Artykuł metodologiczny

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 października 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Streszczenie

Miejsca kontaktu retikulum endoplazmatycznego (ER) z mitochondriami odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i homeostazie komórek, takich jak regulacja Ca2+ i homeostazy lipidów, dynamika mitochondriów, biogeneza autofagosomów i mitofagosomów oraz apoptoza. Brak utrzymania prawidłowego sprzężenia ER-mitochondriów jest związany z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna. Istotne jest zbadanie, w jaki sposób rozregulowanie kontaktów ER-mitochondrialnych może prowadzić do śmierci komórki i czy naprawa tych kontaktów do normalnego poziomu może złagodzić schorzenia neurodegeneracyjne. W związku z tym ulepszone testy, które mierzą poziom tych kontaktów, mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów patogennych tych chorób. W ostatecznym rozrachunku opracowanie prostych i wiarygodnych testów ułatwi opracowanie nowych strategii terapeutycznych. Tutaj opisujemy test rozszczepionej lucyferazy w celu ilościowego pomiaru poziomu kontaktów ER-mitochondriów w żywych komórkach. Test ten można wykorzystać do zbadania patofizjologicznej roli tych kontaktów, a także do identyfikacji ich modulatorów w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych.

Wprowadzenie

Interakcje między ER a mitochondriami są kluczowe dla homeostazy komórkowej i przeżycia1,2,3,4. Wcześniejsze dowody wskazują, że każdy rodzaj zakłócenia lub rozregulowania w miejscach kontaktu ER-mitochondriów może przyczyniać się do wielu chorób neurodegeneracyjnych, metabolicznych i sercowo-naczyniowych, a także raka5,6,7,8,9,10. Na przykład nieprawidłowy wzrost wychwytu Ca2+ do mitochondriów może prowadzić do śmierci komórki poprzez otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów, które są powszechnie obserwowane w niektórych modelach choroby Alzheimera5,11. Podobnie, zmniejszone kontakty ER-mitochondria mogą powodować zmniejszenie produkcji ATP i upośledzenie spożycia Ca2+, co widać w modelach stwardnienia zanikowego bocznego5,11,12. Ponieważ prowadzonych jest coraz więcej badań w dziedzinie kontaktów ER-mitochondria, odkrywane są dodatkowe białka i geny związane z chorobą, które mogą wpływać na te kontakty. Pomimo obecnej wiedzy i dowodów wskazujących na rolę miejsc kontaktu ER-mitochondriów, nadal potrzeba wielu prac, aby wyjaśnić, w jaki sposób kontakty te mogą prowadzić do utraty funkcji komórkowych i ostatecznie śmierci komórki.

Opracowano różne metody oceny bliskości dwóch błon, morfologii strukturalnej i odległości między dwoma miejscami kontaktu organelli3,4,13. Podejścia do monitorowania sprzężenia ER-mitochondriów obejmują obrazowanie oparte na markerach fluorescencyjnych14,15, obrazowanie oparte na reporterze FRET16 oraz obrazowanie oparte na podzielonej sondzie fluorescencji17,18, które wykorzystują mikroskopię epifluorescencyjną i konfokalną. Mikroskopia superrozdzielcza i atomowo-rozdzielcza są również potężnymi narzędziami do dokładnej wizualizacji kontaktów między organellami, chociaż ich wykorzystanie w analizie miejsca kontaktu jest nadal ograniczone, ponieważ wymagają wysoce dedykowanych mikroskopów i wiedzy technicznej19. Ponadto powszechnie stosowana jest transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i inne techniki EM, takie jak tomografia elektronowa (ET) i mikroskopia krioelektronowa, ponieważ zapewniają one ultrastrukturalne obrazowanie miejsc kontaktu w wysokiej rozdzielczości, które często są niemożliwe do zbadania przy użyciu innych podejść eksperymentalnych20,21,22. Jednak te metody oparte na EM są techniką o bardzo niskiej przepustowości, na którą mogą również wpływać procedury utrwalania chemicznego. Ostatnio metody oparte na znakowaniu zbliżeniowym zostały wykorzystane do wykrywania miejsc kontaktu, a także do identyfikacji nowych białek w miejscu kontaktu. Na przykład test ligacji zbliżeniowej (PLA) został wykorzystany do ilościowego określenia bliskości organelli23,24, podczas gdy poprawiona wersja testu peroksydazy askorbinianu (APEX) została wykorzystana do identyfikacji nowych białek w miejscu kontaktu25,26. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że wszystkie opisane powyżej metody mają mocne strony i wewnętrzne ograniczenia w wykrywaniu kontaktów między organellami. W związku z tym wymagane jest połączenie różnych technik, aby uzyskać dokładną interpretację miejsc kontaktu organelli

.

