Otrzymywanie usieciowanych mikrosfer alginianu sodu z różnymi jonami metali z wykorzystaniem technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego

Podsumowanie

Protokół opisuje przygotowanie mikrosfer alginianu sodu usieciowanych różnymi jonami metali za pomocą urządzenia mikroprzepływowego do projektowania nośników leków. Zbadano również właściwości przeciwdrobnoustrojowe i powolne uwalnianie tych mikrosfer przez leki.

Streszczenie

Mikrosfery to mikrometrowe cząsteczki, które mogą ładować i stopniowo uwalniać narkotyki poprzez fizyczną enkapsulację lub adsorpcję na powierzchni i wewnątrz polimerów. W dziedzinie biomedycyny mikrosfery hydrożelowe były szeroko badane pod kątem ich zastosowania jako nośników leków ze względu na ich zdolność do zmniejszania częstotliwości podawania leków, minimalizowania skutków ubocznych i poprawy przestrzegania zaleceń przez pacjentów. Alginian sodu (ALG) jest naturalnie występującym liniowym polisacharydem z trzema wiązaniami glikozydowymi o stałym krzelinie. W każdej z grup polimeru występują dwie pomocnicze grupy hydroksylowe, które mają cechy alkoholowego ugrupowania hydroksylowego. Syntetyczne jednostki ALG mogą ulegać chemicznym reakcjom sieciowania z jonami metali, tworząc usieciowaną strukturę sieciową stosów polimerów, ostatecznie tworząc hydrożel. Mikrosfery hydrożelowe można otrzymać za pomocą prostego procesu wykorzystującego jonowe właściwości sieciowania ALG. W niniejszej pracy przygotowaliśmy mikrosfery hydrożelowe na bazie ALG (ALGMS) przy użyciu strategii elektroosadzania mikroprzepływowego. Przygotowane mikrokulki hydrożelowe miały jednolitą wielkość i były dobrze zdyspergowane, dzięki dokładnej kontroli przepływu elektrorozpylania mikroprzepływowego. ALGMS usieciowany różnymi jonami metali przygotowano przy użyciu techniki elektrorozpylania mikroprzepływowego łączącego mikroprzepływowość i silne pole elektryczne, a następnie zbadano jego właściwości przeciwdrobnoustrojowe, zdolność do powolnego uwalniania leków i biokompatybilność. Technologia ta jest obiecująca pod względem zastosowania w zaawansowanym opracowywaniu i produkcji leków.

Wprowadzenie

Systemy dostarczania leków są gorącym punktem badawczym w dziedzinie inżynierii biotkankowej, mającym na celu poprawę efektywności i skuteczności dostarczania leków oraz zmniejszenie liczby niepożądanych reakcji i skutków ubocznych¹. Wśród tych systemów mikrosfery hydrożelowe, charakteryzujące się dobrą biokompatybilnością, przestrajalnymi właściwościami mechanicznymi i plastycznością funkcjonalną, są jednym z najczęściej stosowanych nośników do ładowania i dostarczania leków². Mogą być używane zarówno do powolnego, jak i kontrolowanego uwalniania leków, zapewniają dobre efekty ochronne dla leków, unikają lub minimalizują niespecyficzne efekty leków w innych tkankach oraz są ukierunkowane na dostarczanie leków do określonych struktur tkankowych³. W związku z tym mikrosfery hydrożelowe stały się nowym i wydajnym systemem dostarczania leków, a stopniowo pojawiają się badania w tej dziedzinie⁴.

Mikrosfery hydrożelowe są zazwyczaj syntetyzowane z materiałów biodegradowalnych, w tym polisacharydów, białek i naturalnych polimerów⁵. Wśród nich ALG jest biokompatybilnym, biodegradowalnym polisacharydem ekstrahowanym z morskich alg brunatnych⁶. Jego łańcuch molekularny zawiera wolne grupy hydroksylowe i karboksylowe, które mogą sieciować z większością dwuwartościowych lub wielowartościowych kationów, tworząc nierozpuszczalną w wodzie strukturę hydrożelową z trójwymiarową siecią⁵. Mikrosfery hydrożelowe utworzone przez ALG mogą być przekształcane w ujemnie naładowane polielektrolity w roztworach obojętnych i zasadowych. To odpychanie między ładunkami ujemnymi powoduje pęcznienie mikrosfer, umożliwiając uwolnienie kapsułkowanego składnika aktywnego lub leku. Te właściwości doprowadziły do uznania mikrosfer ALG za obiecujące nośniki leków, szeroko stosowane do ładowania leków i kontrolowanego uwalniania⁷.

