP, ponieważ oba są wygodne do przygotowania i mierzenia obok siebie. Jeśli użytkownik jest zainteresowany tylko analizamiMA, powinien postępować zgodnie z krokami przygotowania opisanymi w scenariuszu przygotowania DiLP 2, niezależnie od tego, czy brzeg liścia jest ząbkowany, czy nie, oraz krokami pomiarowymi opisującymi tylko szerokość ogonka, powierzchnię ogonka liściowego i powierzchnię liścia. Użytkownik może następnie uruchomić odpowiednie funkcje w pakiecie dilp R, który wykonuje rekonstrukcjeMA.

Protokół

1. Obrazowanie skamieniałych liści

  1. Umieść skamielinę liścia pod kamerą i upewnij się, że leży tak płasko, jak to możliwe, używając na przykład piaskownicy lub szpachli, aby zaklinować się pod skamieliną.
    UWAGA: Fotografując wiele okazów na jednym bloku, najlepiej jest fotografować je osobno jako zbliżenia, aby upewnić się, że szczegóły skamieniałości są wyraźne i ostre. Przydatne jest również umieszczenie skamieniałości na jednolitym ciemnym matowym tle, takim jak filc lub aksamit
    2. .
  2. Umieść pasek skali poziomo i w tej samej płaszczyźnie pionowej co liść, umieszczając go blisko skamieliny, ale nie zakrywając żadnych jej części. Jeśli wokół skamieniałości jest niewiele lub nie ma jej wcale, skala powinna być umieszczona w ramce na zdjęcia i ostra.
  3. Używając statywu do aparatu lub stojaka do kopiowania, ustaw aparat bezpośrednio nad skamieniałym liściem, tak aby obiektyw był równoległy do powierzchni skały. Aby upewnić się, że szczegóły liścia są ostro uchwycone, ustaw aparat jak najbliżej skamieliny, pozostając w odległości ogniskowej obiektywu/aparatu i upewniając się, że cała skamielina znajduje się w kadrze zdjęcia.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, najlepiej jest używać aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości i obiektywu makro z ręcznym ustawianiem ostrości i wystarczającą głębią ostrości, aby wyraźnie ustawić ostrość na liściu, który będzie przetwarzany.
  4. Używając światła pośredniego, oświetl skamielinę w razie potrzeby, aby wyraźnie zobaczyć cały zarys okazu. Często konieczne jest ponowne dostosowanie oświetlenia dla każdej skamieniałości.
  5. Sfotografuj skamieniały liść i odpowiednio oznacz plik obrazu.

2. Przygotowanie cyfrowe

UWAGA: Ilustracja terminologii architektonicznej liści używanej w tych protokołach znajduje się w Rysunek 1. Użyj drzewa decyzyjnego (Rysunek 2) i podanych przykładów (Rysunek 3), aby określić, który scenariusz przygotowania ma zastosowanie do skamielinowego liścia, który ma być mierzony, i przejdź do tej odpowiedniej sekcji. Odniesienie do tabeli 2 zawiera dodatkowe informacje na temat etapów przygotowania. Jeśli liść mieści się w scenariuszu 1 lub 5, nie można go przygotować do ilościowych pomiarów fizjonomii liścia.