Poprzednio ustaliliśmy test ponownego składania lucyferazy 8 z podziałem Renilla (test luca split-R) do monitorowania poziomu kontaktów z błoną ER-mitochondriów (Rysunek 1A)24,26,27. Krótko mówiąc, każda podzielona połowa lucyferazy Renilla jest sprzężona z sekwencją ukierunkowaną na ER lub mitochondria. Po transfekowaniu razem każda podzielona połowa enzymu ulega ekspresji w ER lub błonie mitochondrialnej. Kiedy ER i mitochondria znajdują się w bliskiej odległości od siebie, podzielone połówki łączą się i odtwarzają cały enzym z aktywnością lucyferazy. Dla konstrukcji split-Rluc użyliśmy lucyferazy Renilla 8 (Rluc8) w pBAD/Myc-His27 dla początkowego szablonu. Miejsce podziału (między aminokwasami 91 i 92) zostało określone na podstawie poprzednich raportów27. Dla N-końcowej połowy Rluc8, sekwencje DNA dla aminokwasów 1-91 Rluc8 zostały połączone z końcem 3' znacznika FLAG i mysią sekwencją ukierunkowaną na mitochondria AKAP1 w wektorze pcDNA3.1 TOPO przez PCR27. W przypadku C-końcowej połowy ukierunkowanej na ER, sekwencje DNA kodujące aminokwasy 92-311 zostały połączone z końcem 5' znacznika myc i sekwencją lokalizacyjną drożdży UBC6 ER. Tutaj ulepszyliśmy konstrukt plazmidu luc split-Rw taki sposób, że rozszczepione połówki lucyferazy Renilla są wyrażane w pojedynczym wektorze (pCAG) pod tym samym promotorem, a następnie rozszczepiane na dwa fragmenty, gdy T2A, samorozszczepiająca się sekwencja peptydu 2A z wirusa Thosea asigna, jest wprowadzana między dwie podzielone połówki (Figura 1B). Mapa i sekwencje plazmidowego DNA znajdują się w pliku uzupełniającym 1 i rysunku uzupełniającym S1. Korzystając z tego systemu, zmierzyliśmy wpływ trzech substancji chemicznych (hamujących GTPazy biorących udział w polimeryzacji aktyny) na kontakty ER-mitochondria. Ten test luc split-Rjest prostym, ale solidnym systemem testowym do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla modulatorów kontaktowych między organellami24.

Protokół

1. Utrzymanie i wysiewanie komórek (Dzień 1)

  1. Utrzymać HEK293T komórek w pożywce do hodowli komórkowej zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (w 100 mm szalkach hodowlanych) w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Przed rozpoczęciem sprawdź zbieganie się płytki, oglądając ją pod mikroskopem. Gdy komórki osiągną około 80-90% zbieżności, przygotuj się do wysiewu komórek na 6-dołkowej płytce hodowlanej, usuwając pożywkę i przemywając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  3. Wyjmij DPBS z szalki hodowlanej i potraktuj komórki 1 ml 0,05% czerwieni fenolowej trypsyny-EDTA. Inkubować przez 3 minuty, następnie wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 9 ml pożywki hodowlanej (DMEM z 10% FBS), aby zatrzymać reakcję trypsyny. Powoli pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że wszelkie komórki nadal przyklejone do płytki zostały usunięte. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
  4. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń pożywkę i ponownie zawieś granulki komórek z 1 ml świeżej pożywki (DMEM + 10% FBS).
  5. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    1. Zapewnij równomierne rozprowadzenie komórek, delikatnie obracając rurkę. Natychmiast wyjąć 10 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Dodać 90 μl pożywki do tej samej probówki.
    2. Po delikatnym wymieszaniu komórek i pożywki, pobrać zawiesinę komórek i nanieść 10 μl na każdą z komór hemocytometru, delikatnie pipetując pod szkiełkiem nakrywkowym.
    3. Używając obiektywu 10x, ustaw ostrość linie siatki hemocytometru pod mikroskopem. Po ustawieniu ostrości policz liczbę komórek w jednym zestawie 16 kwadratów (4 x 4 kwadraty) za pomocą ręcznego licznika zliczania. Powtarzaj, aż wszystkie cztery zestawy po 16 kwadratów zostaną policzone.
    4. Oblicz całkowitą liczbę komórek/ml, biorąc średnią liczbę komórek (z każdego z 16 kwadratów narożnych) i mnożąc ją przez 105.
      UWAGA: Zamiast używać hemocytometru do zliczania komórek, można użyć automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Po zakończeniu liczenia komórek przygotuj się do umieszczenia komórek w 6-dołkowej płytce o gęstości 7,5 × 105 komórek/studzienkę z 2 ml pożywki/dołek. W probówce o pojemności 50 ml dodaj niezbędną objętość komórek wraz z 13 ml pożywki. Dozować 2 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego z 6 dołków.
    1. Przed posiewem należy obliczyć liczbę komórek niezbędną do 7,5 × 105 komórek/studzienkę, stosując C1V1 = C2V2, gdzie C1 jest początkową liczbą komórek (liczba komórek/ml), V1 jest objętością potrzebną do początkowej zawiesiny komórek, C2 jest pożądaną docelową gęstością komórek (liczba komórek/ml), a V2 to ostatnia objętość potrzebna do wysiewu komórek.
  7. Po dozowaniu delikatnie postukaj w płytkę ze wszystkich stron, aby rozprowadzić komórki, a następnie umieść ją w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc.

