Ten protokół opisuje ulepszony model myszy do urazów płytki wzrostu kości u nastolatków. Używając transgenicznych myszy z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla kolagenu typu I, II i X, pierwotnych matryc związanych z trzema różnymi podłożami płytki wzrostowej, umieszczanie urazów jest kierowane przez natywną fluorescencję pod mikroskopem.
Artykuł metodologiczny
Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płytki wzrostu chrząstki w kościach dzieci umożliwiają wydłużenie kończyn, ale są słabe w stosunku do kości, co czyni je podatnymi na złamania, gdy kości są przeciążone. Potrzebne są lepsze metody leczenia poważnie złamanych płytek wzrostu, ponieważ odpowiedzią na uraz jest mostek kostny, który przedwcześnie zrasta się z płytką wzrostową, prowadząc do karłowatych i/lub krzywych kończyn. Mysie modele uszkodzenia płytki wzrostowej są korzystne w badaniach mechanistycznych, ale stanowią wyzwanie, ponieważ trudno jest zobrazować i precyzyjnie uszkodzić małe płytki wzrostu u młodych myszy. Opisujemy tutaj ulepszony model uszkodzenia płytki wzrostowej przy użyciu myszy transgenicznych z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla typów kolagenu I, II i X.
Te myszy wykazują natywną fluorescencję związaną z trzema głównymi podłożami płytki wzrostu. Uraz płytki wzrostowej podobny do urazu typu II Saltera-Harrisa jest tworzony w sposób powtarzalny za pomocą wiertła wykorzystującego przerostową część płytki wzrostowej jako odniesienie podczas obrazowania na żywo pod kontrolą mikroskopii stereoskopowej fluorescencji. Zamrożona analiza histologiczna natywnej fluorescencji upraszcza ocenę odpowiedzi komórkowej na uszkodzenie. Metodologia ta stanowi znaczący krok naprzód w badaniach nad uszkodzeniami płytki wzrostowej, zapewniając szczegółową i powtarzalną metodę badania patologii i oceny nowych strategii terapeutycznych.
Wprowadzenie
Płytki wzrostu kości odgrywają kluczową rolę w podłużnym wzroście kości długich w dzieciństwie i okresie dojrzewania1. Znajdująca się na końcach kości długich płytka wzrostowa składa się z wielu stref, w których chondrocyty są kluczowymi składnikami komórkowymi odpowiedzialnymi za wytwarzanie i utrzymywanie tego dynamicznego obszaru wzrostu. Kostnienie śródchrzęstne płytki wzrostowej następuje w celu wydłużenia i rozszerzenia kości poprzez sekwencyjną proliferację chondrocytów, przerost, apoptozę, inwazję naczyń krwionośnych, rekrutację komórek osteoprogenitorowych i wreszcie tworzenie kości2. Ponieważ płytka wzrostowa jest stosunkowo bardziej miękka niż kość, jest bardzo podatna na złamania, gdy kości są przeciążone podczas uprawiania sportu lub innych aktywności. Klasyfikacja Saltera-Harrisa przedstawia pięć różnych typów urazów płytki wzrostowej3. Złamanie typu II w strefie przerostowej płytki wzrostu i przylegającej dolnej tkanki kostnej jest najbardziej rozpowszechnione4. Most kostny często tworzy się w odpowiedzi na urazy strefy przerostowej lub sąsiedniej kości i prowadzi do przedwczesnego zrostu sąsiednich odcinków kości długiej5. Mostki kostne utrudniają normalne rozszerzanie się płytki wzrostowej. Obecnie nie są dostępne żadne metody leczenia profilaktycznego w przypadku powstania mostu kostnego, a niektóre z nich pozostają nieleczone w zależności od wieku pacjenta oraz rozmiaru i lokalizacji mostu kostnego6. Gdy wada rozwojowa kończyny jest poważna, opcje chirurgiczne obejmują usunięcie, a następnie wszczepienie materiałów interpozycyjnych, takich jak tłuszcz lub kauczuk silikonowy, lub osteotomię korekcyjną i zabiegi wydłużania kości; Jednak kościsty most może się jeszcze zreformować6. Potrzebne są dalsze badania, aby zapobiec tworzeniu się mostów kostnych i poprawić wyniki leczenia dzieci z urazami płytki wzrostowej kości.
Stworzono kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania podstawowych mechanizmów i opracowania nowych strategii zapobiegania upośledzeniu mostków kostnych płytek wzrostowych po urazie7,8,9,10,11,12. Te modele zwierzęce często koncentrują się na bliższej płytce wzrostu kości piszczelowej i dystalnej płytce wzrostu kości udowej jako głównym miejscu urazu, biorąc pod uwagę, że jest to zwykle miejsce, w którym dochodzi do urazów u ludzi. Ubytki kości zwierzęcych są tworzone albo przez podejście boczne podobne do rzeczywistej ścieżki złamania, albo przez podejście z góry lub poniżej płytki wzrostowej, prowadzące do centralnego otworu w płytce wzrostowej. We wcześniej opisanym modelu szczurzym ubytek płytki wzrostowej jest tworzony przez wprowadzenie wiertła dentystycznego przez okienko korowe w środkowej części kości piszczelowej i wiercenie w górę przez szpik w kierunku stawu kolanowego, aby centralnie uszkodzić płytkę wzrostową7,13. Alternatywnie, niedawny model myszy wykorzystuje podejście boczne z igłą o małym otworze, aby utworzyć płaską ścieżkę igły przez płytkę wzrostu8. W szeroko stosowanym modelu szczurzym wada powstaje w płytce wzrostowej dystalnej części kości udowej poprzez przewiercenie się przez chrząstkę stawową między kłykciami9,14. U większych zwierząt, takich jak króliki i owce, wady płytki wzrostowej zostały zarówno wywołane bocznie bezpośrednio w bliższej kości piszczelowej, jak i w dystalnej kości udowej poprzez wiercenie lub nacinanie płytki wzrostowej lub zbliżanie się od dołu i tworzenie centralnego defektu, pozostawiając krawędzie płytki wzrostu niezmienione10,11,12,15.
Mysie modele uszkodzeń płytki wzrostowej są korzystne dla badań mechanistycznych, które można przeprowadzić na genetycznie zmodyfikowanych myszach, takich jak badania nad śledzeniem linii komórek macierzystych8. Jednak poważnym wyzwaniem w modelach zwierzęcych mysich lub szczurów jest osiągnięcie spójnego i precyzyjnego uszkodzenia określonego podregionu płytki wzrostu. Uszkodzenie poszczególnych stref płytki wzrostowej i przylegającej kości jest wymagane do naśladowania jednej z klinicznie istotnych ścieżek złamania opisanych przez klasyfikacje Saltera-Harrisa. Dotychczasowe wyzwania związane z modelami gryzoni wynikają przede wszystkim z braku wizualnych środków identyfikacji podłoża płytki wzrostowej podczas chirurgicznego tworzenia urazu. Protokół ten opisuje udoskonaloną technikę tworzenia defektów płytki wzrostu w docelowych podłożach mysiej płytki wzrostowej poprzez wykorzystanie potrójnych transgenicznych myszy, które wyrażają fluorescencyjne reportery kolagenu I, II i X16,17,18. Różna kolorowa fluorescencja tych kolagenów w każdej z podstawowych stref płytki wzrostowej umożliwia wizualną dyskryminację różnych odcinków płytki wzrostowej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym podczas chirurgicznego tworzenia urazu płytki wzrostowej. Zastosowanie tych transgenicznych myszy pozwala na bezprecedensową precyzję obrażeń u młodej myszy na porównywalnym etapie rozwoju do dzieci, które są ranne.
