Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rosnące dowody wskazują, że odpowiedź odpornościowa wywoływana przez zaburzenia mózgowe (np. niedokrwienie mózgu i autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego) zachodzi nie tylko w mózgu, ale także w czaszce. Kluczowym krokiem do analizy zmian w populacjach komórek odpornościowych zarówno w mózgu, jak i w rdzeniu kostnym czaszki po uszkodzeniu mózgu (np. udar) jest uzyskanie wystarczającej liczby wysokiej jakości komórek odpornościowych do dalszych analiz. Tutaj podawane są dwa zoptymalizowane protokoły do izolacji komórek odpornościowych z mózgu i rdzenia kostnego czaszki. Zalety obu protokołów przekładają się na ich prostotę, szybkość i skuteczność w uzyskaniu dużej ilości żywych komórek odpornościowych. Komórki te mogą być odpowiednie dla szerokiego zakresu zastosowań wtórnych, takich jak sortowanie komórek, cytometria przepływowa i analiza transkryptomowa. Aby wykazać skuteczność protokołów, eksperymenty immunofenotypowań przeprowadzono na mózgach po udarze i normalnym mózgu oraz rdzeniu kostnym czaszki za pomocą analizy cytometrii przepływowej, a wyniki zgadzały się z wynikami opublikowanych badań.
Wprowadzenie
Mózg, centralny węzeł układu nerwowego, jest chroniony przez czaszkę. Pod czaszką znajdują się trzy warstwy tkanki łącznej znane jako oponowe - twarda macica, pajęczynówka i miękka macica. Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) krąży w przestrzeni podpajęczynówkowej między pajęczynówką a miękką macicą, ochraniając mózg i usuwając odpady poprzez układ glymphaticzny1,2. Razem, ta unikalna architektura zapewnia bezpieczne i wspierające środowisko, które utrzymuje stabilność mózgu i chroni go przed potencjalnymi obrażeniami.
Mózg przez długi czas był uważany za przywilejowany immunologicznie. Jednak ta koncepcja została częściowo porzucona, ponieważ rosnące dowody wskazują, że oprócz rezydujących mikrogleju w parenchymie, granice mózgu, w tym splot chóroidowy i oponowe, są siedliskiem różnorodnych komórek immunologicznych3. Te komórki odgrywają kluczowe role w utrzymaniu homeostazy, nadzorowaniu zdrowia mózgu i inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej na uszkodzenie mózgu. Warto zauważyć, że ostatnie odkrycia wskazują, że czaszka jest zaangażowana w odporność opon, i może przyczyniać się do odpowiedzi immunologicznej w mózgu po urazie. W 2018 roku Herisson i wsp. dokonali zasadniczego odkrycia bezpośrednich kanałów naczyniowych, które łączą szpik kostny czaszki z oponowymi, stając się w ten sposób anatomiczną drogą migracji leukocytów4,5. Później Cugurra i wsp. wykazali, że wiele komórek szpikowych (np. monocyty i neutrofile) i komórki B w oponowych nie pochodzi z krwi6. Za pomocą technik, takich jak przeszczep płata kości czołowej i selektywne reżimy napromieniowania, autorzy przedstawili przekonujące dowody, że szpik kostny czaszki służy jako lokalne źródło komórek szpikowych w oponach, a także w parenchymie OUN po urazie OUN6. Co więcej, inne badanie zasugerowało, że komórki B oponowe są stale zaopatrywane przez szpik kostny czaszki7. Ostatnio, nowa struktura, zwana wyjściem mankietu pajęczynówkowego (ACE), została zidentyfikowana jako bezpośrednia brama między twardą macicą a mózgiem dla przemieszczania się komórek immunologicznych8.