2. Transfekcja komórek za pośrednictwem polietylenoiminy (PEI) i wysiewanie komórek po transfekcji (Dzień 2)

  1. Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora i odessać istniejące pożywki hodowlane z każdej studzienki. Dodaj 2 ml świeżej pożywki do dołka.
  2. Transfekować komórki za pomocą plazmidowego DNA z podziałem Rluc (pCAG-Mito,Rluc, N-T2A-R, lucC, ER-IRES-mCherry) rozpuszczonego w buforze TE (pH 8,0).
    1. Dla każdej studzienki wymieszać DNA (750 ng) i PEI (stosunek DNA/PEI = 1:3) w 200 μl DMEM w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Szybko wiruj DNA/PEI na poziomie 8 przez około 2 sekundy, aby upewnić się, że dobrze się ze sobą mieszają, tworząc kompleks. Następnie krótko odwiruj w mini wirówce (<3 s).
    2. Pozostawić mieszaninę DNA/PEI do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać mieszaninę (upuszczając ją) na powierzchnię pożywki hodowlanej na 6-dołkowej płytce zawierającej komórki. Delikatnie postukać w płytkę (aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę) i inkubować ją w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin.
  3. Podczas inkubacji przygotować 96-dołkową płytkę pokrytą poli-D-lizyną (PDL), dodając najpierw 70 μl PDL (50 μg/ml w DPBS) do każdej studzienki i inkubując w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Usunąć roztwór PDL, a następnie przemyć każdą studzienkę 2x 100 μl DPBS. Pod koniec drugiego prania upewnij się, że wszystkie pozostałe DPBS zostały usunięte.
  4. Po 6 godzinach od transfekcji przygotuj się do wysiewu transfekowanych komórek na 96-dołkowej płytce pokrytej PDL.
    1. Wyjąć z inkubatora 6-dołkową płytkę zawierającą transfekowane komórki, odessać pożywkę i przemyć każdą studzienkę 2 ml DPBS. Po usunięciu DPBS dodać 350 μl 0,05% czerwieni fenolowej Trypsyna-EDTA i inkubować przez 1-2 minuty. Aby zatrzymać reakcję trypsyny, dodaj 1,7 ml pożywki do każdej studzienki.
    2. Po przeniesieniu komórek wraz z pożywką do probówki o pojemności 50 ml, wirować probówkę o masie 300 × g przez 5 minut w wirówce stołowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml świeżej pożywki. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru (zgodnie z opisem w kroku 1.5).
  5. Zasiać komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej PDL o gęstości 4 × 104 komórek/basenik w 100 μl pożywki hodowlanej. W tym celu w probówce o pojemności 50 ml dodaj niezbędną objętość komórek (obliczenia poniżej) wraz z odpowiednią objętością pożywki (całkowita objętość 12 ml). Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z 96 studzienek. Inkubować komórki przez 18 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
    1. Obliczyć liczbę komórek niezbędną do 4 × 104 komórek/studzienkę, używając C1V1 = C2V2, gdzie C1 to początkowa liczba komórek (liczba komórek/ml), V1 to objętość potrzebna od początkowej zawiesiny komórek, C2 to pożądana gęstość komórek docelowych (liczba komórek / ml), a V2 to ostateczna objętość potrzebna do wysiewu komórek.

