Tutaj opisujemy prostą i tanią technikę inokulacji i obserwacji arbuskularnych grzybów mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych opartych na polimerach.
Artykuł metodologiczny
Inokulacja i obserwacja arbuskularnych kultur mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych na bazie polimerów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Grzyby mikoryzowe (AM) są trudne do manipulowania i obserwowania ze względu na ich stałe powiązanie z korzeniami roślin i rozmnażanie w ryzosferze. Zazwyczaj grzyby AM są hodowane w warunkach in vivo w hodowli doniczkowej z gospodarzem autotroficznym lub w warunkach in vitro z korzeniami przekształconymi w transfer Ri DNA (gospodarz heterotroficzny) na szalce Petriego. Dodatkowo uprawa grzybów AM w uprawach doniczkowych odbywa się w nieprzezroczystym i niesterylnym środowisku. Natomiast hodowla in vitro polega na rozmnażaniu grzybów AM w sterylnym, przezroczystym środowisku. Niedawno opracowano superchłonny system autotroficzny oparty na polimerach (SAP-AS), który łączy w sobie zalety obu metod, unikając jednocześnie ich ograniczeń (zmętnienie i heterotroficzny gospodarz, sterylność). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ułatwiający przygotowanie, inokulację pojedynczych zarodników i obserwację grzybów AM w SAP-AS. Dzięki modyfikacji szalek Petriego możliwe były obserwacje fotograficzne i wideo w wysokiej rozdzielczości na żywych próbkach, co byłoby trudne lub niemożliwe przy użyciu obecnych technik in vivo i in vitro.
Wprowadzenie
Arbuskularne grzyby mikoryzowe (AM) (Glomeromycotina) to starożytne symbionty korzeni roślin (~500 Ma1,2), które mogły odegrać istotną rolę w kolonizacji gleb lądowych przez tracheofity. Ta długa koewolucja między grzybami AM a tracheofitami umieszcza mikoryzę arbuskularną jako arcydzieło mutualizmu międzykrólestwowego. Strzępki grzybów AM znacznie zwiększają zdolność żywiciela do pozyskiwania składników odżywczych w glebie3, w tym przenoszenie składników odżywczych do nowych gospodarzy za pośrednictwem sieci mikoryzowych4. Sieć strzępek poprawia strukturę gleby, a produkcja glomaliny może zmniejszyć erozję gleby5. Przeniesienie części węgla atmosferycznego do symbionta korzeni grzyba zwiększa sekwestrację węgla w glebie6. Ogólnie rzecz biorąc, grzyby AM poprawiają odporność roślin zarówno na stresy abiotyczne, jak i biotyczne i dlatego poświęcono im wiele uwagi w agroekologii7. Rzeczywiście, praktyki zarządzania rolnictwem przyjazne dla grzybów AM mogą potencjalnie zmniejszyć zużycie środków chemicznych do produkcji roślinnej i poprawić zawartość węgla organicznego w glebie, co jest ważnym celem, który rolnicy muszą włączyć do swoich praktyk zarządzania, aby spełnić krajowe i międzynarodowe zobowiązania dotyczące przejścia na zrównoważone praktyki rolnicze i walki ze zmianami klimatu.
Jednakże, grzyby AM są mikroskopijnymi grzybami glebowymi, a ich badanie jest trudne ze względu na ich obligatoryjną biotrofię i rozmieszczenie ryzosfery. Gleba jest jednym z najtrudniejszych biotopów do zbadania ze względu na jej nieprzezroczystość, ogromną różnorodność nisz i interakcje multitroficzne we wszystkich skalach. Izolacja, rozmnażanie i charakterystyka grzybów AM są zatem trudne. Do połowy XX wieku scharakteryzowano tylko gatunki grzybów AM tworzące owocniki AM8. Jednak większość gatunków grzybów AM wytwarza zarodniki niesporokarpiczne o średnicy od ~20 μm do ~500 μm. Opis techniki przesiewania gleby na mokro9 otworzył drogę do opisania tych gatunków grzybów AM, a tempo opisu gatunków wzrosło od tego czasu. Niemniej jednak grzyby AM reprezentują niewielką grupę gatunków w porównaniu z Dikarya.
Kultury pułapkowe, tj. zaszczepienie zarodnikami lub próbką gleby zawierającą zarodniki grzybów AM w doniczce wypełnionej autoklawowanym materiałem, takim jak turface i wermikulit oraz wysterylizowanym nasieniem gospodarza (por, babka lancetowata), jest jednym ze sposobów rozmnażania grzybów AM w kontrolowanych warunkach10. Jednak powodzenie inokulacji można ocenić tylko poprzez szukanie obecności arbuskul we fragmentach korzeni po barwieniu lub przez przesiewanie na mokro podpróbki lub całego garnka w celu wyizolowania zarodników. Zwykle zaleca się, aby nie zakłócać pracy systemu przez co najmniej 6-12 tygodni przed analizą kultury doniczkowej. Ta technika hodowli jest odpowiednia do rozmnażania większości znanych gatunków grzybów AM, ale obserwacja na żywo symbionta grzyba nie jest możliwa, a powodzenie inokulacji jest niepewne, zwłaszcza gdy próbuje się wyhodować pojedyncze zarodniki.