  1. Scenariusz 2: Cały liść z marginesem, którego powierzchnia lub połowa obszaru jest zachowana lub może być zrekonstruowana.
    1. Otwórz plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (np. Adobe Photoshop lub GIMP). W razie potrzeby przytnij obraz, co pomaga zmniejszyć ostateczny rozmiar pliku, ale zapewnia, że pasek skali jest nadal uwzględniony.
    2. Podwój szerokość obszaru roboczego, klikając Obraz > płótno (Photoshop); Obraz > rozmiar płótna (GIMP). Sugerowane jest dodanie nowego płótna po prawej lub lewej stronie bieżącego płótna.
    3. Jeśli brzeg liścia wymaga pewnej rekonstrukcji, zdecyduj, czy powierzchnia i kształt liścia mogą być bardziej wiarygodnie mierzone od połowy liścia czy od całego liścia (Rysunek 3).
    4. Skopiuj liść z matrycy skalnej. Obrysuj cały liść lub jego połowę, łącznie z ogonkiem liściowym, jeśli jest obecny, za pomocą narzędzia lasso (patrz tabela 2). Skopiuj i wklej zaznaczenie, a następnie umieść je w otwartym obszarze płótna. Rozważ wklejenie dwóch kopii tego wyboru, z których jedna jest nieedytowana, aby wrócić do niej w razie potrzeby, aby ponownie uruchomić proces przygotowania.
    5. Napraw wszelkie uszkodzone części marginesu, używając linii o odpowiednim kolorze (zwykle czarnej, jeśli znajduje się na białym tle). Narysuj linię, która rozciąga się na uszkodzonym marginesie, tak aby margines został niezawodnie zrekonstruowany, na przykład za pomocą pędzla lub narzędzia do kreskowania. Upewnij się, że linia jest wystarczająco gruba, aby była widoczna (~1-2 pkt wagi) i że łączy margines w poprzek uszkodzonego obszaru.
    6. Usuń ogonek liściowy z liścia, jeśli jest obecny, za pomocą narzędzia lasso.
      1. Wizualnie podążaj za brzegiem liścia wzdłuż podstawy, aż do momentu, w którym zetknie się z ogonkiem, który często ma ciemniejszy kolor i nie zawiera charakterystycznych żyłek. Umieść tam punkt lasso. Zrób to samo na drugiej połowie liścia i umieść tam drugi punkt.
        UWAGA: Jeśli podstawa liścia jest symetryczna, linia będzie ~prostopadła do ogonka; Jeśli jest asymetryczny, linia będzie pod kątem.
      2. Owiń cały ogonek, aby zakończyć wybór. Wytnij i wklej lub użyj narzędzia do przesuwania, aby umieścić ogonek liściowy obok blaszki liściowej, ale jej nie dotykając.
        UWAGA: W przypadku sercowatej lub klapowatej podstawy liścia, co oznacza, że podstawa rozciąga się poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej, ogonek liściowy może spoczywać na podstawie liścia poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej. Uważaj, aby wyciąć ogonek liściowy w miejscu, w którym faktycznie się przyczepia, dokładnie prześledź brzeg ogonka i napraw powstały uszkodzony brzeg. Uznaje się, że może to być trudne do zauważenia w większości skamieniałości.
    7. W razie potrzeby przytnij ostatni obszar obrazu, aby zmniejszyć rozmiar pliku. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu, jak powinien wyglądać ukończony przygotowany obraz.
  2. Scenariusz 3: ząbkowany liść, którego powierzchni lub połowy powierzchni nie można zrekonstruować, ale ma ≥ dwa kolejne zęby i zachowane ≥25% liścia
    UWAGA: Wymiary zębów są jedynymi cechami, które można zmierzyć na liściach z tej kategorii, dlatego liście są przygotowane tylko do tych pomiarów.
    1. Otwórz plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (np. Adobe Photoshop lub GIMP). W razie potrzeby przytnij obraz, co pomoże zmniejszyć ostateczny rozmiar pliku, ale upewnij się, że pasek skali jest nadal uwzględniony.
    2. Flaki, aby czterokrotnie zwiększyć szerokość obszaru roboczego, klikając Obraz > Płótno (Photoshop); Obraz > rozmiar płótna (GIMP). Sugerowane jest dodanie nowego płótna po prawej lub lewej stronie bieżącego płótna.
    3. Skopiuj liść z matrycy skalnej. Prześledź zakres zachowanego liścia, w tym ogonek liściowy, jeśli jest obecny, za pomocą narzędzia lasso. Nie martw się o śledzenie uszkodzonych części marginesu właśnie dlatego, że zostaną one usunięte. Skopiuj i wklej zaznaczenie, a następnie umieść je w otwartym obszarze płótna. Rozważ wklejenie dwóch kopii tego wyboru, z których jedna jest nieedytowaną wersją, do której można wrócić w razie potrzeby, aby ponownie uruchomić proces przygotowania.
    4. Jeśli jest obecny, usuń ogonek liściowy za pomocą narzędzia lasso.
      1. Wizualnie podążaj za brzegiem liścia wzdłuż podstawy, aż do momentu, w którym zetknie się z ogonkiem, który często ma ciemniejszy kolor i nie zawiera charakterystycznych żyłek. Umieść tam punkt lasso. Zrób to samo na drugiej połowie liścia i umieść tam drugi punkt.
        UWAGA: Jeśli podstawa liścia jest symetryczna, linia będzie ~prostopadła do ogonka, jeśli jest asymetryczna, linia będzie pod kątem.
      2. Owiń cały ogonek, aby zakończyć wybór. Wytnij i wklej lub użyj narzędzia do przesuwania, aby umieścić ogonek liściowy obok blaszki liściowej, ale jej nie dotykając.
        UWAGA: W przypadku sercowatej lub klapowatej podstawy liścia, co oznacza, że podstawa rozciąga się poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej, ogonek liściowy może spoczywać na podstawie liścia poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej. Uważaj, aby wyciąć ogonek liściowy w miejscu, w którym faktycznie się przyczepia, dokładnie prześledź brzeg ogonka i napraw powstały uszkodzony brzeg. Może to być trudne do zauważenia w większości skamieniałości.
    5. Usuń obszar przylegający do uszkodzonych części marginesu za pomocą narzędzia lasso.
      1. Rozpocznij zaznaczanie w punkcie wzdłuż marginesu, który ogranicza uszkodzoną część i narysuj linię prostą od tego punktu do głównej żyły, która jest prostopadła do tej głównej żyły (Rysunek 4). Selekcję należy rozpocząć od zachowanej zatoki zęba mlecznego znajdującej się najbliżej uszkodzenia. Gwarantuje to, że bok zęba nie jest uwzględniany jako obwód wewnętrzny w kolejnych pomiarach, a zęby pomocnicze nie są mierzone tak, jakby były zębami mlecznymi. Może to nie być właściwe, jeśli zęby są oddalone od siebie, ponieważ zbyt dużo zachowanego marginesu może skończyć się usunięciem (Rysunek 4).
      2. Kontynuuj zaznaczanie wzdłuż żyły głównej, aż znajdzie się na poziomie drugiej granicy uszkodzonego brzegu i narysuj linię prostą prostopadłą do żyły głównej do brzegu (Rysunek 4).
        UWAGA: Dla liści pierzastych (Ryc. 1A), z i bez agroficznych żyłek (patrz Ellis et al.43), główną żyłą jest żyłka pierwotna (tj. nerw środkowa). Dla liści z żyłkami palmowymi (Rysunek 1B,D), główną żyłą jest najbliższa żyłka pierwotna (np. Ryc. 4B). W przypadku liści pierzasto klapowanych (Rysunek 1C), jeśli uszkodzenie znajduje się na płacie pierzastym, główną żyłą jest żyła (zazwyczaj żyła wtórna), która zasila płat.
      3. Zakończ zaznaczanie i usuń tę część liścia. Powtórz dla wszystkich uszkodzonych części liścia.
    6. Skopiuj i wklej ten przygotowany liść i umieść go w otwartej przestrzeni płótna.
    7. Usuń zęby za pomocą narzędzia lasso.
      1. Zacznij od wierzchołka liścia, jednego z wierzchołków płata lub najbardziej wierzchołkowego zęba fragmentu liścia i dokonaj selekcji w każdej zatoce zęba mlecznego wzdłuż tego liścia, płata lub fragmentu (Rysunek 5; zobacz Rysunek Uzupełniający 1, Rysunek Uzupełniający 2, aby uzyskać wskazówki, jak odróżnić zęby mleczne i pomocnicze oraz jak odróżnić zęby od płatów). Pamiętaj, aby przestrzegać odpowiednich zasad podczas wycinania zębów (Tabela 2; Rysunek uzupełniający 3).
        UWAGA: Zęby mleczne często stają się mniejsze w kierunku podstawy i wierzchołka.
      2. Po wybraniu zatoki wierzchołkowej najbardziej podstawowego zęba należy zastosować regułę przedłużania (tab. 2; Rysunek uzupełniający 4), aby wyciąć ostatni ząb sekwencji.
