Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.
Artykuł metodologiczny
Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne hepatocyty są powszechnie używanym narzędziem do badań in vitro związanych z wątrobą. Jednak utrzymanie tych komórek zawsze było wyzwaniem ze względu na szybką utratę morfologii, żywotności i funkcjonalności w hodowli. Najnowszym podejściem do hodowli długoterminowej jest generowanie trójwymiarowych (3D) organoidów, narzędzia in vitro, które może rekapitulować tkanki w naczyniu w oparciu o cudowną zdolność wątroby do regeneracji. Opublikowane protokoły zostały zaprojektowane w celu uzyskania długoterminowych funkcjonalnych organoidów 3D z pierwotnych dorosłych hepatocytów (Hep-Orgs). Najnowocześniejsze narzędzie do tworzenia organoidów 3D wymaga możliwości izolowania komórek z dorosłej tkanki, a ten początkowy krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyniku końcowego. Dwuetapowa perfuzja kolagenazy, wprowadzona w latach siedemdziesiątych XX wieku, jest nadal ważną procedurą uzyskiwania pojedynczych hepatocytów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie wszystkich kluczowych etapów procedury chirurgicznej, optymalizując w ten sposób procedurę pierwotnej izolacji hepatocytów w modelu szczurzym. Ponadto szczególną uwagę zwrócono na wytyczne PREPARE w celu zwiększenia prawdopodobieństwa udanych procedur i zapewnienia wysokiej jakości wyników. Szczegółowy protokół pozwala naukowcom przyspieszyć i zoptymalizować dalsze prace w celu ustalenia organoidów 3D z pierwotnych hepatocytów dorosłych szczurów. W porównaniu z hepatocytami 2D, Hep-Orgi były nadal żywotne i w aktywnej proliferacji w dniu 15, wykazując długoterminowy potencjał.
Wprowadzenie
Pierwotne hepatocyty są ważnym i szeroko stosowanym narzędziem do badań in vitro związanych z wątrobą. Jednak ich ekspansja i utrzymanie były historycznie trudne, ponieważ traciły morfologię i funkcjonalność po kilku dniach w culture1. Hodowla 2D jest warunkiem ograniczającym, w szczególności w przypadku hepatocytów, które mają wielokątny kształt i spolaryzowaną strukturę ze zróżnicowanymi błonami wierzchołkowymi i podstawnobocznymi. W rzeczywistości przyleganie hepatocytów do płytki zakłóca ich normalną aktywność, ponieważ prowadzi do płaskiego cytoszkieletu z ograniczoną interakcją między komórkami oraz między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), zmniejszając polaryzację i zaangażowane szlaki sygnałowe2.
Aby ominąć ograniczenia tej metody, Dunn i współpracownicy3 najpierw użyli podwójnej warstwy kolagenu. Ta metoda hodowli, znana jako "metoda hodowli kanapkowej", opiera się na wysiewie pierwotnych hepatocytów między dwiema warstwami macierzy. Metoda ta ma wiele zalet, w tym długotrwałą hodowlę, utrzymanie morfologii wielokątów i aktywność transkrypcyjną porównywalną do świeżo wyizolowanych hepatocytów4. Podobna metoda, oparta na tej samej zasadzie, w której podkład składa się z Matrigelu, a nakładka z kolagenu, dowiodła obecności dobrze ugruntowanej sieci kanałowej5.
Pomimo niezawodności metody hodowli kanapkowej dla wzrostu hepatocytów, obecna praca ma na celu stworzenie hodowli 3D-organoidowej, narzędzia in vitro używanego do rekapitulacji tkanek w naczyniu i stworzenia potencjalnego pomostu w kierunku medycyny spersonalizowanej, umożliwiając generowanie specyficznych dla choroby spostrzeżeń biologicznych, identyfikację celów molekularnych, testowanie leków, tworzenie biobanków i otwieranie nowych horyzontów dla innowacyjnych technologii, takich jak organ-on-chip6. Hepatocyty pierwotne osadzono w półkulistych kropelkach macierzy zwanych "kopułami", aby umożliwić silny wzrost organoidów wewnątrz kopuł i zagwarantować przepływ rozpuszczalnych czynników, w tym czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), z pożywki hodowlanej. Te czynniki wzrostu bezpośrednio aktywują szlaki sygnałowe, aby zapewnić przetrwanie hepatocytów7. Organoidy wątrobowe są zwykle uzyskiwane z komórek macierzystych/progenitorowych wyizolowanych ze stadiów embrionalnych lub dorosłych szczurów, myszy, ludzi (a także psów i kotów) wątroba8. Nawet jeśli konformacja 3D poprawia różnicowanie komórek macierzystych do dorosłych hepatocytów, temu narzędziu nadal brakuje dojrzałości oryginalnej pierwotnej tkanki pierwotnej9. Aby przezwyciężyć ten problem, w 2018 r. dwie różne grupy9,10 jednocześnie opublikowały protokół uzyskania długoterminowej hodowli organoidów wątrobowych 3D, zaczynając od dorosłych pierwotnych hepatocytów myszy (określanych jako Hep-Orgs). Ich protokoły podsumowują reakcję na uszkodzenia proliferacyjne związane z regeneracją wątroby, hodując hepatocyty o wysokim poziomie cytokin zapalnych, tak jak ma to miejsce po częściowej hepatektomii. Rzeczywiście, powyższe badania pokazują, że hepatocyty mogą przejść w stan przewodowy po urazie12 lub gdy proliferacja cholangiocytów jest stłumiona13. Ich zdolność biopotencjalna umożliwia plastyczność komórkową, co jest ważne w przypadku złożonych struktur, takich jak organoidy. Dlatego protokoły te przezwyciężają problem niezdolności do ekspansji pierwotnych hepatocytów in vitro.