Protokół
Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Centrum Zdrowia Uniwersytetu w Connecticut przed rozpoczęciem prac. Zarys protokołu przedstawiono na schemacie w Rysunku 1.
Rycina 1: Schemat protokołu urazu płytki wzrostu u myszy z trójkolorowym reporterem kolagenu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
1. Hodowla myszy i przygotowanie do operacji
- Wyhodować trójkolorowe transgeniczne myszy z reporterem kolagenu, które wykazują ekspresję Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP oraz Col10a1-mCherry16,17,18,19,20,21, stosując standardowe procedury hodowlane, aby uzyskać osiem młodych myszy w wieku 2 tygodni (± 1 dzień) do zabiegu chirurgicznego. Zweryfikować ekspresję potrójnego transgenu poprzez genotypowanie fragmentu końcówki ogona pod mikroskopem fluorescencyjnym. Do kolejnych analiz histologicznych wykorzystywać wyłącznie myszy wykazujące obecność wszystkich trzech kolorów, aby zmaksymalizować korzyści z zastosowanego systemu reporterowego.
UWAGA: Wiek 2 tygodni (± 1 dzień) wybrano dlatego, że płytki wzrostu kości u myszy znajdują się na etapie rozwoju zbliżonym do etapu dojrzewania u ludzi22. Protokół ten dotyczy myszy obu płci. - W dniu operacji lub jeden dzień wcześniej, jednoznacznie oznaczyć każdą mysz przeznaczoną do zabiegu za pomocą dziurkacza do uszu, po uprzednim odkażeniu ucha i dziurkacza nasączonymi alkoholem wkładami antyseptycznymi; zważyć każdą mysz i zapisać uzyskaną wartość.
- Ogolić całą prawą kończynę tylną od biodra do stopy za pomocą trymera elektrycznego, gdy mysz znajduje się pod wpływem znieczulenia izofluranem. Aby wprowadzić myszy w stan znieczulenia, zastosować mieszaninę izofluranu (2-3%) i 100% tlenu, podawaną z przepływem 1 L/min w komorze indukcyjnej o pojemności 1-2 L. Wyjąć mysz i potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez uciśnięcie palca u stopy (tzw. toe pinch), co nie powinno wywołać ruchu myszy.
UWAGA: Taka głębokość znieczulenia będzie trwała wystarczająco długo, aby przeprowadzić golenie bez konieczności stosowania maski do podawania znieczulenia. - Wykorzystać obrazowanie rentgenowskie przy ustawieniach mocy 26 kV (800 mA) do wykonania zdjęć kości piszczelowych u żywych myszy pod wpływem znieczulenia izofluranem w celu zarejestrowania początkowej długości kończyny.
- Przed umieszczeniem myszy w aparacie RTG wprowadzić je w stan głębokiego znieczulenia, stosując mieszaninę izofluranu (2-3%) i 100% tlenu podawaną z przepływem 1 L/min w komorze indukcyjnej o pojemności 1-2 L.
- Umieścić po trzy znieczulone myszy jednocześnie, równolegle na brzuchach w aparacie RTG na wysokości półki umożliwiającej wykonanie jednego zdjęcia obejmującego wszystkie trzy zwierzęta. Rozstawić kończyny tak, aby kości piszczelowe nie były zasłonięte przez ciało myszy. W celu zwiększenia dokładności pomiaru umieścić w pobliżu myszy skalę radiologiczną podczas obrazowania (Rysunek 2A).
- Przenieść przygotowane myszy z powrotem do klatki z matką w oczekiwaniu na kolejne procedury chirurgiczne.
2. Przygotowanie przyborów chirurgicznych i sterylnego obszaru roboczego
- Autoklawować następujące elementy: 10-20 gazików, patyczki z bawełnianą końcówką, wiertła dentystyczne (średnica 0,5 mm), końcówki dentystyczne, pęsety Graefe, zakrzywione kleszczyki hemostatyczne typu mosquito, zakrzywione nożyczki precyzyjne, igłotrzymacze, sondy periodontalne oraz dłuta Cleoid-discoid.
- Przygotować dodatkowe niezbędne sterylne materiały: zawiesinę buprenorfiny do wstrzykiwań, igły 20 G, strzykawki 1 mL, obłożenia z ręczników, niebarwione, plecione, powlekane nici Vicryl 5-0, jodopowidon, sól fizjologiczną (PBS), gaziki nasączone alkoholem antyseptycznym, skalpele nr 15, rękawiczki chirurgiczne, sterylną osłonę rurki (tube sox), smar do oczu oraz spray z 70% etanolem. Włączyć sterylizator szklany do dodatkowej sterylizacji narzędzi podczas operacji oraz elektryczną podkładkę grzewczą pod czystą klatkę dla myszy ze sterylną ściółką.
- Wyczyścić i zdezynfekować za pomocą 70% etanolu stolik stereomikroskopu fluorescencyjnego, powierzchnie przyległe oraz stojak na instrumenty chirurgiczne. Przykryć te obszary, które będą służyć jako pole operacyjne, sterylnymi obłożeniami z ręczników.
- Zmontować elektroniczny system szybkich wierteł dentystycznych. Podłączyć elektroniczny sterownik nożny do jednostki sterującej i pokryć przewód końcówki zdezynfekowaną osłoną rurki (tube sox). Zamocować sterylną okrągłą wiertłę dentystyczną 0,5 mm. Włączyć sterownik i ustawić przełożenie 1:1 oraz maksymalną prędkość 30 000 rpm.
- Przymocować taśmą do stolika stereomikroskopu fluorescencyjnego elastyczny wąż aparatury do izofluranu, którego końcówka w postaci stożka nosowego jest pokryta zdezynfekowaną osłoną rurki (tube sox).
- Włączyć stereomikroskop fluorescencyjny oraz sprzęt pomocniczy i uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazu.
