Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Summary

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Abstract

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe są popularnym modelem mikroagregatów 3D do odtwarzania mikrośrodowiska guza, testowania i optymalizacji terapii lekowych oraz używania bio- i nanosensorów w kontekście 3D. Ich łatwość produkcji, przewidywalna wielkość, wzrost oraz obserwowane gradienty składników odżywczych i metabolitów są ważne dla podsumowania mikrośrodowiska komórek niszowych 3D. Jednak niejednorodność sferoidów i zmienność ich metod produkcji mogą wpływać na ogólny metabolizm komórek, żywotność i odpowiedź na leki. Utrudnia to wybór najodpowiedniejszej metodologii, biorąc pod uwagę wymagania dotyczące wielkości, zmienności, potrzeb biofabrykacji i wykorzystania jako modele tkanek 3D in vitro w biologii komórek macierzystych i nowotworowych. W szczególności produkcja sferoidów może wpływać na ich kompatybilność z ilościowymi mikroskopami żywymi, takimi jak optyczne obrazowanie metaboliczne, mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), monitorowanie niedotlenienia sferoidalnego za pomocą nanoczujników lub żywotność. W tym miejscu przedstawiono szereg konwencjonalnych protokołów tworzenia sferoid, podkreślając ich kompatybilność z żywymi mikroskopami szerokokątnymi, konfokalnymi i dwufotonowymi. Przedstawiono również proces obrazowania uzupełniającego do analizy z multipleksowaną autofluorescencją FLIM oraz z wykorzystaniem różnych typów sferoidów nowotworowych i komórek macierzystych.

Introduction

Sferoidy wielokomórkowe reprezentują grupę trójwymiarowych modeli tkanek uzyskanych w wyniku samoagregacji komórek i wykazujących kulisty kształt. Są one szeroko stosowane do naśladowania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz in vitro oraz do odtwarzania kontekstu 3D w wielu konstruktach pochodzących z raka i komórek macierzystych. Stosuje się kilka technik w celu zmniejszenia przyczepiania się komórek i promowania agregacji. Należą do nich metoda wiszącego spadku oparta na napięciu powierzchniowym¹; metody odpychania przyczepiania komórek, takie jak ultra-niskie płytki mocujące, mikroformy i mikrostudzienki^2,3; podejście oparte na falach akustycznych4; metody agregacji indukowanej przepływem (kolby wirujące, bioreaktory i urządzenia mikroprzepływowe)5; tworzenie wspomagane cząstkami magnetycznymi⁶ oraz wykorzystanie syntetycznych i opartych na ECM matryc i rusztowań promujących agregację^7,8,9.

W badaniach, rozwoju i walidacji nowych terapii lekowych, sferoidy są atrakcyjnym modelem ze względu na ich zdolność do rekapitulacji ograniczonych dyfuzją przestrzenną gradientów składników odżywczych, produktów przemiany materii i O₂, co często prowadzi do powstania martwiczego rdzenia, typowego dla guzów litych^10,11. Te bardziej wiarygodne i wyrafinowane modele in vitro stanowią wyzwanie dla potrzeby szerokiego wykorzystania modeli zwierzęcych (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.0¹²), zgodnie z zasadą 3R w badaniach na zwierzętach (zastępowanie, redukcja i udoskonalanie). Oprócz raka, sferoidy znajdują swoje zastosowanie w badaniach nad komórkami macierzystymi. Na przykład pluripotencjalne komórki macierzyste mają zdolność do tworzenia ciał zarodkowych (EB), które można wykorzystać do różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w kierunku wyspecjalizowanych typów komórek, które są trudne do uzyskania bezpośrednio od pacjentów, takich jak neuronalne komórki prekursorowe¹³ lub komórki ziarniste jajnika^13,14. Co więcej, utworzenie EB jest często pierwszym krokiem w rozwoju bardziej złożonych modeli organoidowych, np. neural¹⁵, retinal^{16, cardiac17}, liver¹⁸, stomach¹⁹ i organoidy jelitowe²⁰. Przy wyborze odpowiedniej metody tworzenia sferoid do eksperymentów należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak rozmiar, odtwarzalność, przepustowość i dalsze zastosowania.

Zwiększona złożoność hodowli 3D może prowadzić do większej zmienności w porównaniu do kultury 2D. Czynniki takie jak skład składników odżywczych²¹, parowanie pożywki²², lepkość²³, kontrola pH²⁴, metoda tworzenia sferoidów, a nawet czas w kulturze^25,26 mogą prowadzić do uzyskania sferoid o różnej morfologii, rozmiarach, żywotności i różnej odporności na chemoodporność^27,28. Ostatnie badania wykazały, że sferoidalne gradienty tlenu nie zawsze są statyczne i mają na nie wpływ metoda tworzenia, rozmiar sferoidy i lepkość zewnątrzkomórkowa, wpływając na niejednorodność sferoidów²⁹. Aby poprawić odtwarzalność i dostępność danych na temat sferoidów, opracowano bazę wiedzy MISpheroID²⁶, identyfikując linię komórkową, pożywkę hodowlaną, metodę tworzenia i rozmiar sferoid jako minimalne informacje dla powtarzalnego wyniku. W związku z tym przeprowadzono szczegółowe porównanie wielu metod o wysokiej przepustowości (SphericalPlate 5D, mikroformy wyprodukowane w laboratorium i formy do mikrotkanek) i nisko osadzonych (tj. 96-dołkowe płytki Biofloat i Lipidure, zarówno bez rusztowań, jak i na rusztowaniach) (Rysunek 1 i Tabela 1), w tym rozmiar studni (biorąc pod uwagę oszacowanie maksymalnego rozmiaru sferoidy), użyte materiały eksploatacyjne, czas przygotowania i możliwość monitorowania sferoid bez transportu je do naczyń mikroskopowych. To ostatnie umożliwia długoterminowe badania, podczas gdy sferoidy wytworzone metodami wysokoprzepustowymi często skutkują eksperymentami końcowymi. Wszystkie metody, z wyjątkiem siatek płytki 5DspheriPlate, nie powodują niepożądanej autofluorescencji, co umożliwia ich bezpośrednie zastosowanie w mikroskopii.

Rysunek 1: Wyjaśnienie metod tworzenia sferoidów. Metody o wysokiej przepustowości, takie jak SphericalPlate 5D, która zintegrowała opatentowane mikrodołki w płytce, podczas gdy produkowane w laboratorium mikroformy i formy MicroTissue wykorzystują stemple do wytwarzania wielu mikrostudzienek w agarozie (niebieskiej). Płytki o niskim przyleganiu, takie jak Lipidure (Amsbio) i Biofloat (Sarstedt), wykorzystują nieprzylegającą powłokę, która hamuje przyleganie do powierzchni komórki i sprzyja samoagregacji komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt.

	Płyta sferyczna 5D	Mikroformy własnej produkcji	Mikrotkanka	Niskie metody mocowania
Liczba sferoid/studzienkę	750	Rok 1589	Rozdział 81	1
Średnica studni	90 μm	400 μm	800 μm	1 mm
Objętość kultury	1 ml	5 ml	1 ml	200 μL
Inne materiały eksploatacyjne	/	7 ml 3% agarozy	500 μL 2% agarozy	/ *
Czas przygotowania	Czas trwania: 10 min	2 h + 3 dni adaptacji mediów	0,5 h + 15 min adaptacja mediów	10–30 min + 1 h suszenia
monitoring	tak	Nie**	tak	tak
Autofluorescencyjny	tak	Nie	Nie	Nie
Wielokrotnego użytku	Nie	tak	tak	Nie**
Koszt	€€	€	€€€€	€€€€: Powłoka i Matrigel
				€€: Komercyjna płytka 96-dołkowa
*Niektóre linie komórkowe wymagają dodania ECM (np. 2%–5% Matrigel), aby utworzyć zwarte sferoidy.
**Powłoka nadaje się do ponownego użycia aż do wyczerpania. Jednak każda płyta będzie zużywać niewielką ilość nośnika, a z czasem może gromadzić się kurz. Regularnie potrzebna jest sterylizacja filtra.

>Tabela 1: Porównanie wielu metod tworzenia sferoidów²⁹. "Monitorowanie": możliwość monitorowania sferoidy bez konieczności przenoszenia do naczynia mikroskopowego. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: >500€

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia bezpośrednie monitorowanie kluczowych aspektów biologicznych sferoid, w tym śmierci komórki, żywotności, proliferacji, metabolizmu, lepkości, a nawet właściwości mechanicznych³⁰. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) zapewnia dodatkowy wymiar ilościowy do badania interakcji sond fluorescencyjnych w ich (mikro)środowisku^31,32,33,34, umożliwiając rozdzielczość nakładających się widm emisji według różnych okresów eksploatacji emisji^35,36 oraz sondowanie metabolizmu komórkowego w oparciu o wewnętrzną autofluorescencję komórkową. Tak więc tak szeroko rozpowszechnione komórkowe związki autofluorescencyjne, jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD(P)H), mononukleotyd flawinowy (FMN), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), protoporfiryna IX i inne mogą być mierzone za pomocą jedno- i dwufotonowego FLIM i służyć jako wewnętrzne "czujniki" katabolizmu glukozy, fosforylacji oksydacyjnej (OxPhos) i zapewniają ogólny przegląd stanu redoks komórki. NAD(P)H występuje w wolnych formach cytoplazmatycznych lub mitochondrialnych związanych z białkami^37,38. Podobnie, stopień utlenienia FAD jest fluorescencyjny z dłuższą żywotnością wolnej postaci. Mikroskopie NAD(P)H i FAD zwykle obejmują wzbudzony dwufotonowy FLIM, mający na celu zapobieganie fotouszkodzeniom próbki³⁹. Często "optyczne obrazowanie metaboliczne" FLIM można połączyć z użyciem sond barwnikowych, genetycznie kodowanych bioczujników, mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) i pomiarów opartych na intensywności ratiometrycznej w celu zapewnienia pełniejszego obrazu metabolizmu sferoidów lub organoidów, natlenienia, proliferacji i żywotności komórek^29,30,31. Ponadto FLIM można również połączyć z metodą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) w celu pomiaru zmienności fluoroforu dawcy w czasie życia w bliskim kontakcie z akceptorem w celu zbadania wiązania leku z jego domeną docelową^33,40,41.

Pozyskane obrazy FLIM są zazwyczaj analizowane w celu obliczenia czasu życia piksel po pikselu. Obecnie istnieją co najmniej 3 popularne strategie stosowane w celu uzyskania czasu życia fluorescencji: półilościowe "szybkie FLIM"⁴² (czasami określane jako "tau sense"^43,44), dopasowanie krzywej zaniku, przy użyciu jedno-, dwu- lub trzywykładniczego dopasowania oraz podejście "bez dopasowania" z transformacją wskazową i analizą wykresu wskazowego. W zależności od dostawcy, do obsługi zmierzonych danych FLIM można użyć dostarczonego oprogramowania (LAS X, Symphotime, SPCImage itp.) lub oprogramowania typu open source (np. FLIMfit⁴⁵, FLIMJ⁴⁶ lub inne⁴⁷). Zazwyczaj oprogramowanie dostarczane przez dostawcę jest przydatne do wstępnej analizy danych, podczas gdy rozwiązania typu open source mogą zapewnić dokładniejsze badania za pomocą np. wykresów wskazowych i wizualizacji 3D.