Wręcz przeciwnie, rozmnażanie in vitro grzybów AM może być monitorowane na żywo dzięki przezroczystości pożywki hodowlanej11, ale ta technika hodowli wymaga dostępności przekształconych korzeni i obecności węgla w pożywce, aby działały w sterylnym środowisku. Zarodniki muszą zostać wysterylizowane, a wraz z powiązaniem z heterotroficznym gospodarzem, większość znanych gatunków grzybów AM nie jest pomyślnie rozmnażana przy użyciu tej techniki.
Dlatego rozmnażanie grzybów AM przy użyciu obecnych technik, choć ugruntowane i szeroko stosowane w większości laboratoriów, ma pewne ograniczenia w badaniu grzybów AM. Paré i in. (2022)12 opracowali technikę in vivo wykorzystującą przezroczysty superchłonny polimer (SAP) w połączeniu z całymi roślinami do rozmnażania grzybów AM. Technika, zaprojektowana jako system autotroficzny oparty na SAP (SAP-AS), jest prosta i niedroga oraz łączy w sobie zalety hodowli doniczkowych (powiązanie z autotroficznym gospodarzem, warunki niesterylne) oraz kultur in vitro (przezroczyste podłoże, monitorowanie rozwoju symbiozy na żywo). Tutaj przedstawiamy protokół wyjaśniający, jak ustawić kultury z pojedynczą inokulacją zarodników i użyć SAP-AS do obserwacji grzybni pozarodnikowej w dużym powiększeniu. W szczególności opisujemy, jak modyfikować dwukomorowe szalki Petriego, przygotować pożywkę, przygotować superchłonny polimer (SAP), przygotować siewki, złożyć SAP-AS i zaszczepić pojedynczym zarodnikiem, wstępnie wykiełkować zarodniki i na żywo monitorować rozwój symbiozy.
Protokół
1. Modyfikacja dwukomorowych szalek Petriego
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Zmodyfikuj pokrywę szalki Petriego.
- Za pomocą narzędzia obrotowego i odpowiedniego wiertła do rzeźbienia wywierć dwa otwory (o średnicy ~7 mm) w górnej części pokrywy i 1 cm otwór z boku. Jeden otwór będzie służył do nawadniania przedziału korzeni (wermikulitu), a drugi do przedziału strzępek (SAP).
- Zmodyfikuj dno szalki Petriego.
- Wywierć nacięcie z boku dna szalki Petriego na łodygę rośliny za pomocą elektrycznego narzędzia obrotowego. Upewnij się, że nacięcie nie jest zbyt głębokie, aby zapobiec spłynięciu płynu. To wcięcie wyrówna się z 1 cm otworem w pokrywie (krok 1.1).
- Aby zastąpić plastikową barierę dwukomorowej szalki Petriego membraną filtracyjną z siatki nylonowej, użyj elektrycznego narzędzia obrotowego, aby wywiercić prostokątne nacięcie o średnicy 30 mm do dna szalki Petriego.
- Aby uzyskać obserwację w wysokiej rozdzielczości, wywierć okrągłe otwory o średnicy ~25 mm w dnie szalki Petriego. W zależności od wymagań należy wykonać pojedynczy otwór (lub wiele otworów) po stronie SAP lub po jednym w każdej komorze. Upewnij się, że otwory nie są wiercone bezpośrednio pod otworami irygacyjnymi pokrywy.
- Zainstaluj membranę filtracyjną z siatki nylonowej.
- Użyj metalowej prowadnicy i spinacza do papieru, aby zaklinować kawałek membrany filtracyjnej z siatki nylonowej na miejscu i mocno docisnąć ją do plastikowej bariery. Wyrównaj górną część membrany z górną częścią plastikowej bariery. Upewnij się, że membrana wystaje z dolnej części prowadnicy.
- Korzystając z zestawu do pirografii, przeciąć wzdłuż krawędzi metalowej prowadnicy, aby stopić i uszczelnić membranę do dna szalki Petriego i plastikowej bariery oddzielającej te dwie komory.
- Trzymając metalową prowadnicę i spinacz do papieru na swoim miejscu, ostrożnie usuń nadmiar nylonowej membrany filtracyjnej za pomocą pęsety.
- Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym, czy membrana filtra z siatki nylonowej jest prawidłowo uszczelniona z tworzywem sztucznym, aby zapobiec przenikaniu korzeni do komory strzępek (SAP).
- Zainstaluj szkiełko nakrywkowe.
UWAGA: Szkiełko nakrywkowe umieszcza się pod szalką Petriego. Pozwala to na użycie olejku immersyjnego i oczyszczenie szkiełka nakrywkowego.- Umieść uszczelniacz silikonowy wzdłuż krawędzi okrągłych otworów (na zewnątrz dna szalki Petriego).
- Umieść szkiełko nakrywkowe na zewnętrznej stronie dna szalki Petriego i delikatnie dociśnij, aby zapewnić idealne przyleganie.