3. Leczenie chemiczne i test lucyferazy w żywych komórkach (Dzień 3)

  1. W probówce do mikrofuge o pojemności 1,7 ml przygotuj trzy świeże roztwory 50 μM Rhosin (50 mM zapas w DMSO), 25 μM Ehop-016 (25 mM zapas w DMSO) i 50 μM ZCL278 (50 mM zapas w DMSO) poprzez rozcieńczenie każdego roztworu podstawowego (50 mM Rhosin, 25 mM Ehop-016 i 50 mL ZCL278; wszystko w DMSO) 1:1,000 w wymaganej ilości (50 μL/studzienkę × liczbę dołków) pożywki hodowlanej. Do każdego roztworu dodać żywy substrat komórkowy (50 mM zapas w DMSO) dla lucyferazy Renilla rozcieńczony w stosunku 1:2,000 do końcowego stężenia 25 μM. Aby przygotować roztwory ZCL278 0,5, 5 i 50 μM, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia przy użyciu początkowych 50 μM ZCL278 w pożywce hodowlanej.
    UWAGA: Jeśli czas inkubacji chemicznej jest pożądany na mniej niż 1-1,5 godziny, komórki można wstępnie inkubować z żywym substratem komórkowym (dla lucyferazy Renilla) przez 1-1,5 godziny przed traktowaniem każdej substancji chemicznej. Jednocześnie dodajemy substancje chemiczne i żywy substrat komórkowy, aby zoptymalizować protokół dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.
  2. Usunąć pożywkę z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki zawierającej transfekowane komórki i dodać 50 μl mieszaniny pożywek chemicznych i substratowych do każdej studzienki.
  3. Po inkubacji komórek przez 1 h, 2 h lub 5 h, wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora, załaduj ją do czytnika płytek luminescencyjnych i zmierz luminescencję.
    1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że czytnik płytek jest włączony. Uzyskaj dostęp do oprogramowania czytnika mikropłytek i utwórz nowy plik, klikając przycisk Nowa sesja. Ustaw temperaturę czytnika płytek na 37 °C, klikając Inkubator, zaznaczając opcję temperatury i wpisując 37 °C. W obszarze Układ blachy wybierz opcję Nieznany i określ dołki do zmierzenia, klikając i przeciągając.
    2. W obszarze Protokół kliknij opcję Luminescencja i zachowaj ustawienia domyślne. Po zakończeniu konfiguracji załaduj płytkę ze zdjętą pokrywką do czytnika płytek i wybierz opcję Uruchom płytkę. Kliknij Start i pojawi się okno zapisywania pliku. Zapisz plik na pulpicie, zmieniając jego nazwę i klikając przycisk Zapisz.
      UWAGA: Luminescencja będzie nadal wytwarzana przez >24 godziny po dodaniu substratu żywej komórki.
  4. Po zakończeniu odczytu wyjmij tabliczkę z czytnika płytek, a następnie kliknij przycisk Uruchom płytę, aby ponownie włożyć czytnik. Po zakończeniu umieścić płytkę z powrotem w nawilżanym inkubatorze (37 °C, 5% CO2) do następnego odczytu.
  5. Po zakończeniu przenieś dane luminescencji do programu do tworzenia wykresów, aby wykreślić względną jednostkę luminescencji (RLU) (oś y) dla każdej zmiennej (np. substancji chemicznych lub stężeń) (oś x) i przeanalizować dane.

4. Walidacja testu luc split-Rinnymi metodami.

  1. Wykonaj inne testy, takie jak test ligacji zbliżeniowej (PLA), transmisyjna mikroskopia elektronowa i monitorowanie mitochondrialnego wychwytu wapnia, aby zweryfikować wyniki uzyskane z testu split-Rluc, jak opisano wcześniej24.

Wyniki

Wykorzystaliśmy opisany powyżej protokół do pomiaru poziomu kontaktów między ER a mitochondriami po dodaniu trzech związków znanych z inhibicji specyficznych GTPaz. CDC42, RHO i RAC to GTPazy, które po aktywacji promują polimeryzację aktyny28, a są odpowiednio inhibowane przez ZCL278, Rhosin i Ehop-01624. Komórki HEK293T transfekowane split-Rluc poddano działaniu DMSO (kontrola), ZCL278 (50 µM), Rhosin (50 µM) lub Ehop-016 (25 µM) i inkubowano przez 1 h, 2 h oraz 5 h. Za pomocą czytnika płytek zmierzyliśmy aktywność split-Rluc w określonych punktach czasowych (Rysunek 2).

Komórki traktowane Rhosinem (inhibitorem GTPazy RHO) nie wykazały istotnych zmian w aktywności lucyferazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO po 1 h, 2 h i 5 h traktowania (p > 0,9999, p= 0,6956, p > 0,9999) (Rysunek 2). Wyniki te dowodzą, że Rhosin nie wpływa na kontakty między siateczką endoplazmatyczną a mitochondriami, co sugeruje brak udziału aktywności GTPazy RHO w regulacji kontaktów między tymi dwiema organellami.

