Artykuł metodologiczny

Metoda oparta na ekstrakcji apoplastów w celu poprawy czystości rekombinowanego białka wytwarzanego przez rośliny

DOI:

10.3791/66852

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie białek rekombinowanych z systemów roślinnych jest zwykle kwestionowane przez białka roślinne. Praca ta zapewnia metodę skutecznej ekstrakcji i oczyszczania wydzielanego rekombinowanego białka z apoplastu Nicotiana benthamiana.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny to nowo rozwijający się system ekspresji eukariotycznej, który jest badany do produkcji białek terapeutycznych. Oczyszczanie rekombinowanych białek z roślin jest jednym z najbardziej krytycznych etapów procesu produkcyjnego. Zazwyczaj białka były oczyszczane z całkowitych rozpuszczalnych białek (TSP), a obecność różnych białek wewnątrzkomórkowych i cytochromów stanowi wyzwanie dla kolejnych etapów oczyszczania białek. Co więcej, większość białek terapeutycznych, takich jak antygeny i przeciwciała, jest wydzielana w celu uzyskania prawidłowej glikozylacji, a obecność niecałkowicie zmodyfikowanych białek prowadzi do niespójnych struktur antygenów lub przeciwciał. Praca ta wprowadza bardziej efektywną metodę otrzymywania wysoce oczyszczonych białek rekombinowanych z roślinnej przestrzeni apoplastycznej. Rekombinowane białko zielonej fluorescencji (GFP) jest modyfikowane w taki sposób, aby było wydzielane do apoplastu Nicotiana benthamiana, a następnie ekstrahowane metodą infiltracji i wirowania. GFP-His z wyekstrahowanego apoplastu jest następnie oczyszczany metodą chromatografii powinowactwa niklu. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod stosowanych przez TSP, oczyszczanie z apoplastu daje wysoce oczyszczone białka rekombinowane. Stanowi to istotne ulepszenie technologiczne dla systemów produkcji roślinnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie badane są różne rekombinowane białka terapeutyczne produkowane przez rośliny, w tym przeciwciała, szczepionki, białka bioaktywne, enzymy i małe polipeptydy1,2,3,4,5,6. Rośliny stają się coraz częściej wykorzystywaną platformą do produkcji białek terapeutycznych ze względu na ich bezpieczeństwo, niski koszt i zdolność do szybkiego skalowania produkcji7,8. Ekspresja i modyfikacja białek w systemach roślinnych, wraz z oczyszczaniem białek, są krytycznymi czynnikami decydującymi o produktywności bioreaktorów roślinnych9,10. Zwiększenie produktywności roślin i uzyskanie docelowych białek o wysokiej czystości to główne wyzwania stojące przed systemami produkcji roślinnej11,12.

Subkomórkowa lokalizacja i modyfikacja rekombinowanych białek zależy od specyficznego peptydu sygnałowego kodowanego na N-końcu, który kieruje białko do jego końcowego miejsca przeznaczenia organelli podczas ekspresji genu. Białka rekombinowane są zaprojektowane tak, aby lokalizować się w apoplastach, retikulum endoplazmatycznym (ER), chloroplastach, wakuoli lub cytoplazmie, w oparciu o ich unikalne właściwości13. W przypadku antygenów i przeciwciał preferowane są białka wydzielane. Przed wydzieleniem białka przechodzą przez ER i Golgiego w celu prawidłowego fałdowania i modyfikacji potranslacyjnych14,15,16.

Po produkcji w roślinach, rekombinowane białka muszą zostać oczyszczone z ekstraktów roślinnych. Zazwyczaj białka są oczyszczane z całkowicie rozpuszczalnych ekstraktów roślinnych, które zawierają obfite białka wewnątrzkomórkowe, nieprawidłowo sfałdowane i niezmodyfikowane produkty oraz cytochromy17. W celu usunięcia zanieczyszczeń ekstrakty roślinne poddawane są intensywnemu frakcjonowaniu, w tym chromatografii powinowactwa specyficznej dla karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBisCO), wytrącaniu fitynianów, wytrącaniu glikolu polietylenowego oraz regulacji temperatury i pH18,19. Takie etapy usuwania zanieczyszczeń są pracochłonne i mogą pogorszyć jakość białka.