Rysunek 2: Kluczowe etapy procedury uszkodzenia płytki wzrostu u myszy z fluorescencyjnym reporterem trzech linii komórkowych. (A) Pomiar długości kości piszczelowej za pomocą obrazowania rentgenowskiego Faxitron z wykorzystaniem radioopakowej linijki umieszczonej obok myszy w kabinie rentgenowskiej. (B) Prawidłowe ułożenie znieczulonej myszy do operacji pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Proksymalna część kości piszczelowej zaznaczona czarną strzałką. (C) Przykład nacięcia wykonanego w celu uzyskania dostępu do płytki wzrostu. (D) Stereomikroskopia fluorescencyjna oświetlająca strefę hipertroficzną płytki wzrostu (biała strzałka). Sąsiednia strefa proliferacyjna zaznaczona jest żółtą strzałką. (E) Oświetlenie światłem jasnym podczas przykładania przez chirurga wiertła dentystycznego 0,5 mm do płytki wzrostu. (F) Precyzyjne umieszczenie wiertła dentystycznego w strefie hipertroficznej pod kontrolą fluorescencyjnej stereomikroskopii. (G) Przykład defektu płytki wzrostu przypominającego złamanie Saltera-Harrisa typu II (biała strzałka). Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Procedura wywołania urazu płytki wzrostu w bliższej części kości piszczelowej
- Zanurz mysz w komorze anestezjologicznej z izofluranem, ustawiając stężenie izofluranu na 2-3% oraz przepływ tlenu na 1 L/min. Odczekaj do indukcji głębokiego stanu znieczulenia, weryfikując go za pomocą testu ucisku palca oraz obserwacji rytmu oddechowego.
- Bezpośrednio po wyjęciu myszy z komory podaj podskórnie połowę przepisanej dawki buprenorfiny. Dawkowanie buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu wynosi 3,25 mg/kg na mysz.
- Nałóż lubrykant do oczu, aby chronić oczy myszy przed wyschnięciem podczas operacji, a następnie przenieś mysz w pozycji grzbietnej do stożka nosowego urządzenia do podawania izofluranu na stole stereomikroskopu (Rysunek 2B). Ustaw przepływ anestetyku przez stożek nosowy na 2% oraz przepływ tlenu na 1 L/min.
- Zdezynfekuj kolejno prawą tylną kończynę, okolicę miednicy, przednią stronę lewej tylnej kończyny oraz ogon, używając najpierw powidonu jodowego, a następnie 70% etanolu, aby zapewnić sterylność podczas procedur chirurgicznych i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia lub infekcji w miejscu operacyjnym bądź w wyniku manipulacji zwierzęciem podczas zabiegu.
- Przed rozpoczęciem operacji zweryfikuj utrzymanie stabilnej głębokości znieczulenia, wykonując dodatkowy test ucisku palca oraz obserwując rytm oddechowy.
- Przy jasnym oświetleniu, za pomocą skalpela nr 15, wykonaj nacięcie skóry tuż poniżej stawu kolanowego o początkowej długości około 5 mm, aby odsłonić koniec proksymalny prawej kości piszczelowej (Rysunek 2C). W razie potrzeby poszerz nacięcie za pomocą nożyczek. Pozostaw przeciwną, lewą kość piszczelową nienaruszoną, aby służyła jako wewnętrzna kontrola nieuszkodzona.
- Wykonaj pionową preparację tępą przez nadkładający się mięsień w obrębie proksymalnej części kości piszczelowej, używając grzbietowej strony skalpela nr 15, usuwając tkankę miękką w celu wyraźnego odsłonięcia płytki wzrostu.
- Wyłącz światła w sali operacyjnej i wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny, aby oświetlić pożądany obszar płytki wzrostu. Zestawy filtrów wymagane do obrazowania poszczególnych fluorescencyjnych kolagenów to Col 2 Cyan: ET436/20x (pobudzenie), ET480/40 m (emisja), Col 10 mCherry: ET577/20x (pobudzenie), ET640/40 m (emisja), Col 1 Topaz: ET500/20x (pobudzenie), ET535/30 m (emisja). Ustaw mysz tak, aby widoczna była proksymalna płytka wzrostu kości piszczelowej (Rysunek 2D). Skoryguj otwór w skórze, przesuwając go nieco bardziej proksymalnie, a następnie dystalnie, aby upewnić się, że w polu widzenia znajduje się płytka wzrostu kości piszczelowej, a nie płytka wzrostu kości udowej.
- Patrząc przez okular mikroskopu, utwórz uszkodzenie przypominające typ II wg Saltera-Harrisa, ustawiając 0,5 mm wiertło stomatologiczne równolegle do osi kości piszczelowej w środku strefy hipertroficznej płytki wzrostu, stosując podejście boczne (Rysunek 2E,F). Aby w sposób powtarzalny wykonać defekt naśladujący uszkodzenie typu II wg Saltera-Harrisa, utrzymuj kończynę równolegle do powierzchni roboczej, tak aby tor wejścia wiertła nie był skierowany pod kątem do nasady kości. Naciśnij pedał wiertarki, aby uruchomić obrót wiertła i delikatnie wprowadź wiertło w płytkę wzrostu, zatrzymując się, zanim defekt stanie się głębszy niż średnica wiertła (Rysunek 2G).
UWAGA: Pomoc drugiej osoby przy stabilizacji kończyny myszy jest pomocna. - Przepłucz miejsce uszkodzenia kroplą sterylnego PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
- Potwierdź głębokość defektu na poziomie 0,5 mm za pomocą sondy periodontologicznej.
4. Procedury po urazie i zamknięcie
- W celu charakterystyki defektu w punkcie czasowym zero, pobierz uszkodzoną kończynę tylną oraz kończynę kontrolną przed zamknięciem tkanek. Postępuj zgodnie z procedurą pobierania i przygotowania tkanek do późniejszej mikrotomografii komputerowej (microCT) oraz obrazowania kriohistologicznego opisaną w sekcji 6.
UWAGA: W przypadku eksperymentów obejmujących implantację substancji terapeutycznej w defekt płyty wzrostu, sam defekt może pomieścić jedynie fragment biomateriału o kształcie zbliżonym do sfery o średnicy ok. 0,5 mm lub objętości 0,082 mm3 (0,082 µL). - Używając pęsety pod kontrolą mikroskopową, wprowadź biomateriał lub wstrzyknij płynną substancję terapeutyczną do defektu w obrębie płyty wzrostu. Zastosuj większą objętość biomateriału lub wstrzykiwanej substancji, jeśli projekt badania nie wymaga ograniczenia terapeutyku wyłącznie do obszaru defektu.
- Ostrożnie wyrównaj brzegi skóry, upewniając się, że wszczepiony materiał, jeśli został zastosowany, pozostaje bezpiecznie w miejscu defektu.
- Zastosuj technikę szwów przerywanych przy użyciu nici z kwasu poliglikolowego 5-0, aby skutecznie zamknąć nacięcie skóry.
- Dokładnie oczyść obszary poza regionem operacyjnym z pozostałości jodopowidonu, używając gazików z wodą sterylną, dbając o to, aby nie dotknąć rany ani obszarów bezpośrednio z nią sąsiadujących.
- Przenieś mysz z maski do izofluranu na stole mikroskopowym do klatki rekonwalescencyjnej, układając ją bokiem na świeżej ściółce na podkładce grzewczej.
- Przez około 5 min uważnie obserwuj częstotliwość oddychania myszy, podając pozostałą dawkę buprenorfiny w celu przeciwbólowym w momencie, gdy efekty znieczulenia izofluranem zaczną słabnąć (co objawia się wzrostem częstotliwości oddychania), ale przed powrotem zdolności ruchowych. Trzymaj mysz w izolowanej klatce rekonwalescencyjnej do czasu odzyskania pełnej sprawności ruchowej, a następnie połącz ją z matką i rodzeństwem.