Istnieją różne metody przygotowania mikrosfer hydrożelowych. Tradycyjne metody przygotowania ALGMS zwykle obejmują metodę zol-żel lub metodę emulsji-zol. Metody te obejmują takie etapy, jak wytrącanie, współstrącanie i reakcje żelowania w celu uzyskania docelowych mikrosfer⁸. W ostatnich latach, wraz z ciągłym rozwojem technologii mikroprzepływowej, metoda elektronatrysku mikroprzepływowego stopniowo stała się wydajną i precyzyjną metodą przygotowania mikrosfery⁹. Metoda ta wykorzystuje technologię mikroprzepływową do elektronatryskiwania roztworu polimeru przez dyszę mikrodrobnoziarnistą w celu utworzenia kropelek i mikrosfer o wielkości mikrometra podczas późniejszego procesu utwardzania lub sieciowania¹⁰. W porównaniu z tradycyjną metodą, elektrorozpylanie mikroprzepływowe zapewnia precyzyjną kontrolę wielkości i morfologii cząstek mikrosfery poprzez dostosowanie parametrów, takich jak natężenie przepływu roztworu, napięcie i rozmiar dyszy drobnoziarnistej¹¹. Umożliwia również szybkie ciągłe przygotowanie mikrosfer, poprawiając wydajność przygotowania i utrzymując łagodne warunki reakcji. Ponadto ALGMS może być przygotowany do pełnienia różnych funkcji, takich jak leki o kontrolowanym uwalnianiu i załadowane katalizatory, co umożliwia ich łatwe zastosowanie w różnych dziedzinach.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mikrosfer ALG za pomocą metody elektrorozpylania mikroprzepływowego. Proces ten polega na przepuszczeniu roztworu ALG przez urządzenie mikroprzepływowe i poddaniu go działaniu elektrorozpylania. Powstałe kropelki zebrano w roztworze zawierającym różne jony metali (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ i Fe³⁺) w celu zainicjowania reakcji sieciowania. Reakcja ta poprawia stabilność i przyczepność mikrosfer oraz nadaje im różne funkcje. Metoda ta jest łatwa do wykonania, a zsyntetyzowane mikrosfery wykazują dobrą jednorodność wielkości w swojej morfologii. Ponadto zbadaliśmy ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe, zdolność do powolnego uwalniania leków i biokompatybilność. Protokół ten będzie przydatny do dalszego opracowywania i produkcji leków.

Protokół

Krew użyta w eksperymentach została uzyskana od samic myszy BALB/c klasy SPF o wadze 20-25 g i wieku około 7 tygodni. Komisja Etyki Eksperymentów na Zwierzętach w Zhejiang Shuren College zatwierdziła wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne.

1. Przygotowanie roztworu

1. Zważyć ALG i rozpuścić w ultraczystej wodzie, mieszając w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby uzyskać 2% roztwór ALG.
2. Oddzielnie przygotować frakcję masową z 5% (lub stężenie masy molowej wynosi 0,3 M) roztwory CaCl₂, FeCl₃,_ZnSO4 i_CuSO4 w wodzie ultraczystej. Wlej każdy roztwór osobno do naczynia zbiorczego.

2. Urządzenie do elektrorozpylania mikroprzepływowego

1. Weź szklaną rurkę kapilarną i umieść ją nad płomieniem palnika, aby zmiękczyć, a następnie rozciągnij ją do różnych średnic (50 μm-500 μm). Odetnij drobne części nożem do szkła i delikatnie wypoleruj port końcówki wysokiej jakości papierem ściernym z węglika krzemu. Po oczyszczeniu podłącz gruby koniec rurki kapilarnej do długiej rurki, a drugi koniec rurki do igły dozującej i strzykawki o pojemności 5 ml (rysunek uzupełniający 1).
   UWAGA: Ostre krawędzie nacięć szklanych rurek są trudne do włożenia do węża; W związku z tym przerwa powinna być zaokrąglona na krawędzi płomienia.
2. Podłączyć strzykawkę do mikroprzepływowej pompy strzykawkowej, a rurkę kapilarną na jednym końcu do uchwytu. Podłączyć czerwony zacisk końcowy wysokiego napięcia zasilacza wysokonapięciowego do igły dozującej strzykawki i umieścić srebrny klips w płynie zbiorczym. Ta konfiguracja tworzy proste mikroprzepływowe urządzenie do elektrorozpylania (Rysunek 1A).
   UWAGA: Umieść rurkę kapilarną prostopadle do stołu.

