Artykuł metodologiczny

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66867

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University, 23D Neuro B.V., 3Zero-Noise Lab, Ernst-Strüngmann Institute for Neuroscience, 4Faculty of Biological Sciences, Goethe University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Streszczenie

Przewlekłe rejestracje elektrofizjologiczne u gryzoni znacząco poprawiły nasze zrozumienie dynamiki neuronów i jej znaczenia behawioralnego. Jednak obecne metody przewlekłego wszczepiania sond wiążą się z wyraźnymi kompromisami między kosztem, łatwością użycia, rozmiarem, elastycznością i długoterminową stabilnością.

Protokół ten wprowadza nowatorski system przewlekłych implantów sond dla myszy zwany DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable, and Modular), zaprojektowany tak, aby przezwyciężyć kompromisy związane z obecnie dostępnymi opcjami. System oferuje lekkie, modułowe i opłacalne rozwiązanie ze standaryzowanymi elementami sprzętowymi, które można łączyć i wszczepiać w prostych krokach oraz bezpiecznie wysadzać w celu odzyskiwania i wielokrotnego ponownego użycia sond, co znacząco obniża koszty eksperymentalne.

System implantów DREAM integruje trzy moduły sprzętowe: (1) mikronapęd, który może przenosić wszystkie standardowe sondy krzemowe, umożliwiając eksperymentatorom regulację głębokości nagrywania na odległość do 7 mm; (2) trójwymiarowy (3D)-drukowalny, otwarty projekt dla noszonej klatki Faradaya pokrytej miedzianą siatką służącą do osłon elektrycznych, ochrony przed uderzeniami i umieszczenia złącza, oraz (3) miniaturyzowanego systemu mocowania głowy dla poprawy dobrostanu zwierząt i łatwości użytkowania. Odpowiedni protokół chirurgiczny został zoptymalizowany pod kątem szybkości (łączny czas: 2 godziny), bezpieczeństwa sondy oraz dobrostanu zwierząt.

Implanty miały minimalny wpływ na repertuar zachowań zwierząt, łatwo nadawały się do zastosowania w swobodnie poruszających się i głowie nieruchomych kontekstach, a także dostarczały wyraźnie rozpoznawalne fale kolczaste i zdrowe odpowiedzi neuronalne przez tygodnie zbierania danych po implantacji. Infekcje i inne komplikacje po operacji były niezwykle rzadkie.

W związku z tym system implantów DREAM jest wszechstronnym, opłacalnym rozwiązaniem dla przewlekłej elektrofizjologii u myszy, poprawiającym dobrostan zwierząt i umożliwiającym bardziej etocznie uzasadnione eksperymenty. Jego konstrukcja upraszcza procedury eksperymentalne w różnych potrzebach badawczych, zwiększając dostępność przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni w szerokim zakresie laboratoriów badawczych.

Wprowadzenie

Elektrofizjologia z przewlekle wszczepianymi sondami krzemowymi stała się potężną techniką badania aktywności nerwowej i łączności u zachowujących się zwierząt, szczególnie myszy, ze względu na ich genetyczną i eksperymentalną podatność na rozwiązywanie1. Laminarne sondy krzemowe, w szczególności, okazały się nieocenionym narzędziem do identyfikowania funkcjonalnych zależności w kolumnach korowych2 oraz do powiązania dynamiki dużych populacji neuronalnych z zachowaniem w sposób, który wcześniej był niemożliwy3.

Dwa uzupełniające się podejścia to obecne złote standardy rejestrowania aktywności neuronowej in vivo: mikroskopia dwufotonowa 4,5 oraz elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa6. Wybór metodologii rejestracji ogranicza charakter możliwych odczytów: mikroskopia dwufotonowa jest szczególnie dobrze przystosowana do badań podłużnych indywidualnie identyfikowalnych neuronów w dużych populacjach na przestrzeni czasu, ale cierpi na wysokie koszty sprzętu i jest ograniczona do powierzchownych warstw kory mózgowej w nienaruszonych mózgach. Ponadto typowa rozdzielczość czasowa ~30 Hz ogranicza zdolność do rejestrowania bieżącej dynamiki neuronalnej 7,8.

Dla porównania, zapisy elektrofizjologiczne oferują wysoką rozdzielczość czasową (do 40 kHz) do śledzenia aktywności neuronów moment po momencie, mogą być szeroko stosowane zarówno na gatunkach, jak i na głębokościach korowych, a także mają stosunkowo niedrogie rozwiązania w porównaniu z mikroskopią dwufotonową. Jednak identyfikacja pojedynczych neuronów, jak również podłużne śledzenie populacji neuronalnych, są trudne do osiągnięcia. Dotyczy to szczególnie elektrod drutowych, np. tetrod, oraz ostrych wstawiań elektrod. Poza brakiem możliwości śledzenia neuronów podczas sesji nagraniowych9, powtarzające się ostre włączenia powodują miejscowy uraz10 , który wywołuje odpowiedź immunologiczną11, zwiększając ryzyko infekcji i glejaku. Ostatecznie zmniejsza to stabilność zarejestrowanej aktywności neuronów i oczekiwaną długość życia zwierząt doświadczalnych, ograniczając zakres badań podłużnych z ostrymi rejestracjami elektrofizjologicznymi dozaledwie kilku dni.

Przewlekłe nagrania sondą krzemową o wysokiej gęstości mają na celu połączenie najlepszych cech ostrej elektrofizjologii i obrazowania dwufotonowego. Mogą śledzić dynamikę populacji nerwowych na przestrzeni sesji, mając jedynie nieco niższą zdolność identyfikacji pojedynczych neuronów w porównaniu do obrazowania dwufotonowego13. Te nagrania zapewniają dużą elastyczność w rozmieszczeniu przestrzennym i precyzyjnej rozdzielczości czasowej zarejestrowanych sygnałów, a także poprawiają długość życia i dobrostan zwierząt doświadczalnych w porównaniu do ostrych nagrań14. Ponadto, w przeciwieństwie do ostrych nagrań, przewlekła elektrofizjologia wymaga tylko jednego zdarzenia implantacji, co skutecznie zmniejsza ryzyko infekcji i uszkodzenia tkanek oraz minimalizuje stres u zwierząt15. Łącznie te zalety czynią przewlekłą elektrofizjologię potężnym narzędziem do badania organizacji i funkcjonowania układu nerwowego.

Jednak powszechnie stosowane techniki przewlekłej implantacji u myszy zmuszają badaczy do istotnych kompromisów między kompatybilnością z rejestracją zachowania, wagą implantu, replikowalnością implantów, kosztami finansowymi oraz ogólną łatwością użycia. Wiele protokołów implantowych nie jest zaprojektowanych tak, aby ułatwić ponowne użycie sond16, co znacznie podnosi efektywny koszt pojedynczych eksperymentów i tym samym utrudnia finansowo niektórym laboratoriom stosowanie przewlekłej elektrofizjologii. Często wymagają też rozległych prac prototypowych i projektowych we firmie, do których nie ma wiedzy i zasobów.

Z kolei zintegrowane systemy implantowe17 oferują szerzej dostępne rozwiązanie dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni. Systemy te zostały zaprojektowane tak, aby integrować mikronapęd trzymający sondę z resztą implantu, co ułatwia obsługę implantu i procedury chirurgiczne. Jednak po wszczepieniu takie systemy mogą być obciążone od góry i ograniczać zdolność eksperymentatora do elastycznego dostosowania eksperymentu do różnych współrzędnych docelowych. Często ich waga uniemożliwia implanty u mniejszych zwierząt, potencjalnie upośledza ruchy zwierząt i wywołuje stres18. Może to nieproporcjonalnie wpływać na badania dotyczące kohort młodocianych i żeńskich, ponieważ ograniczenia wagi częściej dotykają te grupy.

Dodatkowo, nie wszystkie zintegrowane systemy pozwalają na regulację pozycji elektrod po implantacji. Jest to istotne, ponieważ glej lub blizny spowodowane wszczepieniemsondy 19, zwłaszcza w początkowych 48 godzinach po implantacji20, mogą obniżyć jakość zarejestrowanej aktywności neuronalnej. Mikro-korekty głębokości włożenia sondy mogą ograniczyć te negatywne skutki dla integralności sygnału. Dlatego mechanizmy mikropozycjonowania, powszechnie nazywane mikronapędami, mogą być korzystne nawet w sondach z dużą liczbą elektrod rozmieszczonych na całej długości.

Aby przezwyciężyć takie kompromisy, wprowadzamy nowatorski system implantów przewlekłej elektrofizjologii dla myszy, który odpowiada na ograniczenia wcześniejszych konstrukcji, oferując lekkie, opłacalne i modułowe rozwiązanie. System implantów DREAM został zaprojektowany tak, aby ważył mniej niż 10% (~2,1 g) typowej masy ciała myszy, zapewniając dobrostan zwierząt i minimalny wpływ na zachowanie. Walidacja projektu implantu DREAM wykazuje minimalny wpływ na kluczowe metryki behawioralne, takie jak lokomocja – która może być znacząco zmieniona u gryzoni, gdy obciążenia są umieszczane na czaszce. Może to przynieść korzyści eksperymentalnym paradygmatom wykorzystującym swobodnie poruszające się zwierzęta oraz zwierzęta z głową fiksowaną, poprawiając dobrostan zwierząt i umożliwiając bardziej etologicznie uzasadnione eksperymenty.

System zawiera mikronapęd umożliwiający elastyczne regulowanie głębokości nagrywania do 7 mm i może być adaptowany do różnych typów sond i urządzeń rejestrujących, zapewniając naukowcom opłacalne i wszechstronne narzędzie do różnych zastosowań eksperymentalnych. System jest rutynowo łączony z metalowym mikronapędem21, który zapewnia spójne odzyskiwanie sondy w porównaniu z innymi systemami (przewidywana średnia szybkość odzysku: około trzech niezawodnych ponownych użycia na sondę) i drastycznie obniża koszty pojedynczych eksperymentów.

Projekt wyposażony jest w wydrukowaną 3D ochronną klatkę Faradaya, która zapewnia tanią, a jednocześnie solidną ochronę przed zakłóceniami elektrofizjologicznymi, uderzeniami mechanicznymi i materiałami zakaźnymi, umożliwiając stabilne i wolne od szumów nagrania z minimalnym zakażeniem. Ta wszczepialna klatka składa się z tzw. "korony", zaprojektowanej do ochrony przed uderzeniami oraz do zapewnienia struktury przewodzącej metalowej powłoki klatki Faradaya, oraz pierścienia koronowego, który służy jako mocowanie wzmacniacza implantowalnego i/lub złącza sondy (patrz Rysunek 1).