Najnowocześniejsze narzędzie do organoidów 3D wymaga zdolności do izolowania komórek z dorosłej tkanki, a ten początkowy krok jest kluczowy dla uzyskania wysokiej jakości wyniku końcowego. Podczas gdy przygotowanie organoidów 3D można uznać za niedawną i rozwijającą się technikę (ponieważ definicja organoidu została ukuta przez Lancaster14 i Huch15 zaledwie dziesięć lat temu), dwuetapowa perfuzja kolagenazy jest starą procedurą wprowadzoną przez Seglena w latach 197016. Skupiając się na najnowszych publikacjach w tej dziedzinie, protokoły Ng17 i Shen18 można uznać za złoty standard wykonywania procedury u szczurów, podczas gdy te z Cabral19 i Charni-Natan20 dla myszy. Nie jest niczym niezwykłym, że naukowcy koncentrują się na wyborze najlepszej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i czynników wzrostu w celu opracowania organoidów 3D, ale napotykają na awarie, takie jak niewłaściwa procedura chirurgiczna, niska żywotność i wydajność hepatocytów lub wysoki poziom zanieczyszczenia bakteryjnego. Problemy te wydłużają dalsze doświadczenia i zwiększają liczbę zwierząt potrzebnych do kolejnych doświadczeń. I odwrotnie, jeśli procedury chirurgiczne i izolacyjne są dobrze zorganizowane, duża liczba uzyskanych żywotnych hepatocytów pozwala na przygotowanie ogromnej liczby organoidów, ograniczając w ten sposób wykorzystanie zwierząt. Niniejszy protokół rozwiązuje głównie te problemy przy użyciu rozwiązań komercyjnych i optymalizacji precyzyjnej kaniulacji żyły wrotnej, która zapewnia optymalne etapy perfuzji i trawienia z wątrobą in situ.
Aby poprawić jakość, odtwarzalność i przekładalność naszych badań na zwierzętach, starannie rozważyliśmy wytyczne PREPARE: Planowanie badań i procedur eksperymentalnych na zwierzętach: Zalecenia dotyczące doskonałości21. Niniejsze wytyczne dotyczące raportowania mają na celu zwiększenie prawdopodobieństwa sukcesu poprzez planowanie i stanowią ważny krok we wdrażaniu zasady 3R Russela i Burcha (wymiana, redukcja i udoskonalenie). Wytyczne PREPARE obejmują 15 głównych tematów, które powinny być poruszane w każdym indywidualnym projekcie badawczym. Opiszemy tematy, na których skupiliśmy się podczas planowania i przygotowania projektu.
Obecna praca ma na celu opisanie w wyczerpującym, szczegółowym i konsekwentnym protokole kluczowych etapów operacji na modelu szczurzym, aby umożliwić badaczom przyspieszenie i optymalizację dalszych prac. Kiedy na początku podeszliśmy do tych protokołów, napotkaliśmy problemy związane z zanieczyszczeniem bakteryjnym, niską wydajnością trawienia wątroby, niską wydajnością pierwotnych hepatocytów i niską żywotnością hepatocytów, które mogą łatwo wpłynąć na powodzenie techniki. Pokazując, jak zająć się i rozwiązać krytyczne funkcje, protokół ten zoptymalizował procedurę pierwotnej izolacji hepatocytów szczura. Perfuzja wątroby szczura i późniejsza pierwotna izolacja dorosłych hepatocytów są głównymi etapami wstępnymi dla różnych zastosowań. W szczególności protokół ten nadaje się do wszystkich procedur wymagających dobrej wydajności wysokiej jakości i żywotności dorosłych hepatocytów. Wyniki protokołu są odpowiednie do ustanowienia modeli in vitro do badania fizjologii i patologii wątroby.
Protokół
Wszystkie procedury i pomieszczenia dla zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi prawa włoskiego i dyrektywy Wspólnoty Europejskiej. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (zezwolenie nr 321/2022-PR) zgodnie z art. 31 dekretu 26/2014.
1. Przygotowanie do zabiegu na zwierzętach
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla składu podłoża i bufora oraz z Tabelą materiałów dla szczegółów handlowych.
- Podgrzać łaźnię wodną w temperaturze 42 °C, a następnie umieścić bufor perfuzyjny i 1x PBS w łaźni wodnej na około 20 minut.
UWAGA: Ze względu na wrażliwość enzymów, bufor trawienny jest podgrzewany tylko wtedy, gdy procedura perfuzji została pomyślnie rozpoczęta. Podczas procedury perfuzji utrzymuj roztwory w łaźni wodnej. - Umieść na lodzie kompletne podłoże Williama i PBS + 3% P/S.