- Pozostawić do wyschnięcia i usunąć nadmiar szczeliwa żyletką.
- Sprawdź i wyczyść.
- Użyj podmuchu powietrza, aby usunąć kurz lub kawałki plastiku, które mogły przylgnąć do szalki Petriego.
- Zbadaj pod mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować i skorygować wszelkie wady.
UWAGA: Noś rękawiczki, aby uniknąć odcisków palców na szalkach Petriego
2. Przygotowanie 1 L pożywki mMS-1
- Przygotować roztwory podstawowe.
- Makroelementy: W 1 l wody destylowanej odważyć i rozpuścić:
7,31 g MgSO4·7H2O, 0,80 g KNO3, 0,65 g KCl i 0,048 g KH2PO4,. - Odważyć 2,88 g Ca(NO3)2·4H2O i rozpuścić w 1 l wody destylowanej.
- Odważyć 0,80 g NaFeEDTA i rozpuścić w 0,5 l wody destylowanej.
- Odważyć 0,375 g KI i rozpuścić w 0,5 l wody destylowanej.
- Mikroelementy
- Rozpuścić 3 g MnCl2·4H2O w 100 ml wody destylowanej.
- Rozpuścić 1,325 g ZnSO4·7H2O w 100 ml wody destylowanej.
- Rozpuścić 0,75 gH3BO3 w 100 ml wody destylowanej.
- Po rozpuszczeniu wymieszać roztwory przygotowane w krokach 2.1.5.1-2.1.5.3.
- Odważyć 0,65 g CuSO4·5H2O i rozpuścić w 50 ml wody destylowanej.
- Rozpuścić 0,12 g Na2MoO4·2H2O w 100 ml wody destylowanej.
- Dodać 5 ml roztworu z kroku 2.1.5.5 i 1 ml z kroku 2.1.5.6 do roztworu z kroku 2.1.5.4.
- Dostosować objętość roztworu otrzymanego w kroku 2.1.5.7 do 500 ml wodą destylowaną.
- Makroelementy: W 1 l wody destylowanej odważyć i rozpuścić:
- Przygotuj 1 l pożywki mMS-1.
- Dodaj 700 ml wody destylowanej do szklanej butelki o pojemności 2 litrów.
- Ciągle mieszając prętem magnetycznym, dodać 100 ml roztworu makroskładników odżywczych (krok 2.1.1), 100 ml roztworu azotanu wapnia (etap 2.1.2), 5 ml roztworu żelazowego EDTA (etap 2.1.3), 1 ml roztworu KI (krok 2.1.4) i 1 ml roztworu mikroelementów (etap 2.1.5).
- Dostosować objętość roztworu do 1000 ml.
UWAGA: mMS-1 jest adaptacją Bécarda i Fortina (1988)14. Sterylizacja w temperaturze 121 °C przez 15 minut jest opcjonalna, ponieważ SAP-AS nie jest sterylny. pH nie jest korygowane, ponieważ SAP ma silny efekt buforowania, a Paré i in. (2022)12 wykazali, że warunki na SAP były stosunkowo neutralne (6,7 do 7,4).
3. Przygotowanie SAP
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Hydrate SAP: zmieszać 5 g suchego SAP z 500 ml pożywki mMS-1 (krok 2.2).
- Pozostaw do nawodnienia na 12 godzin (przez noc) w temperaturze pokojowej (RT).
- Odcedź i zbierz uwodnione ziarna SAP.
- Gdy do napełnienia 12-dołkowej płytki używa się uwodnionego SAP (sekcja 7), nie należy spuszczać uwodnionego SAP i wymieszać uwodnione ziarno z resztkami pożywki mMS-1.
UWAGA: Dostępne są trzy granulometrie suchego SAP: mała, średnia i duża. Najbardziej odpowiednia jest średnia granulometria (1-2 mm). SAP o dużej granulometrii połyka zbyt dużo po uwodnieniu i pokrywy szalki Petriego nie można zamknąć, podczas gdy SAP o małej granulometrii pozostawia niewiele miejsca między nimi, co stanowi ograniczenie dla obserwacji struktury grzyba między ziarnami.
- Gdy do napełnienia 12-dołkowej płytki używa się uwodnionego SAP (sekcja 7), nie należy spuszczać uwodnionego SAP i wymieszać uwodnione ziarno z resztkami pożywki mMS-1.
4. Przygotowanie sadzonek
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Nasiona P. lanceolata wykiełkować na bibule zwilżonej pożywką mMS-1 na szalce Petriego.
- Inkubuj w ciemności w RT.
- Nawadniaj w razie potrzeby, aż korzonki osiągną co najmniej 2 cm długości.
5. Montaż i zarządzanie SAP-AS
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Montaż SAP-AS (krok 1 + krok 2 + krok 3 + krok 4)
- Umieść łodygę sadzonki w nacięciu z boku szalki Petriego z korzeniem do wewnątrz, a liścieniami/liśćmi i łodygami na zewnątrz.
- Przykryj korzenie około 1,5-2 g wermikulitu.
- Nawodnij komorę korzeniową 8 ml pożywki mMS-1. Pomoże to ustabilizować korzeń i wermikulit.
