Artykuł metodologiczny

Podsumowanie urazu jatrogennego: technika elektrowycięcia do modelowania zwężenia cewki moczowej u szczurów

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy nowatorski, wydajny i stabilny szczurzy model zwężenia cewki moczowej, stworzony przez elektrowycięcie cewki moczowej szczura, który skutecznie symuluje jatrogenne uszkodzenie obserwowane w warunkach klinicznych.

Streszczenie

Zwężenie cewki moczowej (US) jest powszechnym stanem klinicznym w urologii, charakteryzującym się wysoką częstością występowania i zachorowalnością we wszystkich grupach wiekowych. Obecne metody leczenia USG, takie jak poszerzenie cewki moczowej i uretrotomia wewnętrzna, nie rozwiązują w pełni tego stanu i wiążą się z wysokimi wskaźnikami nawrotów i powikłań.

Dodatkowo, patogeneza US nie jest dobrze poznana. Aby zbadać patogenezę US i opracować nowe strategie terapeutyczne, kluczowe jest ustanowienie ustandaryzowanego modelu szczura, który dokładnie odzwierciedla objawy kliniczne. Badanie to przedstawia prostą i powtarzalną metodę wywoływania US u szczurów przy użyciu noża elektrycznego o wysokiej częstotliwości. Metoda polega na wykonaniu podłużnego nacięcia nożem elektrycznym ustawionym na jednobiegunowy tryb cięcia mieszanego o mocy 4 W, co powoduje znaczne uszkodzenie cewki moczowej. Analiza histopatologiczna wykazuje pogrubienie błony dróg moczowych, naciek zapalny i zdezorganizowane włókna kolagenowe. Model ten skutecznie replikuje jatrogenne uszkodzenie poprzez elektrowycięcie cewki moczowej szczura. Podsumowując, badanie to z powodzeniem ustanawia nowy, wydajny i stabilny szczurzy model US, który ściśle naśladuje scenariusz kliniczny, zapewniając cenne narzędzie do dalszych badań nad mechanizmami i nowymi metodami leczenia US.

Wprowadzenie

Zwężenie cewki moczowej (US) jest jednym z najstarszych schorzeń urologicznych i nadal jest szeroko rozpowszechnione. Ostatnie dane sugerują, że na 100 000 mężczyzn przypada od 229 do 627 przypadków US 1. Osoby cierpiące na US doświadczają szeregu objawów, w tym objawów dolnych dróg moczowych2, pain3 i dysfunkcji seksualnych4. Dostępnych jest kilka metod leczenia, takich jak uretrotomia, plastyka cewki moczowej i rozszerzenie 5. Jednak leczenie to jest często skomplikowane ze względu na takie problemy, jak krwawienie, infekcje i nietrzymanie moczu, przyczyniające się do obciążenia chorobą i wykazujące różne wskaźniki nawrotów6,7. W związku z tym identyfikacja najskuteczniejszych podejść terapeutycznych pozostaje krytycznym wyzwaniem angażującym badaczy i klinicystów.

US jest ogólnie charakteryzowane jako zwężenie przedniej cewki moczowej spowodowane zwłóknieniem i bliznowaceniem błony śluzowej cewki moczowej oraz otaczającej tkanki gąbczastej8. Pomimo jego rozpowszechnienia, przyczyny i mechanizmy leżące u podstaw US są słabo poznane i brakuje odpowiednich modeli zwierzęcych do dogłębnych badań. Uraz jatrogenny, głównie spowodowany chirurgią przezcewkową, jest obecnie główną przyczyną USG, stanowiąc 41% przypadków9. W związku z tym idealny model zwierzęcy do badań w USA powinien dokładnie odwzorowywać powszechne urazy kliniczne, wykazywać bliskie podobieństwa genomowe i proteomiczne do ludzi oraz wykazywać zarówno skuteczność, jak i stabilność. Taki model znacznie ułatwiłby głębsze badania nad patogenezą USG i opracowanie skuteczniejszych metod leczenia.

