Ten protokół dostarcza techniki do zbierania i hodowli eksplantowanego zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od dorosłych szczurów Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC).
Artykuł metodologiczny
Zbieranie, osadzanie i hodowla zwojów korzeni grzbietowych w urządzeniach wielokompartmentowych w celu zbadania cech neuronów obwodowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Najczęstszą cechą bólu w neuronach obwodowych jest obniżony próg stymulacji lub nadwrażliwość nerwów końcowych z grzbietowego zwoju korzenia (DRG). Jedna z proponowanych przyczyn tej nadwrażliwości jest związana z interakcją między komórkami odpornościowymi w tkance obwodowej a neuronami. Modele in vitro dostarczyły podstawowej wiedzy pozwalającej zrozumieć, w jaki sposób mechanizmy te prowadzą do nadwrażliwości nocyceptorów. Modele in vitro stoją jednak przed wyzwaniem przełożenia skuteczności na ludzi. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano fizjologicznie i anatomicznie istotny model in vitro do hodowli nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) w trzech izolowanych przedziałach na 48-dołkowej płytce. Pierwotne DRG są zbierane od dorosłych szczurów Sprague Dawley po humanitarnej eutanazji. Nadmiar korzeni nerwowych jest przycinany, a DRG jest cięty na rozmiary odpowiednie do hodowli. DRG są następnie hodowane w naturalnych hydrożelach, co umożliwia silny wzrost we wszystkich przedziałach. Ten wielokompartmentowy system oferuje anatomicznie istotną izolację ciał komórek DRG od neurytów, fizjologicznie istotnych typów komórek i właściwości mechanicznych w celu zbadania interakcji między komórkami nerwowymi i odpornościowymi. W związku z tym ta platforma hodowlana stanowi cenne narzędzie do badania strategii izolacji leczenia, co ostatecznie prowadzi do ulepszonego podejścia do badań przesiewowych w celu przewidywania bólu.
Wprowadzenie
Przewlekły ból jest główną przyczyną niepełnosprawności i utraty pracy na całym świecie1. Przewlekły ból dotyka około 20% dorosłych na całym świecie i stanowi znaczne obciążenie społeczne i ekonomiczne2, przy czym całkowite koszty szacuje się na 560 do 635 miliardów dolarów rocznie w Stanach Zjednoczonych3.
Główną cechą obwodową wykazywaną przez pacjentów z przewlekłym bólem jest obniżony próg stymulacji nerwów, co prowadzi do tego, że układ nerwowy jest bardziej wrażliwy na bodźce4,5. Obniżony próg stymulacji może skutkować bolesną reakcją na bodziec, który wcześniej nie był bolesny (allodynia) lub zwiększoną reakcją na bodziec bolesny (hiperalgezja)6. Obecne metody leczenia bólu przewlekłego mają ograniczoną skuteczność, a terapie, które odnoszą sukces na modelach zwierzęcych, często zawodzą w badaniach na ludziach z powodu mechanistycznych różnic w manifestacji bólu7. Modele in vitro, które mogą dokładniej naśladować mechanizmy uczulania obwodowego, mogą potencjalnie zwiększyć translację nowych środków terapeutycznych8,9. Ponadto, modelując kluczowe aspekty uwrażliwionych nerwów w systemie hodowli, naukowcy mogą lepiej zrozumieć mechanizmy, które napędzają obniżone progi, i zidentyfikować nowe cele terapeutyczne, które je odwracają10.
Idealne platformy in vitro lub systemy mikrofizjologiczne obejmowałyby fizyczną separację dystalnych neurytów i ciała komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG), trójwymiarowe (3D) środowisko komórkowe oraz obecność natywnych komórek podporowych, które ściśle naśladowałyby warunki in vivo. Jednak niedawny artykuł Caparaso et al.11 pokazuje, że obecne platformy hodowlane DRG nie mają jednej lub więcej z tych kluczowych cech, co czyni je niewystarczającymi do replikacji w warunkach in vivo. Mimo że platformy te są łatwe w konfiguracji, nie naśladują biologicznych podstaw uczulenia obwodowego, a zatem mogą nie przekładać się na skuteczność in vivo. Aby rozwiązać ten problem, opracowano fizjologicznie istotny model in vitro dla hodowli zwojów korzenia grzbietowego (DRG) w matrycy hydrożelowej z trzema izolowanymi przedziałami, aby umożliwić czasową płynną izolację neurytów i ciał komórek DRG11. Model ten ma znaczenie zarówno fizjologiczne, jak i anatomiczne, co może pomóc w badaniu obwodowej wrażliwości neuronów in vitro.
