Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie usieciowanych mikrosfer alginianu sodu z różnymi jonami metali z wykorzystaniem technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66871

⸱

7 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Artificial Organs and Computational Medicine in Zhejiang Province, Institute of Translational Medicine, Zhejiang Shuren University, 2The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje przygotowanie mikrosfer alginianu sodu usieciowanych różnymi jonami metali za pomocą urządzenia mikroprzepływowego do projektowania nośników leków. Zbadano również właściwości przeciwdrobnoustrojowe i powolne uwalnianie tych mikrosfer przez leki.

Streszczenie

Mikrosfery to mikrometrowe cząsteczki, które mogą ładować i stopniowo uwalniać narkotyki poprzez fizyczną enkapsulację lub adsorpcję na powierzchni i wewnątrz polimerów. W dziedzinie biomedycyny mikrosfery hydrożelowe były szeroko badane pod kątem ich zastosowania jako nośników leków ze względu na ich zdolność do zmniejszania częstotliwości podawania leków, minimalizowania skutków ubocznych i poprawy przestrzegania zaleceń przez pacjentów. Alginian sodu (ALG) jest naturalnie występującym liniowym polisacharydem z trzema wiązaniami glikozydowymi o stałym krzelinie. W każdej z grup polimeru występują dwie pomocnicze grupy hydroksylowe, które mają cechy alkoholowego ugrupowania hydroksylowego. Syntetyczne jednostki ALG mogą ulegać chemicznym reakcjom sieciowania z jonami metali, tworząc usieciowaną strukturę sieciową stosów polimerów, ostatecznie tworząc hydrożel. Mikrosfery hydrożelowe można otrzymać za pomocą prostego procesu wykorzystującego jonowe właściwości sieciowania ALG. W niniejszej pracy przygotowaliśmy mikrosfery hydrożelowe na bazie ALG (ALGMS) przy użyciu strategii elektroosadzania mikroprzepływowego. Przygotowane mikrokulki hydrożelowe miały jednolitą wielkość i były dobrze zdyspergowane, dzięki dokładnej kontroli przepływu elektrorozpylania mikroprzepływowego. ALGMS usieciowany różnymi jonami metali przygotowano przy użyciu techniki elektrorozpylania mikroprzepływowego łączącego mikroprzepływowość i silne pole elektryczne, a następnie zbadano jego właściwości przeciwdrobnoustrojowe, zdolność do powolnego uwalniania leków i biokompatybilność. Technologia ta jest obiecująca pod względem zastosowania w zaawansowanym opracowywaniu i produkcji leków.

Wprowadzenie

Systemy dostarczania leków są gorącym punktem badawczym w dziedzinie inżynierii biotkankowej, mającym na celu poprawę efektywności i skuteczności dostarczania leków oraz zmniejszenie liczby niepożądanych reakcji i skutków ubocznych1. Wśród tych systemów mikrosfery hydrożelowe, charakteryzujące się dobrą biokompatybilnością, przestrajalnymi właściwościami mechanicznymi i plastycznością funkcjonalną, są jednym z najczęściej stosowanych nośników do ładowania i dostarczania leków2. Mogą być używane zarówno do powolnego, jak i kontrolowanego uwalniania leków, zapewniają dobre efekty ochronne dla leków, unikają lub minimalizują niespecyficzne efekty leków w innych tkankach oraz są ukierunkowane na dostarczanie leków do określonych struktur tkankowych3. W związku z tym mikrosfery hydrożelowe stały się nowym i wydajnym systemem dostarczania leków, a stopniowo pojawiają się badania w tej dziedzinie4.

Mikrosfery hydrożelowe są zazwyczaj syntetyzowane z materiałów biodegradowalnych, w tym polisacharydów, białek i naturalnych polimerów5. Wśród nich ALG jest biokompatybilnym, biodegradowalnym polisacharydem ekstrahowanym z morskich alg brunatnych6. Jego łańcuch molekularny zawiera wolne grupy hydroksylowe i karboksylowe, które mogą sieciować z większością dwuwartościowych lub wielowartościowych kationów, tworząc nierozpuszczalną w wodzie strukturę hydrożelową z trójwymiarową siecią5. Mikrosfery hydrożelowe utworzone przez ALG mogą być przekształcane w ujemnie naładowane polielektrolity w roztworach obojętnych i zasadowych. To odpychanie między ładunkami ujemnymi powoduje pęcznienie mikrosfer, umożliwiając uwolnienie kapsułkowanego składnika aktywnego lub leku. Te właściwości doprowadziły do uznania mikrosfer ALG za obiecujące nośniki leków, szeroko stosowane do ładowania leków i kontrolowanego uwalniania7.