3. Przygotowanie mikrosfer ALG

1. Umieść oddzielne naczynia zbiorcze zawierające różne jony metali bezpośrednio pod rurką kapilarną. Włącz mikroprzepływową pompę strzykawkową i wybierz opcję Fast Forward, aby zalać probówkę ALG, a następnie ustaw odpowiednie natężenie przepływu (2 ml/h).
2. Włącz wyłącznik zasilania wysokiego napięcia i przekręć pokrętło, aby ustawić odpowiednie napięcie (5-7 kV).
3. Dodaj 20 ml roztworu do każdej z 90-milimetrowych szalek Petriego, aby zebrać mikrosfery ALG w celu utworzenia ALGMS usieciowanego różnymi jonami metali (Rysunek 1B).
4. ALG tworzy mikrosfery pod wpływem pola elektrycznego i grawitacji w różnych roztworach zbierających jony w ciągu kilku sekund. Odessać mikrosfery za pomocą wysterylizowanej pipety i przenieść je do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać mikrosfery hydrożelowe Zn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺ i Fe³⁺ -ALG (Rysunek 1C). Oznacz probówki Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS i Fe-ALGMS.
   UWAGA: Mikrosfery o różnych średnicach można uzyskać, dostosowując parametry, takie jak napięcie, średnica końcówki, natężenie przepływu i stężenie roztworu.
5. Weź niewielką ilość przygotowanych mikrosfer, rozprowadź je jak najbardziej równomiernie w PBS i umieść pod mikroskopem w celu wizualizacji.
6. Losowo wybranych 10 pól obserwacyjnych w tej samej partii mikrosfer, zaimportuj obrazy do pomiaru do oprogramowania ImageJ, przekonwertuj obrazy do odpowiedniego trybu skali szarości i użyj technologii segmentacji progowej, aby dokładnie określić obszar cząstek docelowych i uruchomić funkcję analizy cząstek, aby ImageJ mógł zidentyfikować i zmierzyć cząstki docelowe. Uzyskaj dane na temat mikrosfer, a następnie zaimportuj je do oprogramowania Origin w celu analizy i mapowania wielkości cząstek.

4. Test skuteczności przeciwdrobnoustrojowej

1. Przygotować 5 ml zawiesiny Staphylococcus aureus (S. aureus) i Escherichia coli (E. coli) o początkowym zmętnieniu bakteryjnym 0,2 mcF przy użyciu płynnej pożywki Luria-Bertani (LB).
2. Dodaj 10 ml każdego roztworu bakteryjnego do 4 pojedynczych sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 0,5 ml Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS i Fe-ALGMS ALG do każdej probówki i umieść je w wytrząsarce o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C i 200 obr./min na 12 godzin. Dodaj równą ilość soli fizjologicznej do grupy kontrolnej.
3. Rozcieńczyć każdy roztwór bakteryjny do 10⁵ razy sterylną wodą. Użyj sterylnego szklanego kulki, aby rozprowadzić 200 μl roztworu bakteryjnego na stałym podłożu LB.
4. Rozprowadź roztwór szybko i równomiernie na płytce powlekającej, unikając poruszania się tam iz powrotem w tym samym obszarze. Następnie umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 12 godzin. Obserwuj kolonie różnych grup.
   UWAGA: Wszystkie procedury aseptyczne należy wykonywać w pobliżu lampy alkoholowej. Sterylizuj naczynia do hodowli drobnoustrojów, przybory do szczepienia i pożywki hodowlane.