- Przygotować pompę perystaltyczną i połączyć rurkę ze szklaną butelką i pułapką bąbelkową, oba wypełnione buforem perfuzyjnym.
- Podczas zalewania pompy napełnij rurkę ciepłym buforem perfuzyjnym w celu usunięcia powietrza i wypłukania pozostałego etanolu (niska prędkość pompy). Ten krok jest również ważny, aby sprawdzić, czy pompa działa prawidłowo i czy nie ma wycieku z rurki.
2. Przygotowanie do izolacji hepatocytów
- Podczas zabiegu na zwierzętach należy wystawić na działanie światła UV następujące narzędzia: szalkę Petriego 100 mm, sitko do komórek 100 μm, skrobak wielkości M, dużą pęsetę, zlewkę na lód, tackę na lód.
3. Wstępna procedura na zwierzętach i znieczulenie
- Znieczulić dorosłego szczura (250-350 g masy ciała; wiek 10-12 tygodni) poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszanki środków znieczulających (końcowe stężenie dla ksylazyny: 22,5 mg/kg; dla ketaminy: 112,5 mg/kg; ok. objętość końcowa: 0,8-1,0 ml).
- Monitoruj głębokość znieczulenia poprzez szczypanie palców u stóp, aż szczur przestanie reagować na szkodliwe bodźce. Zwykle trwa to 5 minut. Dawka znieczulająca zapewnia głębokie, chirurgiczne znieczulenie, które minimalizuje ryzyko cierpienia lub stresu podczas zabiegu
UWAGA: Wykrwawienie jest wtórną metodą eutanazji szczurów zastosowaną w tym eksperymencie i zapewnia, że zwierzę zostało skutecznie poddane eutanazji. - Ogolić brzuch i oczyścić go 70% etanolem, aby zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne podczas zabiegu.
UWAGA: Jest to operacja niezapewniająca przeżycia, więc pełna aseptyka nie jest zachowana. - Umieść szczura na środku tacki sekcyjnej i zabezpiecz kończyny za pomocą igieł.
- Wykonaj nacięcie w kształcie litery U przez skórę i mięsień od środka podbrzusza do klatki piersiowej, zaciśnij skórę i złóż ją do głowy, odsłaniając jelita.
- Ostrożnie przesuń jelito na lewą stronę zwierzęcia, poza jamę brzuszną i odsłonić żyłę wrotną wątroby i żyłę główną.
- Za pomocą szczypiec przeciągnij bawełnianą nić pod żyłą wrotną i przygotuj 2 węzły, 1 cm od siebie, które otaczają samą żyłę.
UWAGA: nić jest łatwiejsza do wizualizacji. - Wstrzyknąć 100-150 j.m. heparyny rozpuszczonej w 1x PBS (całkowita objętość 300 μl) do żyły głównej, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
4. Kaniulacja i perfuzja wątroby
- Włącz pompę z niską prędkością (przepływ mniejszy niż 1 ml/min).
- Wprowadzić angiocath 18 G do żyły wrotnej na poziomie gwintu pod płaskim kątem w stosunku do żyły.
- Ręcznie wyjmij igłę wewnętrzną, aby pozostawić kaniulę w żyle. Krew będzie w nim płynąć, wypełniając korek i unikając uwięzionych pęcherzyków powietrza w następnym kroku.
- Podczas gdy bufor perfuzyjny przepływa w przewodach, podłącz kaniulę, naciskając przycisk C do końca wylotowego za pomocą złącza Luer lock.
- W tym momencie zawiąż węzły, jeden wokół cewnika wewnątrz żyły, a drugi wokół cewnika, przed wejściem do żyły, aby ustabilizować rurkę we właściwej pozycji.
- Przeciąć żyłę główną, aby krew mogła wypłynąć. Upewnij się, że wątroba zacznie puchnąć i szybko wybielać (sekundy) w ciągu 2-3 sekund. Potwierdza to, że bufor perfuzyjny prawidłowo przepływa przez wątrobę.
UWAGA: Jeśli niektóre płaty pozostają czerwone, angiocewnik jest umieszczony zbyt głęboko. Jeśli są tylko czerwone plamy, lekkie stukanie w wątrobę może pomóc w perfuzji w określonych punktach. Wlej trochę 1x PBS na otwarty brzuch, aby pomóc w poruszaniu krwi i sprawdzić, czy nie ma wycieków. - Powoli zwiększaj przepływ pompy do 10 ml/min i utrzymuj go przez co najmniej 10 minut, aby umożliwić oczyszczenie wątroby z krwi.
- Podczas perfuzji uciskaj żyłę główną patyczkiem kosmetycznym w odstępach 10 sekund: Upewnij się, że wątroba puchnie po zaciśnięciu i rozluźnia się po uwolnieniu. Powtarzaj ciśnienie okresowo (5-10 razy) i sprawdź, czy wątroba nie jest obrzęknięta i rozluźniona.
UWAGA: Ten krok służy jako kluczowy punkt kontrolny do widocznej walidacji perfuzji. Miało to zasadnicze znaczenie dla zapewnienia wysokiej żywotności hepatocytów i maksymalizacji końcowej wydajności. Poprzez aktywną weryfikację tego procesu, bufor może skutecznie dotrzeć do wszystkich części układu naczyniowego wątroby, czego samo bierne oczyszczanie krwi nie osiągnęłoby.