- Dodaj 5 g uwodnionego SAP wzdłuż membrany filtracyjnej z siatki nylonowej z boku komory korzeniowej.
- Dodaj 15 g uwodnionego SAP do przegródki na strzępki. Przegródka na strzępki to komora bez wycięcia z boku dna szalki Petriego.
- Przed zamknięciem szalki Petriego pokrywką upewnij się, że boczne nacięcia pokrywki i dno szalki Petriego są wyrównane tak, aby nie uszkodzić łodygi.
- Uszczelnij szalkę Petriego paskiem parafiny, który łączy podstawę i pokrywkę, uważając, aby nie zmiażdżyć młodej łodygi.
- Zważyć i zapisać średnią masę płytki Petriego w celu określenia, kiedy SAP-AS wymaga ponownego uwodnienia.
- Ułóż szalki Petriego w stos, aby zoptymalizować przestrzeń. Trzymaj szalkę Petriego w ciemności, używając nieprzezroczystej pokrywy z otworem z boku na sadzonki.
- Zarządzanie systemem SAP-AS.
- Nawadniać szalki Petriego wyłącznie roztworem odżywczym mMS-1.
- Użyj średniej wagi jako odniesienia. Gdy szalka Petriego zmniejszy się o 5-6 g, dodaj pożywkę mMS-1, aby przywrócić jej pierwotną wagę. Upewnij się, że wermikulit i SAP są uwodnione, ale nie zalane. Korzenie muszą mieć dostęp do tlenu.
- W miarę rozwoju sadzonki i jej grzybowego partnera nawadniaj je częściej. Nie jest konieczne podlewanie obu komór w tym samym czasie. Wymagania dotyczące nawadniania różnią się w zależności od rozwoju sadzonek, ale także w zależności od warunków środowiskowych, w których SAP-AS są inkubowane.
- Zmniejsz wymagania dotyczące nawadniania, usuwając stare liście, jeśli roślina ma więcej niż trzy zdrowe liście. Usuń martwe liście.
UWAGA: Obecność kationów, takich jak K+, Mg2+ i Ca2+ w pożywce mMS-1, ma tendencję do zmniejszania ekspansji sieci SAP network13 w czasie.
6. Inokulacja SAP-AS pojedynczym zarodnikiem
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Zaszczepić pojedynczym zarodnikiem.
- Podgrzej szklaną pipetę za pomocą płomienia świecy lub palnika Bunsena. Pociągnij, gdy szkło się topi, aby rozciągnąć szklaną rurkę, aż się oddzieli.
- Pod mikroskopem stereoskopowym rozbij końcówkę szklanej pipety, aby zmniejszyć średnicę wewnętrzną (zwykle 100-300 μm). To znacznie ułatwi manipulację pojedynczymi zarodnikami.
- Otwórz szalkę Petriego, zlokalizuj miejsce, w którym ma być umieszczony zarodnik i oczyść przestrzeń wśród 5 g uwodnionego SAP wzdłuż membrany filtracyjnej z nylonowej siatki, aby odsłonić część korzenia.
- Pod mikroskopem preparacyjnym podnieś zarodnik za pomocą wytłaczanej pipety. Odpipetować trochę płynu przed pipetowaniem zarodników. Unikać pipetowania cieczy po zebraniu zarodników.
- Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie umieść zarodnik na korzeniu. Płyn odpipetowany przed pipetowaniem zarodnika pomoże wydalić zarodnik. Jeśli zarodnik nie zostanie osadzony w optymalnym miejscu, użyj igły do akupunktury lub włosia szczotki, aby przywrócić zarodnik do kontaktu z korzeniem. Jeśli to konieczne, zrób zdjęcie zarodnika osadzonego na korzeniu w celach informacyjnych i użyj markera, aby zlokalizować miejsce zaszczepienia.
- Zastąp SAP na fragmencie korzenia, aby zapewnić wilgotne mikrośrodowisko dla korzenia i zarodników. Odczekaj co najmniej 24 godziny przed nawadnianiem komory korzeniowej i uważaj, aby nie zmyć zarodników z korzenia.
- Przed zamknięciem szalki Petriego pokrywką upewnij się, że boczne nacięcia pokrywki i spód szalki Petriego są wyrównane tak, aby nie uszkodzić łodygi sadzonki.
UWAGA: SAP-AS jest gotowy do zaszczepienia, gdy korzenie dotrą do membrany filtracyjnej z siatki nylonowej, najlepiej kilka dni po nawadnianiu, aby nie było wolnego płynu.
7. Kiełkowanie zarodników na SAP (opcjonalnie)
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Kiełkowanie zarodników.
- Zmiksuj uwodniony SAP, aby uzyskać gładką konsystencję (patrz krok 3.3.1). Pęcherzyki powietrza zwykle znikają w ciągu 24 godzin lub poprzez autoklawowanie (opcjonalnie) zmieszanego SAP.
- Używając strzykawki o pojemności 20 ml bez igły, odpipetować około 2 g (co odpowiada 2 ml) zmieszanego SAP do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
- Wybrać zarodnik pod mikroskopem preparacyjnym i użyć wytłaczanej pipety, jak opisano w rozdziale 6.