Pomimo użyteczności i atrakcyjności FLIM jako metody badania sferoid, dostępnych jest bardzo niewiele protokołów eksperymentalnych, a także ogólny brak wiedzy na temat wyboru najodpowiedniejszej metody formowania dla udanych eksperymentów z użyciem mikroskopii wieloparametrycznej na żywo z udziałem FLIM. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe porównanie powszechnie stosowanych protokołów tworzenia sferoidów w oparciu o ich morfologię, żywotność i natlenienie za pomocą niedawno zwalidowanego i scharakteryzowanego nanoczujnika tlenu dalekiej czerwieni i bliskiej podczerwieni (NIR) (MMIR1). Nanocząstka kationowa jest impregnowana dwoma barwnikami reporterowymi, referencyjnym O 2-niewrażliwym aza-BODIPY (wzbudzenie 650 nm, emisja 675 nm) i NIR O₂ czuła metaloporfiryna, PtTPTBPF (wzbudzenie 620 nm, emisja 760 nm). MMIR1 umożliwia analizę gradientów tlenu w czasie rzeczywistym na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym (przy użyciu analizy ratiometrycznej) lub mikroskopie czasu życia fosforescencji (PLIM) bez wprowadzania toksyczności komórkowej i pozwalając na stabilne sygnały, długoterminowe monitorowanie i multipleksowanie^25,29. W zależności od potrzeby barwienia barwnikami lub nanoczujnikami, przepustowości sferoidy lub typu ogniwa, można wybrać najbardziej odpowiedni protokół tworzenia. Ponieważ badania żywotności i natlenienia sferoid są istotne dla badań nad rakiem i sferoidami pochodzącymi z komórek macierzystych, przedstawione protokoły zawierają również przykłady i oczekiwane typowe wyniki NAD(P)H-FLIM i FAD-FLIM z tymi modelami. Prezentowane potoki obrazowania i analizy są ukierunkowane na najpopularniejsze platformy mikroskopii FLIM oparte na zliczaniu pojedynczych fotonów skorelowane w czasie.

Protocol

1. Generowanie sferoid wielokomórkowych

1. Hodowla komórkowa
   UWAGA: Kultury komórkowe można zbierać z American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich lub innych dostawców. ATCC zapewnia wszystkie wymagane informacje dotyczące obsługi, w tym preferowane podłoża wzrostowe, procedury hodowli, poziom bezpieczeństwa biologicznego, szybkość wzrostu i profile STR. W tym przypadku 500 komórek/sferoidę ludzkiej linii komórkowej raka jelita grubego HCT116 jest używane w pożywce McCoy's 5A (VWR, 392-0420) uzupełnionej 10% FBS i 1 mM pirogronianu sodu. W przypadku długoterminowych eksperymentów, które są monitorowane codziennie, do pożywki można dodać 10 mM HEPES, pH 7,2.
   1. Hoduj hodowlę komórkową, aby osiągnąć zbieżność 70%-90%.
   2. Przepłukać komórki wstępnie podgrzanym (37 °C) sterylnym PBS (5 ml na 25 cm² lub 10 ml na 75 cm² kolbę).
   3. Dodać 0,05% trypsyny - 1 mM roztworu EDTA (0,5 ml na 25 cm² lub 1 ml na kolbę 75 cm2) i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w wilgotności 5% CO₂, 95%, aby osiągnąć odwarstwienie komórek.
      UWAGA: Kontroluj odłączenie komórki pod mikroskopem światła transmisyjnego (jasne pole). Nadmierna ekspozycja komórek na dysocjujący roztwór enzymu może wpływać na ich żywotność.
   4. Zneutralizować trypsynę, dodając nadmiar pożywki do hodowli komórkowych zawierającej 10% FBS (co najmniej 5 ml pożywki na 1 ml roztworu dysocjacyjnego).
      UWAGA: W przypadku komórek hodowanych na pożywkach hodowlanych o niskiej zawartości FBS lub wolnych od FBS, neutralizację trypsyny można przeprowadzić przez dodanie 0,5 ml 100% FBS do hodowli komórkowej traktowanej trypsyną, a następnie odwirowanie w celu przeniesienia komórek do ich oryginalnej pożywki hodowlanej.
   5. Dysocjacja agregatów komórkowych przez pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki w pożywce.
      UWAGA: Pipetowanie pipetą serologiczną z końcówką do pipety o pojemności 1000 μl na górze znacznie poprawia wytwarzanie zawiesiny jednokomórkowej w dużej objętości hodowli komórek zawiesinowych.
   6. Użyj komory zliczającej (hemocytometr liniałowany Neubauera lub alternatywnie), aby policzyć liczbę komórek na 1 ml zawiesiny komórek.
   7. Rozcieńczyć zawiesinę komórek, aby uzyskać pożądaną liczbę komórek na mililitr.
   8. Dodać stężony roztwór sondy_O2 (nanocząstki) do zawiesiny komórek o końcowym stężeniu 10 μg/ml do analizy ratiometrycznej_O2,
      UWAGA: Aby zapewnić jednorodne zawieszenie komórek (za pomocą sondy), należy ponownie zawiesić wiele razy przed utworzeniem sferoidy. Jeśli sonda_O2 nie jest wymagana, pomiń ten krok i przystąp do formowania sferoid. Podczas obsługi iPSC należy zastosować zmodyfikowany protokół. Krótko mówiąc, iPSC są hodowane w koloniach na płytkach pokrytych Geltrex i pasażowane za pomocą ReLeSR, zgodnie z opisem w protokole dostarczonym przez dostawcę⁴⁸. W dniu powstania sferoid kolonie powinny być duże, zwarte i wykazywać wielowarstwowe centra z wyraźnymi granicami. Wypłucz komórki wstępnie podgrzanym sterylnym PBS. Dodać 1 ml delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (GCDR) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8-10 minut. Użyj końcówki o pojemności 1000 μl, aby delikatnie odłączyć komórki od studzienki i uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieś zawiesinę jednokomórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM-F12 w celu zneutralizowania GCDR. Przemyj studzienkę 1 ml DMEM-F12 i przenieś ją do reszty zawiesiny komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Zawiesić w 1 ml odpowiedniej pożywki do dalszych eksperymentów. Do eksperymentów opisanych w tym manuskrypcie zastosowano mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor. Policz i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby uzyskać pożądaną liczbę komórek na mililitr.
2. Metody tworzenia sferoidów
   1. Mikroformy 3D do szalek Petriego
      UWAGA: Ta metoda o wysokiej przepustowości służy do jednoczesnego generowania dużej liczby sferoid (81 sferoidów) w układzie mikroform 9 x 9 o średnicy 800 μm i głębokości 800 μm.
      1. Wypłucz mikroformy do odlewania szalek Petriego 3D w dH₂O i umieść w pojemniku nadającym się do sterylizacji w autoklawie.
      2. Odmierz 2 g proszku agarozowego klasy do elektroforezy i umieść go w suchej szklanej butelce o pojemności 200 ml, nadającej się do autoklawu.
         UWAGA: Upewnij się, że butelka i proszek agarozy są suche, bez płynu lub wilgoci.
      3. Autoklaw mikroformy do odlewania szalek i butelek 3D Petriego z proszkiem agarozowym przez 30 min w suchym cyklu.
      4. Przygotować roztwór soli fizjologicznej o stężeniu 0,9 w/v%, dodając 0,9 g NaCl do 100 ml ultraczystej wody i sterylizować w autoklawie.
         UWAGA: NaCl jest zalecany przez producenta. Zwiększa stabilność agarozy.
      5. Przygotuj roztwór agarozy, dodając sterylną sól fizjologiczną do wysterylizowanego proszku agarozy. Przykręć pokrywę luźno dopasowaną, aby uniknąć wzrostu ciśnienia. Zakręć butelką, aby wymieszać proszek agarozy.
      6. Zagotuj i rozpuść agarozę w proszku za pomocą kuchenki mikrofalowej. Często zatrzymuj kuchenkę mikrofalową (~ co 10 s). Obracaj butelką i powtarzaj, aż agaroza się rozpuści.
         UWAGA: Roztwór agarozy jest gorący i wymaga ostrożnego obchodzenia się. Potrząsanie bezpośrednio po procedurze topienia może spowodować wylanie się roztworu z naczynia. Aby uniknąć wypadków, należy używać wystarczająco dużych naczyń wypełnionych nie więcej niż 50% pojemności i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, rękawica kuchenna, ochrona oczu i fartuch laboratoryjny).
      7. Pozostawić rozpuszczony roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury 60-70 °C. Stosując techniki i warunki aseptyki, pipetować stopioną agarozę do mikroformy (500 μl dla serii 12 lub 330 μl dla serii 24).
         UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania lub pipetowania agarozy. Usuń wszelkie uwięzione małe pęcherzyki w małych elementach mikroformy poprzez pipetowanie lub delikatne skrobanie, zanim agaroza zastygnie.
      8. Pozwól agarozie zestalić się przez około 2-3 minuty. Następnie ostrożnie zegnij mikroformę, aby usunąć szalkę Petriego 3D i przenieść na 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
         UWAGA: Nadmierne wygięcie mikropleśni może prowadzić do powstawania pęknięć w pleśni agarozowej.
      9. Aby zrównoważyć szalkę Petriego 3D, dodaj 2,5 ml/studzienkę do hodowli komórkowych. Inkubować przez 15 minut lub dłużej. Usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją świeżą pożywką. Powtórz jeszcze raz, aby zrównoważyć szalkę Petriego 3D z pożywką hodowlaną.
         UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać przerwany do czasu wysiewu komórek. Do długotrwałego przechowywania (do 2 tygodni w temperaturze 4 °C) należy użyć roztworu PBS zamiast podłoża.
      10. Całkowicie usunąć szalkę Petriego 3D otaczającą pożywkę hodowlaną (lub PBS) i dokładnie usunąć pożywkę z wnętrza płytki Petriego 3D, przechylając płytkę do hodowli tkankowej.
      11. Ostrożnie wysiać 190 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 40 500 komórek kroplami do komory wysiewu komórek (patrz krok 1.1).
          UWAGA: Liczba mikrostudzienek w stemplach agarozowych określa liczbę sferoid wytwarzanych na stempel. W tym przypadku ta forma agarozy zawiera 81 mikrostudzienek (81 x 500 komórek / sferoida). Zmiana stężenia komórek w zawiesinie dodanej do makrostudzienki pozwala na zmianę liczby komórek na sferoidę, kontrolując w ten sposób rozmiar sferoidy.
      12. Odczekaj ~10 minut, aby komórki zadomowiły się w cechach 3D Petriego dsh. Następnie dodaj 2 ml pożywki na zewnątrz szalki Petriego 3D.
      13. Umieść płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze do hodowli komórkowych i w razie potrzeby wymień pożywkę otaczającą szalkę Petriego 3D.
   2. Niska płyta mocująca
      UWAGA: Ta metoda służy do generowania pojedynczej sferoidy na studzienkę. Płytki powlekane (Lipidure lub Biofloat) są dostępne w handlu (pomiń kroki 1.2.2.1-1.2.2.4). Alternatywnie, powłokę można zakupić osobno i użyć do powlekania nieobrobionych płytek wielodołkowych. Zaleca się napełnianie studzienek na krawędziach płytek 96-dołkowych sterylną wodą lub PBS ze względu na szybsze parowanie w tych studzienkach, ograniczając w ten sposób liczbę studzienek dla sferoid do 60. W przypadku, gdy potrzeba mniej sferoid, napełnij otaczające puste studnie wodą lub PBS. Używaj bezpyłowych końcówek do obsługi cieczy, aby uniknąć wprowadzania małych cząstek do studzienek, ponieważ zakłócają one tworzenie się sferoidów.
      1. Przygotować roztwór powlekający o stężeniu 0,5 w/v%, rozpuszczając 0,25 g proszku polimerowego w 50 ml etanolu w szklanym pojemniku na butelkę. Filtruj i sterylizuj powłokę.
         UWAGA: Sterylizacja filtra i wszystkie kolejne kroki muszą być przeprowadzone w sterylnych warunkach przy przepływie laminarnym.
      2. Dodać 200 μl roztworu powlekającego do każdego dołka na płytce hodowlanej z dnem 96 U.
      3. Inkubować przez 1 minutę i zdjąć nadmiar powłoki.
         UWAGA: Roztwór do powlekania może być używany wielokrotnie. Przechowywać w szklanym pojemniku w temperaturze pokojowej (RT). Nie zaleca się używania plastikowych pojemników, ponieważ plastik może częściowo się rozpuścić i stać się częścią roztworu. Jeśli obecny jest kurz, filtr wysterylizuj za pomocą filtrów strzykawkowych z polieterosulfonu (PES) lub nylonowych filtrów strzykawkowych o wielkości 0,22 μm.
      4. Pozostaw 96-dołkową płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 1 godz.
         UWAGA: Jeśli komórki potrzebują macierzy zewnątrzkomórkowej, przejdź do kroku 1.2.3. Powlekane płyty mogą być przechowywane w RT po owinięciu w aluminium przez okres do 1 miesiąca. W przypadku wysiewu mniejszej ilości komórek/dołka, odwirowanie płytki przez 5 minut przy 300 g może pomóc w ściągnięciu komórek.
   3. Protokół wspomagania tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej
      UWAGA: Niektóre linie komórkowe same nie wytwarzają wystarczającej ilości macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i wymagają dodania ECM, takich jak Matrigel, Cultrex lub Geltrex, w celu utworzenia zwartych sferoidów^49,50,51. Dla takich typów komórek, jak rak piersi MDA-MB-231, ludzka brodawka skórna, komórki raka prostaty i inne, możliwe jest użycie kroku 1.2.2 z następującymi modyfikacjami⁵², wymagającym dodania ECM. Najlepiej używać bezpyłowych końcówek do pracy z cieczami, aby uniknąć zakłóceń pyłu w tworzeniu się sferoidów. Kroki 1 i 4-7 muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa II).
      1. Wykonaj kroki 1.2.2.1-1.2.2.4 (niskie płytki mocujące) w celu obróbki powierzchni.
      2. Płytkę 96-dołkową schłodzić w temperaturze 4 °C w lodówce.
      3. Przygotować wirówkę z odpowiednim adapterem do płytki 96-dołkowej i schłodzić ją do temperatury 4 °C.
      4. Przygotować 5% roztwór matrycy błony podstawnej (BMM) we wstępnie schłodzonej (4 °C) pożywce do hodowli komórkowych.
         UWAGA: BMM szybko sieciuje w RT. Podczas obchodzenia się z roztworem należy przechowywać zapasy i roztwory na lodzie.
      5. Przygotować zawiesinę komórek (patrz krok 1.1).
      6. Dodać 50 μl roztworu BMM do każdej studzienki.
      7. Delikatnie dodaj 50 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki na wierzchu roztworu BMM (25 000 komórek/studzienkę).
         UWAGA: Nie wdmuchuj tej objętości do studzienki, w przeciwnym razie komórki rozprzestrzenią się po bokach studzienek i nie zgromadzą się na dnie. Mniejszą liczbę komórek w studzience można uzyskać, odpowiednio dostosowując gęstość komórek. Nie wszystkie komórki będą tworzyć sferoidy przy wszystkich gęstościach wysiewu; Optymalizacja musi być wykonana według typu komórki i pożądanego wymiaru. Przy podanych objętościach końcowe stężenie BMM wynosi 2,5%. Jeżeli potrzebne jest inne stężenie, roztwór podstawowy należy przygotować w niższym/wyższym stężeniu.
      8. Odwirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Bez tego kroku komórki nie agregują się prawidłowo na dnie studni, powodując tworzenie się wielu mniejszych agregatów. Wirówka musi zostać schłodzona, aby uniknąć sieciowania na tym etapie.
      9. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Agregaty uważa się za dojrzałe w 4 dniu po wysianiu.
         UWAGA: Aby uzyskać dodatkowe protokoły dotyczące tworzenia sferoidów, patrz Plik uzupełniający 1.