5. Trawienie wątroby
- Po perfuzji należy przełączyć się na wstępnie podgrzany bufor do wytrawiania, nie przerywając przepływu i unikając pęcherzyków powietrza w przewodach.
UWAGA: Tymczasowe zmniejszenie przepływu może pomóc w wykonaniu tego przejścia. Bufor mineralizacyjny zawiera czerwień fenolową, co ułatwia wizualizację przejścia z bufora perfuzyjnego na bufor mineralizacyjny. - Zwiększ prędkość pompy do 20 ml/min i okresowo naciskaj wacikiem, aby uzyskać obrzęk i rozluźnienie wątroby.
- Po tym kroku (trwającym około 15 minut) upewnij się, że wątroba staje się coraz bardziej papkowata. W tym momencie igłę można wyjąć, a pompa się zatrzymuje.
- Ponieważ torebka wątroby jest delikatna po strawieniu, delikatnie i ostrożnie rozetnij wątrobę: chwyć kleszczami centralną tkankę łączną między płatami. Przetnij wszystkie połączenia z innymi narządami i podnieś wątrobę.
- Umyj wątrobę, zanurzając ją we wstępnie schłodzonym roztworze PBS + 3% P/S na kilka sekund. Następnie umieść go w schłodzonej kompletnej tubie zawierającej podłoże Williama.
UWAGA: Wykrwawienie i śmierć zapewniają perfuzję przez żyłę główną. Potwierdzeniem śmierci zwierzęcia jest odma opłucnowa wywołana w momencie eksplantacji wątroby, a przepona jest w pełni wypreparowana, a po oględzinach oddech i bicie serca nie są już funkcjonalne.
6. Oczyszczanie hepatocytów
- Pod kapturem biologicznym przenieś wątrobę na szalkę Petriego o średnicy 100 mm z 15 ml zimnej pożywki William's na tacy pełnej lodu.
- Energicznie dociśnij narząd skrobakiem, aby uwolnić komórki z pożywki.
UWAGA: Jeśli faza trawienia jest przebiegać prawidłowo, uwalnianie komórek powinno być łatwe i nie wymagać dużego nacisku na wątrobę. Nie kroić wątroby na kawałki; Pozostaw go nienaruszony. Utrzymywanie wątroby zanurzonej w pożywce poprawia uwalnianie komórek. - Zebrać komórki zawierające podłoże i przefiltrować je za pomocą filtra 100 μm, przenosząc je do sterylnej stożkowej probówki. Filtracja pozwala na usunięcie tkanek łącznych oraz niestrawionych fragmentów tkanek.
- Wlej około 15 ml zimnej pożywki William's na rozgniecioną wątrobę na szalce Petriego, aby pomóc uwolnić więcej komórek. Powtórz kroki 6.2 i 6.3.
- Powtórzyć ppkt 6.4 co najmniej raz, aż wszystkie komórki zostaną uwolnione. W razie potrzeby podziel pożywkę na bardziej stożkowe rurki i użyj wielu filtrów 100 μm.
UWAGA: Po uwolnieniu hepatocytów i przed filtrowaniem pożywka powinna wyglądać na nieprzezroczystą ze względu na obecność hepatocytów. Pozostała wątroba powinna wyglądać na włóknistą i zostanie wyrzucona. - Odwirować przefiltrowaną pożywkę zawierającą komórki wątroby przy 50 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C z hamulcem o niskiej prędkości.
UWAGA: Hepatocyty są gęstsze niż inne komórki wątroby. Ze względu na niską siłę wirowania w osadzie pozostaną tylko hepatocyty, podczas gdy inne komórki pozostaną w supernatancie. - Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego. Delikatnie dodaj około 40 ml lodowatego kompletnego podłoża Williama do probówki i powoli pipetuj w górę i w dół 2 do 3 razy, aby ponownie zawiesić osad komórek.
UWAGA: Osad komórkowy należy ostrożnie zawiesić, aby uniknąć uszkodzenia komórek. - Wirować przy 50 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
UWAGA: W przypadku pierwszych prób policz żywe komórki za pomocą testu błękitu trypanowego 1:10 po drugim odwirowaniu przed przejściem do kolejnych kroków. Pozwala to uniknąć marnowania mediów i czasu, jeśli wszystkie komórki są martwe. - Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 25 ml lodowatego kompletnego podłoża Williama.
- Dodaj 25 ml roztworu gradientu gęstości 90% do probówki i delikatnie wymieszaj.
UWAGA: Roztwór gradientu gęstości oddziela żywotne hepatocyty od martwych hepatocytów i szczątków komórkowych na podstawie ich gęstości. - Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki musi być uzyskana widoczna osadka, odpowiadająca żywotnym hepatocytom, oraz przezroczysta warstwa na górze gradientu złożona z martwych hepatocytów.
UWAGA: Jeśli w ogóle nie ma osadu, spróbuj ponownie wymieszać roztwór, obracając i powtórz wirowanie. - Odessać warstwę martwych komórek od góry gradientu i pozostawić 1-2 ml pożywki z osadem.
- Zawiesić osad w 30-40 ml kompletnego podłoża Williama.