Wreszcie, płytki głowy dołączone do modułowego systemu implantów są zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z nowatorskim, wydajnym systemem utrwalania głowy bez zwiększania objętości implantu. W przeciwieństwie do innych istniejących systemów, nie wymaga dokręcania małych śrub blisko implantu, przyspieszania utrwalania myszy w warunkach eksperymentalnych oraz poprawy relacji eksperymentator-zwierzę oraz przestrzegania zachowań. Jednocześnie płyta głowowa służy jako podstawa do budowy pozostałych modułów systemu chronicznej elektrofizjologii DREAM.

Pliki projektowe dla implantu DREAM są publikowane jako sprzęt open-source w https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/. W kolejnych sekcjach opisano projektowanie i wykonanie systemu implantu DREAM, zademonstrowano jego skuteczną implementację w modelu myszym oraz omówiono jego potencjalne zastosowania i zalety w porównaniu z istniejącymi systemami.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Towarzystwa Maxa Plancka i zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, kod zatwierdzenia projektu: F149-2000).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Projekt implantu. (A) Trójwymiarowe renderowanie implantu nałożonego na czaszkę myszy z krzemową sondą połączoną z złączem sondy. Centralny otwór płyty głowicy wynosi około 10 mm w skali. Wysokość napędu wynosi około 17 mm. Miedziana siatka tworząca zewnętrzną część korony Faradaya oraz przewody uziemiające/referencyjne nie są pokazane. (B) To samo co (A) z połączeniem do płytki wzmacniacza zamiast złącza sondowego. (C) Wybuchnięty rysunek techniczny implantu, pokazujący jego elementy. (D) Renderowanie skośnego dystansu, który można wszczepić pod mikronapęd, co pozwala na konsekwentne wszczepienie mikronapędu pod określonym kątem (tutaj: 20°). (E) Przedstawienie zintegrowanego mechanizmu stabilizacji głowy, pokazujące wszczepioną płytkę głowy z koroną Faradaya z otaczającą zaciskiem do mocowania głowicy oraz połączeniem jaskółczego ogona do przygotowania. (F) Obraz myszy przymocowanej do bieżni za pomocą zintegrowanego mechanizmu stabilizacji głowy implantu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

UWAGA: Sekcje 1 i 2 omawiają przygotowania przedoperacyjne

1. Przygotowanie sondy krzemowej

  1. W przypadku ponownego użycia sondy czyść sondę krzemową zgodnie z zaleceniami dostawcy sondy (patrz punkt 10.12 dla zalecanej procedury). Namocz sondę w enzymatycznym czyściku (patrz Tabela materiałów) na 5-10 minut, a następnie przepłukaj w wodzie demineralizowanej. Zrób to jak najszybciej po wyjaśnieniu. Dzień przed (ponownym) wszczepieniem namocz sondę w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut w celu dezynfekcji.
  2. Zmierz impedancje kanałów, aby upewnić się, że mieszczą się one w specyfikacjach dla nagranego sygnału. Postępuj zgodnie z protokołem testowania poziomów szumów z instrukcji obsługi Neuropixels22, mierz impedancję za pomocą wybranego oprogramowania do nagrywania (np. https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) oraz stosuj impedancje kanału docelowego od producenta sondy silikonowej lub karty katalogowej. Jeśli impedancje są zbyt wysokie, rozważ ponowne powlekanie miejsc elektrod23.
  3. Przylutuj 0,05" lutownicze gniazdo ogonowe (patrz Tabela materiałów) do przewodu masowego (GND) sondy. Podłącz gniazdo do pinu GND (następny krok) podczas operacji.
    UWAGA: W tym protokole nie używa się osobnego pin referencyjnego (REF), ponieważ GND i REF są zwarte na używanym etapie głównym. Dlatego w pozostałej części protokołu wspomniany będzie tylko pin GND. Jeśli używany jest osobny REF, powtórz następujący krok dla pinu REF.
  4. Aby przygotować pinek GND, wielokrotnie wkładaj stronę pinu gniazda lutowanego ogonowego 0,05" (patrz Tabela materiałów) do gniazda ogonowego lutu GND 0,05", aż wkładanie stanie się w dużej mierze bezwysiłkowe. Użycie złoconych szpilek może zmniejszyć potrzebę stosowania tego etapu wygładzania. Dzięki temu sworzel i gniazdo GND można łatwo podłączyć podczas operacji bez konieczności nadmiernego nacisku, zmniejszając ryzyko obrażeń zwierzęcia i uszkodzeń sondy.
  5. Jeśli używany jest implantowalny przedwzmacniacz do sondy krzemowej, przygotuj je do przewlekłej implantacji zgodnie z procedurami producenta. Następnie przymocuj wzmacniacz/złącze do pierścienia klatki Faradaya, używając gipsu silikonowego, aby przykleić go do obszaru pierścienia Faradaya przeznaczonego do trzymania wzmacniacza (patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Przygotowanie implantowanego przedwzmacniacza do sondy krzemowej do chronicznej implantacji po procedurach dostawcy może obejmować powlekanie ich krzemem lub epoksydem, aby zapobiec uszkodzeniom elektroniki przez wilgoć, a także wielokrotne łączenie złącza wzmacniacza, aby zmniejszyć siłę łączenia wzmacniacza z systemem nagrywającym podczas nagrywania. Jest to szczególnie przydatne dla użytkowników Omnetyki.

2. Przygotowanie mikronapędu i nakrycia głowy

  1. Dokręć śrubę w korpusie mikronapędu tak, aby wahadłowiec mikronapędu był niemal całkowicie schowany do góry.
  2. Opcjonalnie można przymocować skośną dystansę (patrz Rysunek 1D) do spodu mikronapędu za pomocą kleju cyjanoakrylanowego lub cementu dentystycznego, co pozwala na zastosowanie określonego stopnia nachylenia, na przykład podczas nagrywania przez warstwy korowe w obszarze centralnej bruzdy lub w głębokich strukturach, które mogą wymagać podejścia nieprostopadłego (dla skośnego dystansu, zobacz Tabelę materiałów).
  3. Połóż mikronapęd poziomo na uchwycie mikronapędu (Ilustracja uzupełniająca 1).
  4. Umieść mały kawałek klejowej masy (patrz Tabela materiałów) na uchwytie mikronapędu w odległości nad mikronapędem, gdzie będzie umieszczony złącze głowy. Odległość ta zależy od długości kabla elastycznego, który łączy sondę silikonową z złączem sceny głównej.
  5. Umieść na wahadłowcu maleńką kroplę silikonowego gipsu (patrz Tabela materiałów).
  6. Wyjmij silikonową sondę z opakowania za pomocą tępych, miękko zakończonych kleszczy. Wykonaj je, pokryjąc standardowe szczypce igiełkowe rurką termokurczliwą o średnicy 3 mm (patrz Tabela materiałów). Umieść sondę z linką flex najpierw na wahadłowcu mikronapędu tak, aby dolna krawędź kabla elastycznego lekko zwisała nad dolną krawędzią mikronapędu.
  7. Delikatnie przeciągnij kabel elastyczny w stronę góry mikronapędu, aż dolna krawędź kabla zetknęła się z dolną krawędzią promu mikronapędowego. Upewnij się, że podczas tego etapu docisnąłeś kabel elastyczny do lewej krawędzi wahadłowca microdrive, tak aby był dokładnie pionowo umieszczony na końcu microdrive. W tym momencie upewnij się, że trzonki silikonowej sondy nie wystają (lub tylko minimalnie) poza dolną krawędź mikronapędu (w zależności od dokładnej długości trzonków sondy i głębokości docelowego obszaru mózgu).
  8. Umieść złącze sondy na kleju na szczycie uchwytu, aby chronić sondę przed odpadnięciem.
  9. Użyj igły strzykawki o masie 27 G, aby nałożyć małą kroplę kleju cyjanoakrylanowego (patrz Tabela materiałów) między elastycznym kablem a lotkiem, aby zabezpieczyć sondę na miejscu. Upewnij się, że klej nie spływa na mikronapęd ani wzdłuż elastycznego kabla poza wahadłowcem (to bardzo ważne)
  10. Gdy kabel elastyczny zostanie przyklejony, przymocuj wzmacniacz do pierścienia koronowego (patrz Tabela materiałów) za pomocą gipsu silikonowego. Następnie podłącz kabel elastyczny do wzmacniacza i okryj połączenie oraz kabel cienką warstwą silikonowego tynku.
  11. Po 5 minutach, gdy tynk się związnie, bezpiecznie przechowaj mikronapęd i sondę do dalszego użycia.
  12. Wytnij kawałki miedzianej siatki (patrz Tabela materiałów) w kształt otwartego pączka (patrz wzór cięcia na Dodatkowym Rysunku 2), aby przykryć klatkę Faradaya.
  13. Przymocuj wycięcie z miedzianej siatki do klatki Faradaya za pomocą małych kropelek żywicy epoksydowej (patrz Tabela materiałów). W tym przypadku można również zastąpić epoksyd cementem dentystycznym.
    UWAGA: Klatka Faradaya zawiera miejsce na złącze sondy lub wzmacniacz. Ta przestrzeń jest oznaczona literą X w pliku projektowym i zawiera podstawę nośną dla wzmacniacza/złącza oraz większą odległość między dwoma sąsiadującymi szprychami klatki. Aby stworzyć wystarczającą przestrzeń wokół wzmacniacza/złącza, przymocuj niewielką ilość dodatkowej siatki między dwoma sąsiednimi szprychami, tworząc wypustkę. Dzięki temu wzmacniacz/złącze można później umieścić w tej "kieszeni" bez dotykania klatki Faradaya. Aby zapewnić stabilną przyczepność przy minimalnym odkształceniu, użyj pierścienia koronowego umieszczonego bezpośrednio na koronie, aby utrzymać kształt i podtrzymać cienkie szprychy korony. Dodatkowo, używaj lutowniczych rąk, aby zabezpieczyć koronkę i siatkę podczas suszenia. Jeśli podczas zabiegu ktoś ma trudności z utrzymaniem kształtu korony, spróbuj używać epoksydu tylko dwoma ramionami korony naraz, aby zapobiec wypaczeniu.
  14. Jeśli pożądane jest osobne uziemienie klatki Faradaya, przylutuj mały kołek kolektora na 30 mm przewodzie uziemiającym (patrz Tabela materiałów), a następnie użyj przewodzącego epoksydu do wycięcia z miedzianej siatki.
    UWAGA: Ten krok nie jest przestrzegany w laboratorium.
  15. W tym momencie bezpiecznie przechowaj przygotowane części i wykonuj operację na późniejszym etapie.
    UWAGA: Sekcje 3-6 omawiają implantację mikronapędu i nakrycia głowy.