2. Mikroskopia sferoidów na żywo

1. Przygotowanie sferoid do analizy obrazowania na żywo
   UWAGA: W zależności od projektu eksperymentu (np. długotrwałe monitorowanie lub analiza punktu końcowego, ustawienie mikroskopu lub właściwości spektralne mierzonej fluorescencji) lub ze względu na niezgodność metody wytwarzania sferoidów z mikroskopią (np. grubość próbki, autofluorescencja materiału, pływanie sferoid podczas obrazowania) bezpośrednie monitorowanie sferoid w płytce, w której zostały wyprodukowane, może nie być możliwe. Protokół wyjaśnia przygotowanie sferoid do obrazowania, które są odpowiednie dla większości odwróconych mikroskopów szerokokątnych i konfokalnych.
   1. Przygotowanie i wstępne podgrzanie (37 °C) pożywki do obrazowania: DMEM uzupełniony o HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pirogronian sodu (1 mM), L-glutaminę (2 mM) i glukozę (5 mM), bez czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Wodorowęglan sodu sam lub w połączeniu z HEPES-Na może być stosowany, jeśli kontrola CO₂ jest zapewniona podczas obrazowania²⁴. Niektóre typy hodowli komórkowych nie tolerują obecności HEPES. W zależności od projektu eksperymentalnego można modyfikować pirogronian, glutaminę i zawartość glukozy.
   2. Przygotuj sterylne naczynia mikroskopowe (dostępne w handlu lub wyprodukowane w laboratorium) z powlekanymi (dla silnej adhezji sferoidalnej) lub niepowlekanymi (niska adhezja sferoidalna) powierzchniami ze szkła nakrywkowego (grubość #1,5).
      UWAGA: Potrzeba i rodzaj powłoki zależą od typu komórki, właściwości adhezyjnych sferoid oraz szybkości ich migracji komórek z interfejsu hodowli 3D do 2D. Jest to ważne do rozważenia, ponieważ powłoka może ułatwić utratę organizacji 3D, zmieniając kształt mikrogradientów w sferoidach, a co za tym idzie, zachowanie komórek. W przypadku niektórych eksperymentów (np. Obrazowanie analizowało odpowiedź na stymulację lekiem) wymagane jest silne przyleganie sferoidu do powierzchni i preferowane jest pokrycie żelatyną, BMM, kolagenem, kolagenem / poli-D-lizyną lub poli-D-lizyną.
   3. Delikatnie wypłukać sferoidy barwione sondą_O2 z mikrodołków agarozy z mikrowzorami lub płytki 96-dołkowej i przenieść nadal pływające sferoidy do fiolki o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Aby zapewnić zebranie wszystkich sferoid metodą wysokoprzepustową, należy przepłukać pleśń 1-3 razy dodatkową objętością pożywki hodowlanej, łącząc wszystkie zawiesiny sferoidalne w jednej fiolce. W przypadku sferoid na niskiej płytce mocującej, sferoidy należy zbierać pojedynczo z pojedynczych studzienek do fiolki lub bezpośrednio do naczynia mikroskopowego, jeśli niewielka liczba sferoid jest wystarczająca do eksperymentu. Podczas przenoszenia dużych sferoid należy odciąć koniec końcówki pipety, aby upewnić się, że nie zostaną uszkodzone podczas pipetowania.
   4. Pozostawić fiolkę w pozycji pionowej na maksymalnie 5 minut, aby sferoidy osiadły na dnie fiolki, tworząc widoczną osadówkę.
   5. Wyjąć pożywkę z probówki, pozostawiając sferoidy w spokoju, i delikatnie zawiesić je ponownie w wystarczającej ilości świeżej kultury.
      UWAGA: Dla wygody obchodzenia się ze sferoidami, transfer sferoid na nośniki obrazowe może być również wykonywany na tym etapie w małych partiach; Patrz kroki 2.1.7 i 2.1.8. Sferoidy z różnych grup eksperymentalnych powinny być traktowane jednakowo, ponieważ skład pożywki i czas wstępnego kondycjonowania pożywki mogą wpływać na ich metabolizm.
   6. Gdy sferoidy unoszą się na wodzie, przenieś równą objętość zawiesiny sferoidalnej na studzienkę naczynia mikroskopowego.
   7. Inkubować sferoidy przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 ,} aby zapewnić ich przyczepienie do powierzchni naczynia mikroskopowego/studzienki. W przypadku obrazowania przejdź do kroku 2.1.9. W celu barwienia sferoid za pomocą dodatkowych sond należy postępować zgodnie z krokiem 2.1.8.
      UWAGA: Szybkość migracji komórek z sferoidy 3D do powierzchni 2D jest funkcją czasu. Aby uniknąć utraty organizacji 3D, czas inkubacji musi być zoptymalizowany w odniesieniu do typu komórki, rodzaju powłoki powierzchniowej i projektu eksperymentu. Na przykład HCT116, w zależności od wielkości sferoidy, potrzebuje co najmniej 2 godzin na prawidłowe przyłączenie sferoidy do powierzchni pokrytej kolagenem IV/poli-D-lizyną, podczas gdy przyłączenie hDPSC i migracja do interfejsu 2D jest niezwykle szybka, co prowadzi do utraty organizacji 3D w ciągu 1-2 godzin. Aby uniknąć obrazowania "sferoid 2D" z powodu nadmiernego rozprzestrzeniania się, stosuje się niepowlekane powierzchnie szklane o skróconym czasie inkubacji.
   8. Dodać sondę (sondy) fluorescencyjną w zalecanych lub empirycznie zoptymalizowanych stężeniach do znanej objętości zawiesiny sferoidalnej. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C przed obrazowaniem.
      UWAGA: Do oznaczania żywych/martwych należy użyć jodku propidyny i Calcein Green-AM w standardowym stężeniu końcowym 1 μg/ml. Aby uniknąć toksycznego wpływu barwienia jodkiem propidyny na ciała zarodkowe iPSC, końcowe stężenie jodku propidyny wynosiło 0,5 μg/ml. Czas ładowania sondy może się wydłużyć, jeśli dyfuzja sondy nie jest wydajna ze względu na duży rozmiar sferoidy. Czas ładowania powinien być zawsze traktowany jako część całkowitego czasu inkubacji potrzebnego do przyłączenia sferoidy do powierzchni. Jeśli do przyczepienia sferoidy potrzebny jest dłuższy czas, procedurę barwienia należy umówić się na koniec tego okresu. Należy pamiętać, że dłuższy czas inkubacji może prowadzić do utraty organizacji 3D.
   9. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych lub pożywkę zawierającą sondy fluorescencyjne i wymienić ją na niezbędną objętość pożywki do obrazowania. Aby upewnić się, że na drodze obrazowania sferoidalnego nie znajduje się tło fluorescencji podłoża, powtórz etap wymiany pożywki (płukania) do 5 razy.
      UWAGA: Aby uniknąć usunięcia sferoidów podczas wymiany pożywki, zaleca się ostrożne odsysanie pożywki pipetą o pojemności 200 μl od krawędzi naczyń mikroskopowych i dodawanie pożywki przy ściance lub z boku w naczyniu mikroskopowym.
   10. Natychmiast przejdź do kroku 2.2.1 protokołu obrazowania.
       UWAGA: Zbyt długa przerwa między przygotowaniem do obrazowania a faktycznym akwizycją obrazowania może wpłynąć na metabolizm komórek (np. poprzez zmieniony skład pożywki), żywotność (niektóre sondy fluorescencyjne używane do analizy punktów końcowych mają działanie toksyczne, które może stymulować śmierć komórki po długim okresie inkubacji), a także prowadzić do utraty organizacji 3D. Jeżeli konieczne jest porównanie wielu grup sferoid lub warunków eksperymentalnych, projekt eksperymentu musi zostać odpowiednio opracowany, aby czas leczenia, kondycjonowania wstępnego i procedur obrazowania był jak najbardziej równy między analizowanymi grupami.
2. Akwizycja obrazu
   UWAGA: Protokół opisuje wieloparametryczne obrazowanie sferoid na żywo przy użyciu mikroskopu konfokalnego Stellaris 8 Falcon (Leica) i oprogramowania Leica Application Suite X (LAS X) w wersji 4.7. Jednak do przeprowadzenia takiej analizy na alternatywnych platformach mikroskopowych wymagane będą tylko niewielkie modyfikacje.
   1. Włącz klimatyzator temperatury 30-60 minut przed obrazowaniem. Ustaw żądaną prędkość wentylacji i temperaturę (35-37 °C).
      UWAGA: Jeśli oprócz kontroli temperatury podczas obrazowania konieczne jest kontrolowanie stężenia gazów (np. CO₂ lub O₂ ), odpowiednie urządzenia należy również uruchomić z wyprzedzeniem, aby osiągnąć niezbędne warunki przed obrazowaniem.
   2. Włącz mikroskop i podłączone do niego urządzenia (tj. laser DOR DOR, komputer, pompę wodną do obiektywu do zanurzenia w wodzie i inne działające bloki elektroniczne). Uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem (np. LAS X Machine Mode lub Machine Mode with Environmental Control) dostarczone z dokładną konfiguracją mikroskopu i zainicjuj kalibrację stolika.
   3. Wybierz żądany obiektyw w oprogramowaniu i w razie potrzeby nałóż płyn zanurzeniowy.
      UWAGA: W przypadku mikroskopii na żywo zaleca się stosowanie obiektywów zanurzeniowych w wodzie lub glicerolu o wystarczającej ("długiej") odległości roboczej, np. HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (odległość robocza 2,4 mm), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (odległość robocza 0,35 mm) lub co najmniej NA = 0,4 lub więcej dla obiektywów powietrznych. Wybór powiększenia i odległości roboczej zależy od charakteru i wielkości obrazowanej próbki oraz mierzonych sygnałów fluorescencyjnych (jasność, wydajność kwantowa, wydajność barwienia, patrz np. dyskusja na temat barwników i nanocząstek⁵³). Duże obiekty (sferoidy lub organoidy o wielkości >500 μm), "bioreaktory" lub chipy mikroprzepływowe wymagają obiektywów o dużej odległości roboczej i mniejszego powiększenia, podczas gdy analiza pojedynczych komórek lub organelli komórkowych wymaga dużego powiększenia, często osiąganego za pomocą obrazowania "mozaikowego".
   4. Ustaw naczynie mikroskopowe ze sferoidami na scenie. Dostosuj ostrość i znajdź obiekt/obszar zainteresowania (ROI).
      UWAGA: Jeśli trzeba znaleźć małe, słabo fluorescencyjne, o słabym kontraście lub rzadkie obiekty, a znalezienie ostrości jest trudne, zaleca się wstępne ustawienie ostrości na ściankach naczynia mikroskopowego i "przesiewanie" powierzchni pod kątem interesującego obiektu za pomocą serpentyny, zaczynając od jednego z rogów studni.
   5. Wybierz okno Otwórz projekt i kliknij odpowiednią ikonę, Utwórz nowy projekt. Nadaj standardową nazwę (np. zaczynającą się od "opis RRR-MM-DD+") do pliku projektu badawczego. Podczas obrazowania wszystkie wytworzone obrazy zostaną automatycznie zapisane w utworzonym pliku .lif projektu.
   6. Otwórz okno Akwizycja. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera światła białego (WLL) i wymagany zakres hybrydowych lub rezonansowych detektorów skaningowych (typ HyD S, HyD X lub HyD R) w oparciu o znane właściwości spektralne mierzonej fluorescencji (widma wzbudzenia/absorbancji i emisji). Wybierz typ skanowania Liniowy lub Kadrowy.
      UWAGA: W przypadku większości dostępnych na rynku barwników fluorescencyjnych właściwości spektralne można znaleźć (lub dodać) w pakiecie LAS X Dye Assistant. Należy dobrać detektor o odpowiednim zakresie czułości widma zgodnym z właściwościami spektralnymi sondy oraz w przypadku FLIM zgodnym ze zliczaniem fotonów (tj. HyD X lub HyD R). W przypadku obrazowania wieloparametrycznego należy ustawić WLL w wielu pozycjach wzbudzenia (np. dla jednoczesnego obrazowania FAD/Flawin i dwóch kanałów fluorescencyjnych ratiometrycznej sondy MMIR1 O₂ - referencyjnej i czułej, ustawienia wzbudzenia/emisji mogą wynosić odpowiednio 460 nm/510-590 nm HyD X1 i 614 nm/631-690 HyD X3 i 724-800 nm HyD R odpowiednio w jednej lub dwóch sekwencyjnych sekwencjach skanowania). Ważne jest, aby przypisać odpowiedni detektor do zbierania emisji, ponieważ detektory mogą mieć różną czułość spektralną⁵⁴.
   7. (Opcjonalnie dla FLIM) W oknie Acquisition (Akwizycja) wybierz tryb FLIM, aby wykonać obrazowanie połączone ze zliczaniem fotonów (zbieraniem rozpadów). Natychmiast zostanie otwarty dodatkowy "moduł FLIM w oprogramowaniu LAS X" do nawigacji i analizy danych FLIM.
   8. (Opcjonalnie dla FLIM) Wybierz częstotliwość powtarzania impulsów WLL w oparciu o oczekiwany średni czas życia fluoroforu.
      UWAGA: Częstotliwość impulsu laserowego musi być dostosowana, aby zebrać pełny zanik fluorescencji. Można to zrobić za pomocą funkcji Pulse Picker zainstalowanej w mikroskopie. Nakładanie się zaniku fluorescencji na impuls laserowy doprowadzi do skrócenia szacowanego czasu życia fluorescencji. Zaleca się, aby odstępy między impulsami były 4-5 razy dłuższe niż oczekiwany średni czas życia fluorescencji (np. 25 ns/40 MHz dla czasów życia do 5 ns). Wiele laserów impulsowych ma stałą częstotliwość powtarzania 80 MHz (idealna tylko dla zakresu do 2-3 ns). Jest to ważne przy wyborze odpowiednich fluoroforów do eksperymentu.
   9. Rozpocznij obrazowanie podglądu w trybie FAST LIVE i dostosuj precyzyjną ostrość obrazowanego obiektu na interesującym Cię fragmencie.
      UWAGA: Ściśle przestrzegaj zasad bezpieczeństwa lasera. Zawsze należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa lasera i poczekać, aż obrazowanie zostanie zatrzymane, zanim włączysz światło transmisyjne, spojrzysz w okular lub na próbkę.
      UWAGA: W trybie FAST LIVE skanowanie z dużą prędkością 600 Hz (odpowiada maksymalnej liczbie klatek na sekundę 4,43/s w przypadku korzystania z dwukierunkowego trybu skanowania X), rozdzielczość 256 x 256 pikseli jest automatycznie stosowana do obrazu, aby zapobiec fotowybielaniu fluorescencji. Otwórz otwór otworkowy (np. do 3-4 AU) i/lub zwiększ intensywność lasera, jeśli sygnał fluorescencji jest zbyt słaby, aby skupić się na obiekcie. Unikaj niekompletnego zbierania próchnicy.
   10. (Opcjonalnie dla FLIM) Patrząc na histogram intensywności piksela pojawiający się podczas obrazowania w oknie modułu FLIM (tryb Live), dostosuj odpowiednią intensywność lasera/rozmiar otworka i rozdzielczość, aby osiągnąć limit szybkości zliczania ~1 foton/impuls laserowy (czerwona linia). Unikaj zejścia znacznie powyżej 1, aby wykluczyć ryzyko efektu nawarstwiania się. W razie potrzeby dostosuj częstotliwość powtarzania impulsów DOR tak, aby uzyskać pełną kolekcję zaniku w oknie zaniku (aby uniknąć niepełnego zbierania zaników, patrz krok 2.2.8).
       UWAGA: Jeśli liczba fotonów (intensywność) nie jest wystarczająca do zrekonstruowania wiarygodnego rozpadu w celu dopasowania analizy lub chmury wykresu fazorowego, zastosuj kilka powtórzeń skanowania (klatki lub linie, lub ustaw czas skanowania), zwiększ intensywność lasera i/lub poświęć rozdzielczość (rozmiar zeskanowanego ROI). Należy pamiętać, że zmniejszenie częstotliwości powtarzania lasera wymaga zebrania większej liczby fotonów w celu wiarygodnej rekonstrukcji rozpadu i może być wymagana dodatkowa korekta parametrów obrazowania. Należy pamiętać o potencjalnym wpływie intensywnego światła i długiego, ciągłego oświetlenia na żywotność komórek i metabolizm⁵⁵. Negatywny wpływ na żywotność i metabolizm może być różny w każdym indywidualnym przypadku, w zależności od intensywności, czasu trwania i długości fali światła wzbudzenia, a także metody obrazowania (np. obrazowanie konfokalne jednofotonowe vs. wielofotonowe). Dostosuj odpowiednio parametry obrazowania i, jeśli to konieczne, kontroluj żywotność/śmierć komórek za pomocą Calcein Green-AM lub intensywności jodku propidyny w eksperymentach pilotażowych⁵⁶. Tam, gdzie to możliwe, należy rozważyć dalsze optymalizacje protokołu barwienia sondą fluorescencyjną w celu osiągnięcia odpowiedniego sygnału fluorescencji podczas mikroskopii na żywo.