Przedział komórki roślinnej poza błoną plazmatyczną jest zdefiniowany jako apoplast, obejmujący ścianę komórkową, przestrzenie międzykomórkowe i ksylem20. Faza wodna jest potocznie nazywana płynem do płukania apoplastów (AWF). AWF zawiera cząsteczki wydzielane przez komórki w celu regulowania licznych postępów biologicznych, takich jak transport, metabolizm ściany komórkowej i reakcje na stres21,22. W przeciwieństwie do TSP, składniki molekularne AWF są mniej złożone. Ekstrakcja rekombinowanych białek z AWF może uniknąć zanieczyszczenia białkami wewnątrzkomórkowymi, nieprawidłowo sfałdowanymi produktami i pozostałościami cytoplazmatycznymi. Krótko mówiąc, lipid ekstrakcyjny dostaje się do liści przez aparaty szparkowe pod podciśnieniem, a AWF jest zbierany przez delikatne wirowanie23. Podczas gdy izolacja AWF jest szeroko stosowana do badania postępu biologicznego wewnątrz apoplast24,25,26,27, nie była ona wykorzystywana w systemach produkcji opartej na roślinach.

Poprawa produktywności roślin i uzyskanie docelowych białek o wysokiej czystości to główne wyzwania dla systemów produkcji roślinnej28. Zazwyczaj białka są oczyszczane z całkowicie rozpuszczalnych ekstraktów roślinnych zawierających duże ilości białek wewnątrzkomórkowych, nieprawidłowo sfałdowanych i niezmodyfikowanych produktów oraz cytochromów29, co wymaga dużych kosztów późniejszego oczyszczania30. Zastosowanie metod ekstrakcji białek AWF do ekstrakcji egzogennych białek rekombinowanych wydzielanych do apoplastu może skutecznie poprawić jednorodność rekombinowanych białek i obniżyć koszty oczyszczania białek. Tutaj używamy peptydu sygnałowego PR1a, aby umożliwić wydzielanie białka egzogennego do przestrzeni apoplastowej i wprowadzić szczegółową metodę oczyszczania białka rekombinowanego z AWF N. benthamiana.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roślin N. benthamiana

  1. Umieść bloki sadzonek na tacy, dodaj 1 l wody i moczyć przez około 2 godziny, aż do całkowitego nasycenia.
  2. Równomiernie rozsyp nasiona N. benthamiana typu dzikiego na blokach sadzonek, przykryj pokrywką i kiełkuj przez 1 tydzień. Uprawiaj N. benthamiana w szklarni z 18-godzinnym fotoperiodem, 24 °C, 45% wilgotnością względną i nawozić co 2 tygodnie.
  3. Gdy nasiona wykiełkują, użyj pęsety, aby delikatnie usunąć sadzonkę, uważając, aby nie uszkodzić jej korzeni. Wykop mały dół na środku nowej tacy, umieść w nim sadzonkę i lekko przykryj korzenie ziemią. Przykryj pokrywką i kontynuuj wzrost.
  4. Rosnąć, aż sadzonki będą miały trzy liście, z założoną pokrywką. Zdejmij pokrywkę, gdy pojawi się4-ty prawdziwy liść.
  5. Pozwól roślinom kontynuować wzrost jeszcze przez dwa tygodnie przed agroinfiltracją.

2. Budowa rekombinowanego GFP-His

  1. Przeprowadzić optymalizację i syntezę kodonów N. benthamiana GFP i PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) w oparciu o sekwencje genów.
  2. Przeprowadzić podwójne roztwarzanie wektora pCAMBIA1300 przy użyciu enzymów Xba I i Sac I (patrz tabela materiałów).
  3. Przeprowadzić amplifikację PR1a za pomocą starterów upstream (TTGGAGAGAACACGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) i startery końcowe (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), amplifikacja GFP za pomocą starterów upstream (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGGGGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) i startery (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Stosując rekombinację homologiczną, sklonuj PR1a i GFP do wektora ekspresji roślinnej pCAMBIA1300. Po przeniesieniu do E. coli należy wybrać pojedyncze klony i wysłać je do firmy w celu sekwencjonowania. Porównanie wyników sekwencjonowania i właściwego plazmidu to rekombinowany plazmid pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, określany jako p35s-PR1a-GFP-His.