UWAGA: Do całej procedury należy używać wyłącznie pipet serologicznych o pojemności 25 ml. Pipety o mniejszych średnicach mogą zmniejszać żywotność hepatocytów. Wszystkie kroki należy wykonywać na lodzie, aby utrzymać temperaturę +4°C. - Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie odessać supernatant.
7. Hodowla hepatocytów i kolekcja RNA
- Dodaj odpowiednią ilość pożywki do liczenia komórek. Policz żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego w skali 1:10.
- Posiew hepatocytów 2D
- Komórki płytkowe w stężeniu 500 000 komórek / studzienkę 6-dołkowej płytki na pokrytej kolagenem płytce komórkowej ze wstępnie podgrzanym kompletnym podłożem Williama.
- Umieścić hodowlę komórkową w wilgotnym inkubatorze z 95% powietrzem, 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po 4 godzinach zmień podłoże na nowe, wstępnie podgrzane, kompletne podłoże Williama.
- Utrzymuj komórki w inkubatorze. Zmieniaj medium codziennie.
- Zebrać pierwszorzędowe hepatocyty w odczynniku do ekstrakcji RNA przed posiewem (dzień 0) i w dniach 1 do 3 hodowli.
- Ekstrahować RNA zgodnie z protokołem producenta i dokonywać odwrotnej transkrypcji do cDNA w celu oceny genów markerów wątrobowych metodą RT-qPCR. Wykaz starterów przedstawiono w tabeli 2.
- Do długoterminowej hodowli hepatocytów 3D:
- Ponownie zawiesić komórki w zimnej, czystej matrycy o stężeniu 1 000-10 000 komórek w 20 μl.
UWAGA: Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków matrycy. - Używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet, umieść kropelki komórek zawierające matrycę na wstępnie podgrzanej płytce do hodowli komórek.
- Odwróć płytkę do góry nogami i pozostaw ją w inkubatorze do hodowli komórkowych na 20-30 minut.
- Podkręć i dodaj wstępnie podgrzaną pożywkę 3D do długotrwałych hepatocytów i specyficzną pożywkę hodowlaną zgodnie z work22 Penga. Utrzymuj komórki w inkubatorze.
- Zmieniaj długotrwałą pożywkę hepatocytów 3D co 2-3 dni.
- Co najmniej po 14 dniach hodowli Hep-Orgi są oddzielane od matrycy, a żywotne Hep-Orgi są oceniane za pomocą testu proliferacji błękitu trypanowego i EdU i pasażowane zgodnie z pracą Penga.
- Ponownie zawiesić komórki w zimnej, czystej matrycy o stężeniu 1 000-10 000 komórek w 20 μl.
Wyniki
Po zakończeniu procedur przygotowawczych (krok 6.13) uzyskano wydajność komórkową na poziomie do 1 x 108 komórek na jedną izolację z wątroby szczura o masie około 300 g. Żywotność komórek w zakresie od 78% do 97% ustalono za pomocą liczenia z zastosowaniem błękitu trypanu.
Jak opisano w poprzednich badaniach1,18,19, pierwotne hepatocyty w kulturze tracą swoją morfologię, funkcje specyficzne dla wątroby i obumierają w ciągu kilku dni.
W literaturze jest dobrze znane23,24, że pierwotne hepatocyty dorosłych szybko tracą morfologię sześcianowo-heksagonalną, w ciągu kilku dni przyjmują kształt „fibroblastopodobny” i obumierają. Rysunek 1 przedstawia poszczególne fazy: 4 h po wysianiu na płytkę powlekaną kolagenem hepatocyty przylegają do powierzchni, rozprzestrzeniają się w typowej monowarstwie wykazując morfologię sześcianowatą, krawędzie komórek są wyraźne, połączenia między komórkami są liniowe, a powierzchnia komórek wydaje się gładka (Rysunek 1A). W 1. dniu pierwotne hepatocyty nabywają swojego typowego heksagonalnego kształtu i widoczne stają się kropelki lipidów (Rysunek 1B). W dniach 2-3 liczba kropelek lipidów wzrasta (Rysunek 1C-1D), natomiast w dniach 4-5 w komórkach gromadzą się aktynowe włókna stresu (Rysunek 1E-F). Oceńiono również odsetek żywych komórek w pierwotnej hodowli 2D od 1. do 5. dnia i porównano go z żywotnością przed wysianiem w dniu 0 (Rysunek 2). Można zaobserwować drastyczny spadek żywotności już w pierwszych dniach hodowli, osiągający 49,5% (SD 12,7) w 1. dniu, co spada do 45,2% (SD 18,2) w 2. dniu i 33,5% (SD 0,77) w 3. dniu. Odsetek żywych komórek w 4. dniu wynosi już 16,9% (SD 5,4), a w 5. dniu osiąga 9,1% (SD 0,38). Jest zatem oczywiste, że utrata morfologii towarzyszy szybkiej, postępującej śmierci komórek hepatocytów dorosłych w hodowli 2D.
Izolowane hepatocyty przed wysianiem (dzień 0) wykazywały wysoką ekspresję mRNA genów markerowych wątroby (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) ocenianą za pomocą RT-qPCR (Rysunek 3). Wszystkie analizowane geny wykazują zależny od czasu hodowli spadek ekspresji już w 1. dniu hodowli. Poziomy ekspresji mRNA podkreślają utratę funkcjonalności i żywotności pierwotnych hepatocytów w czasie.