   11. (Opcjonalnie dla stosu 3D Z) W trybie Fast Live ustaw współrzędne, kierunek skanowania i przypisz je do Początek i Koniec w oknie Z-stack (tryb skanowania XYZ). Wybierz rozmiar kroku Z lub liczbę kroków.
       UWAGA: Podczas gdy oprogramowanie automatycznie oblicza "optymalną" liczbę kroków na podstawie używanej rozdzielczości i parametrów skanowania, rekonstrukcja 3D na żywo może zwykle wymagać mniejszej liczby kroków, aby uzyskać szybką akwizycję, np. rozmiar kroku 1-2 μm, rozmiar stosu 50-100 μm, skanowanie dwukierunkowe, wymagające 2-3 minut całkowitego czasu skanowania. Należy pamiętać, że organelle subkomórkowe, komórki i model komórki 3D mogą również poruszać się podczas pomiarów. Ponadto, ze względu na głębokość penetracji światła i limity rozpraszania, zwykle można osiągnąć tylko 50-100 μm głębokości skanowania na konfokalnym FLIM.
   12. Po zastosowaniu wszystkich niezbędnych ustawień rozpocznij obrazowanie.
   13. Nadaj obrazowi odpowiednią nazwę.
   14. Wyszukaj następny obiekt obrazowania w trybie światła transmisyjnego i powtórz procedurę obrazowania z poprzednio zoptymalizowanymi ustawieniami obrazowania (kroki 2.2.8-2.2.12).
       UWAGA: W przypadku porównania opartego na intensywności lub analizy współczynnika intensywności (np. analiza natlenienia oparta na sondzie MMIR O₂) zawsze zachowuj te same ustawienia obrazowania dla wszystkich analizowanych obiektów (powiększenie i typ soczewki obiektywu, intensywność lasera, moc i częstotliwość impulsów, długość fali wzbudzenia, zasięg detektorów, otwór, prędkość skanowania, czas przebywania pikseli i rozdzielczość). Ponieważ jednak czas życia fluorescencji nie zależy od intensywności fluorescencji i wymaga zebrania odpowiedniej liczby fotonów w celu wiarygodnych obliczeń, parametry obrazowania FLIM mogą być dostosowywane w trakcie eksperymentu, aby utrzymać porównywalność zebranych fotonów między różnymi zabiegami lub warunkami eksperymentalnymi. Dlatego w przypadku analizy wieloparametrycznej, w której potrzebna jest zarówno analiza oparta na intensywności, jak i na czasie życia fluorescencji, należy zastosować zoptymalizowane uniwersalne ustawienia obrazowania dla wszystkich obiektów w porównywanych grupach eksperymentalnych. W przypadku porównania "tylko FLIM" możliwe jest porównanie obrazów uzyskanych przy nieco innych ustawieniach obrazowania, ponieważ oprogramowanie LAS X zapewnia obliczenie IRF dla indywidualnego pomiaru obrazu⁴². Jednak w przypadku analizy dopasowania FLIM poza LAS X (np. FLIMfit⁴⁵) funkcja odpowiedzi instrumentu (IRF) powinna być mierzona dla każdego innego warunku obrazowania, ponieważ nie można jej wyeksportować z oprogramowania do obrazowania. W związku z tym, aby uprościć projekt eksperymentu i obciążenie, zaleca się zastosowanie tych samych ustawień obrazowania dla wszystkich obrazów w zestawie danych. Następnie, odpowiednie pomiary IRF mogą być wykonane przy użyciu fluoroforów o czasie życia wygaszanym lub o szybkiej fluorescencji (w zakresie ps) o właściwościach emisyjnych mierzonego kanału widmowego^57,58,59, za pomocą luminescencji nanocząstek złota luminescencja⁶⁰ lub za pomocą sygnału generacji drugiej harmonicznej dla wielofotonowego FLIM⁶¹. W oprogramowaniu LAS X wcześniej zoptymalizowane parametry obrazowania można załadować do nowego projektu, klikając prawym przyciskiem myszy na interesujący nas plik i wybierając opcję Zastosuj ustawienia obrazu.
   15. Po zakończeniu sesji obrazowania zapisz projekt obrazowania. Aby sfinalizować sesję obrazowania, należy usunąć próbkę ze stolika mikroskopowego i oczyścić obiektyw z płynu zanurzeniowego (jeśli jest używany) zgodnie ze standardową procedurą wdrożoną w placówce obrazowania. Zamknij projekt i oprogramowanie. Wyłącz mikroskop, lasery i wszystkie podłączone urządzenia.
   16. Kontynuuj analizę danych obrazowych (krok 2.3).
3. Przetwarzanie obrazu wskazowego NAD(P)H/FAD-FLIM za pomocą modułu LAS X FLIM i FIJI
   UWAGA: Protokół opisuje analizę czasu życia fluorescencji obrazowanych sferoid dla danych w dziedzinie częstotliwości na przykładach autofluorescencji NAD(P)H i FAD/Flavins FLIM. Pomiar autofluorescencji NAD(P)H stał się złotym standardem w analizie metabolicznej, w której krótkie i dłuższe składniki czasu życia autofluorescencji NAD(P)H są związane odpowiednio z glikolizą lub fosforylacją oksydacyjną (OxPhos). Można to przeanalizować za pomocą przesunięcia na wykresie fazora wzdłuż trajektorii metabolicznej w kierunku zmierzonych standardów free-NAD(P)H lub NAD(P)H^31,62. Aby przeanalizować trajektorię przesunięcia metabolicznego, a także porównać położenie chmur fazorowych (patrz UWAGA poniżej kroku 2.3.6) na wykresie między grupami eksperymentalnymi, zaimplementowano uproszczoną analizę współrzędnych fazora, opartą na obliczeniu środka geometrycznego (środka ciężkości) chmury fazora²⁹. Opisany protokół przedstawia obliczanie współrzędnych środka ciężkości w FIJI i mierzenie odległości między dwoma punktami na wykresie fazorowym za pomocą współrzędnych (np. odległość od środka ciężkości sferoidalnej chmury fasorowej autofluorescencji NAD(P)H do teoretycznego punktu "wolnego NAD(P)H"). Podobnie można analizować FAD i inne sygnały autofluorescencyjne. Dostępny jest zestaw danych 1 z formatami plików .lif (wymagane oprogramowanie LAS X) lub .ptu do nauki tej procedury (plik uzupełniający 2, plik uzupełniający 3, plik uzupełniający 4, plik uzupełniający 5, plik uzupełniający 6, plik uzupełniający 7, plik uzupełniający 8, plik uzupełniający 9 i plik uzupełniający 10).
   1. Otwórz moduł FLIM w LAS X, wybierz Otwórz projekt i załaduj plik obrazu sferoidalnego (.lif) do autofluorescencji NAD(P)H/FAD analysis.
      UWAGA: Ze względu na potencjalne błędy i pośrednią utratę danych w module FLIM, należy użyć kopii oryginalnego pliku obrazu sferoidalnego (.lif) do analizy NAD(P)H/FAD, zachowując niezmieniony plik raw.
   2. Wybierz pojedynczy obraz i przejdź do interfejsu analizy FLIM. Kliknij przycisk Phasor, aby uzyskać dostęp do wykresu wskazowego i aktywować tryb analizy wskazówki. Zastosuj filtr (mediana lub falka) i ustaw Próg, aby zminimalizować szum i poprawić widoczność danych dla wszystkich analiz fazorowych. Wybierz harmoniczne. W celu analizy przesunięcia metabolicznego na podstawie danych NAD(P)H, należy postępować zgodnie z krokami 2.3.3-2.3.5. W celu ogólnego porównania wykresów fazorowych należy przejść od kroku 2.3.6.
      UWAGA: Zastosuj ustawienia analizy (typ filtra, harmoniczne, próg, binning i zwroty z fazora) równomiernie do wszystkich obrazów w porównywanym zestawie danych.
   3. (Opcjonalnie dla analizy NAD(P)H) Wybierz dowolny obraz związany z zestawem danych i użyj opcji Kursor proporcji rysowania dla dwóch składników, aby dokładnie zlokalizować pozycję 0,45 ns na uniwersalnym okręgu standardowej przestrzeni wykresu wskazowego. Ta pozycja zostanie przypisana do średniego czasu trwania fluorescencji czystego jednorodnego roztworu free-NAD(P)H, który zwykle jest bliski rozpadowi monowykładniczemu⁶².
      UWAGA: Free-NADH i free-NAD(P)H mają podobne właściwości spektralne i podobne wartości czasu życia fluorescencji w roztworze wodnym, z dwoma składnikami o krótkim czasie życia, 0,3 ns i 0,7 ns⁶³. Tak więc, ze względu na prostotę analizy opartej na fazorze i ze względu na niewielką różnicę między składnikami czasu życia, przyjmuje się, że ich zanik fluorescencji jest monowykładniczy, co pozwala na przypisanie chmury wskazówki do uniwersalnego koła. Średni czas życia wolnej formy NAD(P)H można również zmierzyć i wykreślić w przestrzeni wskazowej w celu przeprowadzenia podobnej analizy. Referencyjny czas życia został wybrany na podstawie literatury⁶²; zauważ, że w innych źródłach można znaleźć nieco inną wartość wolnego NAD(P)H w roztworze (0,4 ns⁶⁴).
   4. (Opcjonalnie dla analizy NAD(P)H) Eksportuj wykres wskazowy z przydzielonym okresem życia wolnego NAD(P)H (patrz krok 2.3.3), klikając wykres prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Eksportuj dane. Wyeksportuj wykres wskazowy jako plik w formacie .tiff do wyznaczonego folderu przechowywania.
      UWAGA: Oryginalny rozmiar w pikselach wyeksportowanego obrazu wykresu wskazowego z modułu LAS X FLIM wynosi zawsze 1024 x 600 pikseli. Jeśli do eksportu danych i wstępnej analizy używane jest inne oprogramowanie, należy upewnić się, że wszystkie obrazy wykresu fazorowego są eksportowane z tym samym rozmiarem i rozdzielczością.
   5. Aby wyeksportować chmurę fazorową związaną ze sferoidą, użyj narzędzia Rysuj kursor w module LAS X FLIM, aby wybrać sferoidalny zwrot z inwestycji na obrazie. Eksportuj wygenerowany wykres wskazowy zgodnie z opisem w kroku 2.3.4.
      UWAGA: Odpowiednie współrzędne g i s (podobne do x i y) przestrzeni fazorowej zostaną przypisane do każdego piksela wybranego ROI, zgodnie z ich okresami życia, przekształconymi w zestaw danych w dziedzinie częstotliwości^64,65. Klaster pikseli o podobnych wartościach t_f (czas życia fazy) i t_m (czas trwania modulacji) utworzy wzór chmury (chmura fazorowa) na wykresie, gdzie kodowanie kolorami (z zakresem od głębokiego niebieskiego do czerwonego) będzie odzwierciedlać obfitość wartości czasu życia. Na podstawie położenia chmury na okręgu uniwersalnym lub wewnątrz można wyróżnić rozpady mono- lub wielowykładnicze. Niektóre media pomiarowe wykazują silną (auto)fluorescencję, co prowadzi do pojawienia się odpowiedniej chmury na wykresie wskazowym, której nie można po prostu usunąć za pomocą progu intensywności. Ten wzorzec będzie miał wpływ na obliczanie współrzędnych środka ciężkości i musi zostać wykluczony z eksportowanego wykresu wskazowego. Praca ze sferoidalnym ROI pozwala na wykluczenie niepowiązanych pikseli z dalszej analizy fazorowej.
   6. Powtórz procedurę eksportu wykresu wskazowego dla wszystkich sferoidalnych ROI w zbiorze danych (patrz kroki 2.3.4 i 2.3.6). Dodatkowo sprawdź wyeksportowany zestaw .tiff obrazów, aby zagwarantować pełny zestaw danych do dalszej analizy porównawczej i upewnij się, że wszystkie eksportowane obrazy mają ten sam rozmiar piksela (patrz UWAGA w kroku 2.3.4).
      UWAGA: Na tym etapie protokołu zestaw obrazów musi zawierać fazor z lokalizacją wolnego NAD(P)H (na podstawie literatury lub danych empirycznie) oraz wszystkie sferoidalne wykresy fazorowe ROI (lub alternatywne wzorce ROI, jeśli są potrzebne do konkretnej analizy). Na tym etapie dalsza analiza zostanie przeprowadzona na FIDŻI, a następnie w arkuszu kalkulacyjnym. Korzystając z okna narzędzia Analizuj, ustaw opcję Skala w FIDŻI i upewnij się, że wszystkie obrazy wykresu fazorowego są skalibrowane z tym samym typem jednostki, np. tylko w pikselach. Jeśli nie, ustaw długość jednostki w oknie Ustaw skalę dla wybranej (np. dla skali opartej na pikselach umieść 1 w polu Odległość w pikselach i ustaw jednostkę długości na Piksel). W celu dalszego porównania zmierz wszystkie wyeksportowane dane przy użyciu tego samego typu jednostki.
   7. (Opcjonalnie dla analizy NAD(P)H) Określ pozycję punktu piksela średniego czasu trwania fluorescencji swobodnej NAD(P)H na odpowiednim wyeksportowanym obrazie wykresu wskazowego (patrz krok 2.3.3): Otwórz obraz wskazowy za pomocą FIJI, powiększ obraz, aby wyraźnie zwizualizować z rozdzielczością pikseli przecięcie między uniwersalnym półokręgiem a kursorem proporcji dla linii dwóch składników; użyj narzędzia Rectangle ROI, aby wybrać przecięcie.
      UWAGA: Upewnij się, że prostokątne zaznaczenie jest małym obszarem wokół punktu przecięcia, aby dokładnie określić jego współrzędne w następnym kroku (krok 2.3.9).
   8. (Opcjonalnie dla analizy NAD(P)H) Otwórz narzędzie Analizuj, wybierz okno Ustaw pomiary i wybierz Centroid jako parametr pomiaru. Kliknij Zmierz w oknie narzędzia Analizuj, aby określić współrzędne środka ciężkości punktu odniesienia free-NAD(P)H. Wyeksportuj te współrzędne do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Współrzędne Free-NAD(P)H zostaną użyte jako punkt odniesienia do porównania odległości od tego punktu do położenia sferoidalnej chmury fazorowej w zbiorze danych (sposób charakteryzowania przesunięcia metabolicznego między glikolizą a OxPhos w analizie autofluorescencji NAD(P)H FLIM)
   9. Korzystając z FIDŻI, otwórz obraz sferoidalnej chmury fazorowej. Otwórz narzędzie Okno obrazu, wybierz opcję Dopasuj, a następnie wybierz opcję Próg koloru na pasku narzędzi. Wybierz wybraną metodę progowania (np. Otsu) i ustaw wartość barwy i wartość jasności, aby zawęzić parametry wyboru części chmury fazorowej o najliczniejszych współrzędnych pikseli. Kliknij przycisk Wybierz, aby zdefiniować obszar klastra.
      UWAGA: Zachowaj te same parametry progowe dla wszystkich obrazów wykresu wskazowego, które muszą być analizowane. Dla prezentowanych danych NAD(P)H-FLIM wybrano metodę progowania Otsu z ustawioną wartością barwy 9 i wartością jasności 160 i zastosowano ją do wszystkich obrazów fazorowych. Alternatywnie wybrany obszar można skopiować do Menedżera ROI (podążaj ścieżką Edytuj > Zaznaczenie > Dodaj do Menedżera), aby utworzyć bibliotekę fazorowych ROI do dalszej analizy.
   10. Zachowując wybór, oblicz współrzędne środka ciężkości wybranego obszaru, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.3.9. Wyeksportuj te współrzędne do pliku arkusza kalkulacyjnego.
   11. Powtórz kroki 2.3.9 i 2.3.10, aby określić współrzędne środka ciężkości dla wszystkich obrazów wskazów ROI, aby utworzyć zestaw danych w arkuszu kalkulacyjnym.
       UWAGA: Korzystanie z biblioteki ROI Manager ROI pomaga uprościć i uporządkować analizę ROI (patrz krok 2.3.10)
   12. (Opcjonalnie dla analizy NAD(P)H) Otwórz arkusz kalkulacyjny z wyeksportowanymi współrzędnymi referencyjnymi free-NAD(P)H i sferoidalnymi ROI z różnych grup porównawczych. Oblicz odległość między każdym pojedynczym środkiem ciężkości fazora sferoidalnego w celu odniesienia się do pozycji swobodnej NAD(P)H, korzystając z wyznaczonych współrzędnych i następującego równania:
       