Te ekscytujące odkrycia mają ważne implikacje dla pochodzenia infiltrujących komórek immunologicznych do uszkodzonego mózgu (np. po udarze niedokrwiennym). Dużo dowodów wskazuje, że po udarze wiele komórek immunologicznych infiltruje mózg, przyczyniając się zarówno do ostrego uszkodzenia mózgu, jak i przewlekłej regeneracji mózgu. Konwencjonalna koncepcja jest taka, że te komórki to krążące leukocyty we krwi, które infiltrują mózg, co jest w dużej mierze ułatwione przez uszkodzenie bariery krew-mózg spowodowane udarem. Jednak ta koncepcja została zakwestionowana. W jednym badaniu komórki immunologiczne w czaszce i kości strzałkowej myszy zostały oznaczone inaczej, a 6 godzin po udarze stwierdzono znacznie większy spadek neutrofili i monocytów w czaszce vs. kość strzałkowa, a więcej neutrofili pochodzących z czaszki było obecnych w mózgu dotkniętym zawałem. Te dane sugerują, że w ostrym okresie udaru, neutrofile w mózgu dotkniętym zawałem pochodzą głównie z szpiku kostnego czaszki4. Co ciekawe, PMR może kierować tą migracją. Rzeczywiście, dwa ostatnie raporty wykazały, że PMR może bezpośrednio przekazywać sygnały z mózgu do szpiku kostnego czaszki poprzez kanały czaszki i instruować migrację komórek i hematopoezę w szpiku kostnym czaszki po urazie OUN9,10.
W świetle tych ostatnich odkryć stało się ważne, aby analizować zmiany w komórkach immunologicznych zarówno w mózgu, jak i w szpiku kostnym czaszki, podczas badania odpowiedzi immunologicznej na zaburzenia mózgu. W takich badaniach potrzebna jest wystarczająca liczba wysokiej jakości komórek immunologicznych do dalszych analiz, takich jak sortowanie komórek, analiza cytometrii przepływowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq). Tutaj, głównym celem jest przedstawienie dwóch zoptymalizowanych procedur przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek z tkanki mózgowej i szpiku kostnego czaszki. Ważne jest, aby zauważyć, że czołowa kości (kości czołowa, kości potyliczna i kości skroniowe) czaszki są zwykle używane do ekstrakcji szpiku kostnego, a ten szpik kostny jest w całym badaniu określany jako szpik kostny czaszki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół zatwierdzono przez Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). W badaniu tym użyto myszy C57Bl/6 (w wieku 3-4 miesięcy; 22-28 g). Szczegóły reagentów i wykorzystanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Jednokomórkowa zawiesina z mózgu myszy
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu izolacji komórek mózgowych.
- Znieczulić, intubować i zabezpieczyć mysz, jak pokazano wcześniej11.
- Wykonać górny nacięcie brzucha przez skórę i warstwy mięśni, a następnie ostrożnie przeciąć przeponę i żebra, aby stworzyć otwory w jamie klatki piersiowej.
- Nadmuchać strzykawkę 30 mL zimnym PBS i podłączyć ją do stępionej igły perfuzyjnej za pośrednictwem silikonowego wężyka. Ostrożnie włożyć igłę perfuzyjną do lewej komory.
- Wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić drenaż krwi, a następnie perfuzować12 mysz z szybkością około 10 mL/min przez 3-4 min.
UWAGA: Aby poprawić oczyszczanie krwi z mózgu, można rozważyć zwiększenie objętości roztworu perfuzyjnego i dodanie heparyny. - Odciąć głowę myszy i wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej na skórze na szczycie głowy, aby odsłonić czaszkę.
- Ostrożnie usunąć wszelkie tkanki łączne pokrywające czaszkę za pomocą stępionych kleszczyków.
- Za pomocą ostrych nożyczek do precyzyjnego przecięcia szwów czaszki wzdłuż linii środkowej i po obu stronach, tworząc klapkę.
- Delikatnie unieść klapkę czaszki, aby odsłonić mózg, i za pomocą stępionych kleszczyków delikatnie usunąć mózg z jamy czaszkowej.
- Zanieść mózg do naczynia Petriego zawierającego lodowate PBS i usunąć wszelkie pozostałe tkanki oponowe.
UWAGA: Aby lepiej zachować żywotność komórek, zaleca się wykonywanie wszystkich kolejnych kroków na lodzie lub w 4 °C. - Umieścić mózg w wstępnie schłodzonej szyszce do rozdrabniania szkła Dounce o pojemności 15 mL zawierającej 20 mL (cały mózg) lub 12 mL (połowa mózgu) lodowego buforu HBSS.
- Za pomocą luźnego tłoczka Dounce delikatnie i powoli rozdzielić tkankę mózgu za pomocą około 100-120 ruchów na lodzie.
UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla uzyskania dużej ilości zdrowych komórek mózgowych. Ten krok trwa około 10 min. Przerwać homogenizację, gdy w zawiesinie nie widać już znaczących kawałków tkanki mózgowej. W tym momencie tłoczek może łatwo poruszać się w dół bez użycia siły. - Przefiltrować powstałą zawiesinę tkanki mózgowej przez sitko komórkowe o średnicy 70 µm w 50 mL rurce do wirowania.