W przeciwieństwie do tego, inhibitor GTPazy RAC Ehop-016 wykazał znacznie niższą aktywność lucyferazy niż DMSO po 1 h, 2 h i 5 h traktowania (p = 0.0106, p = 0.0009, p = 0.0024) (Rycyna 2). Dane te wskazują, że aktywność GTPazy RAC jest niezbędna do utrzymania prawidłowych interakcji między ER a mitochondriami w komórce.

Ostatecznie inhibitor CDC42 ZCL278 wykazał najbardziej drastyczne zmiany w aktywności lucyferazy (Ryc. 2). Komórki traktowane ZCL278 wykazały znaczący spadek aktywności lucyferazy w porównaniu z kontrolnym DMSO i miały najniższe wartości p we wszystkich trzech punktach czasowych, utrzymując p < 0.0001 przez cały czas. Nasze dane wykazują silną inhibicję sprzężenia ER-mitochondria, gdy aktywność GTPazy CDC42 jest blokowana przez ZCL278, co jest zgodne z naszym poprzednim raportem z wykorzystaniem oryginalnego testu split-Rluc wykonanego w komórkach kotransfekowanych dwoma wektorami kodującymi oddzielnie każdą połowę rozszczepionej lucyferazy24.

Biorąc pod uwagę uderzające wyniki dla ZCL278, zwłaszcza w porównaniu z innymi inhibitorami GTPaz, aktywność ZCL278 przetestowano dalej w różnych stężeniach [0.5 µM, 5 µM, 50 µM] w stosunku do kontroli DMSO. Aktywności lucyferazy mierzone po 1 h, 2 h i 5 h od zastosowania preparatu wykazały odpowiedź zależną od dawki; 0.5 µM ZCL278 spowodowało najsłabszy efekt w zakresie aktywności lucyferazy, podczas gdy 5 µM wykazało silniejszą, a 50 µM najsilniejszą redukcję aktywności zrekonstytuowanego enzymu (Rycina 3). Łącznie nasze wyniki wykazują, że ZCL278 hamuje aktywność split-Rluc w sposób zależny od dawki i w miarę upływu czasu wyższe stężenia ZCL278 (inhibitora CDC42) nadal wykazują istotną zmianę w stosunku do kontroli DMSO w porównaniu z niższymi stężeniami.

W celu walidacji naszego testu split-Rluc można przeprowadzić uznane niezależne analizy, takie jak test ligacji w bliskim sąsiedztwie (PLA), transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) oraz monitorowanie poboru wapnia przez mitochondria (Rycina 4 oraz dane nieprzedstawione)24. Izoproterenol, agonista receptora β2 adrenergicznego, który był jednym z związków zidentyfikowanych w naszym przesiewie promotorów kontaktów ER-mitochondria (Rycina 4A), został użyty do potwierdzenia, że aktywność lucyferazy split-Rluc po zastosowaniu izoproterenolu wzrosła z powodu zwiększenia kontaktów ER-mitochondria, co wykazano poprzez zmiany w intensywności sygnału PLA, a także poprzez pobór wapnia przez mitochondria (Rycina 4B-E).