       Gdzie X_c i Y_c są współrzędnymi środka ciężkości, X_f i Y_f są współrzędnymi odniesienia.
       UWAGA: Zastosowanie parametru środka ciężkości do określenia przesunięcia w kierunku czasu życia odniesienia jest właściwe tylko w przypadku, gdy wszystkie centroidy ze zbioru danych leżą na tej samej trajektorii liniowej w kierunku punktu odniesienia. Aby to sprawdzić, wszystkie punkty środka ciężkości ze zbioru danych muszą zostać wykreślone razem z punktem odniesienia w tej samej przestrzeni współrzędnych i należy przeprowadzić wyrównanie trendu liniowego. Jeżeli współczynnik R² liniowej linii trendu przeprowadzonej przez wszystkie punkty jest bliski 1 (np. R² wynosi 0,8-0,99), przyjmuje się, że analiza odległości jest odpowiednia.
   13. Uporządkuj wszystkie dane odpowiednio do porównania i wykonuj analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Origin, MatLab). Wybierz odpowiedni test statystyczny zgodnie z charakterystyką zbioru danych (normalność rozkładu, liczba jednostek statystycznych itp.).
       UWAGA: W przypadku analizy NAD(P)H porównaj wartości odległości, aby scharakteryzować przesunięcie metaboliczne w zależności od warunków eksperymentalnych. W celu porównania dowolnych wykresów fazorowych między grupami eksperymentalnymi należy przeprowadzić porównanie współrzędnych centroidów chmur fazorowych ROI.