5. Testowanie uwalniania narkotyków

1. Aby ocenić zdolność uwalniania różnych mikrosfer do uwalniania, należy użyć albuminy surowicy bydlęcej (BSA) jako załadowanego leku modelowego. Dodaj 500 μl każdej mikrosfery (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS) do 1 mg/ml zawiesiny BSA przez 24 godziny.
2. W celu oznaczenia uwalniania leku dodać każdą nasyconą próbkę do 5,0 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; pH 7,4), a następnie mieszać przez 15 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wstrząsaniem przy 80 obr./min.
3. Użyć 100 μl roztworu i zastąpić pożywkę świeżą po 1, 3, 6, 12, 24, 36 i 48 godzinach.
4. Określ ilościowo stężenia białka sklarowanego nad osadem w określonych momentach za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościowo zmierz uwolniony lek za pomocą markera enzymatycznego, aby uzyskać odpowiednią absorbancję i przelicz zmierzoną wartość na rzeczywiste stężenie leku zgodnie z krzywą standardową. Oblicz szybkość uwalniania leku, korzystając z następującego wzoru:
   Procent uwolnienia leku = (stężenie leku uwolnionego w określonym punkcie czasowym / początkowe stężenie leku) x 100%
5. W regularnych odstępach czasu usuwaj równą objętość PBS z każdej studzienki i zastąp ją równą objętością świeżego podłoża.

6. Test hemolizy

1. Umieścić przygotowane Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS w PBS i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu sformułowania roztworu inkubacyjnego.
2. Uzyskaj pełną krew od zdrowych myszy BALB / c przez flebotomię oka, zebraną w probówkach przeciwzakrzepowych zawierających cytrynian sodu. Wirować i wirować przy 1509 x g przez 15 minut w celu uzyskania czerwonych krwinek.
3. Przepłukać czerwone krwinki 2x-3x PBS i przygotować 10% roztwór czerwonych krwinek za pomocą PBS.
4. Przygotowanie różnych ALGMS: Weź 500 μl każdej mikrosfery dla grupy eksperymentalnej, 1 ml ultraczystej wody (ddH₂O) dla pozytywnej grupy kontrolnej i 1 ml roztworu PBS dla negatywnej grupy kontrolnej i wymieszaj każdy z 20 μl roztworu krwinek.
5. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, odwirować w temperaturze 1509 x g, 15 min. Odstawić supernatant na bok i sfotografować czerwone krwinki w każdej grupie po hemolizie.
6. Przyjmij, że wskaźnik hemolizy w pozytywnej grupie kontrolnej wynosi 100%, a w grupie kontroli negatywnej wynosi 0%. Zmierzyć wartości absorbancji supernatantów w każdej grupie i obliczyć szybkość hemolizy, korzystając ze wzoru:
   Hemoliza (%) = (Wartości absorbancji supernatantów każdej grupy-
   Wartości absorbancji samej wody destylowanej) / (Wartości absorbancji grupy kontroli dodatniej- Wartości absorbancji samej wody destylowanej) x 100

7. Test cytobiozgodności

1. Umyj różne ALGMS 2x PBS i umieść na szalce Petriego o pojemności 5 ml na 15 minut i wyrzuć supernatant.
2. Oddzielnie dodać różne ALGMS w ilości 0,2 ml do kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM) zawierającej 10% FBS, inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i przefiltrować roztwór w celu uzyskania odcieku.
3. Hoduj komórki NIH3T3 do około 70% gęstości komórek na płytkach 24-dołkowych, traktuj komórki NIH3T3 roztworem ługującym mikrosfery i kontynuuj hodowlę z kompletną pożywką przez kolejne 24 godziny.
4. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki PBS.
5. Oceń żywotność komórek za pomocą testu Calcein-AM/PI. Weź 2,5 μl roztworu Calcein-AM (4 mM) i 12,5 μl roztworu PI (2 mM) i dodaj je do 5 ml 1x PBS i dobrze wymieszaj, aby uzyskać roztwór roboczy z 2 μM Calcein-AM i 5 μM PI.
6. Dodać roztwór roboczy do uprzednio wysianych płytek do hodowli komórkowych w ilości 500 μl na studzienkę, inkubować w temperaturze 37 °C pod osłoną świetlną przez 15 minut, a następnie obserwować i fotografować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Skonfiguruj trzy repliki dla każdej grupy.
7. Oblicz żywotność komórek według następującego wzoru:
   Żywotność komórek (%) = liczba żywotnych komórek / (liczba żywotnych komórek + liczba martwych komórek)