Aby zbadać proces patogenny i mechanizm typowych typów klinicznych, opracowano różne modele zwierzęce z wykorzystaniem dużych zwierząt, takich jak króliki10,11, dogs12, and pigs13,14, wykorzystując techniki takie jak elektrokoagulacja, elektroresekcja15 i zastrzyki z bleomycyny16. Modele te często napotykają jednak wyzwania związane z ograniczeniami wielkości próby i różnicami genetycznymi w stosunku do ludzi. Ponadto należy wziąć pod uwagę opłacalność wykorzystania dużych zwierząt; Pomimo wysokich kosztów związanych z codzienną opieką, duże zwierzęta niosą ze sobą również znaczne ryzyko infekcji, co wymaga intensywnej opieki pooperacyjnej i znacznych wydatków. Jest dobrze udokumentowane, że gryzonie mają wspólne cechy fizjologiczne i patologiczne z ludźmi w wielu układach narządów. Niedawne badania wykazały homologię między komórkami dróg moczowych gryzoni i ludzi17. Co więcej, koszty zakupu, utrzymania i opieki pooperacyjnej szczurów są znacznie niższe niż w przypadku dużych zwierząt18. W związku z tym za odpowiedni uważa się szczurzy model USA; Jednak rozwój takich modeli u szczurów nie został odpowiednio opisany.

Wcześniejsze badania używały narzędzi chirurgicznych, takich jak ostrza lub igły, do wywoływania US w modelach szczurzych19. Takie podejście wiąże się z ryzykiem, takim jak uszkodzenie naczyń krwionośnych wokół cewki, prowadzące do znacznego krwawienia. Subiektywny charakter tych zabiegów chirurgicznych może również skutkować zmiennością w zakresie urazu mechanicznego, brakiem ilościowych kryteriów modelowania, co może mieć wpływ na ocenę wyników naprawy cewki moczowej w kolejnych badaniach terapeutycznych.

Biorąc pod uwagę te rozważania, istnieje wyraźna potrzeba opracowania dodatkowego amerykańskiego modelu szczura. Aby ustalić wydajny, opłacalny i stabilny model amerykański u szczurów, w naszych badaniach zastosowaliśmy nóż elektryczny o wysokiej częstotliwości. Model ten ułatwi dalsze badania nad mechanizmami USG i ocenę nowych podejść terapeutycznych przed przystąpieniem do badań klinicznych.

Protokół

W tym śledztwie wykorzystano dwadzieścia 6-miesięcznych samców szczurów rasy Sprague-Dawley, każdy o wadze 400-500 g. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Piątym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Sun Yat-Sen (numer zgody: 00349). Zwierzęta były trzymane w obiekcie, w którym panowały kontrolowane warunki temperatury i oświetlenia. Podstawową cechą zwężenia cewki moczowej jest rozwój bliznowacenia w obrębie cewki moczowej. Opierając się na ustalonym harmonogramie powstawania blizny, która zwykle występuje w ciągu 4 tygodni od urazu, wyznaczyliśmy obecność dostrzegalnej tkanki bliznowatej w cewce moczowej w ciągu 4 tygodni po operacji jako eksperymentalny punkt końcowy.

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych

  1. Przygotuj następujące materiały chirurgiczne: cewnik pokryty teflonem (0,6 x 1 mm), szwy wchłanialne (6-0), nożyczki do szwów, kleszczyki do tkanek, szczypce do przytrzymywania igieł, kleszcze gładkie, jednostkę elektrochirurgiczną wysokiej częstotliwości (Rysunek 1), w tym panel noża elektrycznego wysokiej częstotliwości, elektroda chirurgiczna nóż elektrochirurgiczny wysokiej częstotliwości oraz pręt przewodzący odbyt (patrz Tabela materiałów).
  2. Oczyść obszar operacyjny chusteczkami nasączonymi alkoholem zawierającymi 75% etanolu.
  3. Przygotowanie do użycia noża elektrycznego o wysokiej częstotliwości w unipolarnym trybie cięcia elektrycznego.
    1. Podłącz nóż elektryczny wysokiej częstotliwości do uziemionego źródła zasilania 220 V za pomocą przewodu zasilającego.
    2. Włóż wysterylizowaną, ręcznie sterowaną rękojeść noża i pręt przewodzący do odpowiednich gniazd (Rysunek 1C).
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zasilające są prawidłowo podłączone, aby zachować bezpieczeństwo zabiegu.