Results

Wybór odpowiedniej metody tworzenia sferoidów
Wybrana metoda tworzenia sferoidów może w znacznym stopniu wpływać na wielkość, kształt, gęstość komórek, żywotność i wrażliwość sferoidów na leki (Rysunek 2). Wcześniej porównano wpływ wielu metod o wysokiej przepustowości (SphericalPlate 5D, mikroformy wyprodukowane w laboratorium i formy MicroTissue) oraz metod o niskiej przepustowości (96-dołkowe płytki Biofloat i pokryte lipidure) na żywotność sferoid i natlenienie²⁹.

Tutaj różne metody tworzenia skutkują sferoidami o różnych rozmiarach, nawet przy tym samym początkowym stężeniu 500 komórek/sferoidę. Sferoidy HCT116 uformowane w 96-dołkowych płytkach o niskim przyleganiu były znacznie większe w porównaniu z metodami o wysokiej przepustowości po 5 dniach formowania (Rysunek 2 i Tabela 2). Co więcej, metody niskiego przylegania doprowadziły do ewidentnego rozwoju nekrotycznego rdzenia wykrytego przez barwienie jodkiem propidium (czerwony), podczas gdy sferoidy wygenerowane innymi metodami (MicroTissue, formy laboratoryjne i Sphericalplate 5D) wykazały rozproszony rozkład martwych komórek w całym ciele sferoidalnym (Rysunek 2ATa różnica w żywotności komórek w całej objętości sferoidy może również wpływać na dyfuzję tlenu przez pożywkę, na którą z kolei może mieć wpływ ciśnienie parcjalne_O2, szybkość zużycia, temperatura i rozpuszczalność_O2. Dodatkowo, w metodach wysokoprzepustowych, składniki odżywcze ulegają wyczerpaniu, a produkty przemiany materii gromadzą się szybciej, ponieważ większa liczba sferoid znajduje się w tej samej objętości i dlatego wymagają częstszej wymiany pożywek (Rysunek 2A).

Ogólne natlenienie sferoidów zostało zmierzone za pomocą niedawno scharakteryzowanej i zweryfikowanej sondy MMIR1²⁹, z wcześniej zgłoszonym szczegółowym protokołem²⁵. Natlenienie można było porównać tylko osobno między metodami wysokoprzepustowymi i nisko przylegającymi (Rysunek 2B), ponieważ stosunek sygnału do szumu jest różny we wszystkich porównywanych metodach tworzenia sferoidów. Sferoidy 5D z płytką sferyczną wykazały niższe ogólne natlenienie w porównaniu z mikrotkankami (wartość P = 0,0697) i mikroformami wyprodukowanymi w laboratorium (wartość P = 0,0005) (Rysunek 2C). Sferoidy wytwarzane za pomocą płytki sferycznej 5D są hodowane w większej odległości od powierzchni interfejsu powietrza mediów w porównaniu z metodami formy agarozowej, powodując wolniejsze dostarczanie O₂ w kulturze statycznej. Hipoteza ta jest słuszna, ponieważ wartości natlenienia między obiema płytkami o niskim mocowaniu i dodatkowo między obiema metodami pleśni agarozowej są statystycznie podobne (Rysunek 2D).

Rysunek 2: Metody tworzenia sferoid wpływają na morfologię, wielkość, żywotność i natlenienie. (A) Sferoidy HCT116 (początkowa gęstość wysiewu 500 komórek) były hodowane przez 5 dni przed 1-godzinnym barwieniem jodkiem propidium (nekroza komórek, czerwony, 1 μg/ml) i Calcein Green-AM (komórki żywotne, zielony, 1 μg/ml). Metody formowania o niskim przywiązaniu wytwarzają większe sferoidy zawierające nekrotyczne jądro (kolor czerwony). Pasek skali wynosi 100 μm. (B) Natlenienie w sferoidach HCT116 (początkowe wysiew 500 komórek z dodatkiem 20 μg/mL MMIR1 podczas tworzenia sferoidów, 6 dni) wytworzone różnymi metodami wykazało bardziej natlenione sferoidy z mikrotkanką i mikroformami wyprodukowanymi w laboratorium niż SphericalPlate 5D. (C) Całkowite natlenienie sferoid obliczone na podstawie pomiarów stosunku. (D) Wielkość sferoidy w powierzchni kwadratowej po 5 dniach. Wyniki pokazują średni ± SEM wynoszący 6-16 sferoid. 5D = SphericalPlate 5D, MM = metoda Micromold, MT = metoda MicroTissue. Wartość P < 0,001 i ****Wartość P <0,0001 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. )

Metoda formowania	Ilość sferoid na studzienkę	Całkowita ilość komórek wysianych w jednym dołku	Powierzchnia kwadratowa (μm²)
Mikrotkanka	Rozdział 81	40 500 komórek/190 μl	112 558 ± 15 702
Mikrostudzienki wykonane w laboratorium	Rok 1859	794 500 komórek / ml	53 460 ± 8 332
Płyta sferyczna 5D	750	375 000 komórek / ml	44 048 ± 7 259
Lipidure (Lipidure	1	500 / 200 μL	257 148 ± 28 132
Pływak biologiczny	1	500 / 200 μL	254 475 ± 21365

Tabela 2: Różne metody tworzenia sferoidów prowadzą do różnic w rozmiarach sferoidów, mierzonych kwadratem powierzchni.

Przy wyborze konkretnej metody tworzenia sferoid do eksperymentów, należy pamiętać, że dodanie nanocząsteczek może wpłynąć na kształt sferoidy. W przypadku stosowania powłoki na bazie lipidów z mikrostudzienkami o okrągłym dnie, może wystąpić wytrącanie się sondy, co prowadzi do powstania "sferoid satelitarnych" lub sferoid nieokrągłych (Rysunek 3). Dodanie sondy_O2 do komercyjnej płytki Biofloat powoduje powstanie niezwartego obwodu sferoidalnego, co sugeruje potencjalną interferencję nanocząstek z powłoką mikropłytki. Na morfologię sferoid może mieć również wpływ pył przyczepiony do końcówek pipet. Komórki w zawiesinie mogą przyklejać się do pyłu, wpływając w ten sposób na kształt. Dlatego zaleca się używanie końcówek do pipet wielokrotnego napełniania, które są już dostarczone w stojaku.

Rysunek 3: Obrazy z mikroskopii światła transmisyjnego z przykładami nieidealnego formowania się sferoidów. Nieprawidłowe przechowywanie nanocząstek może powodować wytrącanie się sondy, zakłócając tworzenie sferoidów. Przykłady zakłóceń sondy i kurzu. Podziałka skali wynosi 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oczywiście, metody tworzenia sferoid wpływają na wielkość, morfologię i żywotność sferoidy, a także prowadzą do różnic w jej natlenieniu. Metoda wysokoprzepustowa z pleśniami agarozowymi (np. dostępnymi na rynku, takimi jak pleśń MicroTissue) jest kompatybilna z większością eksperymentów. Daje bardziej powtarzalny kształt, nie powoduje wytrącania się nanocząstek, jest wielokrotnego użytku i może być kompatybilny z bezpośrednią mikroskopią kontrolną. Jednak w przypadku dużych sferoid (>800 μm) i długotrwałej hodowli zalecana jest metoda niskiego przyłączenia, ponieważ metody o wysokiej przepustowości wymagałyby częstej wymiany pożywki. W takim przypadku problemu wytrącania się nanocząstek i jego wpływu na tworzenie sferoidów można uniknąć poprzez wstępne barwienie monowarstwowej kultury 2D przez noc przed utworzeniem sferoidów (Rysunek 4).

Rysunek 4: Sugerowany algorytm wyboru metody tworzenia sferoidów dla mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wieloparametrowy FLIM sferoidów Obrazowanie NAD(P)H za pomocą dwufotonowej mikroskopii FLIM ujawnia metaboliczną niejednorodność sferoidów HCT116
Wybitny marker autofluorescencji w bezznacznikowym obrazowaniu metabolicznym, NAD(P)H wykazuje krótszy czas życia dla glikolizy i dłuższy czas życia dla OxPhos, umożliwiając rozszyfrowanie przestrzennego rozkładu aktywności metabolicznej w takich modelach 3D, jak sferoidy i organoidy³¹. Aby wygodnie przeanalizować rozkład NAD(P)H w sferoidach HCT116, zastosowano opartą na fazorze ilościową metodę analizy NAD(P)H autofluorescencji, ujawniającą stany związane z glikolizą i fosforylacją oksydacyjną (OxPhos). Podczas gdy obrazy intensywności fluorescencji sferoid HCT116 nie wykazały istotnych różnic między sferoidami, szybkie obrazowanie FLIM NAD(P)H ujawniło wyraźną różnicę w sferoidalnych sekcjach optycznych. Na szybkich obrazach FLIM sferoidy z wewnętrznym obszarem wykazującym krótszy czas trwania fluorescencji były oznaczone białym kółkiem, identyfikując to jako rdzeń glikolityczny (Rysunek 5A). W związku z tym sferoidy podzielono na dwie grupy, glikolityczną grupę rdzeniową i nieglikolityczną grupę rdzeniową, w oparciu o obecność lub brak rdzenia glikolitycznego. Analiza fazorowa oparta na centroidach została wykorzystana do statystycznej analizy różnic między dwiema odrębnymi grupami i zmierzenia odległości od środka ciężkości klastra pikseli do swobodnego punktu NAD(P)H. Jak pokazano na Rysunek 5B, na wykresie fazora istniała oczywista różnica w klastrze pikseli między grupą glikolityczną a grupą nieglikolityczną. Aby dokładnie zmierzyć odległość, wolny punkt NAD(P)H na wykresie wskazowym został precyzyjnie oznaczony za pomocą modułu FLIM w oprogramowaniu LAS X, a następnie wyeksportowany do oprogramowania FIJI w celu wyznaczenia dokładnych współrzędnych. Następnie, zgodnie z protokołem 2.3, współrzędne środka ciężkości zostały zmierzone na wykresie fazora każdej grupy za pomocą oprogramowania FIJI. Odległość (D) od środka ciężkości do wolnego punktu NAD(P)H, przy użyciu twierdzenia Pitagorasa, została obliczona w ten sposób, ułatwiając analizę profili NAD(P)H w celu rozróżnienia sferoid OxPhos i sferoidów z rdzeniem glikolitycznym. Wyniki, przedstawione na wykresie pudełkowym, pokazują znaczące różnice odległości między sferoidami rdzenia glikolitycznego a grupą rdzenia nieglikolitycznego (***wartość P < 0,001) (Rysunek 5C). Wynik ten był zgodny z szybkim obrazowaniem FLIM, wykazując, że ta metoda analizy fazorowej jest odpowiednia do ilościowej analizy rozbieżności NAD(P)H populacji sferoidalnych. Ponadto, aby sprawdzić, czy to podejście ma zastosowanie do porównania odległości między dwiema grupami sferoidalnymi, przeprowadzono analizę regresji liniowej dla centroidów z obu grup i wolnego punktu NAD(P)H (Rysunek 5D). Wynik pokazał, że centroidy są wyrównane z wolnym NAD(P)H, o wysokim współczynniku korelacji (R² = 0,997), co potwierdza możliwość porównania odległości w celu wywnioskowania różnicy NAD(P)H między grupami sferoidalnymi.