Schemat konstruktu Split-Rluc; test aktywności lucyferazy; metoda transfekcji komórek; pomiar luminescencji.
Rycina 1: Test ponownego składania split-Rluc. (A) Schematyczny obraz testu Split-RLuc. W przypadku braku kontaktów błonowych między mitochondriami a siateczką śródplazmatyczną, Mito-RlucN oraz RlucC-ER nie wchodzą w interakcję, w związku z czym nie występuje aktywność Rluc8. Jednak interakcja między Mito-RlucN a RlucC-ER, zachodząca w miejscach kontaktu błon siateczki śródplazmatycznej i mitochondriów, prowadzi do pełnej aktywności enzymatycznej, wykrywanej poprzez konwersję substratu do luminescencji. (B) Schematyczna mapa konstrukcji DNA split-Rluc (pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry). (C) Schemat przebiegu testu split-Rluc w komórkach HEK293T. Skróty: Mito = mitochondria; ER = siateczka śródplazmatyczna; IRES = wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu; rb_glob pA = sygnał poliadenylacji królika beta-globiny; T2A = sekwencja samoprzecinającego się peptydu 2A z wirusa Thosea asigna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy, porównanie efektów leczenia lekami w różnych odstępach czasu, krotna zmiana RLU, różnice istotne statystycznie.
Rycina 2: Aktywności split-Rluc odpowiadające poziomom kontaktów ER-Mito w komórkach traktowanych inhibitorami GTPazy. (A-C) Aktywności zrekonstytuowanej lucyferazy (A) 1 h, (B) 2 h lub (C) 5 h po traktowaniu DMSO (kontrola), Rhosin [50 µM], Ehop-016 [25 µM] lub ZCL278 [50 µM] (n = 12 dla każdej grupy). Wszystkie dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. Wartości p podano jako p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Słupki błędów wskazują średnią ± standardowy błąd pomiaru. Skróty: Mito = mitochondria; ER = siateczka śródplazmatyczna; RLU = względna jednostka światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący krotność zmiany RLU w DMSO i ZCL278 po 1, 2 i 5 godzinach; analiza statystyczna.
Rycina 3: Aktywności split-Rluc mierzące poziomy kontaktów ER-Mito w komórkach traktowanych ZCL278. (A-C) Aktywności zrekonstytuowanej lucyferazy po (A) 1 h, (B) 2 h lub (C) 5 h od podania DMSO (kontrola) lub ZCL278 w stężeniach [0.5 µM], [5 µM] lub [50 µM] (n = 12 dla każdej grupy). Wszystkie dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testami wielokrotnymi. Wartości p podano jako p > 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****). Słupki błędów wskazują średnią ± błąd standardowy pomiaru. Skróty: Mito = mitochondria; ER = retikulum endoplazmatyczne; RLU = względna jednostka światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający krotność zmiany RLU, obrazy mikroskopowe z PLA i Sec61-GFP, pomiar wapnia.
Rycina 4: Walidacja testu split-Rluc. (A) Przykład kwantyfikacji aktywności split-Rluc po potraktowaniu komórek HEK293T 11 lekami, w tym izoproterenolem, zidentyfikowanymi w screeningu związków promujących kontakty ER-mitochondria. (B) Przykład testu PLA (proximity ligation assay) w komórkach HeLa potraktowanych DMSO lub izoproterenolem (1 µM). Sygnał PLA (czerwony) wskazuje na bliski kontakt między ER a mitochondriami. Sec61-GFP (zielony): marker ER; DAPI (niebieski): jądro komórkowe. (C) Kwantyfikacja sygnału PLA z punktu A (n = 4 eksperymenty, każdorazowo 77-97 komórek; test Mann-Whitneya). (D) Pobór wapnia przez mitochondria w odpowiedzi na histaminę (100 µM). Zmiana intensywności fluorescencji Mito-R-GECO1 (średnia z wielu komórek HeLa) wykreślona co 2,5 s w komórkach potraktowanych DMSO lub izoproterenolem. Strzałka wskazuje moment dodania histaminy. (E) Lewo: Maksymalny szczyt poboru wapnia przez mitochondria z punktu A. Nieparzysty dwustronny test t (n = 10, DMSO; 14, izoproterenol). Prawo: Szybkość poboru wapnia przez mitochondria (jak w punkcie A; od 7,5 do 12,5 s). Test Mann-Whitneya (n = 12, DMSO; 11, izoproterenol). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lim et al.24. Skróty: RLU = względna jednostka światła; PLA = test ligacji w bliskości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Podsumowanie aktualnych technik badania kontaktów między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami. Lista zalet i ograniczeń dla każdej metody. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Plik Zip zawierający sekwencję DNA (w formatach PDF i GBK) dla pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa S1: Mapa pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Użyliśmy testu ponownego składania lucyferazy 8 z podziałem Renilla (test luca split-R) w celu ilościowego określenia poziomu sprzężeń ER-mitochondriów. W tym badaniu zmodyfikowaliśmy oryginalny konstrukt split-Rluc24, generując pojedynczy wektor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, kodując każdy składnik split-Rluc (MitoRlucN i RlucCER) oraz sekwencję samorozszczepiającego peptydu 2A z wirusa Thosea asigna, aby zapewnić ekspresję tej samej ilości każdej podzielonej połówki lucyferazy. Jako substrat dla lucyferazy Renilla, zamiast koelenterazyny, zastosowano zmodyfikowany substrat żywych komórek (chroniona pochodna koelenterazyny; patrz tabela materiałów) z następujących powodów. Po pierwsze, w przeciwieństwie do koelenterazyny, która generuje autoluminescencję w środowisku wodnym (szczególnie gorszą w surowicy), ta chroniona pochodna generuje bardzo niską autoluminescencję (często niewykrywalną) w pożywce zawierającej 10% surowicy, a zatem jej stosunek sygnału do tła jest wyższy niż generowany przez koelennterazinę. Po drugie, w przeciwieństwie do koelenkterazyny, gdzie luminescencja jest najsilniejsza krótko po dodaniu substratu, ale zaczyna bardzo szybko słabnąć, luminescencja wytwarzana przez zmodyfikowany żywy substrat osiąga najwyższy punkt osiągany około 1,5 godziny po dodaniu substratu i pozostaje ciągła przez ponad 24 godziny. Te zmiany w kinetyce reakcji ułatwiają pomiar luminescencji w płytce wielodołkowej, co jest bardzo przydatne w przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Co więcej, luminescencja wytwarzana przez chronione podłoże pozostaje stała w długim okresie, co pozwala na pomiar pojedynczego zestawu próbek w wielu punktach czasowych, w przeciwieństwie do pomiaru wielu zestawów próbek używanych w różnych punktach czasowych (jeden punkt na próbkę).