3. Chirurgia: przygotowanie sondy i miejsca pracy

  1. Sterylizuj i umieść narzędzia chirurgiczne w miejscu pracy po zatwierdzonym zabiegu.
    UWAGA: Może to obejmować użycie sterylizatora kulkowego, narzędzi do autoklawowania lub płukanie nadtlenkiem 30% lub 90% etanolem, w zależności od zatwierdzonego protokołu eksperymentalnego.
  2. Umieść ceramiczną miskę używaną do przygotowania cementu dentystycznego w lodówce, lodówce lub zamrażarce, zgodnie z instrukcjami zawartymi w zestawie cementu dentystycznego (patrz Tabela materiałów). Używaj schłodzonej naczynia ceramicznego podczas mieszania cementu, aby wydłużyć czas plastyczności cementu. Używaj schłodzonej misy, gdy potrzebne są dłuższe etapy cementowania.
  3. Jeśli na końcu eksperymentu potrzebna jest histologiczna weryfikacja umieszczenia sondy, przedłuż sondę krzemową tuż przed zabiegiem, skręcając śrubę mikronapędu przeciwnie do ruchu wskazówek zegara i nałóż barwnik lipofilowy (patrz Tabela materiałów) na sondę, zanurzając ją w małej kropli barwnika. Przygotować barwnik lipofilowy z komercyjnie kupowanego rozcieńczonego roztworu dimetylowego siarkowodorku (DMSO) lub etanolu (EtOH) (patrz Tabela materiałów), rozcieńczając go w odpowiednim buforze, takim jak PBS, w stężeniu 1-5 μM.

4. Chirurgia: Przygotowanie zwierzęcia

  1. Stosuj zatwierdzony protokół znieczulenia przy 2-4-godzinnej operacji gryzoni w warunkach aseptycznych. Może to obejmować znieczulenie ogólne i miejscowe, przeciwból, stosowanie maści do oczu oraz zastrzyki z soli fizjologicznej. Tutaj użyj znieczulenia w zastrzykach (ketamina 100 [mg/kg]/medetomidyna 0,5 [mg/kg]) wraz z miejscowym kremem przeciwbólowym i maścią do oczu (patrz Tabela materiałów) i umieść zwierzę na termoforze regulującym temperaturę ciała. Stosuj zatwierdzoną procedurę monitorowania, np. uszczypnięcie palca, aby regularnie monitorować głębokość znieczulenia (co 20 minut). Monitoruj oddech pod kątem regularności i głębokości, aby upewnić się, że nie przekroczono prawidłowego poziomu znieczulenia.
  2. Gdy zwierzę jest całkowicie znieczulone, przenieś je do osobnego, niesterylnego miejsca golenia.
    1. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio ogrzane; Na przykład połóż ją na termoforze. Usuń włosy na czubku czaszki. Rób to za pomocą golarki elektrycznej lub kremu depilacyjnego (patrz Tabela materiałów) albo wielokrotnie goląc czubek głowy skalpelem pokrytym 70% etanolem.
    2. Ostrożnie usuwaj luźne włosy, aby nie miały kontaktu z odsłoniętą tkanką później. Aby usunąć włosy, użyj np. chusteczek zwilżonych 70% etanolem i/lub pompki do ściskania. Jeśli używasz kremu depilacyjnego, upewnij się, że usuwasz go dokładnie za pomocą patyczków i soli fizjologicznej.
  3. Dezynfekuj ogolony obszar wielokrotnie środkiem dezynfekującym na bazie jodu (patrz Tabela materiałów) oraz alkoholem, używając patyczków kosmetycznych, przesuwając się od środka głowy na boki, aby usunąć pozostałe luźne włosy z miejsca nacięcia.
  4. Nałóż betadynę na ogolony obszar wokół nacięcia i nałóż zasłonę na ciało oraz nieogoloną część zwierzęcia. Opcjonalnie należy nałożyć opaskę bezpośrednio na miejsce nacięcia. Zapewnia to sterylne miejsce robocze i chroni narzędzia oraz materiały chirurgiczne przed kontaktem z niesterylnym futrem.
  5. Umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce za pomocą drążek usznych i uchwytu na nos (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że zwierzę znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia przed rozpoczęciem nacięcia, stosując metody takie jak test uszczypania palca u stóp i monitorowanie wzorców oddechowych.
  6. Używając małych nożyczek chirurgicznych (patrz Tabela materiałów), wyciął migdałowy otwór w skórze na górze czaszki, sięgając od tylnej części szwu lambda do pomiędzy oczami.
  7. Usuń błonę podskórną i okostkę, odcinając ją jeszcze na wilgotno, a następnie zadrapuj czaszkę skalpelem, aby usunąć miękką tkankę błonową z powierzchni czaszki, która może utrudniać przyczepność cementu dentystycznego.
  8. Opcjonalnie: Po oczyszczeniu czaszki z tkanki błonowej, nałóż krótko cienką warstwę nadtlenku 0,5% i zmyj ją środkiem dezynfekującym jodem na bazie wody (np. Betadyną), a następnie szorstkujesz powierzchnię czaszki, aby poprawić przyczepność podkładu do czaszki.
  9. Ostrożnie szorstkować powierzchnię czaszki, rysując wzór krzyżowy z końcówką skalpela odwróconą do góry nogami. To pomaga cementowi dentystycznemu później przylegać do czaszki.
    UWAGA: Nie drap zbyt mocno na szwach, ponieważ może to spowodować pęknięcie szwów i wyciek płynu wewnątrzczaszkowego, co utrudnia przyczepność cementu dentystycznego.
  10. Na przemian używaj ostrza skalpela i sterylnych patyczek kosmotycznych, aby delikatnie drapać/odpychać mięśnie szyi przyczepione do boków szwu lambda, aż mięśnie zostaną wypchnięte z powrotem do "krawędzi" czaszki na szczycie móżdżku. Pomaga to zminimalizować szum mięśniowy w nagraniach neuronalnych.
  11. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 mL igłą 27 g (patrz Tabela materiałów) niewielką ilością chirurgicznego kleju cyjanoakrylanowego (patrz Tabela materiałów). Następnie przyklej skórę do krawędzi czaszki za pomocą strzykawki, aby rozsmarować na niej drobne krople superglue. Przyklej tkankę jak najbardziej płasko do czaszki, aby zostawić miejsce na implanty. Zabieg ten zapewnia, że skóra i mięśnie nie stykają się bezpośrednio z częściami implantu, co zapobiega hałasowi mięśni podczas nagrań i poprawia przyczepność cementu dentystycznego.
  12. Nałóż podkład cementu dentystycznego na czaszkę dla dodatkowej przyczepności i utwardzaj pod światłem UV (patrz Tabela materiałów). Poprawia to przyczepność cementu stomatologicznego i zapobiega przeciekowi szwów czaszki oraz stopniowemu osłabianiu połączenia czaszkowo-cementowego.
  13. Znajdź docelowe miejsce wszczepienia sondy względem bregmy lub lambdy i określ kraniotomię wokół niej markerem chirurgicznym. Umieść płytkę głowową na czaszce tak, aby kraniotomia leżała w niej, z miejscem na mikronapęd po jednej stronie kraniotomii oraz na 1-2 piny uziemiające.
  14. Wszczep płytę głowy za pomocą cementu dentystycznego. Wymieszaj cement dentystyczny w wyznaczonej schłodzonej naczyniu ceramicznej (patrz krok 3.2). Upewnij się, że płytka głowy przylega do czaszki ze wszystkich stron, tworząc szczelną "studnię".
  15. Wiertarką dentystyczną (rozmiar US 1/2 HP) wywierć mały otwór na zadzior, o szerokości sworzni kolektorów przygotowanych w kroku 1.4, nad obszarami mózgu, aby użyć go jako GND/REF. Jeśli chcesz uziemić klatkę Faradaya, wywierć kolejny mały otwór na żarno blisko krawędzi klatki Faradaya na kołek nagłówkowy Faraday-GND.
    UWAGA: W przypadku pinów nagłówka GND/REF umieść kraniotomię w odpowiedniej odległości od krawędzi klatki, aby sam pin mógł później zostać umieszczony w niej bez dotykania klatki Faradaya.
  16. Oczyść kraniotomię, delikatnie skapując na nią sterylną sól fizjologiczną strzykawką i usuwając ją chusteczkami nieusuwającymi łuszenia (patrz Tabela materiałów). Powtarzaj, aż cała krew i luźna tkanka zostaną usunięte.
  17. Przygotuj roztwór agaru o stężeniu 0,7% (patrz Tabela materiałów) w soli fizjologicznej, lekko go ochłodzić i wprowadzić do kraniotomii za pomocą igły 27 g na strzykawce 1 mL.
  18. Delikatnie włóż sworzeń GND (patrz krok 1.3) do każdej kraniotomii wykonanej w poprzednim etapie. Szpilka (lub szpilki) będą otoczone agarem ze wszystkich stron (patrz krok 4.17). Nałóż cement wokół sworzni kolektora, aby je zabezpieczyć i zapewnić izolację elektryczną.
  19. Wyczyść ceramiczną miskę i włóż ją z powrotem do lodówki/zamrażarki.
  20. Wiertłem dentystycznym wywiercaj kontur większej kraniotomii (okrągłej lub kwadratowej), poruszając się wokół krawędzi w równych ruchach. Upewnij się, że czaszka ma wymiary 1 mm x 1 mm do 2 mm x 2 mm, aby umożliwić drobne korekty w umiejscowieniu sondy i unikanie naczyń krwionośnych bez nadmiernego odsłaniania kory. Jeśli to możliwe, unikaj nakładania kraniotomii na szwy. Ćwicz w rundach po 20-30 sekund i schładzaj czaszkę solą fizjologiczną między rundami.
    UWAGA: Rozpoczynając wiercenie, warto zaznaczyć krawędź natarcia mikronapędu markerem, dzięki czemu podczas wiercenia można uformować prostą krawędź równolegle do krawędzi mikronapędowej. Zwiększa to szanse na uniknięcie cementu w czaszce podczas mocowania mikronapędu, a także poprawia przyczepność, zapobiega przepustkowi mikronapędu nad kraniotomią i pozwala na większą zwrotność boczną przy ustawianiu mikronapędu względem końcowej pozycji miejsca rejestracji.
  21. Po kilku początkowych rundach wiercenia sprawdź opór wywierconej części kości, delikatnie naciskając na nią cienkimi kleszczami (rozmiar 5 lub cieńsze; patrz Tabela materiałów).
    1. Testuj między rundami wiercenia, aż kość zacznie "odbijać" się pod kleszczemi podczas pchania. W takim przypadku dodaj kroplę soli fizjologicznej na kraniotomię, aby zmiękczyć kość, a następnie użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć wywiercony kawałek kości.
    2. Jeśli kości nie da się delikatnie usunąć, wykonaj kolejną rundę wiercenia, koncentrując się na miejscach, gdzie kość jest jeszcze mocniej przymocowana. Generalnie należy usunąć czaszkę delikatnym naciskiem kleszczy, zanim zostanie całkowicie przewiercona, ponieważ zwykle minimalizuje to uszkodzenia tkanek.
      UWAGA: Upewnij się, że powierzchnia opony twardej jest regularnie nawilżana, zarówno podczas wiercenia w celu obniżenia temperatury, jak i po usunięciu płata kostnego. Zwiększa to szanse na łatwe włożenie sondy, zapobiegając wysychaniu twardej i utrudnieniu penetracji. Jeśli opona twarda okaże się zbyt twarda do przebicia lub stosuje się sondy tępe lub wielotrzpienne, durotomię wykonuje się poprzez podniesienie opony za pomocą igły 27 G i wykonanie niewielkiego nacięcia pod zanurzeniem w sol fizjologicznej, aby zapobiec przyklejaniu się do powierzchni mózgu.
  22. Przykryj kraniotomię gąbką hemostatyczną (patrz Tabela materiałów) namoczoną w chłodnej, sterylnej soli fizjologicznej, aby chronić oponę twardą i mózg.