3. Produkcja GFP-His w N. benthamiana

  1. Dodać 1 μl plazmidu GFP do 50 μl komórek receptorowych Agrobacterium GV3101, delikatnie wymieszać i dodać do miseczki elektrody, usunąć po porażeniu prądem na elektrowstrząsaczu.
  2. Rozprzestrzenianie się transformowane Agrobacterium tumefaciens na stałej pożywce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny (Kan) i 50 μg/ml ryfampicyny (Rif). Inkubować odwróconą w temperaturze 28 °C przez 48 godzin. Wektor pCAMBIA1300 jest odporny na kan, a Agrobacterium jest odporny na rif; tylko prawidłowe Agrobacterium może rosnąć na płytkach z kan i rif. Klonami monoklonalnymi były dodatnie transformanty o nazwie A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Użyj wysterylizowanej wykałaczki, aby pobrać odpowiednią ilość AtGPG i zaszczepić ją w 4 ml płynnego LB z Kan i Rif. Hodowla w temperaturze 28 °C, 220-300 obr./min przez 24 godziny.
  4. Subkultura bakterii 1:50 do świeżego LB (50 μg/ml Kan, 10 mM kwasu 2-(N-Morfolino) etanosulfonowego (MES), 20 μM acetosyringonu (AS)) i inkubować w temperaturze 28 °C, 220-300 obr./min przez 10-12 godzin.
  5. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 1500 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad z 1 ml MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).
  6. Zmierz i dostosuj gęstość optyczną (OD) AtGPG do OD600=0.8 za pomocą MMA. Inkubuj bakterie przez kolejne 2-4 godziny w temperaturze pokojowej. Pobrać roztwór bakteryjny za pomocą strzykawki bez igły, lekko docisnąć go do tylnej części liści i mocno docisnąć, aby wniknął roztwór do liści. Wstrzyknij tylko środkowe 3-4 liście na roślinę.
  7. Kontynuuj uprawę N. benthamiana w szklarni przez 3-4 dni przed zbraniem liści w celu ekstrakcji białka.

4. Obserwacja subkomórkowej lokalizacji GFP

  1. Po 48 godzinach agroinfiltracji wybierz płaski liść i użyj dziurkacza o średnicy 6 mm, aby zacisnąć ostrze do przebijania.
  2. Wlej 30% roztwór sacharozy na szkiełko podstawowe, umieść próbkę liści tyłem do góry i przykryj ją szkłem nakrywkowym.
  3. Ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nm i wykryj zieloną fluorescencję przy 490-550 nm po powiększeniu 400x. Pierwsze zdjęcie zrób po przygotowaniu zjeżdżalni, a kolejne 10 minut później.