- Przepłukać szyszkę Dounce 5 mL HBSS i kontynuować filtrację, aby zmaksymalizować zebranie komórek.
- Wirować zawiesinę tkankową w temperaturze 550 x g przez 6 min w 4 °C.
- Usunąć nadstan za pomocą aspiranta próżniowego i ponownie zawiesić peletę komórek w 1 mL 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej.
UWAGA: Aby uzyskać 15 mL 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej, należy wymieszać 4,5 mL 100% medium gradientu gęstości podstawowej, 1,5 mL 10× PBS i 9 mL ddH2O. - Przenieść zawiesinę komórek do 15 mL rury do wirowania i dodać 9 mL (cały mózg) lub 6 mL (połowa mózgu) 30% roztworu gradientu gęstości.
- Delikatnie odwrócić rurkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Natychmiast wirować rurkę w temperaturze 845 x g z przyspieszeniem i hamulcem ustawionym na poziomie 3, przez 20 min w 4 °C.
- Delikatnie zdjąć rurkę z wirówki bez wstrząsania i ostrożnie aspiracyjnie usunąć górną warstwę mieliny za pomocą końcówki 1 mL podłączonej do próżni.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie zakłócać tej warstwy. Jakakolwiek pozostała mielina może negatywnie wpłynąć na zdrowie komórek i zaburzyć dalszą analizę. - Aspiracyjnie usunąć nadstan, pozostawiając 1-2 mL, i ponownie zawiesić peletę komórek w minimum 10 mL zimnego HBSS.
- Wirować w temperaturze 550 x g przez 6 min w 4 °C.
- Jeszcze raz przepłukać w minimum 7 mL zimnego HBSS.
- Usunąć jak najwięcej nadstanu i ponownie zawiesić komórki do analizy cytometrii przepływowej za pomocą 100-200 µL buforu cytometrii przepływowej.
UWAGA: Bufor FACS cytometrii przepływowej stosowany w tym badaniu zawiera 0,5% BSA i 2 mM EDTA w 1× PBS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby przygotować komórki odpornościowe z tkanki mózgu myszy, protokół ogólnie daje komórki o wysokiej żywotności (84,1% ± 2,3% [średnia ± SD]). Około 70%-80% tych komórek jest dodatnich na CD45. W normalnym mózgu myszy prawie wszystkie komórki CD45+ są mikrogleją (CD45LowCD11b+), jak się spodziewa. Ten protokół był stosowany w laboratorium do różnych zastosowań, w tym do analizy cytometrii przepływowej, sortowania komórek z aktywacją fluorescencyjną (FACS) i analizy scRNA-seq. Na przykład,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tu, dwa proste, ale skuteczne protokoły są przedstawione w celu odizolowania komórek odpornościowych z mózgu i rdzenia kostnego czaszki. Protokoły te mogą niezawodnie dostarczyć dużą ilość żywych komórek odpornościowych, które mogą być odpowiednie dla różnych zastosowań w dalszym ciągu, w szczególności do cytometrii przepływowej.
Aby badać neuroinflamacje w różnych zaburzeniach mózgu, wiele protokołów przygotowania komórek odpornościowych z mózgu zostało ustanowionych i stosowanych w różnych l...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy Kathy Gage za jej doskonały wkład redakcyjny. Ilustracje stworzono z wykorzystaniem BioRender.com. To badanie zostało wsparte środkami z Wydziału Anestezjologii (Duke University Medical Center) oraz grantami NIH NS099590, HL157354 i NS127163.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-well V-bottom microplate | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA flow cytometer | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 dilution |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 dilution |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 dilution |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 dilution |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 dilution |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 dilution |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 dilution |
| Cell Strainer 70 um | Avantor | 732-2758 | |
| Dressing Forceps | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| Forceps | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 dilution |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 dilution |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 dilution |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 dilution |
| Percoll (density gradient medium) | Cytiva | 17089101 | |
| Phosphate buffer saline (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Scissors | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size | DWK Life Sciences | 357544 |
Bibliografia
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
- Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
- Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
- Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
- Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
- Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
- Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
- Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
- Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
- Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
- Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
- Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
- Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
- Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
- Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
- Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
- Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
- Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
- Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