5. Chirurgia: implantacja sondy

  1. Przymocuj uchwyt na niestandardowy mikronapęd (patrz Tabela materiałów) do ramienia aparatu stereotaktycznego. Jeśli mikronapęd został wyjęty z uchwytu mikronapędu po przygotowaniu sondy, umieść mikronapęd wraz z dołączoną sondą krzemową do uchwytu mikronapędu. Ustawij ramię stereotaksu zgodnie z potrzebami, aby dotrzeć do pożądanego obszaru mózgu. Umieść pierścień koronowy wraz z dopiętym wzmacniaczem na trzech pionowych pinach z tyłu uchwytu mikronapędu (patrz Rysunek Uzupełniający 1).
  2. Obniż mikronapęd do ~0,5 mm od czaszki, a następnie użyj kleszczy, aby połączyć pin(y) nagłówka GND/REF przymocowany do sondy z odpowiednim pinem GND/REF wszczepionym w czaszkę (patrz kroki 4.14-4.15). Zobacz Dodatkowy Rysunek 3 oraz Dodatkowy Rysunek 4 , aby zobaczyć przykłady przerzutu, kraniotomii i umieszczenia sworzni GND/REF.
  3. Po umieszczeniu na miejscu opcjonalnie zabezpiecz sworzeń kroplą przewodzącej srebrnej epoksydu (patrz Tabela materiałów) dla bardziej wytrzymałego połączenia. Po utwardzeniu epoksydu srebra pokryj połączone sworznie niewielką ilością cementu dentystycznego (patrz Tabela materiałów), aby zapewnić stabilność połączenia przez długi czas i uniemożliwić połączenie elektryczne z otaczającymi tkankami i/lub elementami implantu.
  4. Usuń gąbkę hemostatyczną z kraniotomii (patrz krok 4.22).
  5. Ustaw ramię stereotaktyczne z mikronapędem nad kraniotomią.
    UWAGA: Jeśli sonda jest cofana, upewnij się, że mikronapęd jest umieszczony tak, aby sonda dotykała części czaszki, która nie zawiera dużych naczyń krwionośnych.
  6. Jeśli to konieczne, obniż mikronapęd, regulując położenie i kąt do momentu, gdy trzonek sondy dotknie powierzchni twardej lub mózgu (patrz krok 4.21) w obszarze docelowym.
  7. Wymieszaj cement dentystyczny w wyznaczonej ceramicznej misce (patrz krok 3.2) i zacementuj podstawę mikronapędu, koncentrując się na trzech stronach podstawy mikronapędu, które nie są zwrócone w stronę elektrody. Upewnij się, że cement nie dotyka mikronapędu powyżej zdejmowanej "podstawy" (patrz Rysunek 1D).
    1. Upewnij się, że przestrzeń między podstawą a czaszką jest całkowicie pokryta cementem dentystycznym. Umyj ceramiczną miskę i włóż ją z powrotem do lodówki/zamrażarki. Poczekaj, aż cement utwardzi, około 10-15 minut.
      UWAGA: Pozostawia się niewielka szczelina między podstawą mikronapędu a czaszką, a cement jest używany w najbardziej płynnej formie do jej wypełnienia. Gdy cement lekko się zagęści, cement między ścianami podstawy mikronapędu a czaszką powstaje. Zawsze stosuje się bardzo małe ilości cementu, ponieważ przepływ substancji może być nieprzewidywalny, a większe ilości mogą przedostać się do niepożądanych obszarów. Niewielkie ilości gąbki hemostatycznej zanurzonej w soli fizjologicznej mogą być użyte do pokrycia części kraniotomii. Jeśli cement przypadkowo przedostanie się na kraniotomię, usuń cement kleszczami, gdy uzyska konsystencję przypominającą warstwę.
  8. Opuszczaj sondę krzemową na mózg, uważnie monitorując pozycję sondy pod mikroskopem. Gdy trzonki sondy dotykają mózgu, szybko obniż ją o ~250 μm (pełny obrót śruby to 282 μm), aby upewnić się, że sonda przebije się przez opór powierzchni opony twardej/kory.
    1. Sprawdź to wizualnie. Jeśli sonda nie przebiła się do kory, odczekaj 5 minut, a następnie spróbuj przetrawić oporządek ostry końcówką trzonkową, wielokrotnie unosząc i opuszczając sondę o kilkadziesiąt mikrometrów, gdy opona twarda/kora jest napięta od końcówki sondy.
  9. Gdy sonda przebije powierzchnię kory, stopniowo ją opuszczaj wolniej (100-200 μm/min), aż do osiągnięcia współrzędnych docelowych lub przesunięcia się o ponad 1000 μm. Jeśli cel wymaga przesunięcia sondy o więcej niż 1000 μm, przesuwaj sondę w krokach maksymalnie 1000 μm/sesję przez kolejne sesje nagraniowe, aż osiągniemy współrzędne docelowe.
    UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli preferowane jest monitorowanie sygnałów neuronalnych podczas opuszczania sondy krzemowej. Kroki w tym celu opisano w sekcji 7.
  10. Przygotuj elastomer silikonowy zgodnie z instrukcjami (patrz Tabela materiałów) i podaj małą kroplę do kraniotomii za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (patrz Tabela materiałów).
  11. Po wyschnięciu pokryj silikonowy elastomer mieszanką wosku kostnego i oleju mineralnego w formie 50/50. Ten krok dodatkowo chroni sondę i zapobiega gromadzeniu się zanieczyszczeń oraz suchej plazmy na kraniotomii, co ułatwia i czyni ekstrakcję bezpieczniejszą. Zachowaj ostrożność, ponieważ praca wokół sondy podczas jej opuszczania może prowadzić do uszkodzenia.

6. Chirurgia: Wszczepienie klatki Faradaya

  1. Gdy cement dentystyczny całkowicie stwardnieje, poluzuj uchwyt mikronapędu, luzując boczną śrubę mocującą napęd kluczem imbusowym (patrz Rysunek Uzupełniający 1). Delikatnie cofnij uchwyt o ~1 cm, tak aby mikronapęd był wolnostojący, ale wzmacniacz/złącze sondy pozostało przymocowane do uchwytu implantu bez rozciągania kabla elastycznego.
  2. Umieść gotową koronę i siatkę Faradaya wokół płyty głowy, rozciągając klatkę przy otworze i wkładając ją poziomo na kabel microdrive i Flex, a następnie mocuj ją na głowicy cementem dentystycznym.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie przestrzenie między klatką Faradaya a czaszką zamkniesz cementem dentystycznym, aby chronić implant przed zanieczyszczeniem.
  3. Umieść pierścień koronowy Faradaya (patrz Tabela materiałów) z złączem sondy/stopieniem głowicowym nad koroną, ustawiając zintegrowany uchwyt wzmacniacza/złącza sondy z obszarem oznaczonym wgłębionym 'X' na koronie Faradaya (patrz krok 2.13).
  4. Przymocuj pierścień do klatki Faradaya za pomocą małej kropli kleju cyjanoakrylanowego lub cementu dentystycznego na każdym złączeniu szprych-pierścień.
  5. Gdy pierścień Faradaya z wbudowanym wzmacniaczem/złączem sondowym jest zabezpieczony, całkowicie schuj ramię stereotaktyczne za pomocą uchwytu mikronapędu. Zobacz Ilustrację Dodatkową 3 , aby uzyskać krok po kroku przewodnik po montażu tych komponentów.

7. Nagranie testów po operacji

  1. Podłącz wzmacniacz/złącze sondy do sprzętu nagrywającego i rozpocznij nagrywanie.
  2. Jeśli sonda nie osiągnęła jeszcze celu podczas pierwszego włożenia (patrz krok 5.9), powoli obracaj śrubę mikronapędu przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby opuścić sondę, monitorując sygnały neuronalne.
    UWAGA: Sygnały powinny się zmieniać a) gdy elektrody dotykają warstwy silikonowego elastomeru nad kraniotomią oraz b) gdy elektrody zaczynają wchodzić w głąb mózgu (patrz krok 7.2). Aktywność neuronów o wysokiej częstotliwości jest rejestrowana przez elektrody całkowicie wprowadzone w mózgu, natomiast elektrody mające kontakt z mózgowo-rdzeniowym na powierzchni mózgu zazwyczaj pokazują sygnał populacji neuronów o niskim przepustowości bez aktywności skokowej (podobnie jak ślad EEG), a miejsca zapisu w powietrzu zwiększony szum elektryczny. Można dodatkowo zweryfikować głębokość włożenia sondy, mierząc impedancję poszczególnych kanałów po nagraniu testowym. Kanały w kontakcie z powietrzem powinny wykazywać wysoką impedancję (wskazującą na otwarty obwód) oraz impedancje podobne do tych mierzonych przed operacją dla kanałów stykających się z mózgiem lub już znajdujących się w mózgu. Przesuwaj sondę krzemową o maksymalną całkowitą odległość około 1000 μm na sesję, z maksymalną prędkością około 75 μm/min (patrz krok 5.5).
  3. Gdy potencjały pola neuronowego są widoczne na całej sondzie i/lub sonda jest przesunięta maksymalnie o 1000 μm, zakończ nagranie testowe i odłącz złącze stopnia głownego.

8. Odbudowa

  1. Przykryj klatkę Faradaya samoprzylepną chuszą weterynaryjną (patrz Tabela materiałów).
  2. Zakończ znieczulenie i pozwól zwierzęciu dojść do siebie, podczas gdy przez kilka dni podaj opiekę pooperacyjną zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi eksperymentalnymi. Może to obejmować podawanie środków przeciwbólowych oraz antybiotyków profilaktycznych.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano wstrzykiwalną buprenorfinę (0,1 mg/kg), enrofloksacynę (20 mg/kg), a także enrofloksacynę (0,17 mg/mL) i metamizol (1,25 mg/mL) w wodzie pitnej odpowiednio przez 3 i 5 dni po operacji. W zależności od spożycia wody, myszy otrzymują ~1,02 mg/dzień enrofloksacyny i ~7,5 mg/dzień metamizolu.
  3. Jeśli elektrody na sondzie krzemowej nie są jeszcze w pożądanym miejscu, obracaj śrubę mikronapędu małymi krokami, maksymalnie cztery pełne obroty (czyli ~1000 μm) na sesję. W razie potrzeby powtarzaj tę procedurę przez kilka dni, aż osiągniesz cel. Zaleca się połączenie ruchu sondy z jednoczesnymi rejestracjami w celu oceny aktywności elektrofizjologicznej w obszarach poprzecznych ruchu.
    UWAGA: Implant został zaprojektowany tak, aby wymagał bardzo niewielkiej opieki i konserwacji po implantacji. Jednak ze względu na położenie płytki głowy blisko szyi, ruch skóry może powodować podrażnienia. Monitoruj ten obszar i stosuj krem antybiotykowy, jeśli wystąpi podrażnienie, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi eksperymentalnymi.