      3. Usuń zęby, wycinając i wklejając zęby obok blaszki liściowej z usuniętymi zębami bez dotykania jej. Jeśli preparat posiada dodatkowe płatki liści lub fragmenty, które wymagają usunięcia zębów, należy powtarzać powyższe kroki, aż do usunięcia wszystkich zębów.
    8. Jeśli została utworzona dodatkowa wersja oryginalnego liścia do wycinania, usuń dodatkową wersję. W razie potrzeby przytnij ostatni obszar obrazu, aby zmniejszyć rozmiar pliku. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu, jak powinien wyglądać ukończony przygotowany obraz.
  3. Scenariusz 4: ząbkowany liść, którego powierzchnia lub powierzchnia liścia jest zachowana lub może być zrekonstruowana
    1. Otwórz plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (np. Adobe Photoshop lub GIMP). W razie potrzeby przytnij obraz, co pomoże zmniejszyć ostateczny rozmiar pliku, ale upewnij się, że pasek skali jest nadal uwzględniony.
    2. Flaki, aby czterokrotnie zwiększyć szerokość obszaru roboczego, klikając Obraz > Płótno (Photoshop); Obraz > rozmiar płótna (GIMP). Sugerowane jest dodanie nowego płótna po prawej lub lewej stronie bieżącego płótna.
    3. Zdecyduj, w jaki sposób liść zostanie przygotowany. Pomiary powierzchni/kształtu liścia należy wykonać na całym liściu lub półliściu, zdecyduj, która opcja spowoduje dokładniejsze pomiary. Pomiary zębów powinny być wykonane wzdłuż wszystkich odcinków zachowanego marginesu. W niektórych przypadkach pomiary powierzchni/kształtu liścia mogą wystąpić na innym podzbiorze liścia niż podzbiór, w którym mierzone są zmienne zębów.
      UWAGA: W podanym przykładzie (Rysunek 6) zdecydowano, że połowa liścia będzie bardziej wiarygodnie zrekonstruowana niż cały liść. Zachowany margines w prawym dolnym rogu (>1 zachowany ząb) został uwzględniony do wymiarów zębów. Poniższy protokół dla scenariusza 4 jest w przybliżeniu zgodny z podanym przykładem (Rysunek 6), ale szczegóły mogą się nieznacznie różnić w różnych kontekstach przygotowania.
    4. Skopiuj liść z matrycy skalnej, upewniając się, że zawiera wszystkie zachowane marginesy.
      1. Obrysuj brzeg liścia, w tym ogonek liściowy, jeśli jest obecny, za pomocą narzędzia lasso. Nie należy śledzić uszkodzonych części marginesu, które nie zostaną uwzględnione w pomiarach powierzchni/kształtu właśnie dlatego, że zostaną usunięte (np. prawa połowa liścia w Rysunek 6).
      2. Skopiuj i wklej zaznaczenie, a następnie umieść je w otwartym obszarze płótna. Rozważ wklejenie dwóch kopii tego zaznaczenia, z których jedna jest nieedytowana, aby wrócić do niej w razie potrzeby, aby ponownie uruchomić proces przygotowania.
    5. Jeśli jest obecny, usuń ogonek liściowy z liścia za pomocą narzędzia lasso.
      1. Wizualnie podążaj za brzegiem liścia wzdłuż podstawy, aż do momentu, w którym zetknie się z ogonkiem, który często ma ciemniejszy kolor i nie zawiera charakterystycznych żyłek. Umieść tam punkt lasso. Zrób to samo na drugiej połowie liścia i umieść tam drugi punkt.
        UWAGA: Jeśli podstawa liścia jest symetryczna, linia będzie ~prostopadła do ogonka; Jeśli jest asymetryczny, linia będzie pod kątem. Owiń cały ogonek, aby zakończyć wybór.
      2. Wytnij i wklej lub użyj narzędzia do przesuwania, aby umieścić ogonek obok liścia, ale go nie dotykając.
        UWAGA: W przypadku sercowatej lub klapowatej podstawy liścia, co oznacza, że podstawa rozciąga się poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej, ogonek liściowy może spoczywać na podstawie liścia poniżej miejsca, w którym ogonek liściowy przyczepia się do blaszki liściowej. Uważaj, aby wyciąć ogonek liściowy w miejscu, w którym się przyczepia, dokładnie prześledź brzeg ogonka i napraw powstały uszkodzony brzeg (rysunek uzupełniający 5). Może to być trudne do zauważenia w większości skamieniałości.
    6. Skopiuj i wklej izolowany liść z usuniętym ogonkiem, aby utworzyć drugą kopię, aby przygotować się do pomiarów zębów i umieścić ją w otwartej przestrzeni płótna.
    7. Przygotuj wersję liścia do pomiaru powierzchni i kształtu liścia.
      1. Jeśli przygotowujesz pół liścia, odetnij nadmiar materiału liściowego za pomocą narzędzia lasso, aby pozostała tylko cała połowa liścia. Jeśli przygotowujesz cały liść, nie usuwaj żadnego materiału liściowego.
      2. W razie potrzeby napraw uszkodzone obszary wzdłuż marginesu za pomocą linii o odpowiednim kolorze za pomocą linii lub pędzla (zwykle jest to linia dla białego tła). Upewnij się, że linia jest wystarczająco gruba, aby była widoczna (~1-2 pkt wagi) i że łączy margines w poprzek uszkodzonego obszaru.
    8. Przygotuj wersję liścia do wymiarów zębów.
      1. Usuń obszar przylegający do uszkodzonych części marginesu za pomocą narzędzia lasso.
        1. Rozpocznij zaznaczanie w punkcie wzdłuż marginesu, który ogranicza uszkodzoną część i narysuj linię prostą od tego punktu do głównej żyły, która jest prostopadła do tej głównej żyły (Rysunek 4). Selekcję należy rozpocząć od zachowanej zatoki zęba mlecznego znajdującej się najbliżej uszkodzenia. Gwarantuje to, że bok zęba nie jest uwzględniany jako obwód wewnętrzny w kolejnych pomiarach, a zęby pomocnicze nie są mierzone tak, jakby były zębami mlecznymi. Może to nie być właściwe, jeśli zęby są oddalone od siebie, ponieważ zbyt dużo zachowanego marginesu może skończyć się usunięciem (Rysunek 4).
        2. Kontynuuj zaznaczanie wzdłuż żyły głównej, aż znajdzie się na poziomie drugiej granicy uszkodzonego brzegu i narysuj linię prostą prostopadłą do żyły głównej do brzegu (Rysunek 4).
          UWAGA: Dla liści pierzastych (Ryc. 1A), z i bez agroficznych żyłek (zobacz Ellis et al.43 dla definicji i przykładów), główną żyłą jest żyłka pierwotna (tj. nerw środkowy). Dla liści z żyłkami palmowymi (Rysunek 1B,D), główną żyłą jest najbliższa żyłka pierwotna (np. Ryc. 4B). W przypadku liści pierzasto klapowanych (Rysunek 1C), jeśli uszkodzenie znajduje się na płacie pierzastym, główną żyłą jest żyła (zazwyczaj żyła wtórna), która zasila płat.
        3. Usuń uszkodzoną część liścia. Zrób to samo ze wszystkimi uszkodzonymi częściami liścia.
    9. Skopiuj i wklej wersję przygotowaną do pomiarów zębów, z usuniętymi uszkodzonymi częściami i umieść w otwartej przestrzeni płótna.
    10. Usuń zęby za pomocą narzędzia lasso.
      1. Zacznij od wierzchołka liścia, jednego z wierzchołków płata lub najbardziej wierzchołkowego zęba fragmentu liścia i dokonaj selekcji na każdej zatoce zęba mlecznego wzdłuż liścia, płata lub fragmentu (Rycina 5; zobacz Rysunek Uzupełniający 2, aby uzyskać wskazówki, jak odróżnić zęby mleczne i pomocnicze oraz jak odróżnić zęby od płatów). Pamiętaj, aby przestrzegać odpowiednich zasad podczas wycinania zębów (Tabela 2; Rysunek uzupełniający 2).
        UWAGA: Zęby mleczne często stają się mniejsze w kierunku podstawy i wierzchołka.
      2. Po wybraniu zatoki wierzchołkowej najbardziej podstawowego zęba należy zastosować regułę przedłużania (tab. 2; Rysunek uzupełniający 4), aby wyciąć ostatni ząb sekwencji.
      3. Usuń zęby, wycinając i wklejając zęby obok blaszki liściowej z usuniętymi zębami bez dotykania jej. Jeśli preparat posiada dodatkowe płatki liści lub fragmenty, które wymagają usunięcia zębów, należy powtarzać powyższe kroki, aż do usunięcia wszystkich zębów.
    11. Jeśli została utworzona dodatkowa wersja oryginalnego wyciętego liścia, usuń dodatkową wersję. W razie potrzeby przytnij ostatni obszar obrazu, aby zmniejszyć rozmiar pliku. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu, jak powinien wyglądać ukończony przygotowany obraz.