Rosnące zainteresowanie wykorzystaniem eksplantatów DRG w hodowli 3D wynika z ich zdolności do ułatwiania silnego wzrostu neurytów, co służy jako pośredni wskaźnik żywotności DRG12. Podczas gdy pierwotne eksplantaty DRG u noworodków lub embrionów są głównie używane w obecnych platformach hodowli in vitro13,14, użycie eksplantatów od dorosłych gryzoni zapewnia lepszy model dojrzałej fizjologii neuronów, który ściśle naśladuje ludzką fizjologię DRG w porównaniu z eksplantatami od noworodków lub embrionów gryzoni15. Eksplantaty DRG odnoszą się do zachowania tkanki komórkowej i molekularnej natywnej tkanki DRG, głównie poprzez utrzymanie natywnych nieneuronalnych komórek podporowych. W niniejszym protokole opisano metodologię zbioru i hodowli eksplantatów DRG od dorosłych szczurów Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC) (Rysunek 1).
Wykazano skuteczność w hodowli DRG z odcinka szyjnego, piersiowego i lędźwiowego kręgosłupa bez zauważalnych różnic we wzroście neurytów. W przypadku tego zastosowania celem było wywołanie wzrostu neurytów w zewnętrznych komorach urządzenia; w związku z tym w niniejszym artykule nie dyskryminowano poziomów DRG. Jeśli jednak jest to potrzebne do konkretnego eksperymentu, poziom DRG można dostosować do potrzeb eksperymentatorów. Obecnie istnieją inne modele hodowli podzielone na przedziały dla hodowli 3D DRGs16, jednak te urządzenia nie zawierają zachowanych natywnych nieneuronalnych komórek podporowych, co może ograniczać translację. Zachowanie natywnej struktury zebranych DRG jest ważne, ponieważ zapewnia zachowanie nieneuronalnych komórek podporowych, których interakcje z neuronami DRG są niezbędne do utrzymania właściwości funkcjonalnych tych neuronów. W kilku badaniach współhodowano zdysocjowane DRG z nienatywnymi komórkami neuronalnymi, takimi jak komórki Schwanna, w celu promowania mielinizacji neuronów17,18,19.
Protokół
DRG zostało przeprowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Nebraska-Lincoln. Do badań wykorzystano samice szczurów Sprague Dawley w wieku 12 tygodni (~250 g). Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Produkcja i montaż urządzeń wielokomorowych
- Komputerowe wspomaganie projektowania i druku 3D urządzenia wielokomorowego
UWAGA: Urządzenie MC składa się z trzech komór do izolacji ciał komórkowych DRG i neurytów (Rysunek 2A). Urządzenie MC nie jest dostępne na rynku; jednak plik STL jest dostarczany w niniejszym dokumencie (Dodatkowy plik kodowania 1), aby umożliwić drukowanie 3D. Drukowanie MC trwa jeden (1) dzień. - Prześlij plik STL MC do żywicznej drukarki 3D za pomocą kompatybilnego oprogramowania.
UWAGA: Materiałem idealnym do druku jest żywica wysokotemperaturowa. Kluczową zaletą stosowania żywicy wysokotemperaturowej jest to, że jest ona biokompatybilna i może być sterylizowana w autoklawie i ponownie używana. Do wydrukowania urządzenia można również użyć drukarki 3D z cyfrowym przetwarzaniem światła (DLP) lub innych drukarek 3D. - Przenieś wydrukowane urządzenia do roztworu myjącego na 30 minut w izopropanolu (>96%), aby usunąć resztki żywicy z powierzchni drukowanego urządzenia MC.
- Wyroby należy utwardzać w temperaturze 80 °C przez 120 minut przy użyciu dostępnego w handlu utwardzacza (patrz Tabela materiałów). Utwardzacz poprawia właściwości mechaniczne drukowanego urządzenia MC poprzez wystawienie go na działanie temperatury i promieniowania UV.
- Utwardzać urządzenia MC termicznie w piecu w temperaturze 160 °C przez 180 min.
- Sterylizuj urządzenia za pomocą autoklawu przez 45 minut w cyklu grawitacyjnym .
2. Przygotowanie hydrożelu
- Zsyntetyzuj metakrylowany kwas hialuronowy (MAHA, 85%-115% metakrylacji) i scharakteryzuj za pomocą protokołu opisanego przez Seidlits et al.20.
UWAGA: Aby wspomóc wzrost DRG, powszechnie stosuje się potrójne hydrożele składające się z metakrylowalowanego kwasu hialuronowego, kolagenu typu I i lamininy. Wyniki wskazują, że DRG powszechnie rosną w MAHA, w zakresie 1,25-2,5 mg / ml, a kolagen od 2,0 do 4,5 mg / ml. W przypadku lamininy stwierdzono, że 0,75 mg / ml wystarczy, aby zapewnić silny wzrost DRG. W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody tworzenia potrójnego żelu z 1,25 mg / ml MAHA, 4,5 mg / ml kolagenu i 0,75 mg / ml lamininy. Przygotowanie hydrożelu powinno odbywać się w komorze z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną przestrzeń roboczą.
3. Przygotowanie roztworu fotoinicjatora
UWAGA: Fotoinicjator jest niezbędny do sieciowania MAHA pod wpływem światła UV. Jest powszechnie stosowany w procentach od 0,3% do 0,6%.
- Przygotuj roztwór fotoinicjatora na 3 dni przed zbiorem DRG.