9. Eksperymenty behawioralne i chroniczne zapisy

  1. W przypadku chronicznych nagrań z głową podczas wykonywania zadania, przymocuj płytę głowy u podstawy klatki Faradaya do zacisku głowy, ręcznie otwierając zacisk i zaciskając wszczepioną głowicę (patrz Rysunek 1C, E, F).
    UWAGA: Jeśli fiksacja głowy nie jest potrzebna, ten system implantowy może być również używany do swobodnego poruszania się nagrań. Aby nagrywać swobodnie, pomiń kroki 9.1 i 9.7.
  2. Zdejmij samoprzylepną opaskę weterynaryjną z implantu.
    UWAGA: Aby zminimalizować dyskomfort zwierzęcia, zaleca się rozpoczęcie prostego, satysfakcjonującego zadania behawioralnego przed tym krokiem jako odwrócenie uwagi podczas pracy eksperymentatora z implantem.
  3. Podłącz wzmacniacz/złącze do sprzętu nagraniowego.
  4. Przeprowadzaj nagrania neuronalne podczas wykonywania zadania przez zwierzę.
    UWAGA: Jeśli celem jest maksymalizacja liczby zarejestrowanych jednostek zewnątrzkomórkowych, przesuwaj prom o kilka dziesiątek mikrometrów za każdym razem, gdy wydajność neuronalna w danym miejscu maleje. Należy zauważyć, że po przesunięciu sondy sygnał może potrzebować minut do godzin, by się ustabilizować. Dlatego może być korzystne przesunięcie sondy na koniec sesji, aby sygnał mógł się zregenerować do początku następnej sesji.
  5. Odłącz sprzęt rejestracyjny i przykryj implant nową otulą weterynaryjną na końcu rejestracji zachowania.
  6. Otwórz zacisk do mocowania głowy, aby odłączyć zwierzę od zamocowania głowy.

10. Odzyskiwanie sondy

  1. Na końcu końcowego nagrania cofnij sondę krzemową jak najdalej do mikronapędu, przekręcając śrubę zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Rób to, gdy zwierzę jest fiksowane i zachowuje się dobrze lub gdy jest znieczulone w składzie chirurgicznym. Zrób wychod sondy z mózgu, monitorując jednocześnie sygnały neuronalne i sprawdzając, czy elektrody są zanurzone w mózgu, dotykają powierzchni mózgu lub mają kontakt z powietrzem (patrz krok 7.3).
    UWAGA: W zależności od protokołu histologicznego i sondy, przed cofnięciem sondy wykonuje się zmiany elektrolityczne, aby określić dokładne położenie niektórych elektrod na sondzie. Jeśli monitorowanie wyjścia sondy za pomocą rejestracji neuronalnej nie jest konieczne, możliwe jest również wycofanie sondy po zakończeniu kontaktu zwierzęcia.
  2. Zakończyć zabieg zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi (w tym perfuzją, jeśli planowane jest utrwalenie mózgu do kolejnej histologii).
  3. Poczekaj ~ 10 minut po śmierci zwierzęcia. Następnie zafiksuj zwierzę w stereotaksie, upewniając się, że jego głowa nie może się poruszać podczas wyciągania, aby zapobiec uszkodzeniu sondy.
  4. Nałóż kroplę soli fizjologicznej na kraniotomię i pozwól jej namoczyć przez kilka minut, aby zmiękczyć wysuszoną tkankę biologiczną na trzpieniu sondy i zmniejszyć ryzyko jego złamania.
  5. Umieść uchwyt stereotaktyczny około 0,5 cm nad mikronapędem. Następnie przetnij górny koniec szprych klatki Faradaya małymi nożyczkami chirurgicznymi (patrz Tabela materiałów), aby uwolnić pierścień Faradaya trzymający wzmacniacz/złącze i przenieść pierścień z powrotem na pionowe piny na szczycie uchwytu stereotaktycznego (patrz krok 5.1 i Rysunek Uzupełniający 1).
  6. Ostrożnie odetnij miedzianą siatkę tymi samymi nożyczkami chirurgicznymi, wycinając ukształtowane obszary siatki między szprychami korony Faradaya. Następnie odetnij plastikowe szprychy korony u podstawy.
    UWAGA: Unikaj wyginania plastikowych szprych podczas cięcia, ponieważ mogą pęknąć i wysłać plastikowe odłamki w stronę sondy.
  7. Opuszczaj uchwyt stereotaktyczny, aż mikronapęd będzie można zamocować za pomocą bocznej śruby uchwytu, następnie poluzuj śrubę T1 łączącą korpus mikronapędu z podstawą mikronapędu.
  8. Powoli chować ramię stereotaktyczne z uchwytem na implant, aby podnieść mikronapęd z podstawy. Upewnij się, że mikronapęd oddziela się od podstawy pod kątem prostopadłym (czyli "pionowo" względem podstawy).
    UWAGA: Jeśli korpus i podstawa mikronapędu nie oddzielają się łatwo, sprawdź, czy ruch ramienia stereotaktycznego nie jest pod kątem względem orientacji mikronapędu. W razie potrzeby uchwyt i mikronapęd są do siebie wyrównywane przez lekkie poluzowanie fiksacji głowy zwierzęcia i odpowiednie jej ustawienie. Prawidłowe ustawienie jest jednym z kluczowych elementów łatwego odzyskania mikronapędu. Sprawdź też, czy nie ma resztek cementu dentystycznego łączącego microdrive i podstawę microdrive (patrz krok 5.5). Jeśli tak, cement jest starannie zeskrobany skalpelem i/lub wiertarką dentystyczną, w zależności od ilości użytego cementu.
  9. Podnieś ramię stereotaktyczne z podłączoną sondą, aby zrobić wystarczająco dużo miejsca pod nim.
  10. Usuń zwierzę ze stereotaksu i przygotuj mózg, stosując zatwierdzony protokół histologiczny, jeśli jest to pożądane. Odzyskaj wsadnioną podstawę mikrodysku i wyczyść ją, mocząc w acetonie na kilka godzin do późniejszego ponownego użycia.
  11. Połóż czystą podstawę mikronapędu na klejowej szpachli (patrz Tabela materiałów), następnie opuszczaj mikronapęd na podstawę i dokręć śrubę. Aby zapobiec uszkodzeniu, monitoruj pozycję sondy pod mikroskopem przez cały proces. Ten etap można wykonać później, jeśli najpierw trzeba oczyścić wszczepioną podstawę mikronapędu do ponownego użycia.
    UWAGA: Protokół ten przewiduje użycie klejowej masy jako platformy dla podstawy, co jest kluczowe, ponieważ zarówno zabezpiecza podstawę, jak i zapewnia pewną elastyczność, zapewniając, że podstawa nie ślizga się i nie zderza z sondą. Maścielina powinna być uformowana w pionową "ścianę klifu" po stronie podstawy mikronapędu, gdzie sonda zostanie opuszczona. Zapewnia to, że jeśli sonda zostanie opuszczona poniżej podstawy, nie styka się z masą pod spodem. Wieża masy masowej powinna być również na tyle wysoka, aby jeśli zostanie opuszczona poza podstawę mikronapędu, sonda nie stykała się z powierzchnią stołu, na której umieszczono szpachlę. Na koniec dobrze przymocuj szpachlę do powierzchni, aby zapobiec jej ślizganiu się lub upadkowi. Podczas opuszczania mikronapędu na podstawę mikronapędu trzymaną przez szpachlę należy zachować widok boczny z mikroskopu, aby monitorować postęp sondy, tak aby podczas opuszczania sondy nie zderzyła się ani z podstawą, ani z masą.
  12. Czyść i sterylizować sondę zgodnie z instrukcjami producenta. Najczęściej dostępne sondy można namoczić w środku enzymatycznym (patrz Tabela materiałów) na 12 godzin, następnie przepłuczyć w wodzie demineralizowanej i zdezynfekować alkoholem. Zrób to, opuszczając sondę do dużej zlewki zawierającej enzymatyczny środek czyszczący, jednocześnie będąc przymocowaną do uchwytu mikronapędu na ramieniu stereotaktycznym.
    UWAGA: W razie potrzeby należy zmierzyć impedancje elektrod na sondzie po oczyszczeniu, aby monitorować potencjalne uszkodzenie poszczególnych elektrud.
  13. Przechowuj mikronapęd z wyczyszczoną sondą bezpiecznie do następnego eksperymentu.

Wyniki

Protokół ten przedstawia system przewlekłej implantacji, który umożliwia badaczom wdrożenie lekkich, opłacalnych i bezpiecznych przewlekłych rejestracji elektrofizjologicznych u zachowujących się myszy (Rysunek 1). Główne czynniki decydujące o skutecznym zastosowaniu tego podejścia to: całkowite pokrycie czaszki cementem, minimalnie inwazyjna i odpowiednio zabezpieczona kraniotomia, bezpieczne mocowanie mikronapędu i okablowania do czaszki oraz pełna ciągłość ochronnego materiału Faradaya. Gdy uwzględni się te punkty, można konsekwentnie uzyskać wysokiej jakości nagrania. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące następujących głównych aspektów sukcesu operacji:

1) Czy implant zakłóca zachowanie lub dobrostan zwierząt?
2) Czy jakość sygnału jest wysoka i czy można je utrzymać przez dłuższy czas?
3) Czy nagrania można łatwo łączyć z wykonywaniem zadań?

