Artykuł metodologiczny

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

DOI:

10.3791/66861

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program (MBPP), Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące dowody wskazują, że odpowiedź odpornościowa wywoływana przez zaburzenia mózgowe (np. niedokrwienie mózgu i autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego) zachodzi nie tylko w mózgu, ale także w czaszce. Kluczowym krokiem do analizy zmian w populacjach komórek odpornościowych zarówno w mózgu, jak i w rdzeniu kostnym czaszki po uszkodzeniu mózgu (np. udar) jest uzyskanie wystarczającej liczby wysokiej jakości komórek odpornościowych do dalszych analiz. Tutaj podawane są dwa zoptymalizowane protokoły do izolacji komórek odpornościowych z mózgu i rdzenia kostnego czaszki. Zalety obu protokołów przekładają się na ich prostotę, szybkość i skuteczność w uzyskaniu dużej ilości żywych komórek odpornościowych. Komórki te mogą być odpowiednie dla szerokiego zakresu zastosowań wtórnych, takich jak sortowanie komórek, cytometria przepływowa i analiza transkryptomowa. Aby wykazać skuteczność protokołów, eksperymenty immunofenotypowań przeprowadzono na mózgach po udarze i normalnym mózgu oraz rdzeniu kostnym czaszki za pomocą analizy cytometrii przepływowej, a wyniki zgadzały się z wynikami opublikowanych badań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg, centralny węzeł układu nerwowego, jest chroniony przez czaszkę. Pod czaszką znajdują się trzy warstwy tkanki łącznej znane jako oponowe - twarda macica, pajęczynówka i miękka macica. Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) krąży w przestrzeni podpajęczynówkowej między pajęczynówką a miękką macicą, ochraniając mózg i usuwając odpady poprzez układ glymphaticzny1,2. Razem, ta unikalna architektura zapewnia bezpieczne i wspierające środowisko, które utrzymuje stabilność mózgu i chroni go przed potencjalnymi obrażeniami.

Mózg przez długi czas był uważany za przywilejowany immunologicznie. Jednak ta koncepcja została częściowo porzucona, ponieważ rosnące dowody wskazują, że oprócz rezydujących mikrogleju w parenchymie, granice mózgu, w tym splot chóroidowy i oponowe, są siedliskiem różnorodnych komórek immunologicznych3. Te komórki odgrywają kluczowe role w utrzymaniu homeostazy, nadzorowaniu zdrowia mózgu i inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej na uszkodzenie mózgu. Warto zauważyć, że ostatnie odkrycia wskazują, że czaszka jest zaangażowana w odporność opon, i może przyczyniać się do odpowiedzi immunologicznej w mózgu po urazie. W 2018 roku Herisson i wsp. dokonali zasadniczego odkrycia bezpośrednich kanałów naczyniowych, które łączą szpik kostny czaszki z oponowymi, stając się w ten sposób anatomiczną drogą migracji leukocytów4,5. Później Cugurra i wsp. wykazali, że wiele komórek szpikowych (np. monocyty i neutrofile) i komórki B w oponowych nie pochodzi z krwi6. Za pomocą technik, takich jak przeszczep płata kości czołowej i selektywne reżimy napromieniowania, autorzy przedstawili przekonujące dowody, że szpik kostny czaszki służy jako lokalne źródło komórek szpikowych w oponach, a także w parenchymie OUN po urazie OUN6. Co więcej, inne badanie zasugerowało, że komórki B oponowe są stale zaopatrywane przez szpik kostny czaszki7. Ostatnio, nowa struktura, zwana wyjściem mankietu pajęczynówkowego (ACE), została zidentyfikowana jako bezpośrednia brama między twardą macicą a mózgiem dla przemieszczania się komórek immunologicznych8.