Izolowane hepatocyty wysiano w kropelkach macierzy 3D, a następnie monitorowano w czasie tworzenie się struktur komórkowych organoidów 3D. W 1. dniu hodowli pojedyncze hepatocyty znajdują się w zawiesinie w kropelkach macierzy (Rysunek 4A). Stężenie komórek celowo utrzymywano na niskim poziomie, aby zapewnić hepatocytom wystarczającą przestrzeń do wzrostu. Pozwala to również na wizualne śledzenie wzrostu organoidów. Pierwotne hepatocyty wykazywały podziały komórkowe w pierwszych kilku dniach hodowli (Rysunek 4C). Ponadto, podczas gdy w dniu 0 wymiary Hep-Orgs wynosiły 30 μm, w dniu 2 Hep-Orgs niemal podwoiły swoje rozmiary, co podkreśla wzrost wielkości utrzymujący się do 15. dnia (33,08 μm w dniu 1; 64,86 μm w dniu 2; 45,06 μm w dniu 5; 55,19 μm w dniu 7; 51,93 μm w dniu 10; 62,90 μm w dniu 15). Jeśli chodzi o kształt Hep-Orgs, o ile w 1. dniu były one okrągłe, w kolejnych dniach przybrały kształt „grona winogrona” (typowy dla organoidów wątrobowych).
Hepatocyty wysiane w matrycy 3D pozostają żywe w hodowli przez wiele tygodni, wykazując przeżywalność na poziomie 23% ±10% po 15 dniach w teście z użyciem błękitu trypanu (Rycina 4B, pierwszy rząd). W celu potwierdzenia proliferacji szczurzych Hep-Orgs w 15. dniu przeprowadzono test EdU (Rycina 4D). Niemniej jednak barwienie Hoechst wykazało dużą liczbę pojedynczych komórek zamiast Hep-Orgs; aktywność proliferacyjna hepatocytów (komórki zielone) była obecna, mimo że wbudowywanie EdU było niskie (9% ± 7%) (Rycina 4B, drugi rząd).
Rysunek 1: Hodowla 2D pierwotnych hepatocytów na płytkach powlekonych kolagenem w czasie. Obrazy wykonano przy powiększeniu 20x przy użyciu (A) mikroskopii fazokontrastowej 4h po wysiewaniu, (B) w 1. dniu, (C) w 2. dniu, (D) w 3. dniu, (E) w 4. dniu, (F) w 5. dniu. Na każdym zdjęciu zamieszczono pasek skali odpowiadający 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Żywe pierwotne komórki w hodowli 2D na płytkach powlekanych kolagenem. Wykres przedstawia procent żywych komórek od 1. do 5. dnia w porównaniu do żywych komórek wysianych w dniu 0., przyjętych jako 100%. Wyniki przedstawiono jako pojedyncze powtórzenia, średnią oraz SD z 3 różnych eksperymentów (* p-value ≤ 0.05; ** p-value ≤ 0.005). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Ekspresja mRNA markerów wątrobowych zmierzona metodą RT-qPCR w pierwotnych hepatocytach. Wyniki znormalizowano względem β-Actin i/lub GAPDH (genów housekeepingowych) i wyrażono w stosunku do pierwotnych hepatocytów pobranych przed wysianiem w dniu 0, przyjętym jako 1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z co najmniej 3 różnych eksperymentów (**+ p-value ≤ 0,001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Hodowla 3D hepatocytów w kropelkach macierzy w czasie. (A) Izolowane hepatocyty wysiane w kropelkach macierzy w celu stworzenia długoterminowych Hep-Orgs: na zdjęciu kropelki macierzy są widoczne na powierzchni studzienki (czerwone koło = jedna kropelka). (B) Procent żywych komórek określony za pomocą błękitu trypanu oraz procent komórek proliferujących określony za pomocą EdU w 15. dniu przed pasażowaniem. Ilościowe oznaczenie komórek EdU-dodatnich wykonano przy użyciu oprogramowania ImageJ2. Wyniki przedstawiono w procentach jako średnia±SD z co najmniej 3 różnych eksperymentów. (C) Obrazy w kontraście fazowym 3D hodowli Hep-Orgs szczura w różnych dniach wzrostu w kulturze 3D: dzień 1, 2, 5, 7, 10, 15. Powiększenie zdjęcia 20X. Na każdym zdjęciu znajduje się pasek skali odpowiadający 50 µm. (D) Test wbudowywania EdU w Hep-Orgs szczura w 15. dniu. Powiększenie zdjęcia 20X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Skład buforów i pożywek. Tabela zawiera nazwy i składniki (wraz z ich stężeniem końcowym) wszystkich buforów i pożywek komórkowych wykorzystanych w protokole.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Lista starterów dla szczura.Tabela zawiera listę starterów użytych w eksperymentach RT-qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Organoidy 3D są granicą dla medycyny spersonalizowanej i pozwalają na długotrwałą hodowlę hepatocytów. Jakość tej innowacyjnej techniki wymaga dobrego plonu żywotnych hepatocytów pierwotnych oraz dobrze przeprowadzonej perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów. Ta stara procedura jest nadal szeroko stosowana; Składa się jednak z różnych kroków, które mogą być trudne. Podchodząc do zabiegu, doświadczyliśmy krytycznych problemów, takich jak zanieczyszczenie bakteryjne, niska wydajność trawienia wątroby, niska wydajność pierwotnych hepatocytów i niska żywotność hepatocytów, z których wszystkie mogą łatwo wpłynąć na powodzenie techniki. Zaczynając od złotego standarduprotokołów 17,18, tutaj podkreślamy, jak przezwyciężyć typowe problemy, wyjaśniamy najbardziej krytyczne kroki w pierwotnej izolacji hepatocytów szczura i podsumowujemy rozproszone wskazówki, które mogą łatwo wpłynąć na sukces techniki w modelu szczurzym. Chociaż procedura perfuzji wątroby jest dość trudna i wymaga od operatora precyzyjnej wiedzy specjalistycznej, gwarantuje wysokiej jakości wyniki pod względem wydajności, integralności, żywotności i funkcjonalności pierwotnych hepatocytów. Cechy te są niezbędne dla kolejnych etapów.