Aby ocenić wpływ implantu na zachowania zwierząt, przeanalizowaliśmy śledzone wzorce poruszania się u pięciu wszczepionych zwierząt. Rysunek 2A pokazuje przykład zwierzęcia swobodnie poruszającego się w klatce do zabawy przez 10 minut przed i tydzień po implantacji. Widać, że wzorce ruchu pozostają niezmienione. Tę obserwację potwierdza rysunek 2B, C , przedstawiający rozkłady prędkości ruchu i kierunków głowy między zwierzętami. Zarówno prędkość biegu, jak i kierunek głowy pozostały w dużej mierze niezmienione przed i po implantacji, a jeśli już, to prędkość biegu po operacji wydawała się nieco wyższa. Wideo uzupełniające 1 pokazuje krótkie nagranie wideo zwierzęcia 6 dni po operacji implantacji. Typowe zachowania w klatce domowej, takie jak lokomocja, pielęgnacja, wychowywanie i zbieranie żerów w środowisku domowym, są widoczne i wskazują na skuteczną regenerację po operacji oraz ogólny stan zdrowia. Niski wpływ na zachowanie implantu wynika najprawdopodobniej z jego niskiej wagi i łatwego do opanowania wzrostu.

figure-results-1
Rysunek 2: Lokomocja przed i po operacji. (A) Przykład lokomocji zwierzęcia przed (lewy panel) i po implantacji (prawy panel). współrzędne x/y są wyrażone w centymetrach, punkty pokazują pozycję zwierzęcia w każdym punkcie czasowym w ciągu 10 minut. (B) Rozkład prędkości ruchu w cm/s dla 5 sesji przed i 3 sesji po implantacji u 5 zwierząt. (C) Gęstość jądra dla prawdopodobieństwa ruchu w różnych kierunkach, dla tych samych sesji analizowanych w (B). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Następnie oceniana jest jakość sygnału w lokalnym potencjale polowym (LFP) oraz aktywność skoków w miejscach rejestracji. Tutaj przedstawiamy reprezentatywne dane z nagrań korowych w pierwotnej korze wzrokowej (V1). Dla weryfikacji, przypuszczalna aktywność pojedynczej jednostki została wyodrębniona z szerokopasmowych sygnałów neuronalnych zarejestrowanych w V1 u przytomnej myszy za pomocą Kilosort 3 (patrz Rysunek 3). Rysunek 3A pokazuje położenie wyodrębnionych pojedynczych jednostek na trzpieniu sondy, rysunek 3B pokazuje odpowiadające przebiegi impulsów, a rysunek 3C pokazuje odpowiedzi impulsów tych samych neuronów na protokół gęstości źródła prądu (CSD). W tym paradygmatze błyski szerokokątne prezentowano z czasem trwania 300 ms przy częstotliwości 1 Hz (czyli 300 ms włączone, 700 ms wyłączone) w ciągu 200 prób. Na koniec Rysunek 3D pokazuje odpowiedzi tych samych jednostek na protokół mapowania pola wizualnego, składający się z 2000 klatek losowo wybranych czarno-białych kwadratów na szarym tle, każda prezentowana przez 16,6 ms. Kwadraty pokrywały każdy kąt widzenia 12 stopni i były wybierane spośród pola o wymiarach 15 x 5 możliwych lokalizacji, tak aby paradygmat mapowania obejmował przestrzeń wizualną od -90 do +90 stopni azymutu i od -30 do +40 stopni wysokości łącznie. Reakcje szybkości wystrzału na każdą ramkę bodźca zostały wyodrębnione poprzez analizę maksymalnej szybkości wystrzału w oknie 16,6 ms, z opóźnieniem od 40 do 140 ms, określanym jako optymalny dla każdego kanału na podstawie maksymalnej aktywności w każdym oknie. Tego typu zapisy mogą służyć do regulacji głębokości włożenia każdej elektrody oraz do oceny jakości sygnału po operacji implantu.

figure-results-2
Rysunek 3: Zarejestrowane sygnały neuronalne. (A) Wskazane położenie pojedynczych jednostek posortowanych według pakietu sortującego kolce Kilosort 3 wzdłuż styków elektrod sondy. (B) Fale kolczaste dla tych samych jednostek pokazanych w A na przestrzeni 5 ms czasu. Cienkie linie: Pojedyncze fale kolczaste. Grube linie: Przeciętny przebieg fali kolczastych. (C) Wykres rastrowy skoków w odpowiedzi na paradygmat gęstości źródła prądu (CSD), prezentujący błyski szerokopolne o długości 300 ms, po których następuje ekran o długości 700 ms. Odpowiada się na te same jednostki co w A i B. Nałożone na siebie kolorowe linie reprezentują histogramy w czasie okołobodźcowym (PSTH) tych samych odpowiedzi. Szybkostrzelność PSTH była obliczana w pojemnikach o długości 10 ms, a następnie normalizowana przez maksymalną szybkostrzelność na całym PSTH. Czas 0 koncentruje się wokół bodźca błysku szerokopolnego. (D) Szacowane pola receptywne o tych samych jednostkach co w A-C, mierzone za pomocą paradygmatu rzadkiego mapowania pól recepcyjnych szumów. Każdy wykres pokazuje średnią szybkość aktywności w oknie analitycznym 16,6 ms w odpowiedzi na początek (lewy panel) lub przesunięcie (prawy panel) bodźców białych i czarnych kwadratowych. Bodźce prezentowano przez długość 16,6 ms, losowo rozmieszczone na siatce 5 x 15 kwadratów, obejmującej 180 stopni kąta widzenia poziomo i 70 stopni kąta widzenia pionowo. Aktywność szybkostrzelności była oceniana w całej siatce pola recepcyjnego (patrz pasek kolorowy). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Jakość nagrań utrzymywała się na wysokim poziomie podczas powtarzających się nagrań przez tygodnie do miesięcy. Rysunek 4A przedstawia podłużne zapisy LFP jednego zwierzęcia w ciągu 15 tygodni. LFP zostały zarejestrowane w odpowiedzi na opisany powyżej paradygmat CSD (patrz rysunek 3A-C). Rysunek 4A pokazuje uśrednione odpowiedzi LFP 500 ms po rozpoczęciu błysku. W tym przykładzie użyliśmy sondy liniowej z 32 kanałami, z odległością między elektrodami 25 μm. Należy zauważyć, że 18. dnia głębokość sondy została dostosowana, przesuwając ją w dół o 600 μm. Zarówno przed, jak i po tej zmianie, sygnały LFP pozostawały stabilne przez wszystkie dni nagrania.

Zgodnie z tym, fale kolczaste domniemanych pojedynczych jednostek były rozpoznawalne na wielu nagraniach. Rysunek 4B przedstawia reprezentatywne przykłady fal skokowych z trzech sesji nagraniowych na przestrzeni miesiąca nagrań, pokazując, że aktywność pojedynczych jednostek można skutecznie zidentyfikować w czasie. Rysunek 4C przedstawia łączną liczbę domniemanych pojedynczych jednostek wyodrębnionych z przewlekłych zapisów u sześciu zwierząt, obejmujących okres do 100 dni. Pojedyncze jednostki zostały zdefiniowane według domyślnych kryteriów kilosort 3.0 (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Jak widać, liczba wyraźnie zdefiniowanych pojedynczych jednostek zazwyczaj wynosiła ~40 w pierwszym tygodniu po implantacji, a następnie stopniowo spadała, zmierzając do pozornie stabilnej asymptoty ~20 jednostek. Ponieważ nagrania te były wykonywane za pomocą liniowych sond 32-kanałowych, daje to oczekiwaną wydajność około 1,25 jednostki na elektrodę bezpośrednio po wszczepieniu, a w długoterminowych nagraniach spada do około 0,65 jednostki na elektrodę. Powtarzające się połączenia z wzmacniaczem/złączem implantu podczas sesji nie wydawały się wpływać ani na jakość nagrania, ani na stabilność implantu, ponieważ korona Faradaya trzymająca wzmacniacz/złącze może wytrzymać powtarzające się siły powyżej 10 Newtonów, czyli rzędu wielkości więcej niż nawet maksymalne siły łączenia wymagane przez standardowe złącza (patrz Wideo Uzupełniające 2).

figure-results-3
Rysunek 4: Stabilność zapisów neuronalnych w czasie. (A) Średnia aktywność LFP w odpowiedzi na szerokokątny bodziec błyskowy CSD, pokazana na wszystkich 32 kanałach przewlekle wszczepionej sondy od 3 do 110 dni po implantacji. Czerwona pionowa linia oznacza, że sonda została opuszczona w nowe miejsce dzięki kanałom 0-8 nagrywającym z zewnątrz mózgu do 18. dnia po operacji. (B) Fale impulsowe trzech przykładowych jednostek z tego samego przewlekłego implantu wielokrotnie rejestrowane przez cztery tygodnie. Cienkie linie: Pojedyncze fale kolczaste. Gruba nałożona linia: Przeciętny przebieg fali kolczastych. (C) Liczba domniemanych pojedynczych jednostek wykrytych przez Kilosort 3 w ciągu dni rejestracji dla 6 zwierząt (patrz legenda włożona). Czerwony kwadrat oznacza dni, w których sonda była przenoszona. Przerywana linia oznacza liczbę elektrod na implant użytych w tych nagraniach (32). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wreszcie, poprzez zapewnienie modułowego systemu obejmującego mikronapęd, a także noszoną klatkę Faradaya oraz płytę głowową, która służy zarówno jako podstawa implantu, jak i urządzenie do utrwalania głowy, protokół ten umożliwia integrację przewlekłej elektrofizjologii z zachowaniem zamocowanym na głowie. Tutaj pokazano przykładowe dane z myszy poruszających się po wirtualnym środowisku na sferycznej bieżni. Rysunek 5A pokazuje aktywność skoków związaną z biegiem o poziomie 20 jednostek w przykładowym badaniu. Rysunek 5B pokazuje różnorodne, ale solidne zależności między prędkością biegu a aktywnością skoków poszczególnych jednostek sortowanych kolcami, a także średnią populacji dla tego samego efektu na Rysunku 5C, potwierdzając dobrze udokumentowany wpływ aktywności lokomotorycznej na aktywność neuronalną u gryzoni V124.