Te ekscytujące odkrycia mają ważne implikacje dla pochodzenia infiltrujących komórek immunologicznych do uszkodzonego mózgu (np. po udarze niedokrwiennym). Dużo dowodów wskazuje, że po udarze wiele komórek immunologicznych infiltruje mózg, przyczyniając się zarówno do ostrego uszkodzenia mózgu, jak i przewlekłej regeneracji mózgu. Konwencjonalna koncepcja jest taka, że te komórki to krążące leukocyty we krwi, które infiltrują mózg, co jest w dużej mierze ułatwione przez uszkodzenie bariery krew-mózg spowodowane udarem. Jednak ta koncepcja została zakwestionowana. W jednym badaniu komórki immunologiczne w czaszce i kości strzałkowej myszy zostały oznaczone inaczej, a 6 godzin po udarze stwierdzono znacznie większy spadek neutrofili i monocytów w czaszce vs. kość strzałkowa, a więcej neutrofili pochodzących z czaszki było obecnych w mózgu dotkniętym zawałem. Te dane sugerują, że w ostrym okresie udaru, neutrofile w mózgu dotkniętym zawałem pochodzą głównie z szpiku kostnego czaszki4. Co ciekawe, PMR może kierować tą migracją. Rzeczywiście, dwa ostatnie raporty wykazały, że PMR może bezpośrednio przekazywać sygnały z mózgu do szpiku kostnego czaszki poprzez kanały czaszki i instruować migrację komórek i hematopoezę w szpiku kostnym czaszki po urazie OUN9,10.

W świetle tych ostatnich odkryć stało się ważne, aby analizować zmiany w komórkach immunologicznych zarówno w mózgu, jak i w szpiku kostnym czaszki, podczas badania odpowiedzi immunologicznej na zaburzenia mózgu. W takich badaniach potrzebna jest wystarczająca liczba wysokiej jakości komórek immunologicznych do dalszych analiz, takich jak sortowanie komórek, analiza cytometrii przepływowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq). Tutaj, głównym celem jest przedstawienie dwóch zoptymalizowanych procedur przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek z tkanki mózgowej i szpiku kostnego czaszki. Ważne jest, aby zauważyć, że czołowa kości (kości czołowa, kości potyliczna i kości skroniowe) czaszki są zwykle używane do ekstrakcji szpiku kostnego, a ten szpik kostny jest w całym badaniu określany jako szpik kostny czaszki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół zatwierdzono przez Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). W badaniu tym użyto myszy C57Bl/6 (w wieku 3-4 miesięcy; 22-28 g). Szczegóły reagentów i wykorzystanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Jednokomórkowa zawiesina z mózgu myszy

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu izolacji komórek mózgowych.

  1. Znieczulić, intubować i zabezpieczyć mysz, jak pokazano wcześniej11.
  2. Wykonać górny nacięcie brzucha przez skórę i warstwy mięśni, a następnie ostrożnie przeciąć przeponę i żebra, aby stworzyć otwory w jamie klatki piersiowej.
  3. Nadmuchać strzykawkę 30 mL zimnym PBS i podłączyć ją do stępionej igły perfuzyjnej za pośrednictwem silikonowego wężyka. Ostrożnie włożyć igłę perfuzyjną do lewej komory.
  4. Wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić drenaż krwi, a następnie perfuzować12 mysz z szybkością około 10 mL/min przez 3-4 min.
    UWAGA: Aby poprawić oczyszczanie krwi z mózgu, można rozważyć zwiększenie objętości roztworu perfuzyjnego i dodanie heparyny.
  5. Odciąć głowę myszy i wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej na skórze na szczycie głowy, aby odsłonić czaszkę.
  6. Ostrożnie usunąć wszelkie tkanki łączne pokrywające czaszkę za pomocą stępionych kleszczyków.
  7. Za pomocą ostrych nożyczek do precyzyjnego przecięcia szwów czaszki wzdłuż linii środkowej i po obu stronach, tworząc klapkę.
  8. Delikatnie unieść klapkę czaszki, aby odsłonić mózg, i za pomocą stępionych kleszczyków delikatnie usunąć mózg z jamy czaszkowej.
  9. Zanieść mózg do naczynia Petriego zawierającego lodowate PBS i usunąć wszelkie pozostałe tkanki oponowe.
    UWAGA: Aby lepiej zachować żywotność komórek, zaleca się wykonywanie wszystkich kolejnych kroków na lodzie lub w 4 °C.
  10. Umieścić mózg w wstępnie schłodzonej szyszce do rozdrabniania szkła Dounce o pojemności 15 mL zawierającej 20 mL (cały mózg) lub 12 mL (połowa mózgu) lodowego buforu HBSS.
  11. Za pomocą luźnego tłoczka Dounce delikatnie i powoli rozdzielić tkankę mózgu za pomocą około 100-120 ruchów na lodzie.
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla uzyskania dużej ilości zdrowych komórek mózgowych. Ten krok trwa około 10 min. Przerwać homogenizację, gdy w zawiesinie nie widać już znaczących kawałków tkanki mózgowej. W tym momencie tłoczek może łatwo poruszać się w dół bez użycia siły.
  12. Przefiltrować powstałą zawiesinę tkanki mózgowej przez sitko komórkowe o średnicy 70 µm w 50 mL rurce do wirowania.
  13. Przepłukać szyszkę Dounce 5 mL HBSS i kontynuować filtrację, aby zmaksymalizować zebranie komórek.
  14. Wirować zawiesinę tkankową w temperaturze 550 x g przez 6 min w 4 °C.
  15. Usunąć nadstan za pomocą aspiranta próżniowego i ponownie zawiesić peletę komórek w 1 mL 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej.
    UWAGA: Aby uzyskać 15 mL 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej, należy wymieszać 4,5 mL 100% medium gradientu gęstości podstawowej, 1,5 mL 10× PBS i 9 mL ddH2O.
  16. Przenieść zawiesinę komórek do 15 mL rury do wirowania i dodać 9 mL (cały mózg) lub 6 mL (połowa mózgu) 30% roztworu gradientu gęstości.
  17. Delikatnie odwrócić rurkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  18. Natychmiast wirować rurkę w temperaturze 845 x g z przyspieszeniem i hamulcem ustawionym na poziomie 3, przez 20 min w 4 °C.
  19. Delikatnie zdjąć rurkę z wirówki bez wstrząsania i ostrożnie aspiracyjnie usunąć górną warstwę mieliny za pomocą końcówki 1 mL podłączonej do próżni.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie zakłócać tej warstwy. Jakakolwiek pozostała mielina może negatywnie wpłynąć na zdrowie komórek i zaburzyć dalszą analizę.
  20. Aspiracyjnie usunąć nadstan, pozostawiając 1-2 mL, i ponownie zawiesić peletę komórek w minimum 10 mL zimnego HBSS.
  21. Wirować w temperaturze 550 x g przez 6 min w 4 °C.
  22. Jeszcze raz przepłukać w minimum 7 mL zimnego HBSS.
  23. Usunąć jak najwięcej nadstanu i ponownie zawiesić komórki do analizy cytometrii przepływowej za pomocą 100-200 µL buforu cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Bufor FACS cytometrii przepływowej stosowany w tym badaniu zawiera 0,5% BSA i 2 mM EDTA w 1× PBS.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przygotować komórki odpornościowe z tkanki mózgu myszy, protokół ogólnie daje komórki o wysokiej żywotności (84,1% ± 2,3% [średnia ± SD]). Około 70%-80% tych komórek jest dodatnich na CD45. W normalnym mózgu myszy prawie wszystkie komórki CD45+ są mikrogleją (CD45LowCD11b+), jak się spodziewa. Ten protokół był stosowany w laboratorium do różnych zastosowań, w tym do analizy cytometrii przepływowej, sortowania komórek z aktywacją fluorescencyjną (FACS) i analizy scRNA-seq. Na przykład, analiza cytometrii przepływowej została przeprowadzona w modelu udaru ( Rysunek 3). Myszy były poddawane przejściowemu modelowi udaru, 30-minutowemu zatorzeniu tętnicy środkowej mózgu (MCAO)14. Trzeciego dnia po udar, komórki zostały przygotowane z mózgu myszy i zbadanych za pomocą powszechnych markerów powierzchniowych komórek odpornościowych. Strategia bramek jest przedstawiona na Rysunku 3A. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami13,15, zaobserwowano znaczny wzrost komórek CD45High w półkuli przeciwbocznej ( Rysunek 3B,C), wskazując na infiltrację komórek odpornościowych do mózgu.

W przypadku protokołu szpiku kostnego czaszki, konsekwentnie osiągnięto znaczny wzrost komórek szpiku kostnego czaszki (około 2 x 106 komórek) z doskonałą żywotnością (93,8% ± 1,8% [średnia ± SD]). Jak się spodziewało, większość tych komórek jest dodatnia na CD45. Aby zilustrować przydatność tego protokołu, przeprowadzono badanie porównawcze w celu scharakteryzowania składu komórek odpornościowych w kości udowej i szpiku kostnym czaszki myszy naiwnych ( Rysunek 4). Jak pokazano na reprezentatywnych wykresach, skład komórek odpornościowych był podobny między kością udowa a szpikiem kostnym czaszki ( Rysunek 4A,B). Co ciekawe, częstość neutrofili wydaje się być wyższa w kości udowej niż w czaszce ( Rysunek 4C). Jednak to stwierdzenie wymaga dalszej walidacji, ponieważ wielkość próby była niewielka w tej badaniach pilotażowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu izolacju komórek mózgowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Protokół izolacju komórek szpiku kostnego czaszki. (A) Przegląd procedury. (B) Zalecany wzór cięcia czaszki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych w mózgu po udar. (A) Przykład strategii bramek. Wykresy przedstawiają następujące populacje komórek odpornościowych: mikrogleję (CD45LowCD11b+), komórki NK (CD45HighNK1.1+), neutrofile (CD45HighLy6G+), komórki T (CD45HighCD11b-CD3+) i komórki B (CD45HighCD11b-CD19+). Ten przykład przedstawia analizę komórek odpornościowych mózgu w półkuli przeciwbocznej trzeciego dnia po udar. (B,C) Komórki odpornościowe infiltrujące mózg po udar. Młode samce myszy były poddane przejściowemu zatorzeniu tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Trzeciego dnia, mózgi były pobierany i podzielone na lewe (przeciwboczne) i prawe (przeciwboczne) półkule. Komórki mózgowe zostały przygotowane zgodnie z opisanym protokołem, a następnie poddane analizie cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wykresy ilustrują zwiększoną infiltrację komórek odpornościowych do półkuli przeciwbocznej (CD45High komórki; B). Dane ilościowe są przedstawione na wykresach słupkowych (C). Liczba komórek została obliczona na podstawie liczby komórek i objętości zapisanych w danych cytometrii przepływowej. Dane są przedstawiane jako średnia ±

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tu, dwa proste, ale skuteczne protokoły są przedstawione w celu odizolowania komórek odpornościowych z mózgu i rdzenia kostnego czaszki. Protokoły te mogą niezawodnie dostarczyć dużą ilość żywych komórek odpornościowych, które mogą być odpowiednie dla różnych zastosowań w dalszym ciągu, w szczególności do cytometrii przepływowej.

Aby badać neuroinflamacje w różnych zaburzeniach mózgu, wiele protokołów przygotowania komórek odpornościowych z mózgu zostało ustanowionych i stosowanych w różnych laboratoriach15,16,17. Typowe podejścia obejmują enzymatyczne rozdzielenie komórek, a następnie separację gradientową. Zazwyczaj w tych protokołach tkankę mózgową kroi się i następnie inkubują w roztworze enzymatycznej digestii zawierającym zarówno kolagenazę, jak i DNase przez 30-60 min w 37 °C z delikatnym wstrząsaniem. Po digestii komórki przechodzą dalszą dysocjację za pomocą metody mechanicznej, takiej jak pipetowanie lub homogenizacja Dounce. Po przejściu przez sitko komórkowe (np. sitko 70 µm), komórki są następnie poddawane gradientowej centryfugacji (często 30%/70% roztwór gradientu gęstości), aby usunąć mielinę, czerwone krwinki i zanieczyszczenia oraz wzbogacić leukocyty. Jednakże to podejście wymaga przedłużonej enzymatycznej inkubacji w 37 °C, która może znacznie zmienić transkryptom i proteom komórek odpornościowych mózgu. Rzeczywiście, systematyczne badania sugerują, że podejście enzymatyczne wprowadza głębokie zmiany w transkryptomie i proteotypie specyficznych komórek mózgu18. Może to prowadzić do artefaktów w późniejszych analizach transkryptomowych, takich jak scRNA-seq. W przeciwieństwie do tego, protokół opisany tutaj wykorzystuje podejście dysocjacji mechanicznej w niskich temperaturach przez cały proces, co tłumi metabolizm komórkowy. Zapewnia to lepsze zachowanie stanu transkrypcyjnego i proteomicznego, minimalizując potencjalne artefakty. Podczas opracowywania protokołu zauważyliśmy, że użycie dużego homogenizatora Dounce do homogenizacji tkanki mózgowej jest kluczowe dla osiągnięcia wyższych liczb komórek przy niższej śmierci komórek. Prawdopodobnie podczas homogenizacji Dounce ogromna obecność matryc pozakomórkowych, zanieczyszczeń komórkowych i składników cytoplazmy jest toksyczna dla komórek. Użycie nadmiernej ilości buforu pomaga rozcieńczyć te toksyczne substancje i tym samym łagodzi ich szkodliwe działanie, co prowadzi do lepszej żywotności komórek. Dane cytometrii przepływowej potwierdziły około 85% żywotność komórek odpornościowych przygotowanych zgodnie z tym protokołem. Co więcej, warto zauważyć, że centryfugacja tylko z 30% roztworem gradientu gęstości efektywnie wzbogaca komórki odpornościowe mózgu i usuwa mielinę. Może to również zmniejszyć koszt przygotowania komórek.