- Przeprowadzaj codzienne kontrole przez pierwsze 48 h po operacji, a następnie oceny tygodniowe aż do momentu eutanazji. Zwracaj uwagę na oznaki infekcji, sprawność lokomocyjną, dostęp do pokarmu oraz integralność szwów.
- Oddziel myszy od matki w standardowym czasie (tj. w wieku 3 tygodni).
5. Pomiary długości kończyn
- W oparciu o punkty czasowe określone przez hipotezę i plan eksperymentu, znieczul myszy izofluranem i wykonaj obrazowanie rentgenowskie pełnej długości zarówno uszkodzonej, jak i nieuszkodzonej kości piszczelowej, zgodnie z Rysunkiem 2A oraz opisem w sekcji 1.4. Odpowiednie punkty orientacyjne do spójnego pomiaru długości kończyn obejmują górną część nasady kości piszczelowej oraz dystalny koniec kości piszczelowej w stawie skokowym, jak pokazano na Rysunku 3.
UWAGA: Obrazowanie służy do oceny długości kończyn i różnic w ich długości wynikających z urazu, a także do oceny rozwoju mostka kostnego w obrębie tkanek płytki wzrostu w określonych odstępach czasu po operacji.
6. Disekcja tkanek, fiksacja, obrazowanie microCT i zatapianie
- Uśmierć mysz za pomocą CO2 uduszenie, najlepiej z wykorzystaniem automatycznego systemu podawania CO22 system indukcyjny z potwierdzeniem zgonu metodą alternatywną, taką jak zwichnięcie stawów potylicznych.
- Wyizoluj obie nienaruszone kończyny tylne, a następnie usuń skórę oraz mięśnie z kości i obszaru torebki stawowej kolanowego w celu przygotowania do analizy histologicznej i mikro-tomografii komputerowej (microCT).
- Przed umieszczeniem kończyn tylnych w utrwalaczu, należy ostrożnie wyciąć rzepkę za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych, aby ułatwić przenikanie utrwalacza do jamy kolanowej. Należy użyć strzykawki insulinowej 29 G, aby dokładnie rozprowadzić zimną 10% buforowaną formalinę we wszystkich obszarach jamy kolanowej. Należy przeciąć region diafizarny kości udowej i piszczelowej, aby usprawnić dostęp utrwalacza do przestrzeni szpiku. Tkankę stawową należy utrzymać w pełnym wyproście w utrwalaczu przez 24–36 h w temperaturze 4 °C poprzez przywiązanie go gazą do cienkiego kołeczka.
OSTROŻNIE: Formalina jest toksyczna i powinna być używana w dygestorium przy zastosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej.
- Przed umieszczeniem kończyn tylnych w utrwalaczu, należy ostrożnie wyciąć rzepkę za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych, aby ułatwić przenikanie utrwalacza do jamy kolanowej. Należy użyć strzykawki insulinowej 29 G, aby dokładnie rozprowadzić zimną 10% buforowaną formalinę we wszystkich obszarach jamy kolanowej. Należy przeciąć region diafizarny kości udowej i piszczelowej, aby usprawnić dostęp utrwalacza do przestrzeni szpiku. Tkankę stawową należy utrzymać w pełnym wyproście w utrwalaczu przez 24–36 h w temperaturze 4 °C poprzez przywiązanie go gazą do cienkiego kołeczka.
- Po 24–48 h fiksacji w formalinie w temperaturze 4 °Cprzeprowadź wysokorozdzielczą mikrotomografię komputerową (microCT) próbek przeciwstawnych i uszkodzonych po przeniesieniu ich do PBS w celu oceny rozwoju mostka kostnego. Użyj rozmiar woksela z 6.0 µm, czasy pobierania próbek z 330 000 msi ustawienia energii z 55 000 V z an intensywność z 145 µA.
- Po obrazowaniu mikrotomograficznym (microCT) i dodatkowych 24 h utrwalania w formalinie w temperaturze 4 °Cpłucz próbki w 1X PBS przez 3 x 5 min, a następnie zanurz je w 10% sacharozie w 1X PBS przez 1 h, w 20% sacharozie w 1X PBS przez 1 h oraz w 30% sacharozie w 1X PBS przez noc. Użyj strzykawki insulinowej 29 G wypełnionej roztworem sacharozy, aby zapewnić przenikanie roztworu sacharozy do wszystkich obszarów jamy kolanowej. Przenieś do -80 °C zamrażarka, jeśli nie następuje zatapianie po nocnym moczeniu w sacharozie, aby zapewnić zachowanie reportera GFP oraz aktywności enzymatycznej tkanki.
- Przed zatopieniem należy usunąć wszelkie pozostałości tkanki mięśniowej z obszaru stawu. Próbkę należy inkubować w medium do zatapiania kriogenicznego przez noc, aby umożliwić przenikanie medium do jamny kolanowej.
- Przejrzyj obrazy mikro-tomografii komputerowej (microCT), aby przed zatopieniem określić lokalizację defektu oraz mostka kostnego. Nanieś cienką warstwę medium do zatapiania kriogenicznego do formy kriogenicznej i umieść wypreparowaną, wciąż połączoną kość piszczelową/udową/staw w taki sposób, aby obszar zainteresowania był skierowany 90° na powierzchnię medium do zatapiania.
UWAGA: Taka orientacja pozwala na wykonanie przekrojów obejmujących widok boczny defektu wytworzonego z boku. Jeśli mostek kostny znajduje się w pobliżu krawędzi defektu, taka orientacja pozwoli również uniknąć ryzyka pominięcia obszaru zainteresowania podczas wykonywania pierwszych, grubszych przekrojów tkanki. - Umieść formę do mrożenia na suchym lodzie, aż medium do mrożenia stężeje, unieruchamiając próbkę. Kontynuuj napełnianie formy medium, utrzymując ją na suchym lodzie.
- Po zabezpieczeniu próbki zanurz formę do kriotomii w 2-metylobutanie chłodzonym suchym lodem do czasu całkowitego zamrożenia. Po zamrożeniu usuń nadmiar 2-metylobutanu, owiń formy do kriotomii celofanem i przechowuj w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
UWAGA: W przypadku przedłużonego przechowywania w medium do mrożenia tkanek powyżej 1-2 miesięcy, -80 °C zaleca się w celu zapobiegania wysychaniu. Metoda kriosiekcjonowania z wykorzystaniem taśmy oraz przyklejanie skrawków do szkiełek przedmiotowych zostały opisane wcześniej23.
7. Sekwencyjne obrazowanie, barwienie i ponowne obrazowanie
- Zastosuj sekwencyjną procedurę obrazowania, barwienia i ponownego obrazowania, aby ułatwić wykrywanie i kolokalizację wielu sygnałów biologicznych w tym samym przekroju tkanki, zgodnie z wcześniejszym opisem23. W przypadku przekrojów płytki wzrostu od myszy z trójkolorowym reporterem kolagenu zaleca się następujące kroki. To uporządkowane podejście zapewnia kompleksową wizualizację zarówno sygnałów molekularnych, jak i szczegółów strukturalnych.