Rysunek 5: Analiza fazorowa sferoidów HCT116 wykonana przy użyciu płytek o niskim przyłączeniu: porównanie rdzeni glikolitycznych i nieglikolitycznych rozkładu NAD(P)H za pomocą dwufotonowego FLIM. Parametry akwizycji: natężenie lasera: 15%, rozdzielczość: 512 x 512 pikseli, np. 741 nm/em. 411-491 nm. (A) Intensywność fluorescencji i szybkie obrazy FLIM pokazują rozkład NAD(P)H w sferoidach HCT116, odróżniając sferoidy z rdzeniem glikolitycznym (po lewej) od tych bez (po prawej). Białe kółko na szybkim obrazie FLIM wyświetlało krótszy obszar życia, definiując rdzeń glikolityczny. Początkowa gęstość wysiewu: 50 komórek (po lewej) i 500 (po prawej), czas inkubacji: 6 dni, podziałka: 50 μm. (B) Metodologia pomiaru odległości od środka ciężkości sferoid HCT116 do wolnego punktu NAD(P)H na wykresach wskazowych, przy użyciu modułu LAS X FLIM i oprogramowania FIJI w dwóch odrębnych grupach sferoidalnych (D: odległość). W przypadku sferoid HCT116 zastosowano filtr falkowy i wartość progową 10 dla wykresu wskazowego. (C) Wykres skrzynkowy przedstawiający różnicę odległości od środka ciężkości do wolnego punktu NAD(P)H, porównujący glikolityczne grupy rdzeniowe i nieglikolityczne (***P < 0,001). (D) Liniowe dopasowanie środków ciężkości wykresu fazorowego z rdzenia glikolitycznego, nieglikolitycznych grup rdzeniowych i wolnych współrzędnych teoretycznych NAD(P)H wykazało dokładne wyrównanie liniowe z R² = 0,997, co pozwala na bezpośrednie porównanie różnicy odległości między sferoidami rdzenia glikolitycznego i nieglikolitycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Multipleksowana analiza autofluorescencji i niedotlenienia FAD w sferoidach ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC)
Sferoidy komórek macierzystych miazgi zębowej są atrakcyjnym narzędziem eksperymentalnym do biofabrykacji różnych tkanek, w tym osteoblastów^25,66,67. Jednak ich żywotność i metabolizm są rzadko badane. Te sferoidy pochodzące z komórek macierzystych wykazują raczej małe rozmiary (<200 μm), jasnozieloną autofluorescencję z FAD/flawin (później określaną jako FAD) (np. 460 nm, em. 550 nm) oraz obecność "bezpośrednich" i "odwróconych" gradientów hipoksji²⁹. Rysunek 6 pokazuje wyniki połączonego konfokalnego obrazowania ratiometrycznego natlenienia sferoid (za pomocą nanocząstek MMIR wykrywających_O2) i autofluorescencji FLIM FAD. "Klasyczny" gradient bezpośredniego natlenienia zaobserwowano w sferoidach o średnicy 69 mm, podczas gdy większe (141 μm) sferoidy wykazywały gradient "odwrócony". Dodanie FAD-FLIM do tych pomiarów pomaga potwierdzić różnice w metabolizmie oksydacyjnym, jak pokazują szybkie wykresy FLIM i fazorowe: małe sferoidy wykazywały bardziej wyraźny odsetek dłuższych okresów życia FAD, co potencjalnie wskazuje na wyższą aktywność glikolityczną w sferoidach o mniejszych rozmiarach.

Rysunek 6: Przykład wieloparametrycznego obrazowania autofluorescencji flawinowej (np. 460 nm/em. 510-590 nm) i natlenienia (analiza współczynnika intensywności za pomocą wrażliwych nanocząstek MMIR O₂: np. 614 nm/em. odniesienia 631-690 nm / czułych em. 724-800 nm) w sferoidach hDPSC o różnych rozmiarach (małych: 188 komórek/sferoidę, dużych: 820 komórek/sferoidę), wytwarzanych metodą wysokoprzepustowych, samodzielnie wytwarzanych mikropleśni agarozy (konfokalny FLIM). ( A,B) Reprezentatywny przykład współczynnika intensywności natlenienia i obrazowania czasu życia autofluorescencji flawiny w dużych (A, "B Sphs") i małych (B, "S Sphs") sferoidach hDPSC. (C,D) Analiza porównawcza czasu życia autofluorescencji flawiny z wykorzystaniem analizy chmur wykresu fazorowego, w oparciu o porównanie geometrycznych środków chmur wskazowych. (E) Centroidy pikseli (środki geometryczne) współrzędne autofluorescencji flawiny z dużej sferoidy hDPSC (B Sphs) i małej sferoidy hDPSC (S Sphs) na wykresie wskazowym. Dwa różne kody kolorystyczne stosowane do różnych podejść do analizy FLIM, gdzie kodowanie kolorami za pomocą τ pokazuje rozkład średniego czasu nadejścia fotonów (obrazy FAST-FLIM), podczas gdy kodowanie kolorami za pomocą τ φ - faza tau odpowiada analizie fazora-FLIM czasu życia fluorescencji w tych samych sferoidach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Multipleksowana analiza autofluorescencji FAD i śmierci komórek w ludzkich sferoidach iPSC
Sferoidy ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są często stosowane jako pierwszy etap podczas indukcji różnicowania specyficznego dla tkanek i produkcji organoidów, np. w przypadku hodowli organoidów nerwowych. W zależności od obchodzenia się z nimi i konkretnego protokołu wytwarzania, żywotność i późniejsza odtwarzalność organoidów może być poważnie zagrożona. Nieniszczące badanie organoidów i sferoidów zawierających progenitorowe komórki progenitorowe mają kluczowe znaczenie dla oceny strukturalnej, monitorowania i przewidywania jakości rosnących i składanych tkanek nerwowych podczas ich rozwoju^68,69. Rysunek 7A pokazuje, że nieniszczący FLIM autofluorescencyjnych cząsteczek Flavin/FAD może dostarczyć nam informacji o żywotności sferoid iPSC. Obrazowanie wykonano 4 dni po wysianiu 9 000 iPSC w komercyjnych dołkach z płytką o bardzo niskim mocowaniu (Corning). Przed obrazowaniem sferoidy barwiono przez 1 godzinę 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI) w celu uwidocznienia martwych komórek. Nie zaobserwowano nekrotycznych rdzeni w tych sferoidach iPSC o gęstości wysiewu 9 000 komórek po 4 dniach. Na odpowiednim wykresie wskazowym autofluorescencji flawiny/FAD można wyróżnić trzy główne wzorce (Rysunek 7B lewy panel): wzór autofluorescencji pożywki (kolor magenta), wzór (ze średnią τ φ - faza tau, ~2,6 ns) odpowiadający regionom bez PI (ROI1) i wzór (ze średnią τ φ ~3,1 ns) regionów korelujących z markerem śmierci komórki - barwieniem (ROI2). Dodatkowe porównanie kultur 2D iPSC poddanych działaniu PI i nietraktowanych nie wykazało wpływu PI na pojawienie się długożyciowych wzorców fazorowych flawiny / FAD (Rysunek 7C), co wskazuje, że ten wzrost czasu życia flawin / FAD może być niezależnym markerem upośledzonej żywotności iPSC i ich pochodnych komórek. Chociaż obserwacja ta jest zgodna z niedawnym raportem na temat obrazowania opartego na intensywności⁷⁰, nie możemy całkowicie wykluczyć obecności intensywności jodku propidyny w kanale emisji FAD (506-582 nm). Potrzebne są dalsze badania, aby udowodnić związek między zmianami czasu życia flawiny / FAD a potencjalnymi zdarzeniami śmierci komórki. Prosta, wieloparametryczna analiza regionów ROI oparta na fazorach demonstruje elegancki sposób szybkiego badania przesiewowego i analizy danych.

Rysunek 7: Konfokalne barwienie FLIM i jodkiem propyliny w autofluorescencji flawinów w sferoidach iPSC w celu oceny żywotności komórek. (A) Autofluorescencja flawinowa (po lewej) i Jodek propidyny - PI (po prawej) FLIM sferoidy iPSC 4 dni po wysianiu 9 000 komórek na płytce o ultraniskim przyczepie (Corning) i barwieniu PI (0,5 μg/ml, 1 h) przed obrazowaniem. (B) Analiza wykresu fazorowego ogólnych obrazów autofluorescencji flawiny (po lewej) i jodku propidyny (po prawej) oraz odpowiadających im ROI (ROI1 - zielony i ROI2 - czerwony, autofluorescencja podłoża - magenta). Zwroty z inwestycji zostały wybrane na podstawie obecności znakowania jodkiem propidyny. (C) szybka analiza FLIM i wykresu fazorowego autofluorescencji flawin w kulturze 2D iPSC traktowanej i nietraktowanej PI (0,5 μg/ml, 1 h). Nie stwierdzono wpływu barwienia PI na pojawienie się długiego czasu trwania fluorescencji flawin (odpowiadającego wzorowi fazorowemu w różowym kółku) podczas zbierania wzbudzenia flawiny w zakresie 469-542 nm. Ten zakres detektora nie pokrywa się z widmem wzbudzenia PI (550-720 nm). Po zebraniu szerszego zakresu wzbudzenia dla FAD (469-590 nm) można zauważyć wpływ PI. Kodowanie kolorami obrazu odpowiada średnim wartościom czasu nadejścia fotonów (fast-FLIM). Parametry obrazowania wynosiły T = 35 °C, 25X/0,95 obiektyw zanurzeniowy w wodzie (A-B), 40X/1,25 obiektyw glicerolowy (C). Flawiny: np. 460 nm, em. 506-582nm (AB), otwór 4 AU. PI: np. 535 nm, em. 584-667 nm, otwór 1 j.a. Kanały: Intensywność i Tau. Częstotliwość powtarzania 40 MHz w celu uzyskania pełnego rozpadu autofluorescencji flawinowej. Ustawienia analizy wskazówki; Harmoniczna 1, próg 1 (A-B), 47 (C), filtr mediany 17 (A-B), 11 (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Dodatkowe protokoły dotyczące tworzenia sferoidów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Dane FLIM rdzenia glikolitycznego i rdzenia nieglikolitycznego.lif. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Dane FLIM rdzenia glikolitycznego.ptu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Dane FLIM nieglikolitycznego rdzenia.ptu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Szybki FLIM.tif rdzenia glikolitycznego Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Nieglikolityczny, szybki rdzeń FLIM.tif Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Wolny od rdzenia glikolitycznego NAD(P)H point.tif Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Glikolityczna końcówka rdzeniowa plot.tif Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Nieglikolityczny, wolny od rdzenia NAD(P)H point.tif Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 10: Nie.glikolityczny rdzeń plot.tif <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/Supplementary Plik 10.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Sferoidy wielokomórkowe stają się metodą z wyboru w badaniach mikrośrodowisk niszowych nowotworów i komórek macierzystych, odkrywaniu leków i opracowywaniu "cegiełek budulcowych" tkanek do biofabrykacji. Niejednorodna architektura wewnętrzna, gradienty składników odżywczych i natlenienia sferoidów mogą naśladować te w tkankach i guzach in vivo w stosunkowo uproszczonych i dostępnych warunkach. Oczekuje się, że ze względu na potrzebę większej przejrzystości metodologicznej^26,28 i standaryzacji⁷¹, protokoły te pomogą naukowcom wybrać najlepszą metodę tworzenia sferoidów do eksperymentów z ilościowym obrazowaniem czasu życia fluorescencji na żywo. Przedstawione metody wykorzystują czujniki nanocząstek do barwienia komórek i wewnętrzną autofluorescencję komórkową, które można łatwo połączyć z barwieniem śmierci komórki.