figure-results-4
Rysunek 5: Reakcje neuronalne podczas zachowania z głową ukierunkowaną. (A) Wykres rastrowy pojedynczych jednostek w przykładowym badaniu, z nałożoną prędkością biegu (fioletowa linia) i średnią częstotliwością wystrzałów we wszystkich jednostkach (jasnoniebieska linia). (B) Aktywność pojedynczych jednostek w różnych kategoriach prędkości biegu, pokazana dla sześciu przykładowych jednostek. (C) Średnia aktywność skoków we wszystkich pojedynczych jednostkach w jednej przykładowej sesji, wykreślona na pięciu kwintylach rozkładu prędkości biegu. Prędkości biegu w tej sesji wahały się od 0 do 0,88 metra na sekundę. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela pokazująca domyślne parametry używane przez Kilosort 3 do identyfikacji pojedynczych jednostek w nagraniach pokazanych na Rysunku 3, Rysunku 4 i Rysunku 5. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 1: Wideo pokazujące aktywność lokomotoryczną zwierząt po wszczepieniu. Nagranie nagrane po 5-dniowej fazie rekonwalescencji jest zakończone, pokazując prawidłowe zachowanie lokomotoryczne oraz adaptację do rozmiaru i wagi implantu. Zwierzę można normalnie zobaczyć eksplorującego klatkę zabaw zawierającą elementy wzbogacające. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 2: Wideo pokazujące siłę przyłożoną na złożoną koronę Faradaya. Siły wytrzymywane przez koronę Faradaya są około rzędu wielkości większe niż siła połączenia potrzebna do standardowych złączy, takich jak 4-pinowe nano złącza spolaryzowane. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 1: Ilustracja pokazująca zdjęcia uchwytu na dysk. Pliki projektowe do druku można znaleźć w odpowiednim repozytorium Github (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Szablon siatki miedzianej. Wydrukuj szablon z oryginalnym skalowaniem i użyj szablonu do wycięcia miedzianej siatki (krok 2.12). Użyj paska skali do weryfikacji i, jeśli trzeba, do regulacji skalowania wydruku. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy rysunek 3: Seria zdjęć pokazująca etapy montażu implantu podczas operacji. W tej obudowie zainstalowane są dwa mikronapędy oraz dwa wzmacniacze. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Rysunek czaszki myszy z przykładem rozmieszczenia napędów, kraniotomii (na zielono) oraz pinu GND/REF (na czerwono). Lokalizacja szpilki sugeruje się ze względu na umieszczenie w móżdżku, co raczej nie zakłóci rejestracji korowych. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół szybkiej, bezpiecznej i standaryzowanej implantacji sond, który umożliwia także odzyskanie i ponowne użycie sondy na końcu eksperymentu. Podejście wykorzystuje modułowy system komponentów implantu, w szczególności mikronapęd, kompatybilny ze wszystkimi popularnymi krzemowymi sondami i systemami nagrywania, główkę umożliwiającą eksperymenty behawioralne z głową oraz noszoną klatkę Faradaya chroniącą implant. Ta konstelacja pozwala użytkownikom elastycznie dostosowywać implant do różnych paradygmatów eksperymentalnych, takich jak zachowanie z głową stacjonarną zamiast swobodnie poruszającej się czy miniaturyzacja implantu (bez klatki Faradaya) w porównaniu do zwiększonej długoterminowej odporności sygnału (z klatką Faradaya) – bez konieczności rezygnacji ze standaryzacji implantu w tym procesie.

Takie podejście sprawia, że przewlekłe zapisy elektrofizjologiczne są bardziej standaryzowane (dzięki prefabrykowanym elementom, które nie wymagają ręcznego montażu), są tańsze (dzięki odzyskiwaniu sondy), mniej czasochłonne (poprzez uproszczenie etapów operacji) oraz łatwiejsze do kompatybilności z dobrostanem i zachowaniem zwierząt (dzięki zmniejszonemu rozmiarowi implantu i bezstresowej fiksacji głowy). W związku z tym protokół ten ma na celu umożliwienie dostępu do implantów elektrofizjologicznych u zachowujących się gryzoni dla szerszego grona badaczy poza pionierskimi laboratoriami na czele tej dziedziny.

Aby osiągnąć ten cel, przedstawiony tutaj protokół minimalizuje kompromis między kilkoma, często równie istotnymi aspektami implantów microdrive, takimi jak elastyczność, modułowość, łatwość implantacji, stabilność, całkowity koszt, kompatybilność z zachowaniem oraz możliwość ponownego użycia sond. Obecnie dostępne podejścia często wyróżniają się w niektórych z tych aspektów, ale kosztem innych funkcji. Na przykład, w przypadkach wymagających absolutnej stabilności implantu przez długi czas, najlepszym podejściem może być bezpośrednie zacementowanie sondy na czaszce25. Jednak zapobiega to ponownemu użyciu sondy, a także przesuwaniu miejsc nagrywania w przypadku złej jakości nagrania, a także jest niezgodne ze standaryzowanym umieszczaniem implantów. Podobnie, choć napęd AMIE zapewnia lekkie, niedrogie rozwiązanie do odzyskiwania implantacji sond, jest ograniczony do pojedynczych sond i ograniczony w ustawieniu współrzędnych celu17. Na przeciwnym biegunie spektrum są niektóre komercyjnie dostępne nano-napędy (patrz Tabela 1 16,17,21,26,27,28,29,30) są niezwykle małe, można je swobodnie umieścić na czaszce i maksymalizują liczbę sond, które można wszczepić pojedynczemu zwierzęciu16. Jednak są one droższe w porównaniu z innymi rozwiązaniami, wymagają od eksperymentatorów wysokich kwalifikacji do skutecznego przeprowadzenia operacji implantów i zabraniają ponownego użycia sond. Microdrive opracowany przez Vöröslakosa i in.21, którego lekka wersja również jest częścią tego protokołu, poświęca mały rozmiar implantu na rzecz łatwiejszego użycia, niższej ceny i ponownego użytku sondą

Tabela 1: Porównanie popularnych strategii przewlekłych implantów sondowych u gryzoni. Dostępność: czy mikronapęd jest open source (dla naukowców do samodzielnego budowania), dostępny komercyjnie, czy jedno i drugie. Modułowość: Systemy zintegrowane składają się z jednego lub kilku elementów będących względem siebie ustawionych, podczas gdy systemy modułowe pozwalają na swobodne umieszczenie sondy/mikronapędu względem zabezpieczenia (nawozek/klatka Faradaya) po wykonaniu implantu (np. podczas operacji). Modułowość została określona na podstawie opublikowanych informacji lub protokołów implantacji wymienionych implantów. Headfix: Tak: Implant ma wbudowane mechanizmy utrwalania głowy, X: Implant zostawia miejsce, by dodać dodatkową płytę głowy do fiksacji bez większych problemów, Nie: Projekt implantu prawdopodobnie powoduje problemy z miejscem lub wymaga znacznych modyfikacji do użycia z fiksacją głowy. Umieszczenie sondy: Ograniczone: Lokalizacja sondy jest ograniczona na etapie projektowania implantu. Elastyczność: Lokalizacja sondy może być regulowana nawet podczas operacji. Liczba sond: liczba sond, które można wszczepić. Należy zauważyć, że wszczepienie sond >2 myszy stanowi poważne wyzwanie niezależnie od wybranego systemu implantowego. Ponowne użycie sond: tak, jeśli sondy teoretycznie można ponownie wykorzystać. Waga/rozmiar: waga i objętość implantu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Aby stworzyć system bardziej płynnie łączący te różne wymagania, implant DREAM został zaprojektowany na podstawie implantu Vöröslakos21, ale z kilkoma fundamentalnymi modyfikacjami. Po pierwsze, aby zmniejszyć całkowitą masę implantu, używany tutaj mikronapęd jest produkowany z obróbki aluminium zamiast ze stali nierdzewnej drukowanej 3D, a korona Faradaya jest miniaturowana, co pozwala na całkowitą redukcję wagi o 1,2-1,4 g w zależności od wyboru materiału płyty głowowej (patrz Tabela 2). Po drugie, płyta głowy otaczająca mikronapęd została zaprojektowana tak, aby umożliwić zintegrowany mechanizm fiksacji głowy, umożliwiający szybkie i bezstresowe fiksowanie głowy, jednocześnie pełniąc funkcję podstawy dla klatki Faradaya, dając dostęp do większości potencjalnych obszarów docelowych do rejestracji neuronalnych i dodając implantowi minimalną wagę. Płaski kształt mechanizmu fiksacyjnego oraz brak wystań zapewniają również minimalne ograniczenie pola widzenia lub poruszania się zwierząt (patrz rysunek 2A-C), co stanowi wyraźną poprawę w stosunku do poprzednich systemów31,32. Korona Faradaya i pierścień przymocowane do płyty głowicy również zostały znacznie zmienione w porównaniu do wcześniejszych konstrukcji. Obecnie nie wymagają one doraźnej adaptacji (np. pod względem umieszczenia złącza) ani lutowania podczas całej operacji, eliminując potencjalne przyczyny uszkodzeń implantu i nieprzewidywalne różnice jakości implantów. Zamiast tego implant DREAM oferuje wiele ustandaryzowanych wariantów pierścieni koronowych, które pozwalają umieścić każde złącze w jednej z czterech wcześniej określonych pozycji, minimalizując zmienność i wysiłek podczas operacji. Wreszcie, poprzez optymalizację systemu implantu do odzyskiwania sondy, implant DREAM pozwala eksperymentatorom drastycznie obniżyć koszty oraz czas przygotowania na implant, ponieważ mikronapęd i sonda zazwyczaj można odzyskać, wyczyścić i ponownie użyć razem.

Aby uzyskać bardziej wyczerpujący przegląd kompromisów związanych z różnymi systemami implantowymi, zobacz Tabelę 1. Chociaż przedstawione tutaj podejście zazwyczaj nie zapewnia maksymalnej wydajności w porównaniu do innych strategii, np. pod względem rozmiaru, stabilności czy kosztu, działa w górnym zakresie dla wszystkich tych parametrów, co czyni je łatwiejszym zastosowaniem w szerokim zakresie eksperymentów.

Trzy aspekty protokołu są szczególnie istotne do dostosowania do każdego konkretnego przypadku użycia: konstelacja uziemienia i odniesienia, technika cementacji mikronapędu oraz walidacja implantów za pomocą rejestracji neuronalnej. Po pierwsze, przy wszczepianiu uziemienia i pinów referencyjnych celem było określenie idealnego punktu między stabilnością mechaniczną/elektryczną a inwazyjną. Chociaż np. unoszące się srebrne druty osadzone w agarze są mniej inwazyjne niż śruby kostne33, prawdopodobnie są bardziej podatne na wysuwanie się z czasem. Zastosowanie szpilek w połączeniu z agarem zapewnia stabilne połączenie elektryczne, a jednocześnie ułatwia kontrolę podczas wprowadzania, zapobiegając urazom tkanek. Kołki uziemiające przymocowane do czaszki raczej się nie odłączą, a w przypadku odłączenia drutu od bolca ponowne przymocowanie jest zwykle proste ze względu na większą powierzchnię i stabilność wszczepionego bolca.

Tabela 2: Porównanie wag składników między implantem DREAM a implantem opisanym przez Vöröslakosa i in.21. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Po drugie, utrwalenie mikronapędu powinno zazwyczaj nastąpić przed włożeniem sondy do mózgu. Zapobiega to bocznemu ruchowi sondy wewnątrz mózgu, jeśli mikronapęd nie jest idealnie zamocowany w stereotaktycznym uchwytie podczas włożenia. Aby sprawdzić położenie sondy przed zamocowaniem mikronapędu, można na krótko opuścić końcówkę trzonka sondy, aby określić, gdzie będzie miała kontakt z mózgiem, ponieważ ekstrapolacja pozycji lądowania może być trudna ze względu na przesunięcie paralaksy mikroskopu. Po ustaleniu pozycji mikronapędu opcjonalnie można zabezpieczyć kraniotomię elastomerem silikonowym przed zacementowaniem mikronapędu, aby zapobiec przypadkowemu kontakcie cementu z kraniotomią; Jednak obniżanie sondy przez elastomer silikonowy nie jest zalecane, ponieważ pozostałości elastomeru silikonowego mogą zostać wciągnięte do mózgu i powodować stan zapalny oraz glej.