- Podgrzej wstępnie sonikacyjną łaźnię wodną do temperatury 37 °C przed przygotowaniem roztworu fotoinicjatora.
- Pracując techniką sterylną w okapie przepływowym, przygotuj roztwór wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o stężeniu 23,125 mg/ml, rozpuszczając NaHCO3 w 5x roztworze Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES firmy Dulbecco.
- W szklanej fiolce wymieszaj 0,6% wagowo-objętościowy (w/v) fotoinicjator w 20% obj./obj. 1x sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) i 80% obj./obj. 5X DMEM/HEPES.
- W celu ochrony przed światłem owinąć szklaną fiolkę folią aluminiową. Należy jednak upewnić się, że zdjęto folię aluminiową przed przeniesieniem fiolki do sonikującej łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C z sonikacją między 30-40 min.
UWAGA: Roztwór fotoinicjatora musi być chroniony przed światłem, ponieważ może rozpadać się na rodniki i rozpocząć proces polimeryzacji pod wpływem światła21. - Sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do nowej sterylnej szklanej fiolki.
4. Rozpuszczenie metakrylonego kwasu hialuronowego
- Rozpuść metakrylowany kwas hialuronowy (przygotowany w kroku 2) w tym samym dniu, w którym przygotowywany jest roztwór fotoinicjatora (etap 3).
- Umieść zamrożony liofilizowany MAHA w eksykatorze na 15 minut, aby osiągnął temperaturę pokojową.
- Pracując w okapie z przepływem laminarnym i stosując technikę ważenia sterylnego, zważyć liofilizowaną MAHA w szklanej fiolce.
- Dodaj niezbędną objętość przefiltrowanego roztworu fotoinicjatora do MAHA, aby uzyskać pożądane stężenie MAHA. Powszechne końcowe stężenie żelu wynosi 1,25 mg/ml MAHA i 4,5 mg/ml kolagenu.
- Uszczelnij nakrętkę laboratoryjną folią uszczelniającą, owiń szklaną fiolkę folią aluminiową i umieść ją na orbitalnej płycie wytrząsarki w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia (zwykle 3 dni). Od czasu do czasu należy zawirować roztwór, aby rozbić duże grudki MAHA, aby zapewnić równomierne rozpuszczenie MAHA.
5. Montaż urządzenia
- Umieść urządzenie MC w 48-dołkowej płytce na dzień przed zbiorem DRG.
- Nałóż cienką linię żelu silikonowego w rowek pod urządzeniem MC (Rysunek 2B) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml. Pomoże to urządzeniu bezpiecznie przymocować się do płytki studzienki.
- Za pomocą kleszczyków #3 delikatnie umieść urządzenie MC w studzience 48-dołkowej płytki, jak pokazano na Rysunek 2C.
UWAGA: Rozmiar urządzenia można dostosować do zamierzonego zastosowania, a w razie potrzeby można użyć płytki o innym rozmiarze. Urządzenia mogą być ponownie użyte. Aby ponownie użyć, hydrożel musi zostać delikatnie wypłukany ze wszystkich tuneli, a rowek załadowczy pod urządzeniem musi być użyty z 70% etanolem z delikatnym mieszaniem. Po zakończeniu tego procesu urządzenia można ponownie sterylizować w autoklawie w celu sterylizacji przed użyciem.
6. Przygotowanie zwierząt
- Autoklaw wszystkich niezbędnych narzędzi do preparowania przed rozpoczęciem zbiorów.
- Uzyskaj dorosłego samca lub samicę szczura Sprague Dawley w wieku 12-20 tygodni. Płeć szczura nie wpływa na wzrost DRG.
- Poddać szczura eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC, stosując przedawkowanie CO2 jako podstawową metodę eutanazji i obustronne nakłucie odmy opłucnowej jako wtórną metodę eutanazji zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych22.
- Umieść szczura na sterylnym podkładzie na stole sekcyjnym brzuszną stroną do dołu. Spryskaj futro 70% etanolem.
7. Zbiór zwojów korzenia grzbietowego (DRG)
- Przygotuj pożywkę do przycinania zawierającą 86% pożywki neurobazalnej A, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny (PS), 1% glutaminy i 2% witaminy B27 plus 50x i przenieś na płytkę 24-dołkową. Pożywka ta i płytka studzienkowa będą używane do tymczasowego przechowywania zebranych DRG przed zatopieniem ich w hydrożelu.
- Noś fartuch laboratoryjny, maskę chirurgiczną, maskę, okulary ochronne i rękawice.
- Za pomocą dużych nożyczek z nosem przeciąć skórę u podstawy kręgosłupa szyjnego, a następnie wzdłuż kręgosłupa.
- Aby dalej odprowadzać krew z kanału kręgowego, przeciąć pod łopatkami i w dół przez mięsień, aby przeciąć główne naczynia krwionośne.
- Użyj dużych nożyczek z ostrym nosem, aby odciąć mięsień od kręgosłupa. Oczyść jak najwięcej mięśni, aby uwidocznić kręgosłup.