3. Pomiar cyfrowy

UWAGA: Arkusz kalkulacyjny szablonu wprowadzania danych jest dostarczany jako Plik uzupełniający 1. Odniesienie do tabeli 3 zawiera dodatkowe informacje na temat etapów pomiaru. W scenariuszach 1 i 5 jedynym wymaganym krokiem jest zarejestrowanie stanu marginesu liścia w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych (krok 3.5).

  1. Otwórz oprogramowanie ImageJ44. Ustaw, które pomiary będą wykonywane automatycznie (zrób to raz po zainstalowaniu programu).
  2. Kliknij przycisk Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz tylko pole powierzchni, obwód i średnicę Fereta. Upewnij się, że miejsca dziesiętne są ustawione na 3.
  3. Otwórz przygotowany obraz skamieniałego liścia, klikając Plik > Otwórz lub po prostu przeciągając i upuszczając obraz na już otwarty pasek narzędzi ImageJ.
  4. Ustawianie skali dla każdego nowego obrazu liścia.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok i należy go wykonać dla każdego nowego obrazu liścia, aby zapewnić dokładne pomiary.
    1. Kliknij narzędzie Linia prosta. Powiększ pasek skali i narysuj najdłuższą możliwą linię prostą w poprzek podziałki liniowej.
    2. Kliknij przycisk Analizuj > ustaw skalę. W polu znana odległość wprowadź długość mierzoną w cm (aby zachować spójność z jednostką używaną w nowoczesnym zestawie danych kalibracyjnych). Nie ma potrzeby zmiany jednostki długości. Kliknij przycisk OK.
  5. Oznacz liść jako ząbkowany (0) lub cały (1) w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
  6. Zmierz szerokość ogonka, jeśli ogonek jest obecny. Pomiarów należy dokonywać na oryginalnej kopii liścia znajdującego się jeszcze w matrycy skalnej, ponieważ zapewnia to znacznie lepszy kontekst.
    UWAGA: Jeśli ogonek liściowy nie jest obecny, w niektórych przypadkach zamiast ogonka można zmierzyć szerokość żyły środkowej w pozycji podstawnej. Należy to jednak zrobić tylko wtedy, gdy zachowana jest cała szerokość nerwu środkowego (tj. nie ma blaszki ściśniętej na szczycie nerwu lub skamieniałość zachowuje odblaskową stronę liścia), a inne okazy z tego samego gatunku lub morfotypu wykazują, że szerokość nerwu podstawnego jest równoważna szerokości ogonka liściowego.
    1. Narysuj linię prostą prostopadłą do ogonka, w miejscu, w którym ogonek styka się z blaszką liściową, lub jeśli punkt włożenia jest asymetryczny, narysuj linię prostopadłą do ogonka liściowego w najbardziej podstawowym punkcie włożenia. Ważne jest, aby dokładnie narysować tę granicę. Dlatego zaleca się powiększenie tego obszaru liścia, aby ułatwić precyzyjne narysowanie linii.
      UWAGA: Istnieją szczególne okoliczności, w których ten krok musi zostać zmodyfikowany, w tym jeśli w najbardziej podstawowym punkcie wprowadzenia występują uszkodzenia, trichomy, nektarniki, ciernie lub inne cechy, które uniemożliwiają dokładne pomiary szerokości ogonka. W takich przypadkach należy zmierzyć szerokość ogonka liściowego w pierwszym punkcie poniżej elementu, w którym można wiarygodnie wykonać pomiar.
    2. Kliknij przycisk Analizuj > Zmierz lub użyj skrótu, aby zmierzyć długość narysowanej linii. Narysuj tę samą linię na obrazie, aby utworzyć zapis dokładnie miejsca, w którym został wykonany pomiar, klikając Edytuj > Rysuj lub używając skrótu. W razie potrzeby zmień kolor linii za pomocą narzędzia na głównym pasku narzędzi (próbnika kolorów).
    3. Po narysowaniu linii zapisz obraz, najlepiej pod zmodyfikowaną nazwą pliku.
    4. Zapisz długość tej linii pod szerokością ogonka w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
  7. Przygotuj liść do dodatkowych pomiarów, ustawiając obraz jako czarno-biały. Aby to zrobić, kliknij Obraz > Wpisz > 8 bit.
  8. Próg obrazu, klikając Obraz > Dostosuj > Próg lub użyj skrótu. Otworzy się okno zatytułowane Próg i zmieni część obrazu na czerwoną. Jeśli liść ma jasny kolor, a tło jest ciemne, kliknij przycisk Ciemne tło.
  9. Dostosuj próg za pomocą suwaka, aż wnętrze skrzydła stanie się czerwone i będzie odróżniać się od tła. Jest to krytyczny krok i łatwe miejsce do uzyskania nieprecyzyjnych danych. Upewnij się, że czerwony obszar odpowiada dokładnie liściowi (tj. cały obwód liścia jest czerwony i nie więcej), powiększając niektóre sekcje marginesu. Przerwy w kolorze czerwonym we wnętrzu skrzydła są dopuszczalne i nie wpływają na wymiary.
    UWAGA: Jeśli kontur liścia nie jest dobrze zdefiniowany, najpierw spróbuj wyregulować próg w powiększeniu, aby upewnić się, że kontur liścia jest czerwony. Jeśli słaby kontrast między skamieliną a tłem uniemożliwia zastosowanie wiarygodnego progu, użyj narzędzia pędzel, aby dodać solidny kontur do obwodu liścia w obszarach, w których kontrast jest zbyt słaby. Alternatywnie, zwróć liść do oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. Adobe Photoshop lub GIMP) i dostosuj kontrast izolowanych warstw liści lub kolor tła, aby lepiej je rozróżnić.
  10. Zmierz powierzchnię i kształt liści przygotowanych w scenariuszach 2 (krok 2.1) i 4 (krok 2.4).
    UWAGA: Użyj Rysunek 2 i Rysunek 6B jako wskazówkę, które zmienne są mierzone na których składnikach przygotowanego obrazu. Jeśli liście zostały przygotowane w scenariuszu 3 (krok 2.2), pomiń ten krok i przejdź do kroku 3.11.
    1. Zmierz liść przygotowany do pomiaru powierzchni i kształtu liścia, z którego powinien zostać usunięty tylko ogonek liściowy (jeśli ogonek liściowy był obecny). Wybierz narzędzie Różdżka. Kliknij na wnętrze liścia. Cały liść powinien być obrysowany na żółto — upewnij się, że kontur jest poprawny.
    2. Pomiary można wykonywać, klikając przycisk Analizuj > Zmierz lub używając skrótu.
    3. Jeśli mierzona powierzchnia jest przygotowana jako cały liść, zapisz powierzchnię, obwód, Feret i minimalną wartość Feret w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych. Jeśli mierzona powierzchnia jest przygotowana jako pół liścia, zapisz tylko Feret i przejdź do następnego kroku.
    4. Jeśli mierzony obszar jest połową liścia, zmierz sztuczny środkowy obwód liścia, który jest długością sztucznego obwodu, która wynika z przecięcia liścia na pół (Rysunek 6B). Jeśli mierzona powierzchnia obejmuje cały liść, pomiń ten krok i krok 3.10.5.
      UWAGA: Pomiar sztucznego obwodu środkowego pozwala na obliczenie obwodu ostrza na podstawie połówek liści (patrz krok 3.10.5 poniżej). Obwód łopatki nie jest używany w zmiennych uwzględnionych w analizach DiLP i MA, ale jest używany do innych zmiennych przydatnych do charakterystyki fizjonomii (np. współczynnik kształtu, zwartość; Tabela 1).
      1. Wybierz narzędzie linii segmentowej, klikając prawym przyciskiem myszy narzędzie Linia. Prześledź całą długość sztucznego środkowego obwodu.
      2. Kliknij przycisk Analizuj > Zmierz lub użyj skrótu, aby zmierzyć długość. Pomiar ten zostanie wykorzystany we wzorze do obliczenia obwodu łopatki poniżej (krok 3.10.5).
    5. Jeśli mierzony obszar to pół liścia, zmodyfikuj pomiary podczas wprowadzania ich do arkusza kalkulacyjnego wprowadzania danych, mnożąc powierzchnię przez 2, mnożąc minimalną liczbę Feret przez 2 i obliczając obwód źdźbła, najpierw odejmując sztuczny środkowy obwód od obwodu połowy liścia, a następnie mnożąc przez 2 przy użyciu następującego wzoru:
      Obwód ostrza = (obwód - sztuczny środkowy obwód) x 2
    6. Jeśli obecny jest wycięty ogonek, zmierz jego powierzchnię. Jeśli nie występuje, pomiar jest wykonywany dla scenariusza 2, ale przejdź do kroku 3.11 dla scenariusza 4.
      1. Kliknij wycięty ogonek za pomocą narzędzia różdżki. Ogonek liściowy powinien być obrysowany na żółto. Pomiary można wykonywać, klikając przycisk Analizuj > Zmierz lub używając skrótu. Zapisz obszar pod obszarem ogonka liściowego w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
    7. W przypadku scenariusza 2 (krok 2.1) pomiar jest teraz zakończony; w przypadku scenariusza 4 (krok 2.3) przejdź do następnego kroku.
  11. Zmierz zmienne zębów dla liści przygotowanych w scenariuszach 3 (krok 2.2) i 4 (krok 2.3).
    1. Zmierz surowe ostrze. Za pomocą narzędzia do różdżki wybierz wnętrze surowego ostrza (tj. liścia przygotowanego do wymiarów zębów, który nadal ma zęby; Rysunek 6B). Powinien być obrysowany na żółto. Pomiary można wykonywać, klikając przycisk Analizuj > Zmierz lub używając skrótu.
      UWAGA: W zależności od tego, jak liść został przygotowany, może być konieczne zmierzenie kilku rozłącznych sekcji, dodając ich obszary do siebie (np. Rysunek 6B). Alternatywnie możesz zaznaczyć wiele sekcji jednocześnie, wybierając drugą sekcję za pomocą narzędzia różdżki, przytrzymując Shift.
    2. Rejestruj obszar i obwód w obszarze nieprzetworzony obszar ostrza i nieprzetworzony obwód ostrza w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
    3. Zmierz wewnętrzne surowe ostrze. Wybierz wnętrze wewnętrznego surowego ostrza (tj. skrzydła przygotowanego do wymiarów zębów, w którym usunięto zęby; Rysunek 6B). Powinien być obrysowany na żółto. Pomiary można wykonywać, klikając przycisk Analizuj > Zmierz lub używając skrótu.
      UWAGA: W zależności od tego, jak liść został przygotowany, może być konieczne zmierzenie kilku rozłącznych sekcji, dodając ich obszary do siebie (np. Rysunek 6B). Alternatywnie możesz zaznaczyć wiele sekcji jednocześnie, wybierając drugą sekcję za pomocą narzędzia różdżki, przytrzymując Shift.
    4. Obszar i obwód rejestru w obszarze wewnętrzny obszar bloku nieprzetworzonego i wewnętrzny obwód bloku nieprzetworzonego w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
    5. Zmierz długość obwodu cięcia. Usuń próg, aby wyraźnie zobaczyć liść, kliknij przycisk Resetuj w polu progu lub kliknij przycisk Edytuj > Cofnij — ta ostatnia zwykle usuwa również czarno-białą konwersję 8-bitową. Wybierz narzędzie Linia segmentowa i obrysuj całą długość obwodu cięcia na surowym ostrzu.
    6. Zmierz, klikając przycisk Analizuj > Zmierz lub używając skrótu. Jeśli jest wiele porcji, powtórz poprzednie kroki, aby zmierzyć długość obwodu cięcia każdej porcji. Zapisz długość lub sumę długości w polu długość obwodu cięcia w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
      UWAGA: Obwód cięcia wprowadzany jest poprzez przygotowanie skrzydła poprzez usunięcie uszkodzeń. W większości przypadków różni się to od sztucznego środkowego obwodu (Rysunek 6B).
    7. Policz zęby mleczne i pomocnicze, jeśli są obecne.
      UWAGA: Patrz Rysunek Uzupełniający 2, aby uzyskać wskazówki dotyczące rozróżniania zębów mlecznych i pomocniczych.
      1. Jeśli próg nie został jeszcze usunięty, usuń go teraz. Aby usunąć próg, kliknij przycisk Resetuj w polu progu lub kliknij przycisk Edytuj > Cofnij — ta ostatnia zwykle powoduje również usunięcie konwersji czarno-białej 8-bitowej.
      2. Policz liczbę zębów mlecznych (patrz Rysunek Uzupełniający 2, aby uzyskać wskazówki, jak odróżnić zęby mleczne i pomocnicze). Wybierz narzędzie Punkty wielopunktowe. Może być konieczne kliknięcie prawym przyciskiem myszy narzędzia Punkt, aby wybrać narzędzie Wielopunktowe. Kliknij na każdy ząb mleczny, aby go ponumerować.
      3. Aby usunąć omyłkowo zaznaczony punkt, naciśnij Alt (system operacyjny Windows) lub Command/cmd lub Option (Mac OS), jednocześnie klikając punkt. Zapisz końcową liczbę pod # zębów mlecznych w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
      4. Wyczyść zliczanie narzędzi wielopunktowych i adnotacje, klikając kolejno opcje Edytuj > Zaznaczenie > Zaznacz brak lub używając skrótu klawiaturowego.
      5. Policz całkowitą liczbę zębów (tj. wszystkie zęby mleczne i pomocnicze obecne na liściu). Wybierz narzędzie Punkty wielopunktowe. Może być konieczne uprzednie kliknięcie prawym przyciskiem myszy narzędzia Punkt, aby wybrać narzędzie Wielopunktowe. Kliknij na każdy ząb, w tym główny i dodatkowy, aby go ponumerować.
        UWAGA: Liczenie całkowitej liczby zębów, a nie liczby zębów dodatkowych, gwarantuje, że żadne zęby nie są liczone podwójnie. Całkowita liczba zębów jest odejmowana przez liczbę zębów mlecznych w celu określenia liczby zębów pomocniczych (patrz krok 3.11.7.6).
      6. Aby usunąć omyłkowo zaznaczony punkt, naciśnij Alt (system operacyjny Windows) lub Command/cmd lub Option (Mac OS), jednocześnie klikając punkt. Odejmij liczbę zębów mlecznych od całkowitej liczby zębów, aby określić liczbę zębów dodatkowych. Zapisz to w polu # zębów podmiotów zależnych w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych.
        UWAGA: Niektórzy użytkownicy wolą liczyć zęby podczas przygotowywania obrazów liści niż podczas pomiaru.

4. Przeprowadzanie analiz w oprogramowaniu R

UWAGA: Poniższe kroki wymagają pakietu R dilp11. Arkusz kalkulacyjny wprowadzania danych jest wczytywany do języka R i używany przez pakiet. Zapoznaj się z zakładką Dodatkowe instrukcje w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych (plik uzupełniający 2). Skrypt języka R może obsługiwać analizę wielu witryn jednocześnie lub pojedynczej witryny.

  1. Otwórz język R przy użyciu preferowanego środowiska (zalecany jest program R Studio). Aby zapoznać się z wprowadzeniem do języka R, zobacz na przykład https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf.
  2. Zainstaluj pakiet dilp w sesji języka R. Więcej informacji na temat instalowania pakietu i uruchamiania powiązanych z nim funkcji można znaleźć w następującej witrynie internetowej: https://cran.r-project.org/package=dilp
  3. Odczytaj plik .csv zawierający kopalne dane o cechach liści okrytozalążkowych drzewiastych dwuliściennych (tj. dane zapisane w arkuszu kalkulacyjnym wprowadzania danych).
  4. Uruchom funkcję dilp() dla rekonstrukcji średniej rocznej temperatury (MAT) i średniej rocznej sumy opadów (MAP) z powiązanym błędem. Wyniki MAT i MAP są raportowane z modelu wielokrotnej regresji liniowej (MLR; tj. DiLP) i dwóch pojedynczych modeli regresji liniowej (SLR; tj. analizy powierzchni liści i marginesów). Uruchom funkcję lma() dla rekonstrukcji masy liści na powierzchnię (M A) na poziomie morfotypu i miejsca.
  5. Po uruchomieniu dilp() zaleca się sprawdzenie, czy nie występują potencjalne problemy z gromadzeniem danych i potwierdzenie ich jakości, patrząc na wartości odstające i obiekty błędów w zwróconych wynikach dilp(). Alternatywnie użyj funkcji dilp_processing(), a następnie dilp_outliers() i dilp_errors(). Rozwiąż wszelkie oznaczone problemy, odwołując się do przygotowanej próbki i potencjalnie ponownie ją mierząc. Zaleca się, aby oryginalny plik danych został edytowany, a następnie ponownie wczytany z powrotem do R.
  6. Określ, czy miejsce skamieniałości mieści się w fizjonomicznej przestrzeni wielowymiarowej liścia zestawu danych kalibracyjnych za pomocą funkcji dilp_cca().