- W pierwszej kolejności, podczas pierwszej serii obrazowania, zarejestruj endogenne sygnały fluorescencyjne dla trzech kolagenów.
- Wykonaj barwienie kalkeiną niebieską (calcein blue) i obrazowanie tkanki zmineralizowanej23, a następnie barwienie i obrazowanie aktywności enzymatycznej fosfatazy kwaśnej odpornej na TRAP (TRAP)23.
UWAGA: Chociaż wyniki barwienia aktywności enzymatycznej TRAP nie są tutaj przedstawione, ten etap barwienia jest przeprowadzany, ponieważ jest on niezbędny do usunięcia minerałów przed barwieniem Safraniną O/Fast Green, którego wyniki zaprezentowano w sekcji wyników reprezentatywnych. - Przeprowadź barwienie jąder komórkowych 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) zgodnie z poniższym opisem, a następnie wykonaj obrazowanie.
- Umieść szkiełka, które poddano wcześniejszemu obrazowaniu, w naczyniu Coplina zawierającym 1x PBS. Pozostaw je zanurzone do momentu odklejenia się szkiełek podstawkowych od szkiełek przedmiotowych. Po odklejeniu wyjmij i dokładnie osusz szkiełka podstawkowe.
- Nałóż na szkiełka podstawkowe roztwór barwiący DAPI, stosując rozcieńczenie DAPI 1:1 000 w mieszaninie 50% glicerolu i 1x PBS. Po aplikacji przystąp do procesu obrazowania.
- Zakończ procedurę nałożeniem barwienia Safraniną O/Fast Green, aby podkreślić architekturę tkanki, a następnie wykonaj obrazowanie.
UWAGA: Wykonaj ten krok na końcu, aby skorelować obrazy chromogeniczne z sygnałami fluorescencyjnymi.- Przygotuj roztwory żelazowej hematoksyliny Weigerta. Przygotuj Roztwór A, rozpuszczając 1 g hematoksyliny w 100 mL 95% etanolu, oraz Roztwór B, łącząc 4 mL 29% roztworu chlorku żelaza, 95 mL wody dejonizowanej i 1 mL stężonego HCl. Wymieszaj równe części Roztworu A i B, aby otrzymać roboczy roztwór hematoksyliny Weigerta, który jest stabilny przez około 4 tygodnie.
- Zanurz szkiełka w wodzie dejonizowanej 2 x 2 min w celu nawodnienia.
- Zastosuj roboczy roztwór hematoksyliny Weigerta przez 5 min.
- Przemyj szkiełka pod bieżącą wodą przez 5 min, a następnie krótko w wodzie dejonizowanej przez 1 min.
- Barwi przez 2 min roztworem 0,2% Fast Green (0,2 g Fast Green FCF w 100 mL wody dejonizowanej).
- Krótko płucz w 1% kwasie octowym przez 1 min.
- Barwi przez 1 min roztworem 0,1% Safraniny O (0,1 g Safraniny O w 100 mL wody dejonizowanej).
- Płucz w wodzie dejonizowanej do uzyskania wizualnie zrównoważonego koloru, przez około 5 min.
- Zamontuj szkiełka w 30% glicerolu w wodzie dejonizowanej (unikaj PBS) i niezwłocznie przystąp do obrazowania, aby zapobiec dyfuzji koloru z tkanki. Aby podkreślić komórki strefy spoczynkowej płytki wzrostu, wykonaj obrazowanie z filtrem Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).
Wyniki
Niniejszy protokół wykorzystuje myszy z fluorescencyjnym reporterem trzech linii w celu precyzyjnego wywołania ubytku bocznego w płytce wzrostu proksymalnej części piszczeli, wykorzystując naturalną czerwoną fluorescencję emitowaną przez kolagen typu X jako prowadnicę chirurgiczną. Obraz widoczny dla chirurga podczas obserwacji przez okular stereomikroskopu z zastosowanym filtrem mCherry przedstawiono na Rycina 2DNaturalna fluorescencja typu X pozwala chirurgowi na umieszczenie wiertła w strefie hipertroficznej i wywołanie uszkodzenia, które naśladuje częsty typ urazu płytki wzrostu prowadzący do powstania mostka kostnego. (Rysunek 2F)Fluorescencja w kanale czerwonym jest najsilniejsza, dlatego zaleca się jej stosowanie podczas umieszczania wiertła. Alternatywnie, tworzenie defektu można prowadzić w oparciu o inne kolory natywnej fluorescencji potrójnie transgenicznych myszy, jeżeli celem eksperymentu jest badanie uszkodzeń innych stref płytki wzrostu niż strefa hipertroficzna i przyległy obszar skalcyfikowany.
Utworzenie ubytku przypominającego typ II według klasyfikacji Saltera-Harrisa w strefie przerostu płytki wzrostu oraz w przyległej tkance kostnej poniżej, z wykorzystaniem wiertła dentystycznego o średnicy 0,5 mm, zostało zwalidowane za pomocą mikro-tomografii komputerowej (microCT) oraz obrazowania krio-histologicznego uszkodzonych (czas 0) kości piszczelowych bliższych w porównaniu z nieuszkodzonymi kontrolami bocznymi u N = 3 myszy (Rysunek 4). Ubytki były trudne do zauważenia na trójwymiarowych obrazach microCT, lecz były wykrywalne na dwuwymiarowych przekrojach poprzecznych (Rysunek 3A,B,E,F). Rysunek 3G przedstawia rozmieszczenie komórek kostnych produkujących kolagen typu I (zielona fluorescencja), proliferujących chondrocytów produkujących kolagen typu II (cyjanowa fluorescencja) oraz chondrocytów przerostowych produkujących kolagen typu X. Na obrazie uszkodzonej myszy (Rysunek 4G) widoczne jest przerwanie strefy przerostu, warstwy przejściowo zwapniałej oraz części nowo powstałej kości w stosunku do kontroli, przy czym strefa proliferacyjna jest jedynie lekko zaburzona. Barwienie Safranin O/Fast Green (Rysunek 4H) najlepiej ilustruje lokalizację ubytku w uszkodzonej płytce wzrostu, ponieważ wszystkie komórki są wyraźnie widoczne.
Analiza rentgenowska u żywych myszy pozwala ocenić wpływ tego rodzaju uszkodzenia płytki wzrostu na długość kości piszczelowej oraz tworzenie się mostka kostnego w czasie (Rysunek 3). Porównanie obrazowania nieuszkodzonych (Rysunek 3A) i uszkodzonych (Rysunek 3B) kości piszczelowych, wykonane przed operacją oraz 3 tygodnie po niej, wykazuje znaczny wzrost kończyny, pocienienie płytek wzrostu oraz wyraźny obszar nieprzezroczysty, który pojawił się w miejscu uszkodzenia płytki wzrostu w 3. tygodniu. Taka nieprzezroczystość w obrębie płytki wzrostu nie występuje w przypadku kontrolnym ani u myszy przed operacją. System Faxitron stanowi zatem sposób obserwacji zmian patologicznych wywołanych urazem u żywych myszy, takich jak formowanie się mostka kostnego i zmiany długości kończyn.