Podczas planowania projektu dokładnie wzięliśmy pod uwagę listę kontrolną wytycznych PREPARE21. Szczególną uwagę zwrócono na literaturę przedmiotu, porównując różne wcześniejsze prace i nawiązując kontakt z niektórymi autorami (lista kontrolna wytycznych PREPARE _topic A1). Samo narzędzie organoidowe jest ważnym sposobem na zmniejszenie liczby zwierząt, ponieważ komórki mogą rozmnażać się w kulturze przez okres do 7 miesięcy (lista kontrolna wytycznych PREPARE _topic A3). W wyniku dialogu z personelem zakładu dla zwierząt wybraliśmy doświadczonego technika, który udzielił pomocy w procedurze i przyczynił się do uniknięcia wykorzystania nadwyżek zwierząt doświadczalnych (lista kontrolna wytycznych PREPARE _topic B5). Uzyskano odpowiednią pompę perystaltyczną niezbędną do przeprowadzenia perfuzji wątroby (lista kontrolna wytycznych PREPARE _topic B6).
Publikacje Ng17 i Shen18 są najnowszymi opisującymi procedurę u szczurów. Główne kwestie, na które odpowiada niniejszy protokół, a które nie zostały poruszone w poprzednich, dotyczą zastosowania komercyjnych rozwiązań i optymalizacji precyzyjnej kaniulacji żyły wrotnej, która zapewnia optymalne etapy perfuzji i trawienia utrzymując wątrobę in situ. Podczas gdy protokoły Shen18 i Ng17 wykorzystywały rozwiązania domowej roboty, nasz protokół opiera się na komercyjnych roztworach perfuzji i trawienia w celu zmniejszenia zmienności w przygotowaniu buforu. Nadmierne stężenie enzymów trawiennych może być agresywne w stosunku do hepatocytów i wpływać na jakość i żywotność komórek25. Zastosowanie rozwiązań komercyjnych ma kluczowe znaczenie dla poprawy odtwarzalności protokołu, gwarantując standaryzację. Co więcej, protokół wykonywany przez Ng17 może być trudny ze względu na konieczność usunięcia wątroby przed fazą trawienia. Nasz protokół opiera się na perfuzji i trawieniu wątroby bez jej usuwania, dopóki obie fazy nie zostaną wykonane, co upraszcza procedurę. Pod względem uzysku i żywotności komórek wyniki naszego protokołu są porównywalne z wcześniejszymi pracami.
Czyszczenie i dezynfekcja rurki perfuzyjnej, przed i po zabiegu, wraz z dezynfekcją skóry przed rozpoczęciem zabiegu, są bardzo ważne dla ograniczenia skażenia bakteryjnego. Ponadto całkowite wysuszenie rurki po oczyszczeniu etanolem i późniejszym umyciu pożywką ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia żywotności komórek. W rzeczywistości nawet pojedynczy zastrzyk etanolu wstrzyknięty do wątroby spowodowałby śmierć komórki podczas zabiegu.
Ważna jest temperatura wstrzykiwanego roztworu, ale należy również wziąć pod uwagę wrażliwość enzymu kolagenazy na temperaturę. Z tego powodu przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego wstępnie podgrzaliśmy bufor perfuzyjny w temperaturze 42 °C, natomiast bufor trawienny umieściliśmy w kąpieli rozgrzewającej tylko na etapie perfuzji. Dodanie pułapki bąbelkowej do rurki przed cewnikiem zapobiega przedostawaniu się pęcherzyków do cewnika, a także przedostawaniu się powietrza do wątroby, gdy skończy się roztwór perfuzyjny17.