2. Przygotowanie zwierzęcia

  1. Pobrać pentobarbital sodu (60 mg/kg) do strzykawki.
  2. Zabezpiecz szczura, chwytając go za ogon dominującą ręką i przytrzymując skórę uszu i szyi ręką niedominującą, aby upewnić się, że jest mocno zamocowany.
  3. Odsłoń dolną część brzucha szczura i zdezynfekuj obszar za pomocą wacików nasączonych 75% etanolem.
  4. Wprowadzić igłę strzykawki około 1-2 mm obok linii środkowej brzucha w dolnej części brzucha, kierując ją do jamy brzusznej pod kątem 45°.
    UWAGA: Poczujesz utratę oporu, gdy igła wbije się w otrzewną.
  5. Delikatnie odciągnąć tłok strzykawki, aby upewnić się, że w strzykawce nie ma krwi ani płynu.
  6. Powoli wstrzykiwać pentobarbital sodu. Wyjąć igłę, kończąc wstrzyknięcie i ponownie zdezynfekować miejsce za pomocą wacików nasączonych 75% etanolem.
  7. Monitoruj rytm oddychania szczura i uszczypnij go w tylną łapę, aby sprawdzić odruchy.
    UWAGA: Upewnij się, że oddech szczura jest stabilny i że nie wykazuje żadnych odruchów przed przystąpieniem do operacji.
  8. Wyciśnij maść z erytromycyną i zanurz w niej bawełniany wacik. Nałóż maść za pomocą bawełnianego wacika na rogówki obu oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
  9. Użyj golarki elektrycznej, aby ogolić dolną część brzucha i krocze po potwierdzeniu znieczulenia.
  10. Zetrzyj luźne włosy z ogolonego obszaru chusteczką zwilżoną solą fizjologiczną.
  11. Zdezynfekuj obszar, przecierając go dwukrotnie gąbką z gazy nasączoną jodoforem, aby zminimalizować podrażnienie skóry.
  12. Umieść głęboko znieczulonego szczura na poduszce grzewczej ustawionej na 37°C w pozycji leżącej. Zapewnij sterylność podczas zabiegów chirurgicznych, nosząc rękawice medyczne.

3. Cewnikowanie cewki moczowej i zabieg urazu

  1. Włóż pręt przewodzący do odbytu szczura, aby ustanowić skuteczny obwód zamkniętej pętli dla noża elektrycznego o wysokiej częstotliwości (Rysunek 2A).
  2. Cewnikować cewkę moczową szczura, aby pomóc w pozycjonowaniu i zapewnić wsparcie podczas etapów obróbki końcowej operacji.
    1. Nasmaruj cewnik moczowy olejem parafinowym.
    2. Odsłoń penisa, ściskając skórę wokół niego, aby wystawał z brzucha.
    3. Zdezynfekuj penisa szczura gąbką z gazy nasączoną jodoforem.
    4. Delikatnie otwórz ujście cewki moczowej za pomocą gładkich kleszczyków i włóż nasmarowany cewnik do cewki moczowej.
    5. Ostrożnie wprowadzić cewnik pokryty teflonem do cewki moczowej w rytmie skurczu cewki moczowej; unikać siłowego wkładania (Rysunek 2B).
    6. Jeśli napotkasz opór, delikatnie pociągnij penisa w kierunku strony brzusznej, aby wyregulować kąt zgięcia penisa i kontynuuj wprowadzanie cewnika do pęcherza, aż mocz wypłynie (Rysunek 2C).
    7. Potwierdź pomyślne cewnikowanie, upewniając się, że penis tworzy około 45° kąt z brzuchem (Rysunek 2D).
  3. Włącz nóż elektryczny o wysokiej częstotliwości, kliknij przyciski panelu noża o wysokiej częstotliwości, aby wybrać jednobiegunowy tryb cięcia mieszanego i ustaw moc na 4 W dla kolejnych kroków elektrowycinania penisa warstwa po warstwie.
  4. Wyrównaj nacięcie z cewnikiem. Naciśnij żółty przycisk na rękojeści noża elektrochirurgicznego i wykonaj nacięcie wzdłuż linii znakowania cewnika od skóry prącia do zewnętrznej warstwy cewki moczowej za pomocą noża elektrycznego, aż cewka moczowa zostanie odsłonięta (Rysunek 3A,B).
    UWAGA: Upewnij się, że naciskasz żółty przycisk do elektrowycięcia, a nie niebieski przycisk do elektrokoagulacji.
  5. Kontynuuj wykonywanie podłużnego nacięcia o długości 0,5 cm w cewce moczowej za pomocą noża elektrycznego, zapewniając średnicę poprzeczną 0,1 cm, aż cewnik będzie widoczny (Rysunek 3C).
  6. Zszyj ranę i powierzchowną skórę warstwa po warstwie za pomocą szwów wchłanialnych (6-0) z ciągłymi lub przerywanymi szwami (Rysunek 3D, E).
  7. Usuń cewnik cewki moczowej i zmień położenie penisa (Rysunek 3F).
  8. Wyłącz nóż elektryczny o wysokiej częstotliwości i usuń pręt przewodzący z odbytu szczura.
  9. Wyczyść materiały chirurgiczne chusteczkami nasączonymi alkoholem (75% etanolu).