- Usuń grzbietowe i boczne segmenty kręgów. Użyj prostych nożyczek Rongeur i z ostrym nosem, aby usunąć wyrostki kolczyste i poprzeczne kręgów, zaczynając od końca szyjnego i przesuwając się w kierunku końca lędźwiowego.
- Usuń rdzeń kręgowy. Użyj małych nożyczek z ostrym nosem, aby ostrożnie przeciąć korzenie nerwowe połączone z DRG po obu stronach rdzenia kręgowego. Przeciąć szyjny koniec rdzenia kręgowego i ostrożnie stopniowo wyjmować z kanału kręgowego, przecinając wszelkie pozostałe korzenie nerwowe połączone z DRGs.
UWAGA: Umiejętności motoryczne są niezbędne, aby zapewnić, że ciało DRG nie zostanie odcięte w tym procesie. - Aby odsłonić DRG, użyj zakrzywionego Rongeur, aby usunąć więcej bocznych części kręgów. Pociągnij na zewnątrz od linii środkowej, naprzemiennie bokiem. Uważaj, aby nie przeciąć korpusu DRG, ponieważ może to spowodować uszkodzenie ciał komórek i aksonów.
- Za pomocą kleszczy #3 i nożyczek sprężynowych o prostych krawędziach usuń DRG między każdym poziomem kręgów. Chwyć korzenie nerwów rdzeniowych od DRG, ostrożnie wyciągnij je z kieszeni i przetnij drugi koniec nerwu rdzeniowego. Uważaj, aby nie chwycić korpusu DRG bezpośrednio.
- Umieścić DRG w dołkach na 24-dołkowej płytce (zawierającej pożywkę do przycinania, krok 7.1) na lodzie.
- Po zebraniu wszystkich DRG posprzątaj miejsce pracy, umieść tuszę w torbie autoklawu i przechowuj/zutylizuj ją w odpowiedni sposób zgodnie z protokołem IACUC.
8. Przycinanie i cięcie DRG
- Napełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm na czystej ławce środkami do przycinania (krok 7.1). Ustaw lunetę sekcyjną i sterylizator z koralikami szklanymi i umieść autoklawizowaną skrzynkę narzędziową z narzędziami do przycinania (kleszcze #3 i nożyczki sprężynowe o prostych krawędziach) przy lunecie.
- Pod lunetą preparacyjną usuń nadmiar tkanki wokół DRG i przytnij korzenie nerwowe w pobliżu ciała DRG (zwykle nieco ciemniejsze niż otaczające nerwy).
- Napełnij drugą szalkę Petriego o średnicy 60 mm świeżą pożywką. Pod lunetą sekcyjną przyciąć przycięte DRG na około 0,5 mm (lub między 0,5 mm a 0,8 mm). Podczas cięcia pod szalką Petriego umieszcza się linijkę, aby uzyskać prawidłowy szacowany rozmiar ciętych DRG.
- Przenieś pokrojone DRG na świeżą 24-dołkową płytkę z podłożem na lodzie.
UWAGA: Przycinanie, cięcie i osadzanie DRG powinno odbywać się w komorze z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną przestrzeń roboczą. W przypadku braku komory z przepływem laminarnym należy przestrzegać technik aseptyki, zalecając co najmniej odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) (fartuch laboratoryjny, maski, gogle i rękawice) oraz wszystkie narzędzia sterylizowane przez cały czas trwania procesu w celu złagodzenia potencjalnego zanieczyszczenia.
9. Neutralizacja kolagenu
- Zneutralizuj kolagen tego samego dnia, w którym nastąpiły zbiory DRG po przycięciu i pocięciu DRG.
- Pracując na lodzie, odpipetować ~8,16 % ultra czystej wody, ~1,84% 1 M wodorotlenku sodu (NaOH), ~10% 10x PBS i ~80% kolagenu o całkowitej objętości roztworu do szklanej fiolki.
- Mieszaj powoli za pomocą sterylnej końcówki pipety o niskiej retencji, aby odpipetować kolagen (zwykle dodawany jako ostatni) do mieszaniny. Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w roztworze podczas mieszania, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Sprawdź pH zneutralizowanego kolagenu za pomocą pasków pH, aby upewnić się, że wynosi ~7,
UWAGA: Zneutralizowany kolagen można przechowywać na lodzie przez 2-3 godziny bez żelowania; Dlatego wytwarzanie hydrożelu powinno odbywać się szybko po zneutralizowaniu kolagenu.
10. Produkcja hydrożelu
- Pracując na lodzie, pipetuj lamininę (do końcowego stężenia 0,75 mg/ml) i 1x PBS do szklanej fiolki.
- Używając sterylnych końcówek do pipet o niskiej retencji, pipetami zneutralizuj kolagen i roztwór MAHA do mieszaniny, aby uzyskać pożądane stężenie.
- Mieszaj powoli i sprawdź pH powstałego hydrożelu (powinno wynosić ~7).
11. Osadzanie DRG
- Wykonaj osadzanie w wielu komorach.