5. Ekstrakcja GFP z roślin

  1. Ekstrakcja AWF
    1. Zebrać nienaruszone świeże liście N. benthamiana wykazujące ekspresję rekombinowanego GFP po 3 dniach od agroinfiltracji. Delikatnie traktuj liść i utrzymuj integralność liścia, aby uniknąć wewnątrzkomórkowego wypływu białka. Zebrane liście należy natychmiast wykorzystać do następnego kroku, aby uniknąć degradacji białka.
    2. Opłucz blaszkę liściową wstępnie schłodzonym wysterylizowanym ddH2O, aby usunąć zanieczyszczenia.
    3. Zważyć świeże liście i zanurzyć 20 g liści (stroną odbytową do dołu) w 100 ml wstępnie schłodzonego 100 mM buforu fosforanowego (PB 100 mM Na2HPO4 i 100 mM NaH2PO4 zostały oddzielnie skonfigurowane i zmieszane w stosunku 2,2:1 pH 7,0) w zlewce o pojemności 200 ml. Przykryj liście przędzą nylonową o drobnych oczkach o oczkach 100 (patrz Tabela materiałów) i plastikową płytką.
      UWAGA: Wstępne chłodzenie zapobiega degradacji białek. Objętości można regulować w oparciu o skalę eksperymentalną. Upewnij się, że wszystkie liście są zanurzone.
    4. Umieść zlewkę w pompie próżniowej. Zastosuj podciśnienie 0,8 MPa przez 1 minutę, a następnie szybko przywróć ciśnienie atmosferyczne.
    5. Usuń liście z bufora i delikatnie osusz chłonnym papierem. Zwiń liście, owiń przędzą siatkową i umieść 5 g liści w każdej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Aby zebrać AWF, umieść zwinięte liście czubkiem do góry w tubach z przędzą siatkową przymocowaną za pomocą nasadek rury.
    6. Wirować w temperaturze 4 °C, 500 x g przez 5 min. Usunąć liście i zebrać AWF na dnie probówki za pomocą pipety. Z każdej probówki można uzyskać około 5 ml AWF.
      UWAGA: W celu zminimalizowania interferencji ze strony białek wewnątrzkomórkowych i ekstrakcji maksymalnej ilości białek AWF, ekstrakcję można powtórzyć 2x-3x, ale nie więcej niż 3x.
  2. Całkowita ekstrakcja białka rozpuszczalnego
    1. Zmiel 20 g liści na drobny proszek w ciekłym azocie. Dodać bufor ekstrakcyjny (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% Triton X-100, 0,034% β-merkaptoetanolu (patrz tabela materiałów)) w stosunku 1: 2.
    2. Wstrząsać homogenatem w mieszalniku pionowym przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odwirowywać homogenat w temperaturze 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki i powtarzać wirowanie przez 15 minut. Przenieść oczyszczony supernatant do innej probówki.
    4. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm (patrz tabela materiałów), aby uzyskać całkowity rozpuszczalny ekstrakt białkowy.

6. Oczyszczanie GFP-His za pomocą chromatografii powinowactwa niklu (Ni)

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C.

  1. Dodać żywicę Excel sefarozy Ni (patrz tabela materiałów) do probówki w stosunku 1:1000 w stosunku do objętości ekstraktu białkowego z kroku 5.1.6. Objętość żywicy równa się 1/1000 objętości ekstraktu białkowego.
  2. Żywicę Ni przemyć 3x oddzielnie z 10-krotną objętością żywicyddH2O i PB (pH 7,0) i usunąć supernatant.
  3. Inkubować ekstrakt białkowy z żywicą Ni przez 2 godziny, aby umożliwić pełne wiązanie. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w celu usunięcia niezwiązanych białek z supernatantu. Umyć 3x z 20x objętością żywicy PB. Wirować przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  4. Elute GFP-His przez dodanie 10x objętości żywicy 250 mM imidazolu (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 250 mM imidazolu) i zebrać supernatant.

7. Niebieskie barwienie białek Coomassie

  1. Do 40 μl próbek białka dodać 10 μl buforu ładującego 5x SDS, gotować przez 10 minut, a następnie uruchomić na 15% SDS-PAGE przy 110 V przez 60 minut.
  2. Żele białkowe barwić roztworem Coomassie blue (0,1% R-250, 25% izopropanol, 10% lodowaty kwas octowy) przez 2 godziny.
  3. Odlej roztwór i myj roztworem odbarwiającym przez 2 godziny. Obserwuj żel; białka na żelu będą pokolorowane na niebiesko.

8. Western blotting białek

  1. Do 40 μl próbek białka dodać 10 μl buforu ładującego 5x SDS, gotować przez 10 minut, a następnie uruchomić na 15% SDS-PAGE przy 110 V przez 60 minut.
  2. Przenieś białka do membrany nitrocelulozowej o wielkości 0,45 μm w temperaturze 280 mA. Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem na 1 godzinę.
  3. Rozcieńczyć przeciwciała anty-His-tag w stosunku 1:5000 i inkubować błonę z przeciwciałami przez 1 godzinę. Użyj tris-buforowanego soli fizjologicznej i tween 20 (TBST), aby przemyć membranę 4x przez 5 minut.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała anty-mysie w stosunku 1:10000 i inkubować błonę z przeciwciałami przez 1 godzinę. Użyć TBST do przemycia membrany 4x przez 5 min.
  5. Wymieszaj wywoływacz (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1. Dodać 400 μl do membrany i pozostawić do reakcji na 1 minutę. Rób zdjęcia po 1 minutach naświetlania za pomocą wizualizatora.