4. Opieka pooperacyjna

  1. Umieścić szczura na rozgrzanej podkładce (37 °C) i uważnie obserwować jego powrót do zdrowia po znieczuleniu. Zwróć szczególną uwagę na kondycję fizyczną szczura, w tym rytm oddychania, temperaturę ciała i poziom świadomości.
    UWAGA: Nie wkładaj szczura z powrotem do klatki, dopóki nie zaobserwuje się pełnego wyzdrowienia.
  2. Trzymaj szczury w czystej klatce i napełnij butelkę wodą z dodatkiem morfiny (0,4 mg / kg) w celu codziennego leczenia bólu po wyzdrowieniu.
  3. Podawać niesteroidowe leki przeciwzapalne (takie jak karprofen, 0,5 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne) w celu pełnego wyzdrowienia szczurów po bólu pooperacyjnym.

5. Ocena histologiczna

  1. Cztery tygodnie po operacji wywołaj odruch mikcji, unosząc ogony szczurów. Umieść szczura w pudełku do eutanazji, otwórz zawór rury transmisyjnej CO2 i humanitarnie poddaj szczury eutanazji z przedawkowaniem CO2 .
  2. Zakręć zawór po upewnieniu się, że szczur jest nieruchomy i nie oddycha oraz zaobserwowaniu, że źrenica jest rozszerzona. Kontynuuj obserwację stanu fizycznego szczura przez 2 minuty, aby potwierdzić, że eutanazja się powiodła.
  3. Wyjmij szczura z pudełka do eutanazji.
  4. Oczyść obszar operacyjny i materiały chirurgiczne chusteczkami nasączonymi 75% etanolem.
  5. Wypreparuj jamę brzuszną, aby obserwować stan wypełnienia pęcherza moczowego i zbierz całą cewkę moczową.
  6. Po pobraniu cewki moczowej szczura należy umieścić w szczelnie zamykanej torbie i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C do przetworzenia przez techników laboratoryjnych.
  7. Morfologicznie oceń USA pod kątem patologii ogólnej, koncentrując się na kolorze i gładkości tkanki.
  8. Wybarwić tkankę cewki moczowej hematoksyliną i eozyną (H&E), aby uwidocznić strukturę rany i warstwę komórek urotelialnych.
    1. Zanurz szkiełka w ksylenie w celu odparafinowania (2 x 5 min).
    2. Ponownie uwodnić szkiełka w etanolu w kolejności (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (2 min).
    4. Zabarwić szkiełka hematoksyliną (10 min).
    5. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (5 min).
    6. Próbki należy rozróżnić za pomocą roztworu różnicującego (40 s).
    7. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (2 x 3 min).
    8. Zabarwić szkiełka eozyną (2 min).
    9. Uwodnić szkiełka w etanolu w kolejności (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
    10. Zanurz szkiełka w 100% etanolu (1 min) i przeźroczyć szkiełka ksylenem (2 x 1 min).
    11. Dodaj neutralny balsam i zamknij szkiełkiem nakrywkowym.
  9. Nałóż trichromową plamę Massona na tkankę cewki moczowej, aby podkreślić strukturę włókien kolagenowych.
    1. Zanurz szkiełka w ksylenie w celu odparafinowania (2 x 5 min).
    2. Ponownie uwodnić szkiełka w etanolu w kolejności (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (2 min).
    4. Zabarwić szkiełka w roztworze żelaza Hematoksyliny Weigerta (5 min).
    5. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (5 min).
    6. Zabejmij zjeżdżalnie w Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 min).
    7. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej (2 x 3 min).
    8. Zabarwić szkiełka roztworem kwasu fosfomolibdenowego (5 min).
    9. Umieść szkiełka w roztworze błękitu anilinowego (5 min). Wyrzuć roztwór.
    10. Opłucz szkiełka, odwodnij alkoholem i wyczyść w ksylenie.
    11. Dodaj neutralny balsam i zamknij szkiełkiem nakrywkowym.
  10. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała TGF-β w celu oceny warstwy komórek urotelialnych.
    1. Dodaj odpowiedni bufor do odzyskiwania antygenu do szybkowaru. Umieść szybkowar na płycie grzejnej i włącz go z pełną mocą.
    2. Po ugotowaniu przenieś szkiełka z wody z kranu do szybkowaru. Zalej kuchenkę zimną wodą i podgrzewaj szkiełka przez 10 minut.
    3. Wyłącz szybkowar i wyjmij szkiełka. Schłodzić szkiełka do temperatury pokojowej.
    4. Umyć szkiełka roztworem PBS.
    5. Oznaczyć marginesy próbek pisakiem blokującym ciecz.
    6. Zanurz szkiełka w PBS plus 0,3% Triton X-100 na 30 minut.
    7. Umyć szkiełka w PBS z delikatnym mieszaniem (2 x 5 min).
    8. Blok w 10% surowicy koziej w PBS w temperaturze pokojowej (60 min).
    9. Odessać bufor blokujący i inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc.
    10. Umyj szkiełka 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorochromem rozcieńczonym w buforze rozcieńczającym przeciwciała.
    12. Umyj szkiełka 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Zamontuj i uszczelnij prowadnice.
  11. Zeskanuj cyfrowo poplamione szkiełka za pomocą obiektywu 40x w skanerze do slajdów.
  12. Przeanalizuj obrazy i zmierz grubość nabłonka dróg moczowych za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).
    1. Otwórz oprogramowanie.
    2. Kliknij pozycję Komputer lokalny, aby zaznaczyć poplamione obrazy slajdów.
    3. Kliknij przycisk Zmierz odległość, aby zmierzyć grubość nabłonka dróg moczowych.
    4. Zapisz dane dotyczące grubości nabłonka dróg moczowych.