Po trzecie, w zależności od zastosowanego protokołu eksperymentalnego, nagranie testu bezpośrednio po operacji może być przydatne lub nie. W dużej mierze aktywność neuronalna rejestrowana tuż po wszczepieniu sondy nie będzie bezpośrednio reprezentatywna dla aktywności rejestrowanej przewlekle, ze względu na czynniki takie jak przejściowy obrzęk mózgu i ruch tkanek wokół sondy, co oznacza, że zarówno głębokość włożenia, jak i fale kolczaste raczej nie ustabilizują się bezpośrednio. W związku z tym natychmiastowe nagrania mogą służyć głównie do ustalenia ogólnej jakości sygnału i integralności implantu. Zaleca się, aby ruchome mikro-napędowe sanie były używane w kolejnych dniach po operacji, gdy mózg się ustabilizuje i dostosuje pozycję. Pomaga to również uniknąć przesuwania sondy o więcej niż 1000 μm dziennie, minimalizując uszkodzenia miejsca nagrania i tym samym wydłużając żywotność miejsca nagrywania.

Wreszcie, użytkownicy mogą chcieć dostosować system do nagrywania z więcej niż jednego docelowego miejsca. Ponieważ system ten jest modułowy, użytkownik ma dużą swobodę w sposobie składania i umieszczania komponentów względem siebie (patrz wyżej oraz Rysunek Uzupełniający 3 i Rysunek Uzupełniający 4). Obejmuje to modyfikacje pozwalające na zamontowanie poziomo wydłużonego promu na mikronapędzie, umożliwiającego wszczepienie wielu sond lub dużych sond wielotrzepowowych, a także wszczepienie wielu indywidualnych mikronapędów (patrz Dodatkowy Rysunek 3 i Dodatkowy Rysunek 4). Takie modyfikacje wymagają jedynie zastosowania dostosowanego pierścienia koronowego, z większą liczbą stref montażowych dla złączy/płytek interfejsowych/głównych scen. Jednak ograniczenia przestrzeniowe tego projektu są wymuszone przez model zwierzęcy, w tym przypadku mysz, co sprawia, że układanie wielu sond na jednym mikronapędzie jest bardziej atrakcyjne pod względem powierzchni niż samodzielne wszczepianie kilku mikronapędów. Mikronapędy używane tutaj mogą obsługiwać nałożone sondy, dlatego jedynym realnym ograniczeniem jest liczba głównych etapów lub złączy, które mogą spełnić ograniczenia przestrzenne i masowe określone przez model zwierzęcy. Dystansy mogą być również używane do dalszego zwiększenia niepionowych dróg montażu i wstawiania.

Podsumowując, protokół ten pozwala na niedrogą, lekką i co ważne, regulowaną implantację sondy, z dodatkową korzyścią w postaci konstrukcji mikronapędu, która priorytetowo traktuje odzyskiwanie sondy. To rozwiązuje problemy związane z wysokimi kosztami jednorazowych sond, wysokim barierą umiejętności chirurgicznych i implantacyjnych, a także faktem, że komercyjne rozwiązania dla przewlekłej implantacji często trudno jest dostosować do unikalnych zastosowań. Te problemy stanowią problem dla laboratoriów już stosujących ostrą elektrofizjologię i stanowią odstraszacz dla tych, które jeszcze nie przeprowadzają eksperymentów elektrofizjologicznych. System ten ma na celu ułatwienie szerszego wdrożenia badań nad przewlekłą elektrofizjologią poza tymi ograniczeniami.

Oświadczenia

TS, AN i MNH są współzałożycielami 3Dneuro B.V., które produkuje otwartoźródłowe mikronapędy i korony Faradaya używane w tym protokole. FB i PT są członkami naukowej rady doradczej 33Dneuro B.V. FB i PT nie otrzymują żadnego wynagrodzenia finansowego za to stanowisko.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Holenderską Radę Badawczą (NWO; Program Crossover 17619 "INTENSE", TS) oraz otrzymał dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy grantowej nr 600925 (Neuroseeker, TS, FB, PT), a także od Towarzystwa Maxa Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gniazdo ogonowe lutowane 0,05"Mill-Max853-93-100-10-001000
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- Odczynnik tetrametyloindokarbocyanin perchlorian ('DiI'; DiIC18(3))ThermoFisherD282Barwnik lipofilowy stosowany do łatwiejszej histologicznej weryfikacji lokalizacji sondy
Maść samoprzylepna (Blu-Tack)Bostik308590110Wariacje (np. od Pritta) powinny być dostępne w twoim sklepie papierniczym
AgarSigma AldrichA1296Zrób sól fizjologiczną dla przewodnictwa.
Wzmacniacz (Miniamp-64)Cambridge NeurotechMiniaturowy i wszczepialny wzmacniacz oraz cyfryzator. Możliwe jest użycie alternatywnego wszczepialnego cyfrowego lub wszczepialnego złącza Omnetics.
Krem przeciwnagetyczny (EMLA Cream)Aspen39699/0088Krem przeciwnagowy stosowany na ból operacyjny zawierający prilokainę, lidokainę.
Skośna dystansowa3DNeuroSkośna dystansa do montażu napędu nieprostopadłego... Open source, dostępny także w https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Dioda LED do utwardzania niebieskiego światłaB.A. International818223Światło utwardzania do polimeryzacji podkładu. Długość fali 420-480 nm
Wosk kostnySMIZ046Wosk, by chronić kraniotomię i sondę po operacji.
BuprenorfinaElanco Europe LTD401513Roztwór buprenorfiny do wstrzykiwania (0,3 mg/mL)
Siatka miedzianaDexmet3CU6-050FAMiedziana siatka używana do elektrycznej i fizycznej osłony sondy oraz kraniotomii.
Klej cyjanoakrylanowy (Loctite)Loctite1363589Klej żelowy cyjanoakrylanowy
Cement dentystyczny (SuperBond C& B)Sun MedicalK058ECement dentystyczny (SuperBond)
Krem depilacyjny (Veet)Veet310000091434Krem do usuwania owłosienia w okolicach operacji.
Enrofloksacyna (Baytril)Elanco Europe LTD00879/4117Roztwór enrofloksaciny do wstrzykiwania (25 mg/mL)
Korona Faradaya3DNeuroKlatka ochronna wydrukowana w 3D do wszczepiania. Open source, dostępny także w https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Pierścień Faradaya3DNeuroDrukowany 3D wszczepiany ochronny pierścień do klatki Faradaya. Open source, dostępny także w https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Gąbka hemostatycznaSMIZHG101010Wchłaniająca gąbka żelatynowa hemostatyczna
Rurki termokurczliweHellermannTytonTA32-9/3 BKRurka termokurczliwa do produkcji kleszczy z miękkimi końcówkami
JodBraunol9322507Wodny roztwór povidonu i jodu.
Metamizol (Novalgin)Sanofi-Aventis Gmbh4527098Metamizol do zastrzyków (500 mg/mL)
Metamizol (Novalgin)Sanofi-Aventis Gmbh1553758Roztwór metamizolu
Microdrive (R2Drive)3DNeuroOdzyskiwany mikronapęd metalowy z ruchomym promem. Open source, dostępny także pod adresem https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Olej mineralnySigma-AldrichM5310-100MLOlej używany jako rozpuszczalnik do tworzenia żelu ochronnego po kraniotomii.
Chusteczki niewypadające (Kimtech)Kimtech7552Chusteczki niewypadające
PodkładBiscoB-7202PUniwersalny klej do czaszki zapobiega degradacji cementu wilgoci i zapewnia solidną bazę do osadzania się cementu.
Uchwyt R2Drive3DNeuroStereotaktyczne zaczepki do montażu R2Drive. Open source, dostępny także pod adresem https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Samoprzylepna owina3MVB050Osłona ochronna na implant po operacji
Sonda krzemowa (H2)Cambridge NeurotechPrzewlekle wszczepialna liniowa sonda krzemowa z 32 kanałami. Możliwe jest alternatywne użycie sondy.
Elastomer silikonowy (Duragel)Cambridge NeurotechElastomer silikonowy
Gips silikonowy (Kwikcast)WPIKWIK-CAST
Epoksyd przewodzący srebroMG Chemicals8331D-14GEpoksyd srebrny
Szczypce Dumont rozmiar 5FSTools11251-10Małe kleszcze do podnoszenia płata kostnego.
Drut ze stali nierdzewnej, pokryty teflonemProdukty naukowe GmBHSS-3TPrzewód uziemiający
Stereotax (RWD)Napęd na tylne koła68803Stereotax do zabiegów chirurgicznych na myszach.
TergazymeAlconox1304Możliwy enzymatyczny środek czyszczący do czyszczenia sondy
Dwuskładnikowa żywica epoksydowa z szybkim zaklejaniemGorylEP3Epoksyd do trwałego łączenia części implantu DREAM.
Okrągła rączka Vannas Spring KnivesFSTools15403-08Weterynaryjne nożyczki z prostym końcem sprężynowym odbiciem 0,075 mm.
Weterynaryczny klej cyjanoakrylanowy (Vetbond)3M70-0068-5256-3Klej cyjanoakrylowy weterynaryjny

Bibliografia

  1. Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment. Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).
  2. Okun, M., et al. Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex. Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).
  3. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  4. Znamenskiy, P., Kim, M. -H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex. Neuron. 112 (6), 991-1000 (2024).
  5. Rowland, J. M., et al. Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability. Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).
  6. Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex. Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).
  7. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
  8. Demas, J., et al. High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
  9. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  10. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  11. Savya, S. P., et al. In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation. Biomaterials. 289, 121784(2022).
  12. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. J Neural Eng. 10 (3), 036004(2013).
  13. Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels. bioRxiv. , 061481(2016).
  14. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  15. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094(2009).
  16. Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice. Protocol Exchange. , (2023).
  17. Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
  18. Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), e1098(2009).
  20. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).
  21. Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. 10, e65859(2021).
  22. IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8. , Available from: https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf (2023).
  23. Baranauskas, G., et al. Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio. J Neural Eng. 8 (6), 066013(2011).
  24. Niell, C. M., Stryker, M. P. Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex. Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).
  25. Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex. bioRxiv. , (2015).
  26. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Sci Rep. 7 (1), 2773(2017).
  27. Bimbard, C., et al. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
  28. Jones, E. A. A. Chronic recoverable Neuropixels in mice. protocols.io. , (2023).
  29. Neuronexus Products - dDrive. , Available from: https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive/ (2024).
  30. van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678(2014).
  32. Groblewski, P. A., et al. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 346, 108922(2020).
  33. Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats. Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66867

Tagi

Elektrofizjologia myszymodu owy system implantacjiimplant mikrodrajwuklatka Faradayaunieruchomienie g owyrejestracja za pomoc sondy krzemowejchirurgia stereotaktycznarejestracja sygna w neuronalnych
Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.