- Pod mikroskopem preparacyjnym umieść zarodnik na środku każdej studzienki.
- Inkubować 12-dołkową płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej i okresowo monitorować kiełkowanie.
- Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz zarodnik z rosnącą strzępką (o długości co najmniej kilku milimetrów).
- Dodaj 1 ml pożywki mMS-1 do dołka i odczekaj kilka minut, aż podłoże stanie się bardziej płynne.
- W razie potrzeby użyj igły do akupunktury, aby delikatnie usunąć zarodniki i strzępki z podłoża.
- Zbierz zarodnik za pomocą pipety lub przynosząc korzenie sadzonki na powierzchnię podłoża w celu przyklejenia zarodnika i strzępek do korzeni. Następnie umieść sadzonkę na szalce Petriego zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.
UWAGA: Koordynuj kiełkowanie zarodników i wzrost siewek. Ta metoda została przetestowana tylko na zarodnikach R. irregularis.
8. Monitorowanie rozwoju symbiozy na żywo
UWAGA: Materiały wymagane do tego kroku są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Rutynowo obserwuj za pomocą mikroskopu preparacyjnego, pionowego lub odwróconego.
- Obserwuj górną część każdej komory z prędkością 20x – 40x za pomocą mikroskopu preparacyjnego z białym oświetleniem i ciemnym polem.
- Jeśli mikroskop odwrócony nie jest dostępny, należy obserwować dno każdej komory za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub pionowego, odwracając szalkę Petriego. Przed odwróceniem szalki Petriego pozostaw SAP-AS do wyschnięcia przez 2 dni, tak aby SAP lekko przylegał do dna szalki Petriego.
- Wykonaj szczegółowe obserwacje 40x przez dno szalki Petriego i do 100x (zanurzenie w oleju) przez szkiełko nakrywkowe.
- Obserwuj zarodniki i sieci strzępek.
UWAGA: Struktury grzybowe rozwijające się wewnątrz ziaren SAP mogą być barwione.- Przygotuj roztwór atramentu i octu zgodnie z Vierheilig et al. (1998)15. Nie podgrzewać.
- Wyekstrahuj ziarno SAP zawierające strzępki i zarodniki i umieść je w atramencie w temperaturze pokojowej. Atrament wniknie w ziarno SAP i zabarwi strzępki i zarodniki w ciągu kilku minut.
- Usuń ziarno SAP i umieść je w pożywce mMS-1 lub wodzie z kranu. Atrament wyjdzie z ziarna w ciągu 12 godzin, ale zarodniki i strzępki pozostaną poplamione.
- Naciśnij ziarno SAP między dwoma szkiełkami mikroskopu, aby spłaszczyć je do fotografowania i liczenia zarodników.
- Obserwuj arbuskule.
- Wyodrębnij kilka korzeni z komory korzeniowej i zabejcuj za pomocą protokołu atramentu i octu zgodnie z Vierheilig et al. (1998)15. Uważaj, aby nie zanurzyć korzeni w roztworze KOH na dłużej niż 2-3 minuty; W przeciwnym razie korzenie staną się zbyt delikatne dla kolejnych kroków i rozpadną się na bezużyteczne gruzy.
- Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz fragment korzenia o długości około 5 mm, który może zawierać arbuskule i umieść go na szkiełku w kropli wody.
- Za pomocą igieł do akupunktury lub niezwykle cienkiej pęsety oderwij korzenie warstwami o grubości kilku komórek.
- Wchłonąć wodę i sprawdzić pod mikroskopem, czy segmenty z arbuskułami są nadal obecne i zadowalającej jakości oraz prawidłowo umieszczone na szkiełku. W tym momencie arbuskule muszą być dobrze widoczne w warstwach komórek korzeniowych.
- Pozostaw do wyschnięcia na 2-3 minuty, aby warstwy korzeniowe przylegały do szkiełka. Dodać kroplę buforu polialkoholowo-mlekowego glicerolu (PVLG) i dodać szkiełko nakrywkowe. Obserwuj standardowymi metodami mikroskopowymi.
Wyniki
SAP-AS to prosta i niedroga technika hodowli grzybów AM oraz obserwacji rozwoju wewnątrzkorzeniowych i zewnętrznych struktur grzybni. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół, który pomoże użytkownikom w przygotowaniu systemu SAP-AS, oraz wprowadzamy dwie modyfikacje w stosunku do oryginalnego opisu metody SAP-AS.
Po pierwsze, obecność SAP w przedziale korzeniowym wzdłuż membrany Nitex ułatwia inokulację systemu pojedynczą zarodnią (Rysunek 1).