Wyniki

Protokół opisany w tym badaniu skutecznie ustalił stabilne zwężenie cewki moczowej u szczurów i wykazał wysoką powtarzalność. Średni czas trwania operacji wynosił 20 minut, a podczas zabiegów nie wystąpiły żadne problemy techniczne. Próbki cewki moczowej udało się pobrać 4 tygodnie po zabiegu.

W grupie eksperymentalnej, pęcherze szczurów wykazywały oznaki nadmiernego rozdęcia, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej, gdzie pęcherze były puste (Rysunek 4). Obserwacje te wskazują na znaczne upośledzenie funkcji oddawania moczu u szczurów po przeprowadzeniu modelowania eksperymentalnego.

Cztery tygodnie po operacji, miejsca ran przekształciły się w woskowatą białą bliznę wystającą z powierzchni cewki moczowej (Rysunek 5B), podczas gdy odcinki cewki moczowej w grupie kontrolnej wydawały się gładkie i bladoczerwone kontrolne (Rycina 5A).

Badanie histologiczne z barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) odcinka cewki moczowej wykazało znaczne pogrubienie nabłonku moczowego i agregację limfocytów. Dodatkowo, barwienie Massona zidentyfikowało wyraźny czerwonawy obszar hiperplastycznej i metaplastycznej tkanki nabłonka cewki moczowej, któremu towarzyszą nieuporządkowane włókna kolagenowe (patrz rysunek uzupełniający S1 dla szczegółowych obrazów barwienia Massona), wskazując na nieprawidłowości w strukturze mięśni gładkich i włókien kolagenowych (Ryc. 6).