Obrazowanie MicroCT wypreparowanych kości pozwala na szczegółową wizualizację formowania się mostków kostnych w obrębie uszkodzonych płytek wzrostu trzy tygodnie po operacji (Rysunek 5). Jak widać na obrazach sześciu różnych myszy z uszkodzeniem przedstawionych na Rysunku 5, we wszystkich osobnikach występuje spójny rozwój mostków kostnych. Przy użyciu oprogramowania Scanco Medical obliczono objętość mostka kostnego poprzez analizę każdego przekroju proksymalnej płytki wzrostu kości piszczelowej, wyznaczenie obszaru mostka kostnego (Rysunek 5B) za pomocą narzędzia wyboru, a następnie zintegrowanie pola powierzchni każdego przekroju w całej objętości płytki wzrostu w celu uzyskania całkowitej objętości24. Objętość mostka kostnego obliczona w ten sposób wyniosła 0,0761 mm3 ± 0,0246 (średnia ± odchylenie standardowe, N = 6). Większość mostków kostnych formuje się w pobliżu środka płytki wzrostu, pomimo zastosowania podejścia bocznego, które uszkadza zarówno krawędź zewnętrzną, jak i środek płytki wzrostu. Zjawisko to można przypisać faktowi, że za formowanie mostków kostnych odpowiedzialne są mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) z szpiku kostnego, a nie z okochrząstki25.
W przypadku tych tricolor myszy transgenicznych analiza krio-histologiczna uszkodzonej płytki wzrostu jest wzbogacona przez natywną fluorescencję kolagenu (Rycina 6)Ujawnia ono złożone oddziaływanie komórek kostnych i chondrocytów w miejscu urazu. Obrazy mikro-tomografii komputerowej (microCT) przedstawione w Rycina 6J,K przekazano technikowi histologowi w celu przeprowadzenia procesu zatapiania i krojenia. Komórki kostne produkujące kolagen typu I widoczne są w Rycina 6L,O,P (zielona fluorescencja), natomiast proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II widoczne są w Rysunek 6L,O,Q (fluorescencja cyjanowa). Chondrocyty hipertroficzne produkujące kolagen typu X widoczne są w Rysunek 6L,O,R (czerwona fluorescencja). Ta wielobarwna metoda fluorescencyjna umożliwia szczegółowe badanie różnicowania chondrocytów po operacji w obrębie mostka kostnego na tle zmineralizowanej tkanki. Barwienie DAPI zastosowano w celu potwierdzenia rozmieszczenia wszystkich typów komórek w obszarze płytki wzrostu (Rysunek 6M)Barwienie Safraniną O/Fast Green obrazuje organizację strukturalną i kompozycyjną chrząstki oraz kości w obrębie uszkodzonej płytki wzrostu. (Rysunek 6N)Obrazowanie tych barwionych przekrojów przy użyciu zestawu filtrów Cy5 wyraźnie rozjaśnia komórki strefy spoczynkowej na styku kostnej części nasady i chrząstki.
Rycina 3Obrazy rentgenowskie przeciwstawnej kontroli oraz uszkodzonych kości piszczelowych myszy. (AZdjęcia rentgenowskie przeciwległej kości piszczeli kontrolnej wykonuje się bezpośrednio przed urazem, gdy myszy mają 2 tygodnie, oraz 3 tygodnie po operacji, gdy myszy mają 5 tygodni, co pozwala zobrazować zakres wzrostu zachodzącego w tym okresie.B) Uszkodzona kość piszczelowa od tej samej myszy w tych samych punktach czasowych co w (A). Punktami orientacyjnymi wykorzystanymi do pomiaru długości kości piszczelowej są wierzchołek bliższego końca głowy kości piszczelowej oraz koniec kości piszczelowej w stawie skokowym (czerwone strzałki dwukierunkowe). W 5. tygodniu w uszkodzonej bliższej płytce wzrostu kości piszczelowej widoczny jest nieprzezroczysty mostek kostny. Paski skali = 5,00 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Obrazy mikro-TK i histologiczne przeciwstawnych kości piszczelowych myszy w czasie zero: kontrolne i uszkodzone. (A,E) oraz (B,F) przedstawiają trójwymiarowe i poprzeczne dwuwymiarowe widoki mikro-TK, gdzie defekt zaznaczono czerwonymi strzałkami na (E) i (F). (C,G) Złożone, zlewne obrazy krio-histologiczne łączące trzy warstwy fluorescencji endogennej z warstwą tkanki zmineralizowanej. Zielone komórki (Col3.6GFPtpz) to komórki kostne produkujące kolagen typu I, komórki koloru cyjanowego (Col2A1GFPcyan) to proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II, a czerwone komórki (Col10A1RFPchry) to hipertroficzne chondrocyty produkujące kolagen typu X. (D,H) Barwienie Safraniną O i Fast Green tego samego obszaru co na (C) i (G). Paski skali = 1.0 mm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 5: Obrazy MicroCT mostków kostnych utworzonych zgodnie z tym protokołem. (A,C,E,G,I,K) Przekroje poprzeczne bliższej części płytki wzrostu kości piszczelowej u sześciu różnych myszy 3 tygodnie po wykonaniu defektu otworu. Mostek kostny zaznaczono czerwoną linią przerywaną w (A). (B,D,F,H,J,L) Rekonstrukcje 3D z wyciętą płaszczyzną podłużną. Mostek kostny zaznaczono czerwoną linią przerywaną w (B). Paski skali = 1.0 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Obrazy microCT i histologiczne przeciwstawnej kontroli oraz uszkodzonej bliższej części kości piszczelowej myszy z formowaniem się mostka kostnego. (A,J) i (B,K) przedstawiają trójwymiarowe (3D) i poprzeczne dwuwymiarowe (2D) widoki microCT, gdzie mostek kostny wskazano żółtymi strzałkami na panelach (J) i (K). (C,L) Złożone, połączone obrazy kriohistologiczne łączące trzy warstwy fluorescencji wrodzonej z warstwą tkanki zmineralizowanej. Zielone komórki (Col3.6GFPtpz) to komórki kostne produkujące kolagen typu I, komórki w kolorze cyjanowym (Col2A1GFPcyan) to proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II, a czerwone komórki (Col10A1RFPchry) to hipertroficzne chondrocyty produkujące kolagen typu X. Biała ramka wskazuje większe powiększenie pokazane na panelach F i O. (D,M) Tkanka zmineralizowana i barwienie DAPI w obszarze płytki wzrostu z paneli C i L. (E,N) Barwienie Safranin O/Fast Green tego samego obszaru co na panelach (D) i (M), skanowane z fluorescencją cy5. (F,O) Większe powiększenie obszaru płytki wzrostu na obrazie połączonym z paneli C i L. (G-I,P-R) Poszczególne kanały fluorescencji wrodzonej pokazane na tle tkanki zmineralizowanej. Paski skali = 1.0 mm (A-E) i (J-N), = 250 µm w (F-I) i (O-R). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Innowacyjne zastosowanie myszy reporterowych z trójkolorowym kolagenem umożliwia tworzenie defektów płytki wzrostowej o z góry określonym rozmiarze i lokalizacji, znacznie zwiększając dokładność mysich modeli eksperymentalnych dla urazów płytki wzrostowej. Biorąc pod uwagę niewielki rozmiar 2-tygodniowych myszy, bardzo ważne jest, aby użyć małego wiertła 0,5 mm, aby spowodować uraz, aby uniknąć osłabienia kończyny i spowodowania złamania o pełnej grubości. Chirurg musi również wywierać wystarczający nacisk podczas tworzenia wady, aby uniknąć zbyt głębokiego wiercenia w kości z tego samego powodu. Użycie periosondy ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia stałej głębokości urazu.