Badania nad komórkami odpornościowymi w rdzeniu kostnym czaszki są nadal ograniczone. Metoda powszechnie stosowana do odizolowania komórek z czubka czaszki myszy polega na przecięciu czaszki na małe kawałki, a następnie mechanicznym rozdrabnianiu kawałków za pomocą tłuczka6. W obecnym protokole zastosowano krótką centryfugacje. Metoda ta jest zaadaptowana z opublikowanego protokołu przygotowania rdzenia kostnego z kości udowej i piszczelowej19. W przypadku tych długich kości wystarczy odciąć jeden koniec kości, aby zebrać rdzeń kostny przez centryfugacje. W przypadku czaszki krok ten jest zmodyfikowany poprzez przecięcie jej na kilka małych kawałków, aby otworzyć wnętrze rdzenia kostnego. Zaleca się stosowanie spójnego wzorca przy przecinaniu czaszki, aby uzyskać powtarzalne liczby komórek. Ponadto, aby zmaksymalizować odzyskiwanie komórek rdzenia kostnego, kawałki czaszki mogą przejść 2-3 rundy centryfugacyjne z mieszaniem między każdą centryfugacją.

Oba protokoły mają ograniczenia. Po pierwsze, zastosowanie centryfugacji z 30% roztworem gradientu gęstości może nie efektywnie usunąć pozostałe czerwone krwinki w mózgu, co może wystąpić z powodu niekompletnej perfuzji. Ponadto, jeśli struktura mieliny jest modulowana w określonych warunkach, 30% roztwór gradientu gęstości może nie być optymalnym stężeniem do jej usunięcia. W takim przypadku, należy ustalić inne pracujące stężenie roztworu gradientu gęstości. Po drugie, chociaż analiza cytometrii przepływowej wskazuje dobrą żywotność komórek odpornościowych mózgu przy użyciu opisanego protokołu, nadal należy ją ocenić dla innych zastosowań, takich jak analiza transkryptomowa, w której może być stosowany aktynomycyna D. Po trzecie, do przygotowania rdzenia kostnego czaszki wykorzystywany jest czub. Należy jednak zauważyć, że komórki odpornościowe istnieją w wielu innych częściach czaszki. Ostatecznie, opon miękkiej, zwłaszcza opon twardej, zamieszkują różne komórki odpornościowe i odgrywają role w homeostazie i dysfunkcji mózgu20. W przypadku analizy odpornościowej opon mózgowych można przyjąć protokół opublikowany gdzie indziej17,21,22,

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Kathy Gage za jej doskonały wkład redakcyjny. Ilustracje stworzono z wykorzystaniem BioRender.com. To badanie zostało wsparte środkami z Wydziału Anestezjologii (Duke University Medical Center) oraz grantami NIH NS099590, HL157354 i NS127163.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-068
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide NeedleBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339653
96-well V-bottom microplate SARSTEDT82.1583
AURORA  flow cytometerCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 dilution
CD19-BV785BioLegend1155431:500 dilution
CD19-FITCBioLegend1155061:500 dilution
CD3-APCBioLegend1003121:500 dilution
CD3-PEBioLegend1002061:500 dilution
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 dilution
CD45-BV421Biolegend1031331:500 dilution
Cell Strainer 70 umAvantor732-2758
Dressing Forceps V. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 dilution
ForcepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificN71671:500 dilution
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 dilution
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 dilution
Percoll (density gradient medium)Cytiva17089101
Phosphate buffer saline (10x)Gibco70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)BioLegend420302
ScissorsSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL SizeDWK Life Sciences357544

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
  2. Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
  7. Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
  8. Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
  12. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
  13. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
  14. Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
  16. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  17. Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
  18. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
  20. Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
  21. Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
  22. Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
  23. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek odporno ciowychniedokrwienie m zguszpik kostny czaszkicytometria przep ywowazawiesina pojedynczych kom rekdysocjacja mechanicznagradient g sto cineurostan zapalnytkanka m zgowaimmunofenotypowanie

Powiązane artykuły