Analiza immunofluorescencyjna kriosekcji wykazała zwiększoną TGF-β w tkance cewki moczowej po operacji (Rysunek 7), co sugeruje, że tworzenie się struktury cewki moczowej jest związane z podwyższoną ekspresją TGF-β.

figure-results-1
Rysunek 1: Kluczowe instrumenty użyte do ustanowienia modelu amerykańskiego. (A) cewnik pokryty teflonem (0,6 x 1 mm); (B) szwy wchłanialne (6-0), kleszczyki do tkanek, szczypce do przytrzymywania igieł i kleszcze gładkie (od lewej do prawej); (C) długopis elektrochirurgiczny wysokiej częstotliwości i pręt przewodzący odbytu; (D) panel noża elektrycznego wysokiej częstotliwości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przygotowania do operacji. (A) Ogolić dolną połowę brzucha szczura i połączyć pręt przewodzący odbyt. (B-D) Zilustruj umieszczenie cewnika cewki moczowej w cewce moczowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Proces elektroresekcji. (A) Pokazuje utworzenie podłużnego nacięcia na skórze prącia o długości 0,8 cm; (B) odsłonięcie cewki moczowej; (C) szczegółowo opisuje przekrój elektrosekcji przez wszystkie warstwy ściany cewki moczowej, aż cewnik w cewce moczowej będzie widoczny. (D,E) Przedstawia usunięcie cewnika cewki moczowej i zmianę położenia prącia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Stan napełnienia pęcherza moczowego u szczurów w warunkach anatomicznych. (A) Charakteryzuje się pustym pęcherzem u szczurów w grupie kontrolnej; (B) pokazuje przepełniony pęcherz moczowy u szczurów w grupie eksperymentalnej. Pęcherze znajdują się w obrębie czerwonego przerywanego konturu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Makroskopowe wyniki wyciętych próbek cewki moczowej. (A) Prawidłowa tkanka cewki moczowej. (B) Tkanka bliznowata cewki moczowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wyniki badań histologicznych próbek cewki moczowej. (A) Tkanka cewki moczowej z grupy kontrolnej barwiona H&E (oryginalne powiększenie, 100x). (B) Barwienie trichromowe masy cewki moczowej Massona przy 100-krotnym pierwotnym powiększeniu. (C) Powiększenie i dane pomiarowe normalnej grubości nabłonka dróg moczowych, która wynosi 85,9 μm. Pasek skali = 20 μm. (D) Pokazuje barwienie H&E tkanki cewki moczowej z grupy eksperymentalnej przy 100-krotnym pierwotnym powiększeniu. (E) Przedstawia trichromowe barwienie tkanki cewki moczowej przez Massona z grupy eksperymentalnej, również w 100-krotnym oryginalnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. (F) Powiększenie blizny cewki moczowej i dane pomiarowe zagęszczonego nabłonka dróg moczowych-231,2 μm. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wyniki immunohistochemii na wyciętych próbkach cewki moczowej. Znakowanie przeciwciałami TGF-β podkreśla komórki urotelialne; Zielona fluorescencja jest emitowana po związaniu przeciwciała z komórkami. (A-C) Wykazują niższą intensywność sygnału w komórkach urotelialnych grupy kontrolnej w porównaniu z (D-F) wyższą intensywnością sygnału w komórkach urotelialnych grupy eksperymentalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Cały obraz barwienia Massona, próbek cewki moczowej. (A) Barwienie Massona w grupie kontrolnej; (B) Barwienie Massonem w grupie eksperymentalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Stany Zjednoczone stanowią znaczne obciążenie dla opieki zdrowotnej o znacznych skutkach gospodarczych, negatywnie wpływając zarówno na dobrostan psychiczny, jak i fizyczny20 . Nadal istnieje potrzeba leczenia, które nie tylko całkowicie wyleczy US, ale także skutecznie zapobiega jego nawrotom.

W tym badaniu wykorzystaliśmy model szczura do opracowania prostej i powtarzalnej metody naśladowania uszkodzenia cewki moczowej u pacjentów, po którym nastąpiło przezcewkowe uszkodzenie cewki moczowej wywołane operacją cewki moczowej. Szczury są faworyzowane jako modele zwierzęce, ponieważ są opłacalne, łatwe w obsłudze, oferują powtarzalność i dostarczają wiarygodnych danych. Model szczurzy zastosowany w tym badaniu ma kilka zalet w porównaniu z innymi modelami: jest powszechnie stosowany w różnych analizach omicznych i jest łatwy w zarządzaniu. Ponadto podobieństwo w ekspresji genów komórek nabłonka dróg moczowych między gryzoniami a ludźmi sprawia, że szczurzy model US jest szczególnie odpowiedni do głębszych badań21.