- Odpipetować 65,1 μl i 52,8 μl wstępnie zmieszanego hydrożelu odpowiednio do komór soma i neuryt.
UWAGA: Zakłada to użycie urządzeń MC w płytce 48-dołkowej. Woluminy te można zmieniać w zależności od rozmiaru używanego urządzenia MC. - Delikatnie osadź pocięte DRG w komorze somy (Rysunek 2A), upewniając się, że nie porysują dna płytki studzienki. Umieść DRG na środku, aby neuryty mogły wrosnąć w sąsiednie przedziały przez tunele.
- Termiczne sieciowanie hydrożelu w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 min. W takim przypadku włącz lampę UV, aby się rozgrzać.
- Po usieciowaniu termicznym hydrożel jest sieciowany UV przez 90 s.
- Dodaj pożywkę wzrostową DRG do hydrożelu i DRG i po godzinie wykonaj pełną wymianę pożywki, aby wyeliminować nieprzereagowane lub pozostałe ślady fotoinicjatora, które utrzymują się w pożywce.
- Wykonuj połówkową wymianę pożywki co 3 dni i monitoruj wzrost DRG, oglądając pod mikroskopem.
- Po ~4 tygodniach, gdy neuryty DRG zaczną rosnąć (Rysunek 3A), uchwyć obrazy za pomocą imagera z płytką fluorescencyjną i określ ilościowo długość neurytów za pomocą FIJI (ImageJ).
- Odpipetować 65,1 μl i 52,8 μl wstępnie zmieszanego hydrożelu odpowiednio do komór soma i neuryt.
12. Kontroluj osadzanie DRG
- Odpipetować 250 μl hydrożelu w 48-dołkowej płytce (bez MC).
- Delikatnie umieść pocięty DRG na środku studzienki i do połowy w dół w hydrożelu, upewniając się, że nie porysuje dna płytki studzienki.
- Termiczne sieciowanie hydrożelu w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 min.
- Sieciowanie hydrożelu UV przez 90 s.
- Dodaj pożywkę wzrostową DRG do hydrożelu i DRG i po godzinie wykonaj pełną wymianę podłoża.
- Wykonuj połówkową wymianę pożywki co 3 dni i monitoruj wzrost DRG, oglądając go pod mikroskopem.
- Po ~4 tygodniach, gdy neuryty DRG zaczną rosnąć (Rysunek 3B), uchwyć obrazy za pomocą imagera do płytek fluorescencyjnych.
UWAGA: Każdy mikroskop w jasnym polu będzie działał w przypadku obrazowania. Zautomatyzowany mikroskop płytkowy przyspiesza ten proces. Kontrolne zatapianie w zwykłych żelach bez urządzenia odbywa się w celu porównania wzrostu neurytów DRG w wielu komorach. Gdy użytkownicy sprawdzą, że DRG rosną podobnie w żelach MC i kontrolnych, mogą nie być musieli za każdym razem powtarzać żeli kontrolnych.
13. Obrazowanie DRG
- Rejestruj obrazy w jasnym polu w 4-krotnym powiększeniu za pomocą kamery fluorescencyjnej w różnych odległościach ogniskowych, aby zobrazować całe urządzenie DRG i MC.
- Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby ułatwić oglądanie neurytów.
- Zapisz obraz jako plik .tiff.
14. Kwantyfikacja neurytów DRG
- Pobierz i zainstaluj FIJI (ImageJ).
- Otwórz plik ImageJ. Otwórz plik obrazu i upewnij się, że jest on monochromatyczny.
- Zwiększ kontrast, aby widoczne były najmniejsze neuryty. Zrób to, otwierając opcję jasności i kontrastu za pomocą skrótu Ctrl+Shift+C.
- Dostosuj suwaki kontrolera zgodnie z potrzebami, aby zobrazować neuryty, i kliknij Zastosuj, aby uzyskać żądaną jasność i kontrast.
- Otwórz śledzenie neurytu, otwierając menu Wtyczki, wybierając Segmentacja i klikając Prosty ślad Neurite .
- Rozpocznij nowy ślad, klikając jeden koniec neurytu tuż przy korpusie DRG.
- Kliknij inny punkt wzdłuż neurytu, aby dodać ślad, aż neuryt zostanie prześledzony od końca do końca. Kliknij Zakończ ścieżkę po prześledzeniu neurytu.
- Przekonwertuj narysowaną długość na rzeczywiste jednostki i zapisz wyniki, kopiując je i wklejając do programu Excel.
- Użyj narzędzia linii prostej w FIJI, aby narysować linię o tej samej długości co podziałka liniowa (nie puszczając końca linii) i spójrz na wartość długości widoczną pod paskiem narzędzi. Wartość długości jest używana do konwersji.
- Zmierz długość sześciu długich neurytów rozciągających się z obu stron DRG (Rysunek 3C,D) i oblicz średnią długość tych neurytów, aby uzyskać reprezentatywną średnią długość DRG, jak pokazano w Rysunek 4.
UWAGA: Barwienie immunologiczne zostało przetestowane na eksplantatach DRG w zwykłych żelach, aby wykazać obecność nieneuronalnych komórek podporowych7. DRG są utrwalane w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze pokojowej, myte trzykrotnie 1x PBS przez 15 minut i przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C do momentu barwienia immunologicznego. - W przypadku eksplantatów w urządzeniach MC usuń urządzenie MC i postępuj zgodnie z tym samym procesem opisanym powyżej7.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje technikę izolacji i hodowli zwojów korzeni grzbietowych (DRG) od dorosłych szczurów linii Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC). Jak pokazano na Rysunku 1, izolowane od dorosłych szczurów zwoje DRG zostały przycięte i pocięte na fragmenty o wielkości ~0.5 mm. Następnie przycięte i pocięte zwoje DRG osadzono w hydrożelu w obszarze somy urządzenia MC (Rysunek 2) i hodowano przez 27 dni przed przeprowadzeniem kwantyfikacji neurytów. Jako kontrolę wykorzystano DRG hodowane w zwykłym żelu. Stężenie formulacji hydrożelu użytej w tym eksperymencie wynosiło 4.5/1.25 mg/mL kolagenu: MAHA. W 27. dniu dla żeli wielokomorowych oraz w 21. dniu dla żeli zwykłych zaobserwowano intensywny wzrost neurytów (Rysunek 3). Średnia długość neurytów w MC (894.22 µm ± 308.75 µm) była porównywalna z długością neurytów w kontrolnych żelach zwykłych (864.26 µm ± 362.84 µm) (Rysunek 4). Dowodzi to zdolności urządzenia MC do wspierania hodowli DRG oraz wzrostu neurytów. Długość neurytów określono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający procedurę eksperymentalną. (A) Pobieranie zwojów korzeni grzbietowych (DRG) od dorosłych szczurów rasy Sprague Dawley. (B) Przycinanie i cięcie pobranych DRG. (C) Formułowanie hydrożelu, osadzanie DRG i hodowla w hydrożelu wewnątrz MC umieszczonego w płytce 48-dołkowej. (D) Wzrost neurytów DRG po 21-30 dniach hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Wydrukowane urządzenie wielokomorowe (MC) z trzema odizolowanymi komorami, które może być stosowane w płytce 48-dołkowej. (A) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające widok z góry wydrukowanego urządzenia MC, ukazujące komory DRG i neurytów (linie czerwone) oraz obszar osadzania DRG (kolor zielony). (B) Widok z boku MC. (C) Zdjęcie MC dopasowanego do płytki 48-dołkowej. Pasek skali = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Wzrost neurytów w urządzeniu wielokomorowym (MC) oraz w kontrolnych żelach jednolitych. (A) Reprezentatywny obraz w świetle przechodzącym pokazujący śledzenie wzrostu neurytów w urządzeniu wielokomorowym (MC). (Poniżej) Neuryty, które wyrosły przez tunele MC, zaznaczono strzałkami. (B) Obraz wzrostu neurytów w kontrolnych żelach jednolitych (bez MC). (C) Reprezentatywny obraz pokazujący śledzenie dwunastu długich neurytów w kontrolnych żelach jednolitych (fioletowe linie). Ilościowo określono sześć długich neurytów po obu stronach DRG w celu wyznaczenia średniej długości neurytów. Obrazy wykonano za pomocą fluorescencyjnego imager'a płytek przy powiększeniu 4x, a neuryty przeanalizowano ilościowo przy użyciu programu FIJI (ImageJ). Paski skali = 1000 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Długość neurytów w układzie wielokomorowym (MC) w porównaniu do zwykłego żelu (PG). Wykres punktowy przedstawiający indywidualne długości neurytów, gdzie średnie i odchylenia standardowe są reprezentowane przez słupki błędów. Średnia długość neurytów w MC wyniosła 1204.40 µm ± 690.43 µm (średnia ± SD) w porównaniu do 864.26 µm ± 362.84 µm (średnia ± SD) w zwykłym żelu, co wskazuje, że MC wspiera wzrost neurytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający z kodem 1: Plik STL urządzenia wielokomorowego (MC) wygenerowany przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Protokół ten przedstawia metodę zbierania dorosłych DRG Sprague Dawley i hodowli ich w naturalnych hydrożelach 3D. W przeciwieństwie do tej metody, inne podejścia do zbierania DRG od myszy i szczurów obejmują izolację kręgosłupa. Wycięty kręgosłup jest zmniejszany o połowę, a rdzeń kręgowy jest usuwany w celu odsłonięcia DRG 23,24,25. Uszkodzenie rdzenia kręgowego ogranicza dopływ krwi, co wpływa na DRG i neurony wewnętrzne26. Zmniejsza to aktywność DRG, dzięki czemu podejścia chirurgiczne są bardziej odpowiednie. Ponadto przedstawiono metodę drukowania 3D solidnego urządzenia MC, które pozwala na fizjologicznie istotną hodowlę DRG.
Protokół ten przedstawia metodę hodowli DRG in vitro, kładąc nacisk na badanie obwodowej wrażliwości neuronów w anatomicznie i fizjologicznie odpowiednim modelu. Ta metoda hodowli może ustanowić fizyczną separację dystalnych neurytów i ciała komórki DRG w środowisku 3D. Urządzenie MC naśladuje środowisko in vivo , ponieważ eksplantaty DRG z komórkami są zachowane i mogą być hodowane wspólnie z natywnymi komórkami glejowymi. Eksplant DRG zawiera nienatywne komórki neuronalne, które mogą być hodowane wspólnie z innymi komórkami w celu naśladowania warunków fizjologicznych. To fizjologiczne znaczenie sprzyja badaniom nad tym, w jaki sposób komórki nieneuronalne regulują aktywność neurytów i pomaga w zrozumieniu podstawowych mechanizmów związanych z nocycepcją. Włączenie tych interakcji nieneuronalnych powinno zapewnić dokładniejsze przewidywania wyników sygnalizacji komórkowej w porównaniu z uproszczonymi modelami hodowli ze zdysocjowanymi DRG. Obecność dwóch przedziałów neurytowych maksymalizuje znaczenie fizjologiczne, ponieważ pojedyncze DRG unerwiają różne tkanki in vivo. Taka konstrukcja pozwala na leczenie jednego przedziału neurytowego, podczas gdy drugi służy jako kontrola. Przedziały kontrolne i zabiegowe połączone z pojedynczą somą można wykorzystać do badania efektów międzyprzedziałowych, naśladując warunki in vivo , w których neuryty rozciągają się z jednej somy i doświadczają różnych bodźców podczas unerwiania różnych tkanek, zapewniając wgląd w wzajemne oddziaływanie między neurytami. Jeśli dochodzi do przesłuchów między neurytami w sąsiednich przedziałach, nieleczone DRG mogą służyć jako prawdziwa kontrola.
Urządzenie to może być używane do izolacji leczenia lub do badania interakcji między neuronami a DRG w kontekście bólu. Ponieważ neuryty dystalne mogą być selektywnie leczone oddzielnie od somy DRG i neurytów proksymalnych, system ten może być stosowany do leczenia obwodowego, takiego jak celowane terapie stawów, w których bezpośrednio leczony jest końcowy koniec obwodowych neuronów czuciowych.
Kluczową zaletą urządzenia MC są eksperymenty o wysokiej przepustowości w wielu dołkach tej samej płytki, ponieważ urządzenie MC zostało zaprojektowane tak, aby pasowało do płytki 48-dołkowej. Dodatkową zaletą platformy in vitro jest zdolność do zmiany sztywności hydrożelu w MC poprzez dostrojenie stężeń kolagenu i MAHA w celu naśladowania właściwości różnych mikrośrodowisk tkankowych. Jednym z potencjalnych ograniczeń tego protokołu jest to, że izolacja płynowa między przedziałami somy neurytu i DRG nie jest idealna dla kultur trwających dłużej niż 72 godziny bez zmiany pożywki. Poprzednie badanie potwierdziło, że izolacja płynowa jest utrzymywana w komorach przez okres do 72 godzin bez wymiany mediów11. Wcześniejsze badania wykazały, że zwiększenie stężenia kwasu hialuronowego znacznie zwiększa gęstość sieciowania kolagenu, ograniczając w ten sposób dyfuzyjność makrocząsteczek w matrycy hydrożelowej27. Dlatego, aby poprawić izolację fluidyczną dla kultur powyżej 72 godzin, stężenie MAHA można zwiększyć, jak wykazano w badaniu Caparaso i wsp.7, gdzie wzrost MAHA spowodował poprawę izolacji fluidalnej. Osadzanie kontrolne ma na celu zapewnienie porównywalnego wzrostu neurytów DRG w MC i zwykłym żelu. Ma to na celu zapewnienie, że MC nie ma wpływu na wzrost DRG. Nie zaleca się powtarzania osadzania kontrolnego przy każdym eksperymencie po walidacji wzrostu DRG w MC.
Autorzy przyznają, że ludzkie DRG są większe, zawierają więcej komórek i mają różne proporcje podtypu neuronów w porównaniu do DRG szczurów28. Stosowanie DRG na gryzoni jest ograniczeniem tego badania pod względem przełożenia do praktyki; Jednak system ten może być cenny jako platforma przesiewowa do identyfikacji związków, które wpływają na pobudliwość neuronów. Chociaż istnieją różnice w składzie chemicznym między DRG gryzoni i ludzi, istnieje również duże nakładanie się proteomu między DRG szczurów i ludzi29. To nakładanie się proteomu - i obecność tych samych podtypów neuronalnych - sugeruje, że DRG szczura może być używany do badań przesiewowych terapii na wysokim poziomie, a dalsze badania mogą być prowadzone w celu zbadania, czy zmiany w DRG szczura mechanicznie przekładają się na DRG u człowieka.