Korzystając z tej zaktualizowanej wersji konstruktu luc split-R, przetestowaliśmy, czy GTPazy RHO, RAC i CDC42 uczestniczą w tworzeniu kontaktu ER-Mito. Dodaliśmy inhibitory GTPazy, Rhosin (inhibitor RHO), Ehop-016 (inhibitor RAC) i ZCL278 (inhibitor CDC42), aby HEK293T komórek eksprymujących składniki split-Rluc. Wyniki naszych testów wskazują, że ZCL278 jest najsilniejszym inhibitorem tworzenia kontaktów ER-mitochondriów, a Ehop-016 jest kolejnym znaczącym inhibitorem, podczas gdy Rhosin nie wpływa na ich kontakty. Dane te sugerują, że polimeryzacja aktyny za pośrednictwem CDC42 (a także w mniejszym stopniu za pośrednictwem RAC) jest wymagana do utrzymania kontaktów ER-mitochondriów w komórce, podczas gdy polimeryzacja aktyny za pośrednictwem RHO prawdopodobnie nie jest ważna.

Aby zapewnić maksymalną wydajność, istnieje wiele krytycznych kroków, które należy wziąć pod uwagę w przypadku tego protokołu. Przede wszystkim należy zbadać ilość transfekowanego konstruktu, ponieważ zbyt duża ilość DNA może mieć toksyczny wpływ na komórki. Po drugie, ponieważ liczba komórek może mieć znaczący wpływ na mierzone poziomy lucyferazy, utrzymanie gęstości komórek tak blisko, jak stwierdzono w protokole, ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia idealnej i stałej 80% zbieżności komórek do czasu testu. Może nastąpić zmniejszenie luminescencji, jeśli komórki osiągną konfluencję w czasie ekspozycji chemicznej, ponieważ komórki zlewające się wytwarzają ogólnie mniej białka. Po trzecie, aby upewnić się, że komórki nie złuszczają się podczas dodawania chemikaliów i substratu, używamy 96-dołkowej płytki wstępnie pokrytej poli-D-lizyną. Po czwarte, w przypadku związków (w tym substratu) stosowanych w tym protokole ważne jest, aby utrzymywać je w temperaturze -20 °C lub niższej (-70 °C) w podwielokrotnościach i dodawać je do komórek natychmiast rozmrożonych. Wreszcie, ze względu na możliwe wahania temperatury, które mogą wpływać na aktywność lucyferazy, najlepiej jest zdecydować się na użycie najbardziej wewnętrznych dołków płytki i zignorować dołki wyściełające zewnętrzną stronę płytki.

Test split-Rluc8 oferuje łatwą, ale solidną metodę określania kontaktów ER-mitochondriów, idealną do wysokoprzepustowych badań przesiewowych; Istnieją jednak pewne ograniczenia, na które należy zwrócić uwagę. W przypadku fizjologii komórki istnieje kwestia zmian w zachowaniu komórek spowodowanych ciągłą nadekspresją konstruktu DNA. Obecnie pracujemy nad konstruktem z indukowalnym promotorem, który ma zwalczać potencjalne zmiany w fizjologii komórki spowodowane ciągłą nadekspresją. Ponadto, gdy test ten jest stosowany do celów przesiewowych, należy zauważyć, że wyniki fałszywie dodatnie mogą wynikać z jakiegokolwiek pośredniego wpływu leków na i) poziomy ekspresji, ii) skuteczność ukierunkowania na organelle wspomnianych fragmentów białka lub iii) aktywność enzymatyczną odtworzonych lucyferazy. Ze względu na te ograniczenia test ten musi być testowany w połączeniu z innymi metodami w celu dalszej walidacji wyników. Tabela 1 odnosi się do różnych metod testowania tych miejsc kontaktowych wraz z ich zaletami i wadami. Skorzystaliśmy z innych metod, w tym między innymi testów ligacji zbliżeniowej (PLA), które wykrywają bliskość między białkami, oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), która pozwala na wyraźną wizualizację kontaktów organelli, w połączeniu z testem split-Rluc, aby potwierdzić, że wynikające zmiany w RLU są rzeczywiście spowodowane zmianami w miejscach kontaktu ER-mitochondriów (Figura 4 i Lim i wsp.24). Wykazaliśmy również korelację między zmianami w kontaktach ER-mitochondria a parametrami funkcjonalnymi, takimi jak transfer wapnia i rozszczepienie mitochondriów (Figura 4 i Lim i wsp.24). Aby upewnić się, że wpływ leków na aktywność rozszczepionego Rluc nie jest spowodowany zwiększoną ekspresją genu split-Rluc, inhibitor transkrypcji lub translacji może być dodany do leków, tak jak zrobiliśmy to wcześniej24.