Rysunek 1: Inokulacja pojedynczą zarodniką SAP-AS. (A) Inokulacja pojedynczą zarodniką Rhizophagus irregularis. (B) Inokulacja pojedynczą zarodniką Funneliformis mosseae. Białe strzałki wskazują miejsce inokulacji. Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Łatwo jest zidentyfikować obszar z kilkoma korzeniami, w którym można osadzić zarodnik. Dokładna lokalizacja zarodnika może zostać zaznaczona na powierzchni pokrywki szalki Petriego, a następnie okresowo sprawdzana pod kątem kiełkowania i kolonizacji korzeni. Obecność nawodnionych ziaren SAP zapewnia wilgotne środowisko sprzyjające kiełkowaniu zarodników. Inokulacja korzeni w sąsiedztwie membrany Nitex umożliwia szybki rozwój symbiozy, dzięki czemu grzybnia pozakorzeniowa może szybko dotrzeć do przedziału strzępkowego i pobierać składniki odżywcze (Rycina 2). Możliwość obserwacji, czy pojedynczy zarodnik umieszczony w punkcie inokulacji wykiełkował, pozwala również na identyfikację i usuwanie nieudanych kultur oraz ich zastępowanie.
Po drugie, szkiełka podstawowe na dnie szalki Petri umożliwiają obrazowanie na żywo o wysokiej rozdzielczości symbiozy grzybów AM (Rysunek 2B,C), a w szczególności przepływu cytoplazmy w obrębie grzybni zewnątrzkorzeniowej (Rysunek 2D).
Rysunek 2: Zaszczepiony SAP-AS. (A) SAP-AS zaszczepiony pojedynczym zarodnikiem Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). Rośliną żywicielską jest Plantago lanceolata. (B) Grupa zarodników obserwowana przez szkiełko przykrywowe w przedziale strzępek pod stereomikroskopem. Pasek skali: 500 µm. (C) Fotografia wysokiej rozdzielczości grupy zarodników obserwowana przez szkiełko przykrywowe pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x. Pasek skali: 100 µm (D) Fotografia wysokiej rozdzielczości strzępek obserwowana przez szkiełko przykrywowe pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100x. Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Użytkownicy mogą próbować kiełkować zarodniki grzybów AM na SAP nawodnionym pożywką mMS-1, aby zagwarantować, że SAP-AS są inokulowane wyłącznie żywotnymi zarodnikami (Rysunek 3). Jednakże metoda ta została przetestowana jedynie na komercyjnych zarodnikach R. irregularis, a sukces kiełkowania zarodników na SAP nawodnionym pożywką mMS-1 może znacznie różnić się w przypadku innych gatunków grzybów AM.
Rysunek 3: Kiełkowanie zarodników R. irregularis na płytce 12-dołkowej. Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wreszcie, ponieważ SAP-AS jest techniką in vivo, niesterylną metodą propagacji AMF, szalkę Petriego można manipulować na blacie i otwierać w celu pobrania próbek skolonizowanych korzeni, wolnych zarodników lub skolonizowanych ziaren SAP (Rycina 4). Grzybniowe struktury wewnątrzkorzeniowe i pozakorzeniowe można barwić w sposób analogiczny do AMF propagowanych w kulturach doniczkowych lub kulturach organów korzeniowych (Rycina 4C).
Rycina 4: Pozakorzeniowe i wewnątrzkorzeniowe struktury grzybów AM wyizolowane z SAP-AS. (A) Wolne zarodniki R. irregularis obserwowane w przedziale korzeniowym. Pasek skali: 200 µm. (B) Zarodniki R. irregularis barwione w SAP. Pasek skali: 500 µm. (C) Barwione fragmenty korzeni wykazujące wewnątrzkorzeniowe strzępki i arbuskule. Paski skali: 50 µm, 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Porównanie grubości różnych narzędzi dostępnych do manipulowania zarodnikami grzybów AM. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 2: Skumulowane SAP-AS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Inokulacja jest najbardziej krytycznym krokiem w protokole, a pipety Pasteura z ekstrudowanego szkła okazały się doskonałym narzędziem do dokładnego manipulowania pojedynczymi zarodnikami grzybów AM przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności. Pipety Pasteura z wytłaczanego szkła można łatwo kształtować za pomocą płomienia świecy lub palnika Bunsena, a otwór można regulować pod mikroskopem stereoskopowym, aby dopasować go do wielkości pipetowanych zarodników. Ważne jest, aby manipulować zarodnikami za pomocą narzędzi dostosowanych do wielkości zarodników grzyba AM (rysunek uzupełniający 1) i zaszczepiać SAP-AS, gdy korzenie rośliny żywicielskiej są wystarczająco długie, aby dotrzeć do błony Nitex, gdzie osadza się zarodnik.
SAP-AS można łatwo dostosować do wymagań eksperymentu. Większe szalki Petriego mogą być używane, z wieloma komorami, do monitorowania, na przykład, interakcji między blisko spokrewnionymi szczepami lub między różnymi gatunkami AMF lub do modyfikowania środowiska chemicznego (pH) lub biologicznego (wprowadzenie nicieni, bakterii, grzybów). Różne mikotroficzne rośliny żywicielskie mogą być również wykorzystywane do dostarczania grzybom AM fotosyntez. Pożywka mMS-1 została uzyskana z receptury minimalnej (M) pożywki opisanej przez Bécarda i Fortina (1988)15 pomniejszonej o sacharozę, witaminy i agar baktonowy w celu ograniczenia źródeł węgla. Jednak SAP-AS może być uzupełniany różnymi pożywkami, w zależności od celów eksperymentu.