Wyniki

Charakterystyka ALGMS usieciowanego różnymi jonami metali
Morfologia optyczna Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS jest pokazana w Rysunek 2, wykazując dobrą sferyczność, gładką powierzchnię, równomierny rozkład wielkości cząstek (rysunek uzupełniający 2) i doskonałą monodyspersyjność. Następnie przeprowadziliśmy charakterystykę mikroskopową przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i analizy spektroskopii dyspersji energii (EDS). Jak pokazano na Rysunek 3, mikrosfery były na ogół kuliste z dobrze zdefiniowaną okrągłością. Powierzchnia Zn-ALGMS była nierównomiernie rozłożona, wydawała się bardziej szorstka z wieloma zmarszczkami. Przeprowadziliśmy spektroskopię dyspersji energii w celu określenia rozkładu zawartości jonów metali biorących udział w reakcji sieciowania w żelu. Warto zauważyć, że rozmiar mikrosfery można regulować, zmieniając parametry, takie jak odległość zbierania, stężenie żelu i napięcie pola elektrycznego¹². W przedstawionym protokole, dostosowując parametry urządzenia mikroprzepływowego i stężenie cieczy, można łatwo uzyskać cząstki o różnych rozmiarach zgodnie z określonymi wymaganiami.

Ocena właściwości przeciwdrobnoustrojowych
Oceniliśmy zdolność przeciwdrobnoustrojową różnych mikrosfer za pomocą metody płytki, jak pokazano na Rysunek 4. Różne mikrosfery wykazywały działanie przeciwbakteryjne wobec E. coli i S. aureus, przy czym Cu-ALGMS i Zn-ALGMS wykazywały najsilniejsze właściwości przeciwbakteryjne. Ta zwiększona skuteczność może być przypisana aktywności przeciwdrobnoustrojowej metali, a mianowicie miedzi (Cu) i (Zn)¹³. Sukhodub i wsp. wykazali, że Fe³⁺, Zn²⁺, Ca²⁺ i Cu²⁺ wykazywały synergistyczne działanie przeciwbakteryjne z chitozanem, podczas gdy próbki bez chitozanu nie wykazywały takiej aktywności, potwierdzając synergistyczne działanie przeciwbakteryjne utworzonych kompleksów¹⁴. Uzyskane wyniki są zgodne z tym badaniem, przy czym Cu-ALGMS i Zn-ALGMS są lepsze od innych mikrosfer hydrożelowych w leczeniu bakteryjnych chorób zakaźnych.

Ocena właściwości uwalniania leków
Ocena uwalniania leku z różnych mikrosfer hydrożelowych alginianu na bazie metali przy użyciu BSA jako leku modelowego ujawniła różnice w ich profilach uwalniania. (Rysunek uzupełniający 3). Jony wykazywały lepszą zdolność do powolnego uwalniania leków niż jony innych materiałów. Szybkość uwalniania^Fe2+ była stosunkowo szybsza niż pozostałych trzech jonów, podczas gdy szybkość uwalniania Ca²⁺ i Zn²⁺ była stosunkowo wolniejsza. Wyniki te podkreślają różnice w wpływie różnych jonów na uwalnianie leków. Stawiamy hipotezę, że Fe^{2 +} może wchodzić w interakcje z lekiem lub wiązać się w sposób, który ułatwia jego uwalnianie, podczas gdy Ca^{2 +} i Zn^{2 +} wiążą się z lekiem ściślej lub istnieją inne czynniki, które ograniczają szybkość uwalniania. To ciągłe uwalnianie leku z mikrosfer hydrożelowych może być związane z siłą usieciowania między metalem a polisacharydem alginianowym. Ponadto różnica w zdolności adsorpcyjnej różnych metali w porównaniu z zdolnością BSA prawdopodobnie przyczyniła się do zaobserwowanych różnic w zdolnościach opóźniających działanie leków.

Ocena biokompatybilności
Dobra biokompatybilność jest warunkiem wstępnym dla nośników leków w zastosowaniach klinicznych. Dlatego oceniliśmy hemokompatybilność mikrosfer za pomocą testu hemolizy in vitro. Użyliśmy czystej wody jako kontroli pozytywnej i roztworu PBS jako kontroli negatywnej. Wyniki eksperymentalne przedstawiono na rysunku uzupełniającym 4, ujawniając, że czerwone krwinki w zawiesinie pozostały nienaruszone w kontakcie z różnymi mikrosferami, co wskazuje na minimalną hemolizę przez mikrosfery. Wyniki cytobiokompatybilności wykazały, że mikrosfery nie wpływają na aktywność komórkową (ryc. uzupełniająca 5). Wyniki te wykazały, że mikrosfery mają dobrą kompatybilność z komórkami krwi.