Najbardziej krytyczne etapy to protokół tworzenia sferoid; Tak więc, w przypadku wysokoprzepustowej metody opartej na agarozie, konieczne jest wystarczające zrównoważenie form agarozowych dla pożywek hodowlanych. Niewystarczający czas równowagi doprowadzi do rozcieńczenia składników odżywczych w pozostałym PBS i przyniesie dodatkowe czynniki dla niejednorodności sferoidalnej 21,26,72,73. Świeżo wykonana pleśń agarozowa musi być również wizualnie sprawdzona pod kątem obecności pęcherzyków powietrza, mikropęknięć i innych wad.

Chociaż zawiesina nanocząstek jest skuteczna w obrazowaniu, może wykazywać samoagregację i powodować powstawanie sferoid o nieregularnych kształtach w metodach tworzenia o niskim przyłączeniu. Często można to złagodzić poprzez dodanie surowicy do pożywki hodowlanej lub przez wstępne barwienie jednowarstwowej kultury komórkowej przed utworzeniem sferoidów. Często podczas kompaktyzacji sferoidowej dodanie niewielkiej ilości nanocząstek (np. 10% początkowego stężenia barwienia) może również pomóc w barwieniu strefy proliferacji sferoid. Wreszcie, ważne jest, aby używać "bezpyłowych" sterylnych końcówek do pipet we wszystkich metodach formowania.

Podczas eksperymentów obrazowych należy zawsze brać pod uwagę potencjalny wpływ oświetlenia na żywotność komórek. Dlatego ważne jest, aby znać czynniki ryzyka negatywnie wpływające na każdy eksperyment obrazowania na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, fotouszkodzenia obejmują kilka mechanizmów: (1) wysoki lokalny wzrost temperatury, (2) naprężenia mechaniczne oraz (3) stres fotochemiczny (reakcja oksydacyjna i wolnorodnikowa)⁷⁴. W zależności od metody obrazowania (np. obrazowanie konfokalne jednofotonowe vs. wielofotonowe, tryby oświetlenia ciągłego vs. impulsowego, czułość detektorów i moc źródła światła przy różnych długościach fal, jeśli możliwe jest dostrojenie wzbudzenia), typu komórki i tkanki (np. zależna od typu tkanki akumulacja pigmentów skutecznie pochłaniających światło lub innych cząsteczek autofluorescencyjnych, organizacja 3D vs. 2D, wzrost i skład pożywki do obrazowania), pochodzenie sondy fluorescencyjnej (np. właściwości fotouczulające) różne kombinacje czynników ryzyka mogą powodować fototoksyczność podczas obrazowania. Ponadto, nawet jeśli nie obserwuje się wzrostu śmierci komórki po oświetleniu, zależne od mocy światła wcześniejsze efekty przedśmiertne na mitochondria i metabolizm mogą potencjalnie zakłócać analizę^{i interpretację} eksperymentu.

Aby wykluczyć wpływ fototoksyczności na wyniki eksperymentalne, badacz powinien przeprowadzić ogólne monitorowanie żywotności komórek i zmian w morfologii komórek w porównaniu z nienaruszoną kontrolą lub użyć sond śmierci komórki w celu oszacowania wzrostu śmiertelności komórek po oświetleniu. Jeżeli eksperymenty metaboliczne są wykonywane, optymalizacja parametrów obrazowania powinna być dokonana odpowiednio w eksperymentach pilotażowych w celu oszacowania i zminimalizowania wpływu obrazowania na mierzone parametry metaboliczne. W przypadku sond wrażliwych na tlen przedawkowanie światła można łatwo prześledzić poprzez nagły wzrost trwałości i intensywności fosforescencji barwnika O₂ wrażliwego na działanie (odpowiednie zmiany współczynnika intensywności odniesienia do barwnika wrażliwego na_O2) spowodowany tak zwanym efektem "fotoindukowanego zużycia_O2"^53,75. Można to łatwo osiągnąć poprzez analizę krzywej kinetycznej eksperymentów poklatkowych z różnymi parametrami mocy światła, wykorzystując na przykład następujący opublikowany protokół²⁵. W "obronie" iluminacji impulsowej (np. wykorzystywanej w mikroskopii TCSPC-F(P)LIM), ostatnie badania wykazały jej minimalny wpływ na produkcję ROS i fotowybielanie sondy w porównaniu z pomiarami oświetlenia w stanie ustalonym^76,77, wskazując na dodatkową przewagę TCSPC-FLIM w porównaniu z konwencjonalnym podejściem do obrazowania opartym na intensywności.

Głównym ograniczeniem prezentowanych metod powstawania sferoid są zastosowania w monitorowaniu bezpośrednim i długoterminowym. Formy agarozowe wymagają obiektywu o dużej odległości roboczej (lub dodatkowego mikroskopu pionowego lub stereomikroskopu fluorescencyjnego) ze względu na grubą warstwę agarozy, a materiał płytki sferycznej 5D może zakłócać pomiary w kanałach czerwonej fluorescencji (sonda_O2 ). Rozmiar sferoidy wytwarzany metodami wysokoprzepustowymi jest ograniczony średnicą mikrodołka i wymaga częstej wymiany pożywki, aby uniknąć wyczerpania i zakwaszenia pożywki. Biorąc pod uwagę wszystkie te ograniczenia, zalecamy szalki Petriego 3D (MicroTissue) do eksperymentów wymagających wysokiej przepustowości (np. do zastosowań biodruku 3D) i metod o niskiej przyczepności do "średnioprzepustowych" badań podstawowych, wymagających również mniejszej liczby komórek.

Ratiometryczne monitorowanie natlenienia i konwencjonalne eksperymenty mikroskopowe oparte na barwniku fluorescencji żywych komórek są przystępne cenowo na powszechnie dostępnych mikroskopach odwróconych, jeśli są wyposażone w kamerę czułą na bliską podczerwień (NIR), wzbudzenie oparte na diodach elektroluminescencyjnych (LED) i odpowiedni obiektyw²⁵. W celu uzyskania bardziej odpowiedniego przekroju optycznego i FLIM zaleca się dostępne od ręki komercyjne systemy mikroskopów konfokalnych (takie jak opisane tutaj). Chociaż opisujemy również metodę wykrywania autofluorescencji NAD(P)H, wymagającą bardziej kosztownego dwufotonowego mikroskopu FLIM, istnieje wiele różnych podejść, kompatybilnych i przydatnych dla konfokalnych systemów FLIM, idealnie wyposażonych w laser światła białego i detektory hybrydowe lub. Obejmują one ocenę metabolizmu komórkowego, białka biosensora FRET-FLIM, obrazowanie mechaniki komórek i tkanek, autofluorescencję określonych typów komórek i tkanek oraz interakcje receptor-lek wizualizowane za pomocą FLIM-FRET³¹.

Dostarczone przez dostawcę oprogramowanie do akwizycji i analizy FLIM może mieć wpływ na powodzenie eksperymentu, ponieważ nie zawsze jest możliwe wyeksportowanie IRF lub obrazów w formacie zgodnym z późniejszą analizą typu open source. Przetwarzanie końcowe jest ważną częścią przepływu pracy analizy FLIM i nadal nie jest powszechnie ustandaryzowane ani akceptowane. Dopasowanie krzywej wymaga większej liczby fotonów i większej mocy obliczeniowej w porównaniu z podejściem fazorowym. FLIMfit⁴⁵ (dopasowanie globalne i piksel po pikselu) i Flimview⁷⁸ należą do otwartego oprogramowania używanego do analizy dopasowania krzywych, podczas gdy PAM⁷⁹, FLUTE⁶⁴ i AlliGator⁸⁰ są używane do analizy wskazówkowej. FLIMJ⁴⁶ to przydatna wtyczka ImageJ, która działa z obydwoma podejściami. Ogólnie rzecz biorąc, te opcje pomagają ulepszyć procedurę przetwarzania końcowego i sprawiają, że jest ona szybsza, bardziej wszechstronna i przyjazna dla użytkownika.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsyna-EDTA	Gibco	25300-054	Dostępne również w
pipetach serologicznych Sigma 10 ml	VWR	612-3700	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne	Greiner bio-one	665-180	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning i innych firmach.
12-dołkowy szkiełko komorowe, wyjmowane	Ibidi	81201	Dostępne również w Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific i innych
probówkach wirówkowych 15 ml	Nerbe plus	02-502-3001	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Mikroformy 3D na szalce Petriego	Mikrotkanka	Z764000-6EA
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne	Greiner bio-one	657160	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
70% etanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Dostępna na rynku powlekana 96-dołkowa płytka do tworzenia sferoidów
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Stosować w rozcieńczeniu 1:1000
Oprogramowanie CellSens Dimension	Olympus	version 3
Kolagen z ludzkiego łożyska, typ IV	Sigma	C5533	Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną
Konfokalny mikroskop FLIM	Leica Microsystems	N/A	Mikroskop odwrócony Stellaris 8 Falcon z laserem światła białego, detektory HyD X, klimat / komora kontrolna T (OkoLab), obiektyw 25x/0,95 W
D(+)-glukoza	Merck	8342	Przygotuj 1 M roztwór podstawowy, 1:100 do przygotowania pożywki obrazowej (stężenie końcowe 10 mM)
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle's (DMEM), bez czerwieni fenolowej, glukozy, pirogronianu i glutaminy	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Do przygotowania pożywki
Surowica bydlęca płodu ( FBS)	Gibco	10270-098	Dostępny również w Sigma. Przed użyciem należy go dezaktywować termicznie.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 10 mM)
Ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	wersja 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	wersja 4.6.1.27508
L-glutamina	Gibco	25030	Dostępny również w firmie Sigma. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, wymaga dodania 1 mM pirogronianu sodu i 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standardowa pożywka wzrostowa dla komórek HCT116
Mikrowzorzyste stemple PDMS drukowane w 3D	N/A	/A	Dostarczone przez Centrum Technologii Mikrosystemów, prof. dr Jan Vanfleteren, Uniwersytet w Gandawie
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Komora do płukania Neubauer	Sondy O2 Fisher Scientific	15980396
MMIR1	N/A	N/A	Pełną charakterystykę, walidację i niektóre aplikacje można znaleźć pod adresem: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Rozpuść tabletkę PBS w 500 ml wody destylowanej.
Pióro Strep :P enicylina (10 000 U/ml) / streptomycyna (10 000 μ g/mL) 100x roztwór	Gibco	15140-122	Dostępny również w firmie Sigma. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
Poli-D-lizyna	Sigma	P6407-5mg	Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną
Jodek propidium	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Barwienie śmierci komórkowej użyj 1 &mikro; g / ml w 1h inkubacji
filtr strzykawkowy PVDF 0,22 i mikro; m	Novolab	A35149	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Pirogronian sodu (100 mM)	Gibco	11360-070	Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterylny petridish	Greiner bio-one	633181	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Kolba do hodowli tkankowych (25 cm² )	VWR	734-2311	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Kolba do hodowli tkankowych (75 cm²)	VWR	734-2313	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
96-dołkowa płytka w kształcie litery U VWR		10062-900	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one i innych firmach
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Inne rodzaje agarozy, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia (A-9414, Sigma), agaroza do rutynowego użytku (A-9539, Sigma)
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny	Olympus	N/A	Odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX81, z silnikowym sterowaniem osią Z, CoolLED pE4000 (16 kanałów, 365-770 nm), kamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), szklana płyta grzewcza Okolab, oprogramowanie CellSens Dimension v.3 i obiektywy pneumatyczne 4x/0,13 UPlanFLN i 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opcjonalnie, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości) 60x/1,0 LUMPLFLN woda