Rozmnażanie grzybów AM w SAP-AS wymaga regularnego podlewania. Ograniczona ilość wermikulitu i SAP naraża korzenie i grzyby AM na wahania wilgotności, szczególnie w standardowych dwukomorowych szalkach Petriego (średnica 10 cm). Zdolność do ekspansji, a co za tym idzie, przezroczystość ziaren SAP zmniejsza się z czasem. W rzeczywistości obecność kationów z pożywki stopniowo ogranicza rozszerzanie się sieci akrylowej i wymaga wymiany SAP po kilku miesiącach. Ponadto zielone algi i pleśń mogą z czasem rosnąć, jeśli szalki Petriego nie są odpowiednio chronione przed światłem lub nadmiernie podlewane.
Do tej pory siedem gatunków grzybów AM zostało z powodzeniem wyhodowanych w SAP-AS, co jest znacznie poniżej liczby gatunków grzybów AM, które można rozmnażać w kulturach doniczkowych. Jednak zarówno warunki biotyczne, jak i abiotyczne w SAP-AS są bardzo podobne do tych w kulturach doniczkowych i jest prawdopodobne, że inne gatunki grzybów AM powinny być w stanie rozmnażać się w SAP-AS. Bezpośrednia inokulacja zarodników w SAP-AS prawdopodobnie zapewnia warunki środowiskowe bliższe warunkom ryzosfery w naturalnej glebie ze względu na obecność wysięków korzeniowych i/lub bakterii, jeśli do inokulacji używa się niesterylnych zarodników/nasion. Powinno to być preferowane zamiast inokulacji kiełkującymi zarodnikami. Ponadto warunki, które wywołują kiełkowanie zarodników w AMF, są nadal słabo poznane, dlatego SAP uwodniony pożywką mMS-1 może nie być przystosowany do kiełkowania zarodników innych gatunków grzybów AM. Kiełkowanie zarodników na SAP uwodnionym roztworem odżywczym mMS-1 zostało przetestowane w celu specyficznego wybrania żywotnych zarodników do etapu inokulacji przy użyciu wyłącznie inokulum R. irregularis .
Inokulacja i monitorowanie rozwoju symbiozy AM są łatwe do przeprowadzenia w SAP-AS. Zmodyfikowane dwukomorowe szalki Petriego pozwalają na hodowlę różnych gatunków grzybów AM. Paré i wsp.12 rozmnożyli siedem różnych gatunków AMF z sześciu rodzajów i trzech rodzin. Modyfikacja dwukomorowych szalek Petriego jest łatwa do wykonania za pomocą niedrogich narzędzi. Koszt i ilość materiałów (wermikulit, SAP, pipeta Pasteura itp.) oraz odczynników (mMS-1) wymaganych do przygotowania i konserwacji SAP-AS są ograniczone, co pozwala na zarządzanie dużą liczbą SAP-AS przy minimalnych kosztach. Możliwość układania w stos SAP-AS znacznie zmniejsza również ślad kultur grzybów AM w porównaniu z kulturami doniczkowymi. Na przykład 50 SAP-AS (5 stosów po dziesięć) może zmieścić się na półce o długości 1 m (rysunek uzupełniający 2). Te cechy sprawiają, że SAP-AS jest prostą i niedrogą techniką, która jest kompatybilna z nauczaniem symbiozy AM na kursach laboratoryjnych w szkołach średnich lub na poziomie licencjackim na uniwersytetach. Skolonizowane ziarna SAP mogą być używane do inokulacji nowych kultur SAP-AS lub kultur doniczkowych.
Obecność szkiełka nakrywkowego z tyłu dna szalki Petriego pozwala na fotografowanie i filmowanie w wysokiej rozdzielczości pozarodnikowych struktur grzybowych. Przepływ cytoplazmatyczny można łatwo badać w warunkach życia, które są bardzo zbliżone do warunków naturalnych. Ma to ogromne znaczenie dla badań funkcji grzybów AM związanych z ich grzybnią (składniki odżywcze, transport wody, struktura gleby itp.) oraz dla badań morfogenezy strzępek.