Rysunek 1: Przygotowanie mikrosfer hydrożelowych alginianu. (A) Instalacja technologii elektronatrysku mikroprzepływowego. (B) Obraz procesu elektrorozpylania mikroprzepływowego w czasie rzeczywistym. (C) Przygotowane mikrosfery hydrożelowe alginianu Ca²⁺, Cu²⁺, Z^{n2 +} i Fe³⁺. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mikrosfery hydrożelu alginianowego. Mikrografia (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS i (D) Fe-ALGMS w PBS (pH 7,4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Skaningowa mikroskopia elektronowa i spektroskopia dyspersyjna energii. Obrazy przedstawiają charakterystykę (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS i (D) Fe-ALGMS z i i ii dla danych z mikroskopii skaningowej i iii-v dla danych spektroskopowych. Obrazy iii-v pokazują mapowanie EDS, w którym EDS wybiera powierzchnię na powierzchni próbki do skanowania w celu uzyskania informacji o rozkładzie pierwiastków na całym obszarze. Tryb przemiatania mapy jest używany w aplikacjach do analizy składu, analizy stref fazowych i rozkładu wielkości cząstek materiałów, gdzie każdy pierwiastek jest reprezentowany przez inny kolor, jak pokazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe mikrosfer. (A) Właściwości przeciwdrobnoustrojowe grup badano przy użyciu metody rozmazu bakteryjnego. (B, C) Kwantyfikacja wyników zliczania płytek rozmazu bakteryjnego dla każdej grupy. W próbkach kontrolnych widoczne są kolonie wyhodowane na podłożu LB bez żadnego dodatku. Względne kolonie dla innych bakterii obliczono, przyjmując liczbę klonów w grupie kontrolnej jako 100% i używając jej jako punktu odniesienia. Słupek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Szklana rurka jest połączona ze strzykawką przez długą gumową rurkę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Wielkość cząstek. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. We wszystkich próbkach zastosowano stężenie molowe 5%. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Uwalnianie leku. Krzywa uwalniania leku Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS w PBS (pH 7,4). Pasek błędu: odchylenie standardowe, n = 3 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Test hemolizy Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS. PC (kontrola pozytywna): ddH₂O; NC (kontrola ujemna): PBS. Słupek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Cytotoksyczność mikrosfer usieciowanych różnymi jonami. Przeprowadzono ocenę biokompatybilności Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS i Fe-ALGMS. Do przeprowadzenia testu użyto Calcein-AM/PI, a dla wyników tutaj losowo wybrano 5 pól widzenia. ImageJ wykorzystano do analizy stosunku czerwonych krwinek do martwych komórek w celu uzyskania względnej żywotności komórek. 1. PC, kontrola pozytywna, 2.NC, kontrola negatywna, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, Pasek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę przygotowania ALGMS w oparciu o technologię elektrorozpylania mikroprzepływowego. Metoda jest prosta w obsłudze i pozwala uzyskać dużą liczbę mikrosfer o jednolitej okrągłości i kontrolowanej średnicy. Takie podejście zapewnia wygodę naukowcom i może promować badania i zastosowanie mikrosfer hydrożelowych. Ponadto, poprzez sieciowanie z różnymi jonami metali, poprawiono stabilność i bioaktywność ALGMS. W eksperymentach przeciwdrobnoustrojowych Cu-ALGMS i Zn-ALGMS wykazywały znaczące działanie hamujące działanie bakteryjne.