W przypadku zastosowania systemu split-Rluc w zróżnicowanych neuronach w hodowli, w której szybkość transfekcji jest niska, alternatywnym podejściem byłaby infekcja wirusowa (z lentiwirusem wykazującym ekspresję składników split-Rluc). Jego zastosowanie można rozszerzyć w celu stworzenia systemu badań przesiewowych, w którym komórki (np. ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) są modyfikowane tak, aby stabilnie wyrażały każdy składnik split-Rluc, MitoRlucN i RlucCER, albo przez infekcję wirusową, albo przez edycję genów za pośrednictwem CRSPR. Jednak w przypadku stabilnego systemu ekspresji należy mieć świadomość, że może istnieć presja selekcyjna na komórki lepiej tolerujące system split-Rluc, który może nie być reprezentatywny dla normalnego stanu fizjologicznego. Ta adaptacja lub selekcja może wprowadzić błąd systematyczny w wynikach eksperymentu.

Podsumowując, pomimo niektórych ograniczeń omówionych powyżej, split-Rluc jest szybkim, prostym i potężnym testem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych pod kątem małych cząsteczek lub genów regulujących kontakty międzyorganellowe w komórce, jak wykazano w naszym poprzednim badaniu przesiewowym leków24.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Dr. Jeffreyowi Goldenowi (Cedars-Sinai Medical Center) za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,7 ml probówka do mikrowirówek SafeSealSorenson16070
6-dołkowa płytka TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 ml Końcówki do pipet OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μ L końcówki do pipet OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μ L Skośne końcówki OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Polipropylenowa rurka stożkowaFalcon352070
96-dołkowe stojaki na mikroprobówki FlipperThermoFisher Scientific8770-11
96-dołkowa płytka TC Treated USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm Naczynie poddane obróbce TCUSA ScientificCC7682-3394
1250 μ L Końcówki Wirówka OneTipUSA Scientific1112-1720
5910  Ri - Wirówka z chłodzeniemEppendorf5943000131
Dimetylosulfotlenek, bezwodny, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, wysoka zawartość glukozyThermoFisher Scientific11965092
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Rozpuszczać w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 ° C
EnduRen Żywy substrat komórkowyPromegaE6481Przechowuj porcje w temperaturze -70 & stopni; C
Eppendorf 2-20 μ Pipeta LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta LEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12-kanałowyEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta LEppendorf 
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowane, zatwierdzone przez USDAregiony ThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  Inkubator, 184 l, polerowana stal nierdzewnaThermoFisher Scientific381
Ręczny licznik liczącySigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Hemacytometr - Neubauer Bright Line, komora podwójnego liczeniaLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BuforThermoFisher Scientific8019005
MikroskopZeissAxiovert 25 CFL
Mini wirówkaBenchmark ScientificC1012
Tube Rack do probówek stożkowych 50 ml, stożkowych i mikrowirówek 15 mlBoekel Scientific120008
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40 000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichP6407-5MG
Chlorowodorek rhozynyBio-Techne Tocris5003Rozpuścić w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 stopni; C
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25300054
Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUXThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365poziom 8
System aspiracji próżniowej VWRVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Rozpuścić w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 stopni; Z
3123000055 Multi

Bibliografia

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test rozdzielonej lucyferazykontakty ER mitochondriaobrazowanie ywych kom rekmiejsca kontaktu b onchoroby neurodegeneracyjnewysokoprzepustowe przesiewaniedynamika mitochondrialnahomeostaza wapniowaczytnik p ytek luminescencyjnychkom rki HEK293T
Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.