Wyniki

W celu przedstawienia przykładu reprezentatywnych wyników z wykorzystaniem zarówno metody cyfrowej fizjonomii liści (DiLP), jak i metody rekonstrukcji masy liścia na jednostkę powierzchni (MA) wykorzystano wcześniej opublikowany zbiór danych z pomiarów fizjonomii liści z wczesnoeoceńskiego stanowiska kopalnego McAbee w południowo-centralnej Kolumbii Brytyjskiej (Lowe et al.38; dane zawarte w Pliku uzupełniającym 2). Stanowisko to stwarza możliwość rekonstrukcji paleoklimatu i paleoekologii z najcieplejszego interwału kenozoiku (Wczesnoeoceńskiego Optimum Klimatycznego) w krajobrazie wyżynnym i wulkanicznym38,45,46,47. Zespoły kopalne pobrano z dwóch oddzielnych poziomów w sekwencji lacustrycznej, nazwanych H1 (grubość 28 cm) i H2 (grubość 27 cm), łącząc je w wąskim zakresie stratygraficznym przy użyciu techniki spisu, w ramach której zebrano lub policzono wszystkie okazy, które można było przypisać do konkretnego morfotypu38,48.

Dane fizjonomiczne liści McAbee przeszły kontrole błędów oznaczone przez funkcję dilp_errors(), a siedem wartości odstających wskazanych przez dilp_outliers() zostało ponownie zweryfikowanych, aby upewnić się, że reprezentują one rzeczywistą zmienność danych, a nie błąd metodologiczny. Następnie dane przetworzono za pomocą funkcji dilp() w celu rekonstrukcji paleoklimatu oraz funkcji lma() w celu rekonstrukcji masy liści na jednostkę powierzchni.

Rekonstrukcje MA oraz dolne i górne granice ich 95-procentowych przedziałów predykcji przedstawiono w Tabeli 4 zarówno na poziomie gatunku, jak i stanowiska, stosując równania zaprezentowane przez Royer et al.5 oraz Butrim et al.10. Rekonstruowane wartości mieszczą się w zakresie MA typowym dla współczesnych gatunków lądowych (30-330 g/m2)49. Przy zastosowaniu progów omówionych przez Royer et al.5, większość gatunków posiada zrekonstruowaną wartość MA, która odpowiada długości życia liści <1 rok (≤87 g/m2), niektóre ok. 1 rok (88-128 g/m2), natomiast żadne nie wykazują wartości typowych dla >1 rok (≥129 g/m2). Rekonstrukcje średniej i wariancji MA dla stanowiska w McAbee odzwierciedlają rozpowszechnienie i różnorodność strategii ekonomicznych liści na danym stanowisku10,50. Nie stwierdzono istotnych różnic w średniej i wariancji stanowiska pomiędzy H1 a H2, w związku z czym brak jest dowodów na to, aby skład i różnorodność strategii ekonomicznych liści zmieniały się między tymi dwoma punktami czasowymi. Dodatkowo, rekonstrukcje średniej dla stanowiska wykonane przy użyciu równań Royer et al.5 oraz Butrim et al.10 były bardzo zbliżone.

Rekonstrukcje średniej rocznej temperatury (MAT) i średnich rocznych opadów (MAP), przeprowadzone z wykorzystaniem równań regresji liniowej wielorakiej (DiLP) oraz regresji liniowej pojedynczej (analizy marginesów i powierzchni liści) przedstawionych przez Peppe i wsp.6, przedstawiono w Tabeli 5. Estymacje paleoklimatyczne są najbardziej wiarygodne, jeśli fizjonomia liści w zbiorach kopalnych mieści się w przestrzeni fizjonomicznej zbioru kalibracyjnego. Jest to oceniane w kroku analizy kanonicznej analizy odpowiedniości (CCA) realizowanym przez funkcję dilp_cca(). Zarówno McAbee H1, jak i H2 mieszczą się w zakresie fizjonomii liści zaobserwowanym w zbiorze kalibracyjnym (Rycina 7A). Gdyby zrekonstruowane wartości dla stanowisk znajdowały się poza przestrzenią kalibracyjną, rekonstrukcje paleoklimatyczne należałoby interpretować ostrożnie (np. poprzez porównanie z niezależnymi dowodami; dalszą dyskusję zaprezentowano u Peppe i wsp.6). Zrekonstruowane wartości MAT i MAP dla H1 i H2 są zgodne z umiarkowanym biomem sezonowym (Rycina 7B,C), co dobrze koreluje z niezależnymi dowodami, w tym z wnioskami opartymi na najbliższych żyjących krewnych zarówno dla kopalnych zbiorowisk roślinnych, jak i owadziej fauny w McAbee45.