Mikrosfery hydrożelowe są elastycznymi mikrostrukturami o doskonałej plastyczności, umożliwiającymi skuteczne dostarczanie leków dzięki określonemu doborowi materiałów i projektowaniu konstrukcji. Alginian, naturalny polisacharyd, który żeluje w łagodnych warunkach, jest biokompatybilny, biodegradowalny i nietoksyczny. Mikrosfery alginianu sodu w skali mikronowej są szeroko stosowane w biochemii i biomedycynie, w tym w badaniach farmaceutycznych, dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej. Kluczową zaletą mikrosfer alginianu sodu w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków jest ich zdolność do długotrwałego uwalniania leku, zapewniająca utrzymanie wysokich stężeń aktywnego składnika farmaceutycznego przez dłuższy czas¹⁴. Nasze eksperymenty z przedłużonym uwalnianiem leków wykazały, że ALGMS z różnymi jonowymi sieciami mają zdolność do podtrzymywania uwalniania leków i mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Typowe metody wytwarzania mikrosfer hydrożelowych obejmują emulgowanie wsadowe, rozdrabnianie mechaniczne, litografię, emulsję mikroprzepływową i elektrorozpylanie ^8,15. Zalety metod emulgowania wsadowego i kruszenia mechanicznego polegają na prostocie metody wytwarzania i wysokiej wydajności wyjściowej. Za pomocą tych metod trudno jest jednak kontrolować kształt poszczególnych mikrosfer hydrożelowych. Fotolitografia polega na skupieniu światła na płytce maski lub formie w celu utwardzenia sieciowania i utworzenia mikrosfer hydrożelowych. Jednak na wydajność produkcji tej metody łatwo wpływa płytka maskująca, źródło światła i pleśń. Co więcej, metoda emulsji mikroprzepływowej może lepiej kontrolować proces formowania mikrosfer hydrożelowych i wytwarzać mikrosfery hydrożelowe o określonych kształtach; Jednak jego wydajność produkcji jest niska¹⁶. W porównaniu z tymi metodami, metoda elektrorozpylania mikroprzepływowego może wytwarzać mikrosfery hydrożelowe o jednolitym rozmiarze, regularnym kształcie i regulowanej wielkości cząstek¹⁷. Kluczowym krokiem w tym protokole jest przygotowanie mikrosfer. Rozmiar i kształt mikrosfer może się różnić w zależności od płaskości szklanej rurki, wartości napięcia i natężenia przepływu¹⁸. Istnieją również pewne ograniczenia w stosowaniu technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego do przygotowania mikrosfer, takie jak tendencja mikrokanalików do zapychania się i ograniczona wydajność, ograniczona kompatybilność materiałów i trudność w zwiększaniu skali procesu oraz trudność w kontroli i monitorowaniu procesu. Ogranicza to w pewnym stopniu ich powszechne stosowanie¹⁹.

Podsumowując, technologia elektrorozpylania mikroprzepływowego jest dojrzałą metodą przygotowania mikrosfer, oferującą zaletę jednoetapowej syntezy. Optymalizując parametry wielkości kanału przepływowego oraz kontrolując stężenie materiału i natężenie przepływu, można łatwo uzyskać mikrosfery o różnych morfologiach i rozmiarach. Warto zauważyć, że proces ten obejmuje tylko fazę wodną i nie zawiera dodatkowych środków powierzchniowo czynnych, dzięki czemu jest przyjazny dla środowiska i prosty w obsłudze, co pozwala uniknąć konieczności stosowania skomplikowanych procesów mycia. Metoda ta zapewnia strategię wytwarzania mikrosfer z materiałów hydrożelowych podobną do procesu żelowania alginianów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekran o siatce 120	Solarbio, Chiny	YA0946
Palnik alkoholowy	Solarbio, Chiny	YA2320
Myszy BALB / c	Wukong Biotechnology, Chiny
Odczynnik do oznaczania kwasu bicynchoninowego	Meilunbio, Chiny	MA0082
Albumina bydlęca	Lablead, Chiny	9048-46-8
CaCl2& nbsp; proszek	Aladdin, Chiny	10043-52-4
Calcein-AM / PI	Biosharp, Chiny	BL130A
Probówki wirówkowe	Corning, Ameryka	430290
CuSO4  proszek	Jnxinyuehuagong, Chiny	7758-99-8
DMEM	Gibicol, Chiny	C11995500BT
FeCl3  proszek	Aladdin, Chiny	7705-08-0
Surowica bydlęca	płodu HAKATA, Chiny	HN-FBS
Szklane rurki	Sartorius, Niemcy	CC0028
Mikroskopia lekka	Evidentscientific, Japonia	BX53 (LED)
Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa	Longerpump, Anglia	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte, Chiny	TCM-C752
szalka Petriego	Thermofisher,Ameryka	150464
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Thermofisher,Ameryka	3002
Skaningowy mikroskop elektronowy	Thermofisher,Ameryka	Axia ChemiSEM
Alginian sodu w proszku	Bjbalb, Chiny	Y13095
ZnSO4 w proszku	Jnxinyuehuagong, Chiny	7733-02-0