Jak widać na rycinie 7, TGF-β ulegał ekspresji w całym okręgu cewki moczowej zarówno w grupie kontrolnej, jak i eksperymentalnej, a ekspresja TGF-β w grupie eksperymentalnej była znacznie wyższa niż w grupie kontrolnej. Wcześniejsze prace udokumentowały, że rezydujące komórki nabłonka dróg moczowych praktycznie przechodzą fenotypową zmianę w miofibroblasty po urazie, której proces jest głównie napędzany przez TGF-β, który wywiera znaczący wpływ na tworzenie blizn poprzez regulację produkcji ECM (macierzy zewnątrzkomórkowej), modulacji immunologicznej, proliferacji, migracji i różnicowania komórek22,23. Nasze odkrycie sugeruje, że nadekspresja TGF-β może sprzyjać tworzeniu się blizn w cewce moczowej, a wydzielanie TGF-β nie ogranicza się do komórek rezydujących na powierzchni rany, ale wymaga udziału całej cewki moczowej.

Mała średnica i krzywizna cewki moczowej samca szczura stanowią wyzwanie w wykrywaniu zmian w urodynamice po modelowaniu. Brakuje badań nad metodami oceny funkcji moczu u samców szczurów. W tym badaniu zastosowaliśmy metody pośrednie do obserwacji zmian w funkcji moczu poprzez ocenę stanu wypełnienia pęcherza moczowego 4 tygodnie po operacji. Po stymulacji odruchu mikcji, obserwacja wypreparowanego brzucha szczura wykazała, że grupa eksperymentalna wykazywała utrzymujące się pełność pęcherza, co wskazuje na znaczne upośledzenie funkcji mikcji po modelowaniu. Wyniki te są zgodne z objawami klinicznymi trudności w oddawaniu moczu doświadczanych przez pacjentów ze zwężeniem cewki moczowej24. Jednak opracowanie metod prowadzenia badań fizjologicznych parametrów moczu u samców szczurów, takich jak częstotliwość oddawania moczu, średnia objętość oddawanego moczu i skuteczność oddawania moczu, pozostaje wyzwaniem.

Wybór trybów i ustawień mocy noży elektrycznych wysokiej częstotliwości ma decydujący wpływ na zakres obrażeń podczas zabiegów chirurgicznych. Badanie to przedstawia technikę chirurgiczną, która zapewnia odpowiedni poziom obrażeń oraz odpowiedni stopień noża elektrycznego o wysokiej częstotliwości, który ma moc 4 W do opracowania modelu amerykańskiego u szczurów. Najczęstszą metodą w szczurzych modelach amerykańskich jest wykonywanie nacięć igłą lub skalpelem25. Jednak używanie skalpela zwiększa prawdopodobieństwo ciągłego krwawienia ze względu na gładką powierzchnię i małą średnicę cewki moczowej szczura, co może nieumyślnie uszkodzić otaczające naczynia krwionośne.

Nóż o wysokiej częstotliwości oferuje znaczącą zaletę, zapewniając jednoczesną hemostazę poprzez zastosowanie stabilnego i regulowanego prądu elektrycznego do tkanek, zwiększając stabilność i wygodę zabiegu. Dodatkowo sterowalność ustawienia mocy pozwala na ilościową ocenę wyrządzonych szkód.

Idealny protokół eksperymentalny konsekwentnie powodowałby rany cewki moczowej o jednakowej wielkości i głębokości. W tym badaniu wybrano jednobiegunowy mieszany tryb cięcia w celu wywołania uszkodzenia cewki moczowej. W przeciwieństwie do trybu elektrokoagulacji, który powoduje przede wszystkim ulatnianie się składników płynnych, suszenie, koagulację tkanek i uszczelnianie naczyń krwionośnych bez pękania tkanek - co prowadzi do szybkiego przypalenia i adhezji tkanek - tryb cięcia umożliwia precyzyjne, warstwa po warstwie nacinanie tkanki prącia. Podczas gdy elektrokoagulacja jest powszechnie stosowana w modelach królików amerykańskich i wymaga dodatkowych kroków, takich jak oddzielenie penisa od radu i wykonanie nacięć innymi narzędziami chirurgicznymi26, co zwiększa ryzyko urazów i powikłań u zwierząt, jednobiegunowy tryb cięcia mieszanego pozwala na bezpośrednie nacięcia napletka w celu odsłonięcia cewki moczowej. Metoda ta zwiększa wydajność operacyjną i minimalizuje urazy u zwierząt doświadczalnych.