Skład buforu, ciśnienie perfuzji i natężenie przepływu powinny mieścić się w odpowiednim zakresie17. Przekonaliśmy się, że niskie ciśnienie i niskie natężenie przepływu powodują niską wydajność i negatywnie wpływają na żywotność komórek, ponieważ bufor nie mógł dotrzeć do małych zbiorników. Z drugiej strony natężenie przepływu nie powinno być zbyt wysokie, aby kapsuła Glissona pozostała nienaruszona. Ponieważ integralność adhezji komórkowej wymaga Ca2 + 18, bufor perfuzyjny jest roztworem wolnym od Ca2 + zawierającym EDTA, który atakuje mostki zawierające wapń między komórkami, dlatego jest niezbędny do usuwania wapnia i wypłukiwania krwi z wątroby. Czas perfuzji wynoszący 8-15 minut przy natężeniu przepływu 10 ml/min jest kluczowy, aby umożliwić dotarcie do wszystkich komórek przez roztwór wolny od EDTA, Ca2+. Nieoptymalna perfuzja może prowadzić do zmniejszonego trawienia.
Bufor trawienny zawiera Ca2+, ponieważ kolagenaza trawiąca macierz kolagenową jest zależna od Ca2+ . Natężenie przepływu buforu wytrawiającego powinno być utrzymywane na poziomie co najmniej 20 ml/min, a czas ten zależy od pojemności kolagenazy. W przypadku specyficznego buforu do wytrawiania, którego używamy, musimy perfundować przez 15 minut, aby uzyskać końcową objętość 300 ml roztworu. Jeśli trawienie jest niepełne, połączenia komórka-komórka są utrzymywane, a kolejne naciski mechaniczne uszkadzają komórki, zmniejszając ich żywotność. Powolne zwiększanie natężenia przepływu przyczynia się do zmniejszenia stresującego wpływu perfuzji na komórki. Podczas operacji skupiliśmy się na przejściowym zaciśnięciu żyły głównej dolnej i późniejszym obrzęku wątroby: to przejście znacznie poprawiło zarówno efektywność trawienia, jak i regenerację komórek. Pod koniec trawienia wątroba powinna wyglądać na jasnobrązową i miękką. Po zakończeniu resekcji wątroby, mycie wyizolowanej wątroby w PBS +3% P/S zmniejsza tytuł bakteryjny i pomaga uniknąć zanieczyszczenia w dalszej części procedury.
W przypadku etapów izolacji hepatocytów pod maską biologiczną zastosowanie pipet serologicznych o pojemności 25 ml pozwala uniknąć zmniejszenia żywotności hepatocytów przez pipety o mniejszej średnicy. Dodaliśmy opcjonalny krok w celu zwiększenia pierwotnej wydajności hepatocytów, który polega na wylaniu kompletnej pożywki Williama na rozbitą wątrobę, aby powtórzyć etap skrobania pod maską. Ten krok jest wykonywany po przefiltrowaniu pożywki uwalnianej przez komórki z izolowanej wątroby i pomaga oczyścić Petriego i odzyskać więcej komórek z torebki wątrobowej. Jeśli konieczne jest zastosowanie wysokiego ciśnienia, aby przesunąć hepatocyty przez filtry, żywotność komórek będzie niska19.
Niezdolność hepatocytów do hodowli 2D przez więcej niż 2 dni skłoniła nas do znalezienia alternatywnego długoterminowego modelu hodowli. Odpowiednim modelem do hodowli hepatocytów przez dłuższy czas jest dorosły Hep-Org. W porównaniu z hepatocytami 2D, Hep-Orgs okazały się nadal żywotne i w aktywnej proliferacji w 15 dniu, wykazując długoterminowy potencjał.
Perfuzja wątroby szczura i późniejsza pierwotna izolacja dorosłych hepatocytów są głównymi etapami wstępnymi dla różnych zastosowań. Chociaż powtarzalność może być ograniczeniem techniki, ponieważ procedura obejmuje wiele etapów i zmiennych, zwrócenie uwagi na wizualny opis procedury pomaga odtworzyć metodę z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Wskazując krytyczne etapy i pokazując, jak sobie z nimi poradzić, protokół ten optymalizuje procedurę pierwotnej izolacji hepatocytów szczura i wyniki odpowiednie do ustanowienia modeli in vitro , takich jak pokolenie Hep-Orgs, w celu zbadania fizjologii i patologii wątroby.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Davide Selvestrelowi i prof. Giovanniemu Sorrentino z SorrentinoLab na Uniwersytecie w Trieście za pomoc w przeprowadzeniu testu proliferacji EdU. Prace były wspierane przez grant ad hoc Banca d'Italia oraz granty FIF w ramach programu stacjonarnego.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| A83-01- Inhibitor ALK5 IV | Podwójna helisa | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym | Zestaw do obrazowania Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Kolagen, typ I, roztwór z ogona szczura | Merck | C3867-1VL | |
| Deksametazon | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparyna sodowa 25000 j.m./5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| Roztwór insuliny-transferyny-selenu 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| roztwór L-glutaminy | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | Thermofisher Naukowy | 17703-034 | |
| Pożywka do perfuzji wątroby | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| Suplement N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylocysteina | Merck | A9165 | |
| Nikotynamid | Merck | N-0636 | |
| Aminokwasy endogenne | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| Bufor PBS 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A Pompa | |
| perystaltyczna | Ismatec i handel; | MS-4/12 Reglo Pompa | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| TRI Odczynnik | Merck | T9424 | |
| Rurki | Ismatec i handel; | ID.2,79mm | |
| Williams' E Medium, bez glutaminy | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Bibliografia
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
- Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
- Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
- Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
- Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
- Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
- Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
- Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
- Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
- Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
- Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).
Przedruki i uprawnienia