9. Oznaczanie stężenia białka

  1. Dodaj 5 μl białka do 1 ml odczynnika barwnikowego Bradford 1x i reaguj przez 5 minut.
  2. Określić wartość OD595 po wyzerowaniu i obliczyć stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej.

10. Kwantyfikacja białka 31

  1. Wykonaj Western blot próbek białek wraz z wzorcami.
  2. Przeprowadzić kwantyfikację GFP według stosunku do wzorców przy użyciu analizy skali szarości ImageJ 1.5.0.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP-His jest przeznaczony do wydzielania do przestrzeni apoplastycznej N. benthamiana
GFP sklonowano do plazmidu pCAMBIA1300 z N-końcowym peptydem sygnałowym PR1a do wydzielania i C-końcowym znacznikiem His do oczyszczania, generując p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). Rekombinowane białko uległo przejściowej ekspresji w N. benthamiana, a pasmo 30 kDa wykryto za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała anty-His po 3 dniach od agroinfiltracji (Figura 1B). Plazmoliza to obróbka liści przy użyciu roztworu hipertonicznego w celu oddzielenia ściany komórkowej od błony komórkowej32. Aby ustalić, czy GFP znajduje się w apoplastach, użyliśmy 30% sacharozy do plazmolizy liści. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała obecność GFP-His w apoplaście (Rysunek 1C). Białka AWF ekstrahowane metodą infiltracji próżniowej-wirowania zawierały również GFP-His (Rysunek 1D). Wyniki te wskazują na wydzielanie GFP-His do AWF liści N. benthamiana, z których można go wyekstrahować w celu dalszego oczyszczania.

Oczyszczanie białka z AWF
Skuteczność ekstrakcji AWF ma duży wpływ na końcowy plon GFP. Opierając się na opublikowanych protokołach ekstrakcji AWF24,25,26,27, przetestowaliśmy różne rozwiązania optymalizujące odzyskiwanie wydzielanych GFP-His. Zbadano tu osiem roztworów ekstrakcyjnych: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,1), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) i ddH2O (pH 7,0). PB wyekstrahował największą ilość AWF i GFP-His, wyprzedzając inne rozwiązania ponad 4-krotnie (Rysunek 2A,B). Porównanie PB przy zmiennym pH wykazało poprawę ekstrakcji AWF i GFP-His w warunkach obojętnych do łagodnie zasadowych (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 i 8,0; Rysunek 2C,D). Dodatkowo porównano PB o stężeniach 50 mM, 100 mM i 150 mM pod kątem skuteczności ekstrakcji. Wyniki wykazały, że 100 mM PB wykazało maksymalną skuteczność w odzyskiwaniu zarówno AWF, jak i GFP-His (Rysunek 2E,F).

Na podstawie tych eksperymentów optymalizacyjnych, 100 mM PB, pH 7.0, zostało wybrane do ekstrakcji AWF na dużą skalę z N. benthamiana. Korzystając z tego buforu, z apoplastu odzyskano 495 μg całkowitych białek AWF na gram świeżego materiału liściowego (Rysunek 2G). Wyekstrahowany AWF zawierał 10 μg GFP-His (Rysunek 2H)), co odpowiadało około 18% całkowitego GFP-His w TSP (Rysunek 2I). Po chromatografii powinowactwa Ni, czystość GFP-His osiągnęła 84,3% z ekstrakcji AWF, znacznie wyższą niż czystość 44,9% osiągniętą przez ekstrakcję całkowitego rozpuszczalnego białka (Rysunek 2J).