Platforma ta pozwala na ukierunkowaną stymulację farmakologiczną i badanie neuronów lub ciał komórkowych z kontrolą czasową. Zmiany w pobudliwości neuronów i przekazywaniu sygnałów można łatwo zmierzyć, manipulując neurytami lub DRG. Wykazano zdolność do oceny pobudliwości neuronalnej za pomocą obrazowania wapnia w hydrożelach kontrolnych z eksplantatem DRG7. Podobne metody można zastosować w urządzeniu MC do oceny pobudliwości neuronów.
Metoda ta może być stosowana do badania różnych stanów bólowych, w których stymulacja obwodowych pierwotnych neuronów czuciowych jest czynnikiem napędzającym, takich jak ból krzyża związany z dyskiem. Badania przesiewowe nadwrażliwości nocyceptorów mogą być obiecującym narzędziem do odkrywania nowych leków zmniejszających nadpobudliwość. Zmniejszenie nadpobudliwości może potencjalnie przełożyć się klinicznie na zmniejszenie bólu. Platforma ta może przeprowadzać badania przesiewowe leków o wysokiej przepustowości w celu zidentyfikowania najskuteczniejszych kandydatów do walidacji in vivo za pomocą testów zachowania przypominających ból.
Oświadczenia
Autorzy tego badania deklarują, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez NSF Grant (2152065) i NSF CAREER Award (1846857). Autorzy chcieliby podziękować wszystkim obecnym i byłym członkom Wachs Lab za wkład w ten protokół. Schematy na rysunku 1 zostały wykonane w programie Biorender.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #5 kleszczy | Fine Science Tools | 11252-00 | Do przycinania i cięcia DRG |
| 10x | DMEM MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoklawowane) | Przygotowane w laboratorium | 7,3 - 7,5 pH | |
| VWR | 82050-892 | Do tymczasowego przechowywania zebranych i pokrojonych DRG | |
| 3 ml Strzykawka sterylna, jednorazowego użytku | BD | 309657 | |
| Płytki 48-dołkowe | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm szalka Petriego | Fisher Scientific | FB0875713A | Do przechowywania mediów do przycinania i cięcia |
| Folia aluminiowa | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | Do mediów DRG |
| Kolagen typu I | Ibidi | 50205 | |
| Zakrzywiony kubek Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | Do preparacji |
| Kleszcze Dumont #3 | Narzędzia do nauki o | 11293-00 | Do rozwarstwiania |
| płodowej surowicy bydlęcej (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | Do podłoża DRG |
| Utwardzanie formy | utwardzający | Form Labs | |
| Form wash | Form Labs | Aby zmyć nadmiar żywicy z MC | |
| Sterylizator kulek szklanych | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Fiolki szklane (8 ml) | DWK Nauki Przyrodnicze (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | Do mediów DRG |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| Żywica wysokotemperaturowa V2 | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Sól sodowa kwasu hialuronowego | MilliporeSigma | 53747 | Używany do produkcji MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R& D Systems | 344600501 | |
| Duże nożyczki z noskiem | Militex | EG5-26 | Do preparacji |
| Duże kleszcze (końcówki ząbkowane) | Militex | 9538797 | Do rozwarstwiania |
| Duże nożyczki z ostrym noskiem | Fine Science Tools | 14010-15 | Do preparacji |
| Końcówki do pipet o niskiej retencji | Fisher Scientific | 02-707-017 | Do pipetowania kolagenu i MAHA |
| Metakrylowany kwas hialuronowy (MAHA) | Przygotowany w laboratorium | N/A | 85 - 115 % metakrylu |
| Czynnik wzrostu nerwów (NGF) | R& D Systems | 556-NG-100 | Dla mediów DRG |
| Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | Dla mediów DRG |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Penicylina/Streptomycyna (PS) | EMD Milipore | 516106 | Do mediów DRG |
| Paski testowe pH | VWR International | BDH35309.606 | |
| Końcówki do pipet (1000 µ L) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 oprogramowanie | Formslab | Aby przesłać plik STL | |
| Rat | Charles River | ||
| Resin | Form Form | Form 3L | Druk 3D MC Urządzenie |
| Małe nożyczki z ostrym noskiem | Fine Science Tools | 14094-11 | Do sekcji |
| Wodorowęglan | soduMilliporeSigma | S6014 | |
| Prosta miseczka rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | Do preparacji |
| Nożyczki sprężynowe z prostą krawędzią | Fine Science Tools | 15024-10 | Do preparacji |
| Chirurgiczne ostrze łopatki (nr 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Filtry strzykawkowe, PES (0,22 i mikro; m) | Celltreat | 229747 | |
| Małe nożyczki sprężynowe | World Precision Instruments | 14003 | Do przycinania i cięcia Lampa UV DRG |
| Analytik Jena US | Do fotocrosslinku hydrożel (15 - 18 mW / cm2) |
Bibliografia
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
- Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
- Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
- Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
- Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
- Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
- Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
- Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
- F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
- Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
- Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
- Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
- Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
- Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
- Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
- Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
- Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
- Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).
Przedruki i uprawnienia
