Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne hepatocyty są powszechnie używanym narzędziem do badań in vitro związanych z wątrobą. Jednak utrzymanie tych komórek zawsze było wyzwaniem ze względu na szybką utratę morfologii, żywotności i funkcjonalności w hodowli. Najnowszym podejściem do hodowli długoterminowej jest generowanie trójwymiarowych (3D) organoidów, narzędzia in vitro, które może rekapitulować tkanki w naczyniu w oparciu o cudowną zdolność wątroby do regeneracji. Opublikowane protokoły zostały zaprojektowane w celu uzyskania długoterminowych funkcjonalnych organoidów 3D z pierwotnych dorosłych hepatocytów (Hep-Orgs). Najnowocześniejsze narzędzie do tworzenia organoidów 3D wymaga możliwości izolowania komórek z dorosłej tkanki, a ten początkowy krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyniku końcowego. Dwuetapowa perfuzja kolagenazy, wprowadzona w latach siedemdziesiątych XX wieku, jest nadal ważną procedurą uzyskiwania pojedynczych hepatocytów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie wszystkich kluczowych etapów procedury chirurgicznej, optymalizując w ten sposób procedurę pierwotnej izolacji hepatocytów w modelu szczurzym. Ponadto szczególną uwagę zwrócono na wytyczne PREPARE w celu zwiększenia prawdopodobieństwa udanych procedur i zapewnienia wysokiej jakości wyników. Szczegółowy protokół pozwala naukowcom przyspieszyć i zoptymalizować dalsze prace w celu ustalenia organoidów 3D z pierwotnych hepatocytów dorosłych szczurów. W porównaniu z hepatocytami 2D, Hep-Orgi były nadal żywotne i w aktywnej proliferacji w dniu 15, wykazując długoterminowy potencjał.
Wprowadzenie
Pierwotne hepatocyty są ważnym i szeroko stosowanym narzędziem do badań in vitro związanych z wątrobą. Jednak ich ekspansja i utrzymanie były historycznie trudne, ponieważ traciły morfologię i funkcjonalność po kilku dniach w culture1. Hodowla 2D jest warunkiem ograniczającym, w szczególności w przypadku hepatocytów, które mają wielokątny kształt i spolaryzowaną strukturę ze zróżnicowanymi błonami wierzchołkowymi i podstawnobocznymi. W rzeczywistości przyleganie hepatocytów do płytki zakłóca ich normalną aktywność, ponieważ prowadzi do płaskiego cytoszkieletu z ograniczoną interakcją między komórkami oraz między komórkami a macierzą ze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury i pomieszczenia dla zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi prawa włoskiego i dyrektywy Wspólnoty Europejskiej. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (zezwolenie nr 321/2022-PR) zgodnie z art. 31 dekretu 26/2014.
1. Przygotowanie do zabiegu na zwierzętach
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla składu podłoża i bufora oraz z Tabelą materiałów dla szczegółów handlowych.
- Podgrzać łaźnię wodną w temperaturze 42 °C, a następni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po zakończeniu procedur przygotowawczych (krok 6.13) uzyskano wydajność komórkową na poziomie do 1 x 108 komórek na jedną izolację z wątroby szczura o masie około 300 g. Żywotność komórek w zakresie od 78% do 97% ustalono za pomocą liczenia z zastosowaniem błękitu trypanu.
Jak opisano w poprzednich badaniach1,18,19, pierwotne hepatocyty w kulturze tracą swoją morfologię, funkcje specyficzne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Organoidy 3D są granicą dla medycyny spersonalizowanej i pozwalają na długotrwałą hodowlę hepatocytów. Jakość tej innowacyjnej techniki wymaga dobrego plonu żywotnych hepatocytów pierwotnych oraz dobrze przeprowadzonej perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów. Ta stara procedura jest nadal szeroko stosowana; Składa się jednak z różnych kroków, które mogą być trudne. Podchodząc do zabiegu, doświadczyliśmy krytycznych problemów, takich jak zanieczyszczenie bakteryjne, niska wydajność trawienia wątroby, niska wydajność pierw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Davide Selvestrelowi i prof. Giovanniemu Sorrentino z SorrentinoLab na Uniwersytecie w Trieście za pomoc w przeprowadzeniu testu proliferacji EdU. Prace były wspierane przez grant ad hoc Banca d'Italia oraz granty FIF w ramach programu stacjonarnego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| A83-01- Inhibitor ALK5 IV | Podwójna helisa | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym | Zestaw do obrazowania Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Kolagen, typ I, roztwór z ogona szczura | Merck | C3867-1VL | |
| Deksametazon | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparyna sodowa 25000 j.m./5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| Roztwór insuliny-transferyny-selenu 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| roztwór L-glutaminy | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | Thermofisher Naukowy | 17703-034 | |
| Pożywka do perfuzji wątroby | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| Suplement N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylocysteina | Merck | A9165 | |
| Nikotynamid | Merck | N-0636 | |
| Aminokwasy endogenne | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| Bufor PBS 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A Pompa | |
| perystaltyczna | Ismatec i handel; | MS-4/12 Reglo Pompa | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| TRI Odczynnik | Merck | T9424 | |
| Rurki | Ismatec i handel; | ID.2,79mm | |
| Williams' E Medium, bez glutaminy | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Bibliografia
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