figure-results-1
Rysunek 1: GFP-His jest przeznaczony do wydzielania do apoplastu N. benthamiana. (A) Schemat konstrukcji PR1a-GFP-His w wektorze ekspresji roślinnej pCAMBIA1300. (B) Western blot wykrywający produkcję GFP-His u u N. benthamiana. Tutaj załadowano i wykryto 10 μl próbek białka. Liście N. benthamiana jednocześnie wstrzyknięte MMA zastosowano jako kontrolę negatywną. Ta sama objętość próbek została zbadana i wybarwiona przy użyciu dużych podjednostek roślinnych jako kontrola obciążenia (C) Mikroskopia konfokalna pokazująca subkomórkową lokalizację GFP-His (zielony). Liście N. benthamiana zplazmolizowano 30% sacharozą. Białe przerywane linie wskazują błonę plazmatyczną. Czerwone strzałki oznaczają nagromadzenie GFP-His w apoplastach. (D) Western blot wykazujący obecność GFP-His w wyekstrahowanym płynie apoplastycznym. Tutaj załadowano i wykryto 10 μl próbek białka. Liście N. benthamiana jednocześnie wstrzyknięte MMA zastosowano jako kontrolę negatywną. Skróty: 35s = 2x promotor wirusa mozaiki kalafiora 35s; PR1a = peptyd sygnałowy białka 1a związany z patogenezą tytoniu; Jego = 6x Jego tag; Nos = terminator syntazy nopaliny. BS = przed plazmolizą; PS = po plazmolizie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja metody ekstrakcji białek z AWF. (A-B) Ekstrakcja białek z AWF przy użyciu różnych. Do ekstrakcji białek z AWF przetestowano osiem roztworów: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,0), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) i ddH2O (pH 7,0). Skuteczność ekstrakcji analizowano za pomocą SDS-PAGE (A), a GFP-His wykryto za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała anty-His (B). (C-D) Ekstrakcja przy użyciu PB przy różnych wartościach pH. PB o pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 i 8,0 użyto do ekstrakcji z AWF. Skuteczność ekstrakcji wykryto za pomocą SDS-Page (C), a GFP-His wykryto za pomocą western blot z przeciwciałem anty-His (D). (E-F) Ekstrakcja przy użyciu PB w różnych stężeniach. PB przy 50 mM, 100 mM i 150 mM użyto do ekstrakcji z AWF. Skuteczność ekstrakcji analizowano za pomocą SDS-Page (E), a GFP-His wykryto za pomocą western blot z przeciwciałem anty-His (F). (G-H) Analiza ilościowa wyekstrahowanych białek. Białka ekstrahowano przy użyciu 100 mM PB (pH 7,0). Całkowite rozpuszczalne białko (G) i GFP-His (H) oznaczono ilościowo do analizy statystycznej. (I) Analiza statystyczna proporcji GFP AWF do GFP całkowitej. (J) Oczyszczanie GFP-His z całkowitych rozpuszczalnych białek N. benthamiana lub AWF. Białka ekstrahowano przy użyciu 100 mM PB (pH 7,0), a GFP-His oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni. Oczyszczanie analizowano za pomocą SDS-PAGE. Skrajny prawy pas ruchu to standard BSA 1 μg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie roślin do produkcji białek terapeutycznych szybko się rozszerzyło w ostatnich latach 1,2,3,4,5,6. Geny kodujące białka są klonowane do wektorów ekspresyjnych i dostarczane do tkanek roślinnych poprzez agroinfiltrację. Po wyprodukowaniu przez komórki roślinne białka są oczyszczane do dalszych zastosowań. Zazwyczaj białka rekombinowane są oczyszczane z ekstraktów TSP. Jednak obfite białka roślinne i cytochromy uwalniane z komórek roślinnych podczas ekstrakcji mogą utrudniać oczyszczanie33. Z jednej strony cytochromy roślinne mogą zatykać kolumny separacyjne, spowalniając przetwarzanie17; z drugiej strony, białka występujące w dużych ilościach, takie jak RuBisCO, są trudne do usunięcia, co zmniejsza czystość 18,19. Problemy te stają się bardziej problematyczne, gdy docelowe białka ulegają ekspresji na niskich poziomach. Oczyszczanie z AWF omija te problemy, umożliwiając wyższą czystość (rysunek 2J).