AMF kończą swój cykl biologiczny w korzeniach roślin i w ryzosferze. Badanie mikroorganizmów glebowych jest skomplikowane ze względu na nieodłączną trudność w obserwacji środowiska glebowego. Głównym celem SAP-AS jest odtworzenie środowiska jak najbardziej zbliżonego do ryzosfery do rozmnażania się grzybów AM przy jednoczesnym zachowaniu możliwości bardzo szczegółowej obserwacji rozwoju grzybów AM. Ponieważ oznacza to warunki niesterylne, ilość dostępnego węgla powinna być ograniczona, aby uniknąć namnażania się mikroorganizmów saprotroficznych. Wiedza na temat zachowania grzybów AM w ryzosferze jest nadal bardzo ograniczona, a SAP-AS oferuje możliwość dokonywania szczegółowych porównań między gatunkami pod względem ich zdolności do żerowania w środowisku pozarodnikowym, produkcji zarodników i kolonizacji korzeni. Można to dodatkowo skomplikować poprzez dodanie interakcji z innymi gatunkami gleby, takimi jak bakterie, nicienie, protisty i patogeny grzybów korzeniowych, a dzięki SAP-AS można poszerzyć wiedzę na temat interakcji mikrobioty glebowej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dwóm anonimowym recenzentom za ich sugestie. Finansowanie tych badań zostało zapewnione przez Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) w ramach projektu J-002295 (Zarządzanie i ulepszanie kolekcji biologicznych AAFC).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 x 15 mm Dwupłytkowa | płytka Kord Valmark | 1204U09 | https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate |
| 12-dołkowa | Greiner Bio-one | 665180 | https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html |
| 18 mm okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-545-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100 |
| 20 mL Strzykawka PP/PE bez igły | Millipore Sigma | Z683620-100EA | https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= CPC& utm_campaign=20674735406 & utm_content=157607444391& gc pokrywka=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB |
| Igła do akupunktury | Lierre | A143-LP1-3075 | https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs? _source=1& gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-igły& utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 & utm_medium=CPC& utm_source= google& variant=35001500991622 |
| Bibuła | FLINN | FB0678 | https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/ |
| Blender komercyjny lub naukowy lub ręczny blender kuchenny | kitchenaid | KHBV53DG | https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html |
| Wiertło do rzeźbienia Dremel 199 | Dremel | 2615000199 | https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199 |
| Dry SAP o średniej granulacji 1– Ostrza | 2 mm HORTA-SORB MD | https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/ | |
| Feather do rękojeści noży preparacyjnych | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b Szklane pipety Pasteura 230 mm | Kimble | RK-25554-14 | |
| https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414 Ink | Sheaffer | 94321 | https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU |
| Przewodnik po topieniu: zmodyfikowana farba Skrobak, 2-calowy | Mastercraft | #049-7335-8 | https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp |
| Szkiełko mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-552-5 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525 |
| Siatka filtracyjna z nylonu Nitex | Dynamic Aqua-Supply Sp. z o.o. | NTX30-108 | https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731 |
| Spinacz do papieru | Makanu | Clips-BK-41mm-24 | https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes |
| Parafilm | Avantor/vwr | 470201-930 | https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm |
| Nasiona babki lancetowatej | ecoumene | NA | https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/ |
| Alkohol poliwinylowy-kwas mlekowy-glicerol (PVLG). | NA | NA | https://invam.ku.edu/recipes |
| Zestaw do pirografii z cienką końcówką | Orzech Hollow | 483103 | https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool |
| Uszczelniacz silikonowy | Aqueon | 100165003 | https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant |
| Rękojeść skalpela chirurga | Fisher Scientific | 22-079657 | https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel |
| Zestaw narzędzi obrotowych dwubiegowych | Dremel | 200-1/21 | https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah |
| Vermiculite | PRO-MIX | 4981110 | https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html |
| X1000 Okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm #1 (0.13– 0,16 mm) | Fisher Scientific | 12164692 | https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692 |
Bibliografia
- Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert. Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).
- Redecker, D. Glomalean fungi from the ordovician. Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).
- Olsson, P. A., Jakobsen, I., Wallander, H. Foraging and Resource Allocation Strategies of Mycorrhizal Fungi in a Patchy Environment. Mycorrhizal Ecology. Ecological Studies. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2003).
- Zheng, C., Chai, M., Jiang, S., Zhang, S., Christie, P., Zhang, J. Foraging capability of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to soil phosphorus patches and evidence of carry-over effect on new host plant. Plant Soil. 387 (1-2), 201-217 (2015).
- Singh, A. K., et al. The role of glomalin in mitigation of multiple soil degradation problems. Crit Rev Environ Sci Technol. 52 (9), 1604-1638 (2022).
- Wilson, G. W. T., Rice, C. W., Rillig, M. C., Springer, A., Hartnett, D. C. Soil aggregation and carbon sequestration are tightly correlated with the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi: results from long-term field experiments. Ecol Lett. 12 (5), 452-461 (2009).
- Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, M. -N., van Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. Agroecology: the key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Stürmer, S. L. A history of the taxonomy and systematics of arbuscular mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza. 22 (4), 247-258 (2012).
- Gerdemann, J. W., Nicolson, T. H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans Br Mycol Soc. 46 (2), 235-244 (1963).
- Walker, C., Vestberg, M. A simple and inexpensive method for producing and maintaining closed pot cultures of arbuscular mycorrhizal fungi. Agr Sci Finland. 3, 233-240 (1994).
- Fortin, J. A., et al. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot. 80 (1), 1-20 (2002).
- Paré, L., Banchini, C., Hamel, C., Bernier, L., Stefani, F. A simple and low-cost technique to initiate single-spore cultures of arbuscular mycorrhizal fungi using a superabsorbent polymer. Symbiosis. 88, 61-73 (2022).
- Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review. Soil Tillage Res. 204, 104736(2020).
- Bécard, G., Fortin, J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).
- Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).
Przedruki i uprawnienia