Podobnie jak w przypadku każdej operacji, ważne jest, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia, potwierdzoną przez sporadyczne szczypanie palca u nogi, a sterylność jest zachowana przez cały czas. Innym ważnym punktem chirurgicznym jest to, że opisano rozwarstwienie za pomocą rzeźbiarza, ponieważ pozwala to uniknąć uszkodzenia tkanek miękkich i pomaga zapewnić, że myszy są w stanie poruszać się natychmiast po wyzdrowieniu ze znieczulenia, aby dotrzeć do matki myszy w celu odżywienia i komfortu. Z naszego doświadczenia wynika, że rany zamknięte szwami pozostały skutecznie zamknięte i klipsy do ran nie są wymagane. Zaleca się operację na myszach w wieku 2 tygodni, aby jak najlepiej naśladować małe dziecko, które doświadcza złamań płytki wzrostowej. Jedną z wad tego protokołu jest to, że biorąc pod uwagę nieprzewidywalną naturę porodu, użycie tego mysiego modelu wymaga dostępności chirurga w krótkim czasie.
Jeśli chodzi o umiejscowienie wiertła w celu wytworzenia defektu, protokół opisuje tworzenie urazu za pomocą zestawu czerwonych filtrów mCherry / Texas, który oświetla strefę przerostową w płytce wzrostowej ze względu na jasność fluorescencji kolagenu X. Aby upewnić się, że uraz powstał w obrębie płytki wzrostowej piszczelowej, korzystne jest lekkie przesunięcie otworu tkanki miękkiej w lewo i w prawo, aby potwierdzić, że widoczna jest bliższa płytka wzrostowa piszczelowej, a nie kość udowa. Przełączanie między kanałami zestawu filtrów w celu oświetlenia proliferacyjnej strefy chondrocytów lub sąsiednich odcinków kości jest przydatne do potwierdzenia dokładnego położenia względem lokalizacji strefy proliferacyjnej i sąsiednich odcinków kości.
Podczas gdy proliferacyjna strefa chondrocytów oraz kość nasadowa i przynasadowa można rozróżnić pod mikroskopią fluorescencyjną u żywych myszy, rzeczywista wartość reporterów kolagenu typu II i typu I jest realizowana podczas analizy histologicznej płytki wzrostu. Biorąc pod uwagę wodny charakter procesów kriohistologicznych, tradycyjne protokoły wytrącania barwników chromogennych są nieodpowiednie ze względu na potencjalną niewspółosiowość koloru z obrazowaniem fluorescencyjnym spowodowaną etapami odwadniania. Chociaż protokół wodny daje wzory barwienia podobne do tych w skrawkach parafiny, szybkie obrazowanie po barwieniu jest niezbędne, aby zapobiec dyfuzji barwnika z tkanki. Wykorzystanie 30% glicerolu w wodzie destylowanej jako medium montażowego może spowolnić tę dyfuzję, umożliwiając wielokrotne barwienie chromogenne na tym samym odcinku, w tym chrząstki za pomocą Safranin O/Fast Green.
Proces kostnienia śródchrzęstnego jest wyraźnie widoczny z czerwonymi chondrocytami wyściełającymi rozwijający się most kostny (ryc. 6). Dodatkowe zastosowanie technik immunohistochemicznych, dla których dostępnych jest wiele mysich przeciwciał, może jeszcze bardziej wzmocnić badania mechanistyczne prowadzone na tych transgenicznych myszach. Podsumowując, połączenie technik faksytronu, mikrotomografii komputerowej i obrazowania kriohistologicznego w tym transgenicznym modelu myszy oferuje kompleksowe zrozumienie makroskopowych i mikroskopowych zmian, które zachodzą w odpowiedzi na uszkodzenia płytki wzrostu, torując drogę dla przyszłych interwencji terapeutycznych w celu złagodzenia takich niekorzystnych wyników. Dalsze manipulacje genetyczne tych transgenicznych myszy mogą zostać przeprowadzone, aby umożliwić badania nad śledzeniem linii w celu zrozumienia pochodzenia komórek, które są czasowo i przestrzennie zaangażowane w gojenie. Eksperymenty na myszach z dodatkowymi modyfikacjami pozwoliłyby na badanie chorób chrząstki, takich jak osteochondroma - przerost chrząstki i kości w pobliżu płytki wzrostowej.
Spójność naszego modelu przejawia się w powtarzalnym tworzeniu mostów kostnych u wszystkich myszy bez konieczności odrzucania jakichkolwiek myszy z grupy z powodu uszkodzenia chrząstki stawowej. Jest to poprawa w stosunku do poprzednich modeli, które zbliżały się do płytki wzrostowej z okna korowego poniżej płytki wzrostowej i ustawiały ostre narzędzie lub wiertło w górę w kierunku płytki wzrostowej i czasami przestrzeliwały w chrząstkę stawową. Dodatkowy uraz chrząstki stawowej nie naśladuje powszechnie występujących urazów płytki wzrostowej u dzieci. Bardziej precyzyjne uszkodzenie tego modelu zwierzęcego zmniejsza liczbę myszy wymaganych na eksperyment i jest to kolejna poprawa. Wykorzystanie myszy transgenicznych pozwala badaczowi skupić uraz na pododcinkach płytki wzrostu, takich jak obszar przerostowy/tymczasowo zwapniały lub nasada/strefa spoczynku/obszar strefy proliferacyjnej, bez wpływu na chrząstkę stawową. Ograniczeniem tego modelu jest jednak zmienność objętości mostu kostnego, która może różnić się nawet o 30% wśród rannych zwierząt. W związku z tym wykrycie klinicznie istotnego wpływu na tworzenie się mostków kostnych nadal wymaga dużej liczby zwierząt, aby osiągnąć znaczenie statystyczne.