Chociaż ekstrakcja AWF jest szeroko stosowana w biologii roślin 24,25,26,27, rzadko jest wykorzystywana w rurociągach rolnictwa molekularnego. W tym przypadku używamy roślinnego modelu GFP, aby zademonstrować oczyszczanie białek na podstawie AWF. Ekstrakcję GFP z AWF przeprowadzono poprzez dodanie peptydu sygnałowego, aby umożliwić wydzielanie GFP do przestrzeni apoplastowej. Metoda ta pozwala na ekstrakcję białek o wyższej jednorodności i obniża koszty dalszego przetwarzania białek. Kilka kwestii zasługuje na przeprowadzenie przyszłych badań w celu wdrożenia oczyszczania AWF w bioreaktorach roślinnych. Po pierwsze, efektywne wydzielanie wymaga fuzji specyficznych N-końcowych peptydów sygnałowych. Po drugie, aby zachować jakość AWF, nienaruszone liście muszą być przetwarzane szybko po zbiorach bez zamrażania, co uwalnia zawartość wewnątrzkomórkową. Po trzecie, PB skutecznie ekstrahuje białka AWF34, ale pH buforu i stężenie soli powinny być dostosowane do poszczególnych białek rekombinowanych (ryc. 2C-D). Po czwarte, uzyskaliśmy oczyszczone białko z 200 g N. benthamiana wielokrotnie w warunkach laboratoryjnych o stabilnej czystości i wydajności. Aby można je było zwiększyć do użytku w fabryce, potrzebne są większe zbiorniki i pompy próżniowe oraz bardziej efektywna metoda oczyszczania, a warunki takie jak czas trwania próżni, liczba odzysku itp. mogą wymagać optymalizacji.

Metoda ta jest ograniczona przez fakt, że białka egzogenne są wydzielane do AWF, a białka wewnątrz błony plazmatycznej są opuszczone (ryc. 2H-I). Przynosi to korzyść w postaci uzyskania wyżej oczyszczonych białek przy prawidłowej modyfikacji, ale przy wyższym koszcie wydajności. Głównym technicznym wąskim gardłem dla oczyszczania opartego na AWF jest poprawa docelowego poziomu białka wewnątrz AWF. Połączenie z silnymi promotorami i zoptymalizowanymi systemami wydzielania poprawi platformy ekspresji roślin, zapewniając zarówno wysoką czystość, jak i większe plony. Aby przezwyciężyć to wąskie gardło, w przyszłych pracach wymaga się wyższego systemu produkcji i bardziej efektywnego systemu wydzielania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży CAS (2021084) oraz Fundusz Wsparcia Kluczowych Projektów Wdrożeniowych Trzyletniego Planu Działania Instytutu Mikrobiologii Chińskiej Akademii Nauk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przędza nylonowa o drobnych oczkach 100Guangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2Do ekstrakcji białka AWF
50 ml probówek wirówkowychVazymeTCF00150Do wirówki
ClonExpress II jednoetapowy zestaw do klonowaniaVazymeC112-02Do klonu
FastDigest Sac1NEBR3156SDo klonu
FastDigest XbaINEBFD0685Do klonu
ImageJ 1.5.0//Doanalizy w skali szarości
Duży filtrThermo FisherNESTDo filtrowania
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalnaLeica SP8Do lokalizacji subkomórkowej
Sefaroza Ni excelCytiva10339806Do oczyszczania białek
Prefabrykat białkowy plus żelYEASEN36246ES10Dla SDS-PAGE
Mały filtrNalgene1660045Do filtrowania
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit
Triton X-100SCR30188928Aby skonfigurować bufor ekstrakcyjny
Typ rotaryvang pompapróżniowa Zhejiang taizhouqiujing pompa próżniowa spółka z ograniczoną odpowiedzialnością2XZ-2Do infiltracji próżniowej
Mieszalnik pionowyHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing spółka z ograniczoną odpowiedzialnościąBE-1200Do mieszania
i beta;-merkaptoetanoluSIGMABCBK8223VAby skonfigurować bufor ekstrakcyjny
Thermo Fisher 34076 Do western blotting

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995(2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953(2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5(2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815(2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249(2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048(2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363(2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113(2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806(2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48(2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ek rekombinowanychro linny system ekspresjiNicotiana benthamianainfiltracja pr niowachromatografia powinowactwazielone bia ko fluorescencyjnep yn do p ukania apoplastycznegosekrecja bia ekWestern blot

Powiązane artykuły