Morfologia kopalnego liścia: schemat użylenia pierzastego i dłoniastego, liści klapowanych i nieklapowanych.
Rysunek 1: Terminologia fizjognomii i architektury liści stosowana w niniejszym artykule. (A) liść o użyleniu pierzastym, nieklapowany, o brzegu całym, (B) liść o użyleniu dłoniastym, nieklapowany, o brzegu zębatym, (C) liść o użyleniu pierzastym, klapowany, o brzegu całym, (D) liść o użyleniu dłoniastym, klapowany, o brzegu zębatym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy morfologii liści; scenariusze dla liści całobrzegich i ząbkowanych; metody pomiaru liści.
Rycina 2: Schemat metody.Schemat blokowy obrazujący, w jaki sposób różne warunki konserwacji oraz typy liści determinują zakres cech liści, które można wiarygodnie zmierzyć (żółta ramka). Określa to, który scenariusz przygotowania zostanie zastosowany w protokole oraz w których kolumnach arkusza wprowadzania danych zostaną wprowadzone dane (punkty). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Scenariusze rekonstrukcji skamieniałego liścia; schemat przedstawiający różne metody przygotowania i wyniki.
Rysunek 3: Różne scenariusze przygotowania. Różne scenariusze przygotowania prezentujące przykłady ukończonych obrazów przygotowanych cyfrowo, gotowych do etapu pomiarów. (A) Scenariusz 1, cały liść z marginesem, którego powierzchni lub połowy powierzchni nie można zrekonstruować, (B) Scenariusz 5, liść ząbkowany, którego powierzchni lub połowy powierzchni nie można zrekonstruować i który nie posiada ≥2 kolejnych zębów i/lub zachowanego ≥25% powierzchni liścia, (C) Scenariusz 2, cały liść z marginesem, którego powierzchnia lub połowa powierzchni jest zachowana lub może zostać zrekonstruowana, (D) Scenariusz 3, liść ząbkowany, którego powierzchni lub połowy powierzchni nie można zrekonstruować, ale posiada ≥2 kolejne zęby i zachowane ≥25% powierzchni liścia, (E) Scenariusz 4, liść ząbkowany, którego powierzchnia lub połowa powierzchni jest zachowana lub może zostać zrekonstruowana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat rekonstrukcji skamieniałego liścia; analiza kształtów i wzorów liści z referencjami skali.
Rysunek 4: Ilustracja usuwania uszkodzeń. Ilustracja sposobu wycinania uszkodzonego brzegu oraz obszaru liścia przylegającego do tego uszkodzonego brzegu. Czerwone przerywane linie pokazują sposób dokonywania zaznaczeń za pomocą narzędzia lasso. Należy zauważyć, że granice uszkodzeń celowo rozpoczęto w zatokach zębów pierwotnych (patrz Rysunek uzupełniający 2 w celu pomocy w rozróżnieniu zębów pierwotnych od pomocniczych). (A) Liść o unerwieniu pierzastym, w którym zaznaczenie obejmuje żyłkę główną. (B) Liść o unerwieniu dłoniastym, w którym zaznaczenie obejmuje najbliższą żyłkę pierwotną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzoru użylnienia liścia, schemat przedstawiający geometrię fraktalną z powiększeniem szczegółów żyłek.
Rysunek 5: Ilustracja przykładu wycinania ząbków. (A) Czerwone przerywane linie pokazują sposób wykonywania zaznaczeń za pomocą narzędzia lasso. Należy zauważyć, że w tym przypadku ząbki są złożone, dlatego zaznaczenia wykonano wyłącznie pomiędzy zatokami głównymi (pomocy w rozróżnianiu ząbków głównych od pomocniczych udziela Rysunek uzupełniający 2), (B) powiększony widok sposobu zaznaczania ząbków, gdzie czerwone kropki reprezentują miejsca kliknięć myszą podczas zaznaczania, (C) kopia liścia po usunięciu ząbków. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat pomiaru skamieniałego liścia, rejestrowanie powierzchni, kształtu i parametrów ząbkowania do analizy paleobotanicznej.
Rysunek 6: Ilustracja scenariusza przygotowania 4. Ilustracja decyzji dotyczących przygotowania oraz kroków pomiarowych dla przykładowego liścia przygotowanego zgodnie ze scenariuszem 4. (A) Scenariusz przygotowania, w którym zdecydowano, że połowa liścia zapewnia najdokładniejsze pomiary kształtu i powierzchni liścia, a zachowane brzegi na obu połowach środkowych zostały uwzględnione w pomiarach ząbkowania. (B) Przykład demonstrujący, jakie zmienne są mierzone na różnych elementach przygotowanego liścia. Tekst pogrubiony wyróżnia pomiary niezbędne do analiz DiLP i MA, natomiast tekst niepogrubiony (obwód blaszki, minimalna średnica Fereta i sztuczny obwód środkowy) wyróżnia pomiary, które nie są wymagane, ale są użyteczne do dodatkowych charakteryzacji fizjonomicznych (np. współczynnika kształtu i zwartości; Tabela 1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza danych klimatycznych; średnie roczne opady w stosunku do temperatury; wielokolorowe wykresy stref biomów.
Rycina 7: Reprezentatywne wyniki. Wyniki z dwóch poziomów kopalnych (H1 i H2) pobranych z wczesnoeoceńskich złóż kopalnych McAbee z pracy Lowe et al.38. (A) Kanoniczna analiza odpowiadania wykazująca reprezentację wielowymiarowej fizjonomii liści w zbiorze danych kalibracyjnych. Dane kalibracyjne pochodzą z pracy Peppe et al.6. Fizjonomia liści z dwóch poziomów McAbee nakłada się na siebie i mieści się w przestrzeni kalibracyjnej. (B i C) Szacunki temperatury i opadów oraz powiązana z nimi niepewność (błędy standardowe modeli), obliczone przy użyciu równań przedstawionych przez Peppe et al.6 dla dwóch poziomów McAbee, naniesione na diagram biomów Whittakera. (B) Szacunki zrekonstruowane przy użyciu modeli wielokrotnej regresji liniowej (MLR) Digital Leaf Physiognomy (DiLP), (C) Szacunki zrekonstruowane przy użyciu równań pojedynczej regresji liniowej (SLR) analizy powierzchni liści (LAA) i analizy marginesu liści (LMA) dla dwóch poziomów McAbee, naniesione na diagram biomów Whittakera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Zmienne fizjognomiczne liści. Zmienne, które są mierzone i/lub obliczane oraz stosowane w modelach predykcyjnych w ramach niniejszego protokołu do rekonstrukcji suchej masy liścia na jednostkę powierzchni (MA), średniej rocznej temperatury (MAT) oraz średnich rocznych opadów (MAP). MAT i MAP są rekonstruowane za pomocą równań przedstawionych przez Peppe i wsp.6, stosując podejście wielowymiarowe dla cyfrowej fizjognomiki liści (DiLP) oraz podejścia jednowymiarowe dla analizy marginesu liści (LMA) i analizy powierzchni liści (LAA). Zmienne wymienione jako „Inne” nie są wykorzystywane w analizach MA, DiLP, LMA i LAA, lecz są nadal mierzone i obliczane zgodnie z tym protokołem, ponieważ są łatwe do wdrożenia i dostarczają przydatnych charakterystyk fizjognomiki liści. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Dodatkowe uwagi i objaśnienia do kroków przygotowawczych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Dodatkowe uwagi i wyjaśnienia do poszczególnych etapów pomiarowych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Rekonstrukcje suchej masy liścia na jednostkę powierzchni (MA) oraz powiązane górne i dolne granice 95% przedziałów prognozy dla McAbee Fossil Beds na podstawie pracy Lowe et al.38. Rekonstrukcje wykonano dla średniej dla morfotypu5, średniej dla stanowiska5,10 oraz wariancji dla stanowiska10. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Rekonstrukcje średniej rocznej temperatury (MAT) i średnich rocznych opadów (MAP) dla horyzontu 1 (H1) i 2 (H2) w wczesnoeoceńskich złożach kopalnych McAbee, wykonane przy użyciu wielokrotnej regresji liniowej (MLR) cyfrowej fizjonomii liści (DiLP) oraz pojedynczej regresji liniowej (SLR) analizy marginesów liści (LMA) i analizy powierzchni liści (LAA) przedstawionych w pracy Peppe i wsp.6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rycina uzupełniająca 1: liść Quercus rubra z Harvard Forest ilustrujący zasadę rozróżnienia między płatem a zębem. Odcinki linii p i d zostały zdefiniowane w tekście. Skala = 1 cm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Liść Betula lutea z Harvard Forest ilustrujący zasady rozróżniania zębów pomocniczych od zębów głównych. Wyizolowany fragment liścia został powiększony 2X. Niebieska linia łączy zatoki o największym stopniu wcięcia (tzn. zatoki główne), a zęby powiązane z tymi zatokami są uznawane za główne (niebieskie strzałki). Czerwone kropki zaznaczają zęby, które można zidentyfikować jako pomocnicze, ponieważ ich zatoki wierzchołkowe są wcięte w mniejszym stopniu. Zęby oznaczone czerwonymi strzałkami mają podobny stopień wcięcia w porównaniu do zębów głównych, ale można je zidentyfikować jako pomocnicze na podstawie względnie cieńszej głównej żyłki w porównaniu do zębów głównych. Paski skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Ilustracja wyboru zębów, reguły listkowatych płatów oraz reguły pierwszeństwa płatów. (A) Wybór zębów dla liścia Hamamelis virginiana z rezerwatu Huyck Preserve. Zaciemnione obszary odpowiadają tkance liściowej włączonej do całkowitego wyboru zębów, ponieważ zęby pomocnicze są odróżnialne od zębów pierwotnych. (B) Liść Quercus alba z IES ilustruje regułę pierwszeństwa płatów. Zaciemnione obszary są mierzone jako płaty, a niezaciemnione jako zęby, jednak wszystkie wypustki są traktowane jako płaty zgodnie z regułą pierwszeństwa płatów. Paski skali = 1 cm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Liść Acer saccharum z National Forest w Allegheny ilustrujący zasady rozszerzenia i pojedynczego zęba. Linie przerywane przedstawiają wybory zębów. Linia ciągła przedstawia oś symetrii dla powiązanego zęba. Czarny obszar to obciążnik służący do spłaszczenia liści do celów fotograficznych. Paski skali = 1 cm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Ilustracja optymalnego sposobu wycinania ogonka liściowego znajdującego się na sercowatej podstawie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szablon wprowadzania danych dla wszystkich pomiarowych zmiennych cyfrowej fizjonomii liści. Tego pliku nie należy modyfikować, ponieważ będzie on służył jako plik wejściowy dla pakietu R. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przykładowe dane z łóżek kopalnych McAbee z pracy Lowe et al.38. Dane te zostały wykorzystane do wygenerowania Rysunku 7 oraz do omówienia reprezentatywnych wyników. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Dokument zasad dla cyfrowej fizjonomii skamieniałych liści. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

W artykule przedstawiono, w jaki sposób ciągłe cechy fizjonomii liści mogą być mierzone na zdrewniałych liściach okrytozalążkowych dwuliściennych, a następnie stosowane do wskaźników zastępczych opracowanych na podstawie nowoczesnych danych kalibracyjnych w celu rekonstrukcji paleoklimatu i paleoekologii. Wymaga to dołożenia starań, aby dostosować kroki metodologiczne do etapów przedstawionych w zestawach danych kalibracyjnych wskaźników zastępczych 5,6,10. Rozważania te rozpoczynają się przed zastosowaniem tego protokołu podczas zbierania skamieniałych liści, w szczególności w odniesieniu do wielkości próbki. Zaleca się łączenie zbiorowisk skamieniałych liści w jak najwęższym zakresie stratygrafii w celu uzyskania odpowiedniej liczby mierzalnych okazów i morfotypów, aby zminimalizować uśrednianie czasu. Zaleca się również ograniczenie rekonstrukcji paleoklimatu do stanowisk z co najmniej 350 możliwymi do zidentyfikowania okazami i co najmniej 15-20 zdrewniałymi morfotypami okrytozalążkowychdwuliściennych 19,51,52. Ponadto, przy wyborze liści do analiz, zaleca się zmierzenie jak największej liczby liści na morfotyp i co najmniej wybór okazów, które reprezentują zmienność fizjonomii liści w obrębie morfotypu.

Należy zachować dalszą ostrożność podczas wdrażania sekcji przygotowawczych i pomiarowych, aby zachować spójność ze zbiorem danych kalibracyjnych. Kroki wykonywane na etapach przygotowania mają największy potencjał subiektywizmu i zróżnicowanych wyników wśród użytkowników. Jeśli jednak protokół jest przestrzegany z rozmysłem, a tabele dodatkowych rozważań (tabela 2, tabela 3) i dokument z zasadami (plik uzupełniający 3) są często przywoływane, metoda ta prowadzi do obiektywnych i powtarzalnych pomiarów fizjonomii liści. Dla użytkowników, którzy nie znają tej metody, sugeruje się potwierdzenie, że liście zostały prawidłowo przygotowane z kimś, kto ma większe doświadczenie. Szczególną ostrożność należy zachować przy pomiarze szerokości ogonków liściowych w przypadku rekonstrukcji MA . Ponieważ wartości te są podniesione do kwadratu, niedokładność pomiarów stanie się przesadzona. Niepełna konserwacja i uszkodzenie mogą zmienić wymiary ogonków liściowych i należy ich starannie unikać.

Istnieją pewne ograniczenia tych metod, na które warto zwrócić uwagę. Co najważniejsze, rekonstrukcje zastępcze zawarte w pakiecie dilp R dotyczą wyłącznie drzewiastych roślin okrytozalążkowych, a zatem mogą wykluczać inne grupy roślin, które były znaczącymi składnikami starożytnych społeczności. Opublikowano jednak dodatkowe wskaźniki zastępcze na bazie ogonków liściowych dla poziomu gatunku MA dla ogonków liściowych i nagonasiennych szerokolistnych 5,8, zielnych roślin okrytozalążkowych8 i paproci9, które użytkownik może włączyć oddzielnie w razie potrzeby. Wykluczenie znaczących grup roślin w zbiorowiskach poza drzewiastymi dwuliściennymi okrytozalążkowymi ma prawdopodobnie największy wpływ na rekonstrukcję średniej i wariancji MA na poziomie obszaru, ponieważ zapewnią one niekompletną perspektywę strategii ekonomicznych w całej społeczności. Historia filogenetyczna wpływa na występowanie zębów liściowych23, wprowadzając możliwość, że analiza zbiorowisk kopalnych o nowym składzie taksonomicznym może powodować niepewność w uzyskanych szacunkach, chociaż realizacja tego potencjalnego wpływu nie została jeszcze przetestowana i wykazana.

Skamieniałe liście muszą być również odpowiednio zachowane, aby uwzględnić ilościowe pomiary fizjonomii liści poza stanem brzegowym. W przypadku DiLP jest to szczególnie prawdziwe w przypadku liści z całobrzegiem, ponieważ mogą one przekazywać informacje poza stanem marginesu tylko wtedy, gdy cały liść lub połowa liścia jest zachowana lub można go zrekonstruować. Podobnie, liście mogą być włączone do rekonstrukcji MA tylko wtedy, gdy (1) zachowany jest zarówno ogonek liściowy w momencie jego włożenia do blaszki liściowej, albo, w szczególnych przypadkach, jeśli zachowana jest podstawa liścia i najbardziej podstawowa część nerwu środkowego (patrz uwaga w kroku 3.6), oraz (2) jeśli można oszacować rozmiar liścia, albo poprzez pomiar całego liścia, albo rekonstrukcję połowy liścia. Oznacza to, że niektóre morfotypy mogą być całkowicie wykluczone z analiz MA na poziomie lokalizacji. Wreszcie, w przypadku tego protokołu ograniczeniem jest czas, ponieważ jednowymiarowe alternatywy dla rekonstrukcji paleoklimatycznych zajmują stosunkowo mniej czasu.

Pomimo tych ograniczeń, stosowanie metod rekonstrukcji DiLP i MA nadal ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami. Rekonstrukcje M.A są jednym z niewielu sposobów rekonstrukcji strategii ekonomicznych liści w zapisie kopalnym, a zastosowanie dwuwymiarowych pomiarów szerokości ogonków liściowych i powierzchni liści pozwala na wykonanie rekonstrukcji przy użyciu typowych skamieniałości liści wyciskowych/kompresyjnych. W przypadku DiLP włączenie wielu ciągłych pomiarów, które są funkcjonalnie powiązane z klimatem, poprawia odtwarzalność pomiarów i dokładność uzyskanych rekonstrukcji klimatycznych 6,13. Protokół ten ma na celu uwzględnienie niekompletnego charakteru zapisu kopalnego, umożliwiając wykonywanie pomiarów uzębienia liści przy użyciu fragmentów liści. Chociaż ciągłe pomiary powierzchni liści dostarczają więcej informacji na temat wielkości liści, szacunki DiLP MAP mogą być uzupełnione przez te wykorzystujące klasy wielkości liści w celu zwiększenia wielkości próbki16,53 lub poprzez włączenie szacunków skali nerwów powierzchni liści 42,54,55. Podobnie jak w przypadku większości zaangażowanych metod, efektywność czasowa tego protokołu poprawi się, gdy użytkownik stanie się bardziej doświadczony i pewny siebie, szczególnie na etapach przygotowania. Fakt, że pomiary DiLP na poziomie stanowiska zostały wykonane zgodnie z tym protokołem dla >150 współczesnych 6,10,56 i co najmniej 22 dotychczasowych zespołów kopalnych, świadczy o jego wykonalności 6,38,39,40,41,42. Wreszcie, kompleksowe pomiary fizjonomii liści mają zastosowania wykraczające poza te omówione tutaj i mogą być przydatne w opisywaniu innych aspektów ekologii roślin, fizjologii, ewolucji i rozwoju, z zastosowaniem zarówno do współczesnychbadań 56, jak i paleo40.

Podsumowując, zastosowanie metod opisanych w tym artykule pozwala użytkownikowi zrekonstruować paleoklimat i paleoekologię przy użyciu solidnych i powtarzalnych metod. Metody te stanowią ważną okazję do zaprezentowania wcześniejszych przykładów reakcji klimatu i ekosystemów na perturbacje środowiskowe oraz do uzyskania dalszych informacji na temat złożonych interakcji systemów naturalnych Ziemi.

Podziękowania

AJL dziękuje studentom studiów licencjackich 2020-2022 Team Leaf na Uniwersytecie Waszyngtońskim za motywację i sugestie dotyczące tworzenia skutecznych materiałów szkoleniowych dla DiLP. AGF, AB, DJP i DLR dziękują wielu studentom Uniwersytetu Wesleyan i Uniwersytetu Baylor, którzy mierzyli współczesne i kopalne liście i których wkład był nieoceniony w modyfikowaniu i aktualizowaniu tego protokołu. Autorzy dziękują Grupie Roboczej ds. Cech Ilościowych PBot i zespołowi PBOT za zachęcanie do prac nad sformalizowaniem tego protokołu, aby uczynić go bardziej dostępnym dla szerszych społeczności. Prace te były wspierane przez National Science Foundation (grant EAR-0742363 dla DLR, grant EAR-132552 dla DJP) oraz Baylor University (Young Investigator Development Program dla DJP). Dziękujemy dwóm anonimowym recenzentom i redaktorowi recenzji za opinie, które pomogły poprawić przejrzystość i kompleksowość tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stojak na kopie lub statywDo fotografii skamieniałości
AparatDo fotografii skamieniałości preferowany aparat o wysokiej rozdzielczości
Oprogramowanie do edycji obrazu Do przygotowania cyfrowego. Przykłady obejmują Adobe Photoshop i GIMP, z których ten ostatni jest darmowy (https://www.gimp.org/)
Oprogramowanie ImageJIJ1.46prDo wykonywania pomiarów cyfrowych, darmowe oprogramowanie (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft ExcelMicrosoftLub podobne oprogramowanie do wprowadzania danych
Oprogramowanie RfundamentDo uruchamiania podanego skryptu języka R (https://www.r-project.org/). R studio oferuje przyjazne dla użytkownika środowisko R (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Oba są bezpłatne.
dilp RMożna zainstalować zgodnie z instrukcjami tutaj: https://github.com/mjbutrim/dilp
cyfrowy Pakiet

Bibliografia

  1. Gates, D. M. Transpiration and leaf temperature. Ann Rev Plant Physiol. 19 (1), 211-238 (1968).
  2. Givnish, T. On the adaptive significance of leaf form. Topics Plant Pop Biol. , 375-407 (1979).
  3. Niklas, K. J. Plant biomechanics: an engineering approach to plant form and function. , University of Chicago Press. (1992).
  4. Niklas, K. J. Plant Allometry: The Scaling of Form and Process. , University of Chicago Press. (1994).
  5. Royer, D. L., et al. Fossil leaf economics quantified: Calibration, Eocene case study, and implications. Paleobiology. 33 (4), 574-589 (2007).
  6. Peppe, D. J., et al. Sensitivity of leaf size and shape to climate: global patterns and paleoclimatic applications. New Phytol. 190 (3), 724-739 (2011).
  7. Wright, I. J., et al. The worldwide leaf economics spectrum. Nature. 428 (6985), 821-827 (2004).
  8. Royer, D. L., Miller, I. M., Peppe, D. J., Hickey, L. J. Leaf economic traits from fossils support a weedy habit for early angiosperms. Am J Botany. 97 (3), 438-445 (2010).
  9. Peppe, D. J., et al. Biomechanical and leaf-climate relationships: a comparison of ferns and seed plants. Am J Botany. 101 (2), 338-347 (2014).
  10. Butrim, M., et al. dilp: Reconstruct paleoclimate and paleoecology with leaf physiognomy. R package version 1.1.0. , https://cran.r-project.org/web/packages/dilp/index.html (2024).
  11. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. A botanical index of Cretaceous and Tertiary climates. Science. 41 (1066), 831-834 (1915).
  12. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. The climatic distribution of certain types of angiosperm leaves. Am J Botany. 3 (1), 24-39 (1916).
  13. Peppe, D. J., Baumgartner, A., Flynn, A. G., Blonder, B. Reconstructing paleoclimate and paleoecology using fossil leaves. Meth Paleoecol: Reconstructing Cenozoic Terre Environ Ecol Comm. , 289-317 (2018).
  14. Wolfe, J. A. Temperature parameters of humid to mesic forests of eastern Asia and relation to forests of other regions of the Northern Hemisphere and Australasia. , U.S. Govt. Print. Off. (1979).
  15. Wilf, P. When are leaves good thermometers? A new case for Leaf Margin Analysis. Paleobiology. 23 (3), 373-390 (1997).
  16. Wilf, P., Wing, S. L., Greenwood, D. R., Greenwood, C. L. Using fossil leaves as paleoprecipitation indicators: An Eocene example. Geology. 26 (3), 203-206 (1998).
  17. Miller, I. M., Brandon, M. T., Hickey, L. J. Using leaf margin analysis to estimate the mid-Cretaceous (Albian) paleolatitude of the Baja BC block. Earth Planetary Sci Lett. 245 (1), 95-114 (2006).
  18. Wing, S. L., Greenwood, D. R. Fossils and fossil climate: The case for equable continental interiors in the Eocene. Philosophical Transact: Biol Sci. 341 (1297), 243-252 (1993).
  19. Wolfe, J. A. A method of obtaining climatic parameters from leaf assemblages. U S Geol Sur. (2040), 1-71 (1993).
  20. Huff, P. M., Wilf, P., Azumah, E. J. Digital future for paleoclimate estimation from fossil leaves? Preliminary results. Palaios. 18 (3), 266-274 (2003).
  21. Spicer, R. A. Recent and future developments of CLAMP: Building on the legacy of Jack A. Wolfe. Adv Angiosperm Paleobotany Paleoclimatic Reconstruct. 258, 109-118 (2007).
  22. Yang, J., Spicer, R. A., Spicer, T. E. V., Li, C. S. CLAMP Online': a new web-based palaeoclimate tool and its application to the terrestrial Paleogene and Neogene of North America. Palaeobiodivers Palaeoenviron. 91 (3), 163-183 (2011).
  23. Little, S. A., Kembel, S. W., Wilf, P. Paleotemperature proxies from leaf fossils reinterpreted in light of evolutionary history. PLoS One. 5 (12), e15161(2010).
  24. Webb, L. J. A physiognomic classification of Australian rain forests. J Ecol. 47 (3), 551-570 (1959).
  25. Schmerler, S. B., et al. Evolution of leaf form correlates with tropical-temperate transitions in Viburnum (Adoxaceae). Proc Royal Soci B: Biol Sci. 279 (1744), 3905-3913 (2012).
  26. Nicotra, A. B., et al. The evolution and functional significance of leaf shape in the angiosperms. Funct Plant Biol. 38 (7), 535-552 (2011).
  27. Leigh, A., Sevanto, S., Close, J. D., Nicotra, A. B. The influence of leaf size and shape on leaf thermal dynamics: does theory hold up under natural conditions. Plant Cell Environ. 40 (2), 237-248 (2017).
  28. Wright, I. J., et al. Global climatic drivers of leaf size. Science. 357 (6354), 917-921 (2017).
  29. Givnish, T. J. Leaf and canopy adaptations in tropical forests. Physiol Ecol Plants Wet Tropics. 12, 51-84 (1984).
  30. Feild, T. S., Sage, T. L., Czerniak, C., Iles, W. J. Hydathodal leaf teeth of Chloranthus japonicus (Chloranthaceae) prevent guttation-induced flooding of the mesophyll. Plant, Cell Environ. 28 (9), 1179-1190 (2005).
  31. Royer, D. L., Wilf, P. Why do toothed leaves correlate with cold climates? Gas exchange at leaf margins provides new insights into a classic paleotemperature proxy. Int J Plant Sci. 167 (1), 11-18 (2006).
  32. Edwards, E. J., Spriggs, E. L., Chatelet, D. S., Donoghue, M. J. Unpacking a century-old mystery: Winter buds and the latitudinal gradient in leaf form. Botanical Soc Am. 103 (6), 975-978 (2016).
  33. Givnish, T. J., Kriebel, R. Causes of ecological gradients in leaf margin entirety: Evaluating the roles of biomechanics, hydraulics, vein geometry, and bud packing. Am J Botany. 104 (3), 354-366 (2017).
  34. Royer, D. L., Wilf, P., Janesko, D. A., Kowalski, E. A., Dilcher, D. L. Correlations of climate and plant ecology to leaf size and shape: potential proxies for the fossil record. Am J Botany. 92 (7), 1141-1151 (2005).
  35. Green, W. A. Loosening the CLAMP: an exploratory graphical approach to the climate leaf analysis multivariate program. Palaeontol Electro. 9 (2), 19(2006).
  36. Peppe, D. J., Royer, D. L., Wilf, P., Kowalski, E. A. Quantification of large uncertainties in fossil leaf paleoaltimetry. Tectonics. 29 (3), 002549(2010).
  37. Royer, D. L., Meyerson, L. A., Robertson, K. M., Adams, J. M. Phenotypic plasticity of leaf shape along a temperature gradient in Acer rubrum. PLoS One. 4 (10), e7653(2009).
  38. Lowe, A. J., et al. Plant community ecology and climate on an upland volcanic landscape during the early Eocene climatic optimum: McAbee fossil beds, British Columbia, Canada. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 511, 433-448 (2018).
  39. Flynn, A. G., Peppe, D. J. Early Paleocene tropical forest from the Ojo Alamo Sandstone, San Juan Basin, New Mexico, USA. Paleobiology. 45 (4), 612-635 (2019).
  40. Allen, S. E., Lowe, A. J., Peppe, D. J., Meyer, H. W. Paleoclimate and paleoecology of the latest Eocene Florissant flora of central Colorado, U.S.A. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 551, 109678(2020).
  41. Baumgartner, A., Peppe, D. J. Paleoenvironmental changes in the Hiwegi Formation (lower Miocene) of Rusinga Island, Lake Victoria, Kenya. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 574, 110458(2021).
  42. Wagner, J. D., Peppe, D. J., O'keefe, J. M., Denison, C. N. Plant community change across the Paleocene-Eocene boundary in the Gulf coastal plain, Central Texas. Palaios. 38 (10), 436-451 (2023).
  43. Ellis, B., et al. Manual of leaf architecture. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (2009).
  44. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9, 671-675 (2012).
  45. Greenwood, D. R., Pigg, K. B., Basinger, J. F., DeVore, M. L. A review of paleobotanical studies of the Early Eocene Okanagan (Okanogan) Highlands floras of British Columbia, Canada, and Washington, USA. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 548-564 (2016).
  46. Lowe, A. J., West, C. K., Greenwood, D. R. Volcaniclastic lithostratigraphy and paleoenvironment of the lower Eocene McAbee fossil beds, Kamloops Group, British Columbia, Canada. Canadian J Earth Sci. 55 (8), 923-934 (2018).
  47. Lowe, A. J., et al. Dynamics of deposition and fossil preservation at the early Eocene Okanagan Highlands of British Columbia, Canada: insights from organic geochemistry. Palaios. 37 (5), 185-200 (2022).
  48. Gushulak, C. A. C., West, C. K., Greenwood, D. R. Paleoclimate and precipitation seasonality of the Early Eocene McAbee megaflora, Kamloops Group, British Columbia. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 591-604 (2016).
  49. Poorter, H., Niinemets, Ü, Poorter, L., Wright, I. J., Villar, R. Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA): a meta-analysis. New Phytol. 182 (3), 565-588 (2009).
  50. Enquist, B. J., et al. Scaling from traits to ecosystems. Adv Ecol Res. 52, 249-318 (2015).
  51. Burnham, R. J., Wing, S. L., Parker, G. G. The reflection of deciduous forest communities in leaf litter: implications for autochthonous litter assemblages from the fossil record. Paleobiology. 18 (1), 30-49 (1992).
  52. Burnham, R. J., Ellis, B., Johnson, K. R. Modern tropical forest taphonomy: does high biodiversity affect paleoclimatic interpretations. PALAIOS. 20 (5), 439-451 (2005).
  53. Jacobs, B. F. Estimation of low-latitude paleoclimates using fossil angiosperm leaves: examples from the Miocene Tugen Hills, Kenya. Paleobiology. 28 (3), 399-421 (2002).
  54. Sack, L., et al. Developmentally based scaling of leaf venation architecture explains global ecological patterns. Nat Comm. 3 (1), 837(2012).
  55. Merkhofer, L., et al. Resolving Australian analogs for an Eocene Patagonian paleorainforest using leaf size and floristics. Am J Botany. 102 (7), 1160-1173 (2015).
  56. Baumgartner, A., Donahoo, M., Chitwood, D. H., Peppe, D. J. The influences of environmental change and development on leaf shape in Vitis. Am J Botany. 107 (4), 676-688 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza skamienia ych li ciRekonstrukcja paleoklimatuWska nik paleoekologicznyPomiar cech li ciAnaliza w programie ImageJPomiar z bkowania li ciSzeroko ogonka li ciowegoEkosystemy l dowe
Rekonstrukcja paleoklimatu i paleoekologii lądu za pomocą skamieniałych liści przy użyciu cyfrowej fizjonomii liści i masy liści na obszar
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.