Korzyści dla modelu mysiego, jak opisano tutaj, w porównaniu z modelami uszkodzeń płytki wzrostu szczurów lub królików wcześniej opublikowanymi 7,9,10,14, obejmują mniejszą liczbę wykorzystanych zwierząt, redukcję kosztów, wydajną wielkość repliki dzięki odtwarzalnemu tworzeniu się prętów kostnych, krótsze ramy czasowe badania i bardziej precyzyjne umieszczanie urazów dzięki obrazowaniu na żywo potrójnie transgenicznych myszy. Chociaż nie omówiono tego szczegółowo, ten model myszy może być używany do testowania implantów inżynierii tkankowej lub biomateriałów dostarczających czynniki wzrostu. Znaczącym ograniczeniem tej mysiej metody jest to, że rozmiar implantu używanego do dostarczania leków lub komórek terapeutycznych jest ograniczony do objętości ubytku kuli o średnicy około 0,5 mm. Tylko większe modele zwierzęce są w stanie pomieścić taką ilość badanego materiału, jaka zostałaby użyta u ludzi. Wada wiertła powstała w tym protokole nie ma tej samej geometrii co cienkie złamanie, a zatem różni się od rzeczywistych obrażeń u ludzi. Niemniej jednak korzyści płynące z tego modelu myszy są liczne, a podejście boczne pozwala uniknąć uszkodzenia chrząstki stawowej, które miałoby miejsce, gdyby zbliżać się na ślepo powyżej lub poniżej płytki wzrostowej w linii z długą osią piszczeli. Metodologia ta stanowi znaczący krok naprzód w badaniach nad uszkodzeniami płytki wzrostowej, zapewniając szczegółową i powtarzalną metodę badania patologii i oceny nowych strategii terapeutycznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z National Institutes of Health, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) 1R21AR079153 oraz grant University of Connecticut Research Enhancement Program (REP). Autorzy dziękują za pomoc Renacie Rydzik z University of Connecticut MicroCT Imaging Core facility.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-metylo-butan | Sigma Aldrich | M32631 | |
| Alkoholowe podkładki antyseptyczne | Acme United Corporation | H305-200 | |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | |
| Oprogramowanie AxioVision | Carl Zeiss AG | ||
| Roztwór Betadine (10% jodu powidonu) | Avrio Health L.P. | 67618-150-01 | |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | |
| Zestaw filtrów CFP | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | |
| Kriostat | Leica Biosystems | 3050s | |
| Lab Cryofilm | 2C | ||
| Nożyczki | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Zakrzywione kleszcze hemostatyczne do komarów | HuFriedyGroup | H3 | |
| cy5 zestaw | filtrów Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | |
| Chroma | Technology Corp. | 49000 | |
| Wiertło dentystyczne (średnica 0,5 mm) | |||
| Dentystyczny cleoid dyskoidalny rzeźbiarz | ACE Surgical Supply Inc. | 6200097A-EA | |
| Sterylizator suchych kulek szklanych (Inotech Steri 350) | Inotech Bioscience, LLC | IS-250 | |
| Dziurkacz do uszu | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Elektryczna poduszka | |||
| Elektroniczny sterownik | nożny Nouvag AG | 1866nou | |
| Silniki elektroniczne 31 ESS | Nouvag AG | 2063nou | |
| Środowiskowa bariera powierzchniowa (rura 3 x 12 cali sox) | Patterson Companies, Inc. | BB-0312H | |
| Etanol (70%) | |||
| Ethiqa XR (zawiesina do wstrzykiwań buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu) 1,3 mg/ml | Fidelis Animal Health | 86084-100-30 | |
| Szafa rentgenowska Faxitron | Kubtech Scientific | Parameter | |
| Stereomikroskop fluorescencyjny | Carl Zeiss AG | Lumar V12 | |
| GFP | zestaw filtrów Chroma Korporacja Technologiczna | 49020 | |
| Lodowcowy kwas octowy | Sigma Aldrich | ARK2183 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Thermo Scientific | 3051 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Kleszcze Graefe | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Rękojeść (kątnica 32:1 przycisk) | Nouvag AG | 5201 | |
| Jednostka sterująca systemem implantologii/chirurgii jamy ustnej (Straumann) | Nouvag AG | SEM | |
| Woreczek do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem z podwójnymi wewnętrznymi/zewnętrznymi wskaźnikami procesu (3 1/2 x 5 1/4 cale) | Fisher Scientific | 01-812-50 | |
| Woreczek do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem z podwójnymi wewnętrznymi/zewnętrznymi wskaźnikami procesu (5 4/1 x 10 cali) | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Strzykawka insulinowa (29 G) | Exel International | 26028 | |
| Izofluran& nbsp; | Dechra Pharmaceuticals plc | 17033-091-25 | |
| znieczulający izofluranem | |||
| Zestaw filtrów mCherry | Chroma Technology Corp. | 39010 | |
| Nożyczki do mikropreparowania | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Igła (20 G) | Becton, Dickinson and Company | 305178 | |
| Uchwyt na igły | HuFriedyGroup | NHCW | |
| Neutralna buforowana formalina (10%) | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Niesterylne waciki do aplikatorów | Allegro Industries | 205 | |
| Gaza włókninowa (3 x 3 cale) | Fisher Scientific | 22028560 | |
| Klej optyczny Norland, 61 | Klej optyczny Norland | Optical | |
| Maść okulistyczna (lubrykant do oczu Optixcare) | CLC Medica | ||
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | |
| Sonda periodontologiczna | HuFriedyGroup | PQW | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4 (1x) | Gibco, firmy Life Technologies | 10-010-023 | |
| Plastikowe szkiełka mikroskopowe | Mikroskopia elektronowa Sciences | 71890-01 | |
| Profesjonalna maszynka do strzyżenia/trymer (Wahl Classic Peanut)Wahl | Clipper Corporation | 8685 | |
| Roller | Mikroskopia elektronowa Nauki | 62800-46 | |
| Oprogramowanie Scanco Medical | SCANCO Medical | Scanco μ CT 50 | |
| Octan sodu bezwodny | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Azotyn sodu | Sigma Aldrich | S2252 | |
| Winian sodu dwuwodny dwuwodny | Sigma Aldrich | T6521 | |
| Dysk z próbką | Leica Biosystems | 14037008587 | |
| Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej #15 | Aspen Surgical Products, Inc. | ||
| Sterylne rękawice chirurgiczne | Cardinal Health, Inc. | 2D72PT65X | |
| Sterylna zasłona na ręcznik (18 x 26 cali) | IMCO | 4410-IMC | |
| Sacharoza | Sigma | Aldrich S9378 | |
| Strzykawka (1 ml) | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| Niebarwiony pleciony powlekany szew vicryl (5-0) | Ethicon Inc. | J490G | |
| UV czarne światło | General Electric | F15T8-BLB |
Bibliografia
- Iannotti, J. P. Growth plate physiology and pathology. Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).
- Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate. Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).
- Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries involving the epiphyseal plate. JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).
- Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures. Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).
- Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
- Muruganandan, S., et al. A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic. J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
- Foster, B. K., et al. Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep. J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).
- Erickson, C. B., et al. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. J Vis Exp. (125), e55571(2017).
- Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
- Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury. Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).
- Chen, J., et al. Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations. Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).
- Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials. Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).
- Dyment, N. A., et al. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Kalajzic, I., et al. Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).
- Maye, P., et al. Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice. Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).
- Chokalingam, K., et al. Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes. Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sci. 152, 244-248 (2016).
- Dyment, N. A., et al. multi-image cryohistology of mineralized tissues. J Vis Exp. (115), e54468(2016).
- Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
- Chung, R., Xian, C. J. Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration. J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).
Przedruki i uprawnienia