Ustawienie mocy w poprzednim badaniu nie zostało szczegółowo określone, ponieważ zazwyczaj zależy od wagi zwierząt doświadczalnych i obszaru kontaktu między nożem elektronicznym a tkanką. W tym badaniu uczestnikami eksperymentu były 6-miesięczne szczury SD o wadze od 400 g do 500 g. Dla tych warunków optymalne ustawienie mocy określono na poziomie 4-7 W, co pozwalało na precyzyjną kontrolę nad wielkością i głębokością nacięcia. Zalecamy, aby operatorzy zaczęli od niższego ustawienia mocy przy pierwszym użyciu noża o wysokiej częstotliwości w celu opracowania amerykańskiego modelu szczura, dostosowując w razie potrzeby, aby znaleźć najbardziej odpowiednią wartość dla różnych warunków.

Ponadto jednym z krytycznych etapów jest cewnikowanie cewki moczowej szczurów przed operacją. Pomyślne cewnikowanie jest potwierdzone, gdy cewnik jest prawidłowo umieszczony w pęcherzu moczowym. Chociaż cewnik służy jako tymczasowe rusztowanie, musi utrzymywać pozycję cewki moczowej i pomagać w identyfikacji miejsca operowanego. Cewka moczowa samca szczura ma stosunkowo małą średnicę, a przestrzeń między napletkiem a tkanką prącia jest ograniczona, co ułatwia omyłkowe wprowadzenie cewnika do niewłaściwego otworu, co potencjalnie komplikuje kolejne zabiegi. Prawidłowe umieszczenie cewnika jest sprawdzane, gdy mocz wypływa, co wskazuje, że jest on bezpiecznie w pęcherzu. Dodatkowo cewnikowany penis powinien być ustawiony pod kątem 45°, aby zwiększyć stabilność w cewce moczowej i ułatwić zabieg chirurgiczny.

Podsumowując, badanie to demonstruje nowatorską, wysoce skuteczną i opłacalną metodę tworzenia modelu amerykańskiego u szczurów. Metoda ta charakteryzuje się prostotą, wysokim wskaźnikiem sukcesu i stabilnością, oferując cenne narzędzie do badania szerokiej gamy innowacyjnych metod leczenia zwężenia cewki moczowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (nr 2019A1515012116 i nr 2022A1515012559).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szwy wchłanialne (6-0)FIRMA KERONG KR2230814
Podkładka operacyjna dla zwierzątDostarczone przez Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical ImagingNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
CarprofenSigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488-sprzężony kozi anty-króliczy IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H& E Zestaw do bejcAbcamab150669
  Jednostka elektrochirurgiczna wysokiej częstotliwościPekin Taktvoll Technology CompanyES-100v
Zestaw do barwienia MassonMerckHT15
RWD Life ScienceS15001-11
Olej parafinowyNANA kleszcze
gładkieRWD Life ScienceF13019-12
PentobarbitalsoduKluczowe Laboratorium Obrazowania Biomedycznego Prowincji GuangdongNA
Sprague– Dawley ratGuangdong Laboratorium Medyczne Centrum ZwierzątGDMLAC-035
Nożyczki do szwówRWD Life ScienceS15001-11
Cewnik pokryty teflonem (0,6 mm x 1 mm)DGZF nowe materiały firmaNA
TGF Beta 1 Przeciwciało poliklonalneProteintech21898-1-AP
Nożyczki do tkanekRWD Life ScienceS13029-14
Szczypce do trzymania igieł

Bibliografia

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model szczurzyuraz cewki moczowejwysokocz stotliwo ciowy skalpel elektrycznyanaliza histopatologicznauszkodzenie cewki moczowejdezorganizacja w kien kolagenowychnaciek zapalny
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły