Pokazano tutaj minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną, która polega na umieszczeniu laserowej sondy dopplerowskiej na czaszce nad dystalnym obszarem środkowej tętnicy mózgowej (MCA), miejscem okołooczodołowym odpowiednim dla szczurów i myszy, w celu oceny przepływu krwi podczas przejściowej okluzji MCA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Okołooczodołowe umieszczenie laserowej sondy dopplerowskiej do monitorowania przepływu krwi w mózgu przed niedrożnością tętnicy środkowej mózgu w modelach gryzoni
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest złotym standardem w przedklinicznym modelowaniu udaru niedokrwiennego u gryzoni. Jednak udanego zgryzu nie gwarantują nawet najbardziej wprawne ręce chirurgiczne. Błędy występują przede wszystkim, gdy żarnik nie jest umieszczony na odpowiedniej głębokości i obejmują przypadki braku zawału lub perforacji naczynia, co może spowodować śmierć. Laserowa przepływomierz dopplerowska (LDF) to niezawodna technika, która zapewnia informacje zwrotne w czasie rzeczywistym na temat regionalnego przepływu krwi w mózgu (CBF) podczas procedury MCAO. Tutaj demonstrujemy szybką technikę okołooczodołowego umieszczania laserowej sondy dopplerowskiej do pomiaru CBF zarówno u myszy, jak i szczurów. Naszym uzasadnieniem było uproszczenie wdrażania LDF, zachęcając do powszechnego stosowania w celu poprawy niezawodności chirurgicznej. Technika ta eliminuje potrzebę przerzedzania czaszki i specjalistycznego sprzętu, z umieszczeniem w okolicy okołooczodołowej, a nie grzbietowej, co zwiększa wydajność i łatwość adaptacji. Opisany tutaj protokół obejmuje przygotowanie przedoperacyjne, umieszczenie okołooczodołowej sondy dopplerowskiej oraz opiekę pooperacyjną. Reprezentatywne wyniki obejmują wizualne przedstawienia elementów proceduralnych wraz z reprezentatywnymi śladami LDF ilustrującymi udane operacje MCAO, z przypadkami nieudanego umieszczenia włókien prowadzącego do powikłań. Protokół ilustruje LDF w potwierdzaniu prawidłowego umieszczenia filamentu i oferuje uproszczoną procedurę w porównaniu z alternatywnymi metodami.
Wprowadzenie
Metoda zamykania tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest szeroko stosowana u gryzoni od czasu wprowadzenia do społeczności naukowej w celu zastosowania u szczurów w 1986 roku1 z adaptacją Longa opisaną w 19902, a adaptacje dla myszy wkrótce nastąpią3. Chociaż nie zostało to opisane w publikacji Longa, użycie sygnału laserowej przepływomierzy dopplerowskiej (LDF) do potwierdzenia umiejscowienia filamentu zostało wkrótce opisane w literaturze4. Zastosowanie LDF podczas procedury MCAO jest wyraźnie opisane w literaturze, ale jest wyznaczone jako opcjonalny krok w obecnych standardowych procedurach operacyjnych (SOP) Udar Mózgu (SPAN)5.
Użycie LDF potwierdza prawidłowe rozmieszczenie włókien podczas procedury MCAO, a tym samym przyczynia się do rygoru projektowania badań i późniejszych wyników, szczególnie w eksperymentach mających na celu zbadanie skuteczności leków. Stosowanie LDF zmniejsza liczbę błędów chirurgicznych wynikających z nieprawidłowego umieszczenia filamentu, co skutkuje dychotomiczną sytuacją braku obrażeń, gdy filament nie jest umieszczony wystarczająco daleko, lub śmiercią zwierząt z powodu perforacji naczynia występującej, gdy filament jest włożony zbyt głęboko. Z drugiej strony, stosowanie LDF nie wiąże się ze zmiennością wielkości zawału powszechnie obserwowaną po procedurze MCAO6. Zastosowanie LDF w procedurze MCAO może być postrzegane jako trudne i uciążliwe, szczególnie u szczurów, ponieważ czaszka jest grubsza niż u myszy i może wymagać przerzedzenia czaszki przed umieszczeniem LDF7,8. Również umieszczenie sondy grzbietowej jest często opisywane za pomocą niektórych protokołów wymagających specjalistycznego sprzętu lub przygotowania7,8,9. W przypadku którejkolwiek z tych barier implementacja LDF w celu potwierdzenia umieszczenia filamentu może nie mieć miejsca.
W tym protokole opisujemy umieszczenie laserowej sondy dopplerowskiej na czaszce i nad dystalnym obszarem tętnicy środkowej mózgu - umiejscowienie okołooczodołowe - w celu oceny przepływu krwi podczas procedury MCAO zarówno u myszy, jak i szczurów. Naszym uzasadnieniem było opracowanie procedury, która ma wiele zalet w porównaniu z niektórymi metodami opisanymi w literaturze7,8,9,10 w tym, że jest minimalnie inwazyjna, szybka i nie wymaga przerzedzania czaszki ani specjalistycznego sprzętu poza laserową sondą dopplerowską.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Dorosłe myszy i szczury zostały użyte do zilustrowania tego protokołu (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). Postępowanie ze zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą i zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Arizony, przepisami krajowymi oraz zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi11. Szczury i myszy trzymano w pomieszczeniach z 12-godzinnym harmonogramem światła/ciemności (7-19) z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
UWAGA: Zazwyczaj, operacja MCAO u gryzoni jest wykonywana jako operacja przetrwania, co wymaga użycia albo aseptycznej techniki chirurgicznej, albo techniki chirurgicznej opartej tylko na końcówkach, zgodnie z opisem w specyficznym dla instytucji protokole IACUC. W takim przypadku chirurg stosuje technikę opartą tylko na końcówkach ze sterylizowanymi narzędziami i materiałami.
- Zdezynfekuj powierzchnię roboczą chirurgiczną komercyjnym środkiem dezynfekującym i przygotuj sterylne pakiety chirurgiczne z narzędziami, obłożami, gazą, wacikami, szwami i ostrzami skalpela przez autoklawowanie. Utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia zgodnie z technikami zatwierdzonymi przez IACUC, takimi jak zakrywanie gałek mikroskopu i obciąganie folią spożywczą.
- Użyj sterylizatora z suchymi kulkami do kiełkowania, aby ponownie wysterylizować narzędzia chirurgiczne między zabiegami, jeśli podczas jednej sesji przeprowadzanych jest wiele operacji na gryzoniach.
- Umieść szczura lub mysz w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie 3%-5% izofluranem (1 l/min przy użyciu połączonej mieszaniny 80% powietrza i 20% tlenu).
- Przenieś zwierzę z komory na ławkę i stożek do znieczulenia (mysz: 0,5 l/min 80%/20% mieszanina tlenu/powietrza; szczur: 1,5 l/min 80%/20% mieszanina tlenu i powietrza). Nałóż maść okulistyczną na oba oczy i ostrożnie ogol przestrzeń między uchem a oczodołem po stronie zabiegu MCAO (zwykle po prawej), aby nie ciąć skóry za pomocą maszynki do strzyżenia. U szczura, po ogoleniu, dołek w wąsach będzie widoczny mniej więcej w połowie odległości między oczodołem a uchem. Kontynuuj golenie obszarów zgodnie z potrzebami procedury MCAO9 (nie wchodzi w zakres tego artykułu).
- W razie potrzeby należy umieścić zwierzę z powrotem w komorze lub przenieść je do stożka na przygotowanym stole operacyjnym rozgrzanego do temperatury 37 °C. Włożyć termometr doodbytniczy. Zwierzę powinno być trzymane w temperaturze około 36 °C ± 1 °C przez cały czas trwania procedury i zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC.
- Nałóż betadynę na bawełniany wacik i zdezynfekuj skórę, spiralnie schodząc na zewnątrz od środka obszaru chirurgicznego. Przetrzyj wacikiem nasączonym alkoholem. Powtórz oba kroki, w sumie przez trzy cykle. Potwierdź prawidłowe znieczulenie i oceniaj co 15 minut podczas zabiegu za pomocą refluksu szczypania palca u nogi.
2. Umiejscowienie sondy dopplerowskiej w okołooczodołowej
- Małymi nożyczkami wykonaj pionowe cięcie (mysz: ~0,5 cm; szczur: ~0,7 cm) między kącikiem oka a fałdem ucha, jak pokazano w Rysunek 2A (mysz) i Rysunek 3A (szczur), aby odsłonić super twarz i leżący pod nią mięsień.
UWAGA: Leczyć ból przed operacją zgodnie z zatwierdzeniem protokołu IACUC. - Za pomocą ostrych kleszczy i zakrzywionych nożyczek ostrożnie przetnij warstwę mięśni, aż dotrzesz do czaszki. Czaszka będzie płaska i trudna do dotknięcia czubkiem kleszczy. Jest to okno, w którym znajdzie się laserowa sonda dopplerowska, jak pokazano na rysunku Rysunek 2B.
- Użyj narzędzia do kauteryzacji kleszczy, aby skrzepnąć pojawiającą się krew, poszerzyć okno i zapewnić drogę do czaszki.
- Po otwarciu okna osusz bawełnianymi wacikami, aby w razie potrzeby usunąć nadmiar krwi.
Umieść mysz lub szczura w pozycji leżącej. - Użyj kleszczy, aby cofnąć skórę lub tkankę i umieść sondę Dopplera w oknie okołooczodołowym tak, aby przylegała do czaszki prostopadle, bez skóry lub mięśni, które utrudniałyby sygnał laserowy. Obszar ten znajduje się nad dystalnym MCA, jak pokazano na rysunku 1A,B. Zabezpiecz umieszczenie sondy taśmą laboratoryjną. W tym protokole opisano użycie sondy prostej.
UWAGA: Zdajemy sobie sprawę, że protokoły chirurgiczne będą się różnić w zależności od laboratorium. W literaturze (jeśli jest to zgłaszane), niektórzy mielą czaszkę cienko, a inni nie9. Może to być spowodowane tym, że czaszka jest cieńsza w okolicy okołooczodołowej, ale to tylko spekulacje. Z naszego doświadczenia wynika, że bezpośrednie umieszczenie bez mielenia można osiągnąć u myszy i szczurów i jest to wykazane w tym protokole. - Monitoruj względne odczyty przepływu krwi na monitorze za pomocą odpowiedniego oprogramowania ( Rysunek 2D, Rysunek 3C,D). Odczyty LDF będą się różnić. Jednak optymalny zakres wykrywania spadków przepływu krwi wynosi >200 jednostek perfuzyjnych (PU).
- Przejdź do MCAO surgery9 (nie wchodzi w zakres tego artykułu). Podczas operacji MCAO należy przetestować umieszczenie sondy poprzez krótkie zawiązanie tętnicy szyjnej wspólnej, co powinno spowodować nagły spadek przepływu krwi (~50%).
3. Usunięcie sondy Doppler i opieka pooperacyjna
- Po zakończeniu MCAO lub po zakończeniu odczytów przepływu krwi wyjmij laserową sondę dopplerowską z okienka operacyjnego. Sonda dopplerowska zazwyczaj pozostaje na miejscu przez cały czas trwania operacji MCAO u myszy, ponieważ czas niedokrwienia jest często krótszy niż 90 minut. Z drugiej strony, w procedurze MCAO u szczurów, sonda Dopplera może zostać usunięta po umieszczeniu filamentu i podczas niedokrwienia (zwykle > 90 min), a następnie ponownie umieszczona w oknie okołooczodołowym, aby potwierdzić reperfuzję, powtarzając kroki 2.6 i 2.7.
UWAGA: Typowe ciągłe śledzenie LDF od mysiego MCAO można zaobserwować w Rysunek 4A. Typowe ślady LDF z procedury MCAO na szczurach są zilustrowane na Rysunek 4B. - Wstrzyknąć zatwierdzony przez IACUC środek znieczulający miejscowo podskórnie wzdłuż potencjalnego miejsca nacięcia.
- Zamknij skórę za pomocą 1-2 szwów za pomocą standardowego węzła chirurgicznego z wchłanialną nicią do szwów lub klejem chirurgicznym, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. Leczyć ból pooperacyjny zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC (np. bupiwakaina HCL 0,5% i lidokaina 2%, raz po nacięciu u myszy i szczurów). Zwierzęta nie powinny być pozostawiane bez opieki, dopóki nie będą w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka, a żadne zwierzęta nie powinny być zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Umiejscowienie sondy laserowego Dopplera w obszarze MCA zostało przedstawione na Rysunku 1, który zawiera schemat naczyń krwionośnych i służy jako przewodnik wizualny w rzucie strzałkowym oraz grzbietowym. Rysunek 2 podsumowuje kluczowe etapy umieszczania sondy laserowego Dopplera oraz uzyskane wyniki u myszy. Rysunek 2A przedstawia obraz znieczulonej i przygotowanej myszy z przerywanym oznaczeniem w miejscu nacięcia pionowego, niez...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
MCAO jest złotym standardem w procedurze modelowania niedrożności i reperfuzji tętnic mózgowych u gryzoni i stanowi podstawę przedklinicznych badań nad udarem mózgu, umożliwiając indukcję ogniskowego niedokrwienia u gryzoni w celu naśladowania patofizjologii udaru u człowieka. Jest to wymagający zabieg chirurgiczny ze znaczną zmiennością między chirurgami, a nawet wewnątrz chirurga. Chociaż nie ma dowodów na to, że zastosowanie LDF zmniejsza zmienność, może poprawić rygor naukowy i wyniki badań w niektórych projektach. J...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| zakrzywione nożyczki sprężynowe | do 1501710 | Castroviejo | |
| #5 | Narzędzia do nauki | precyzyjnej 11250-20 | |
| Kleszcze #5/45 | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 1151-35 | |
| Forcepts Narzędzie do kauteryzacji | Conmed | M18019-01 | |
| Taśma laboratoryjna | Fisherbrand Taśma etykietująca | 15-950 | |
| Laserowy monitor dopplerowski | Instrumenty Moore'a | Oprogramowanie MOORVMS-LDF | |
| LDF | Perisoft dla systemu Windows lub moorSOFT | NA | |
| Maszynki do strzyżenia myszy | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000, sonda 407 | Sprzęt Perimed | nie jest już dostępny | |
| folia foliowa | Glad | press n seal | |
| Maszynki do strzyżenia szczurów | oster | A5 lub podobne | |
| Małe znieczulenie gryzoni | JD Medical | zamówienie | |
| małe nożyczki | excelta | 362 Sissors lub podobny | |
| System monitorowania temperatury z sondą | Physitemp | TCAT-2AC Controller |
Bibliografia
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese J Stroke. 20 (1), 84-91 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84(1989).
- Hata, R., et al. A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice: hemodynamic, biochemical, and magnetic resonance imaging. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (4), 367-375 (1998).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9 (5), 589-596 (1989).
- Lyden, P. D., et al. The stroke preclinical assessment network: Rationale, design, feasibility, and stage 1 results. Stroke. 53 (5), 1802-1812 (2022).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Effect of laser Doppler flowmetry and occlusion time on outcome variability and mortality in rat middle cerebral artery occlusion: inconclusive results. BMC Neurosci. 19 (1), 24(2018).
- Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
- Watcharotayangul, J., et al. Post-ischemic vascular adhesion protein-1 inhibition provides neuroprotection in a rat temporary middle cerebral artery occlusion model. J Neurochem. 123 Suppl 2 (Suppl 2), 116-124 (2012).
- Beretta, S., et al. Optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. (72), e50214(2013).
- Ritter, L. S., Stempel, K. M., Coull, B. M., McDonagh, P. F. Leukocyte-platelet aggregates in rat peripheral blood after ischemic stroke and reperfusion. Biol Res Nursing. 6 (4), 281(2005).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. , 8th ed., The National Academies Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Sci Rep. 6, (2016).
- Morais, A., et al. Embracing heterogeneity in the multicenter stroke preclinical assessment network (SPAN) trial. Stroke. 54 (2), 620-631 (2023).
- Ström, J. O., Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Method parameters' impact on mortality and variability in rat stroke experiments: a meta-analysis. BMC Neurosci. 14, 41(2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