Istnieją różne metody przygotowania mikrosfer hydrożelowych. Tradycyjne metody przygotowania ALGMS zwykle obejmują metodę zol-żel lub metodę emulsji-zol. Metody te obejmują takie etapy, jak wytrącanie, współstrącanie i reakcje żelowania w celu uzyskania docelowych mikrosfer8. W ostatnich latach, wraz z ciągłym rozwojem technologii mikroprzepływowej, metoda elektronatrysku mikroprzepływowego stopniowo stała się wydajną i precyzyjną metodą przygotowania mikrosfery9. Metoda ta wykorzystuje technologię mikroprzepływową do elektronatryskiwania roztworu polimeru przez dyszę mikrodrobnoziarnistą w celu utworzenia kropelek i mikrosfer o wielkości mikrometra podczas późniejszego procesu utwardzania lub sieciowania10. W porównaniu z tradycyjną metodą, elektrorozpylanie mikroprzepływowe zapewnia precyzyjną kontrolę wielkości i morfologii cząstek mikrosfery poprzez dostosowanie parametrów, takich jak natężenie przepływu roztworu, napięcie i rozmiar dyszy drobnoziarnistej11. Umożliwia również szybkie ciągłe przygotowanie mikrosfer, poprawiając wydajność przygotowania i utrzymując łagodne warunki reakcji. Ponadto ALGMS może być przygotowany do pełnienia różnych funkcji, takich jak leki o kontrolowanym uwalnianiu i załadowane katalizatory, co umożliwia ich łatwe zastosowanie w różnych dziedzinach.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mikrosfer ALG za pomocą metody elektrorozpylania mikroprzepływowego. Proces ten polega na przepuszczeniu roztworu ALG przez urządzenie mikroprzepływowe i poddaniu go działaniu elektrorozpylania. Powstałe kropelki zebrano w roztworze zawierającym różne jony metali (Ca2+, Cu2+, Zn2+ i Fe3+) w celu zainicjowania reakcji sieciowania. Reakcja ta poprawia stabilność i przyczepność mikrosfer oraz nadaje im różne funkcje. Metoda ta jest łatwa do wykonania, a zsyntetyzowane mikrosfery wykazują dobrą jednorodność wielkości w swojej morfologii. Ponadto zbadaliśmy ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe, zdolność do powolnego uwalniania leków i biokompatybilność. Protokół ten będzie przydatny do dalszego opracowywania i produkcji leków.

Protokół

Krew użyta w eksperymentach została uzyskana od samic myszy BALB/c klasy SPF o wadze 20-25 g i wieku około 7 tygodni. Komisja Etyki Eksperymentów na Zwierzętach w Zhejiang Shuren College zatwierdziła wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Zważyć ALG i rozpuścić w ultraczystej wodzie, mieszając w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby uzyskać 2% roztwór ALG.
  2. Oddzielnie przygotować frakcję masową z 5% (lub stężenie masy molowej wynosi 0,3 M) roztwory CaCl2, FeCl3,ZnSO4 iCuSO4 w wodzie ultraczystej. Wlej każdy roztwór osobno do naczynia zbiorczego.

2. Urządzenie do elektrorozpylania mikroprzepływowego

  1. Weź szklaną rurkę kapilarną i umieść ją nad płomieniem palnika, aby zmiękczyć, a następnie rozciągnij ją do różnych średnic (50 μm-500 μm). Odetnij drobne części nożem do szkła i delikatnie wypoleruj port końcówki wysokiej jakości papierem ściernym z węglika krzemu. Po oczyszczeniu podłącz gruby koniec rurki kapilarnej do długiej rurki, a drugi koniec rurki do igły dozującej i strzykawki o pojemności 5 ml (rysunek uzupełniający 1).
    UWAGA: Ostre krawędzie nacięć szklanych rurek są trudne do włożenia do węża; W związku z tym przerwa powinna być zaokrąglona na krawędzi płomienia.
  2. Podłączyć strzykawkę do mikroprzepływowej pompy strzykawkowej, a rurkę kapilarną na jednym końcu do uchwytu. Podłączyć czerwony zacisk końcowy wysokiego napięcia zasilacza wysokonapięciowego do igły dozującej strzykawki i umieścić srebrny klips w płynie zbiorczym. Ta konfiguracja tworzy proste mikroprzepływowe urządzenie do elektrorozpylania (Rysunek 1A).
    UWAGA: Umieść rurkę kapilarną prostopadle do stołu.

3. Przygotowanie mikrosfer ALG

  1. Umieść oddzielne naczynia zbiorcze zawierające różne jony metali bezpośrednio pod rurką kapilarną. Włącz mikroprzepływową pompę strzykawkową i wybierz opcję Fast Forward, aby zalać probówkę ALG, a następnie ustaw odpowiednie natężenie przepływu (2 ml/h).
  2. Włącz wyłącznik zasilania wysokiego napięcia i przekręć pokrętło, aby ustawić odpowiednie napięcie (5-7 kV).
  3. Dodaj 20 ml roztworu do każdej z 90-milimetrowych szalek Petriego, aby zebrać mikrosfery ALG w celu utworzenia ALGMS usieciowanego różnymi jonami metali (Rysunek 1B).
  4. ALG tworzy mikrosfery pod wpływem pola elektrycznego i grawitacji w różnych roztworach zbierających jony w ciągu kilku sekund. Odessać mikrosfery za pomocą wysterylizowanej pipety i przenieść je do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać mikrosfery hydrożelowe Zn2+, Ca2+, Cu2+ i Fe3+ -ALG (Rysunek 1C). Oznacz probówki Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS i Fe-ALGMS.
    UWAGA: Mikrosfery o różnych średnicach można uzyskać, dostosowując parametry, takie jak napięcie, średnica końcówki, natężenie przepływu i stężenie roztworu.
  5. Weź niewielką ilość przygotowanych mikrosfer, rozprowadź je jak najbardziej równomiernie w PBS i umieść pod mikroskopem w celu wizualizacji.
  6. Losowo wybranych 10 pól obserwacyjnych w tej samej partii mikrosfer, zaimportuj obrazy do pomiaru do oprogramowania ImageJ, przekonwertuj obrazy do odpowiedniego trybu skali szarości i użyj technologii segmentacji progowej, aby dokładnie określić obszar cząstek docelowych i uruchomić funkcję analizy cząstek, aby ImageJ mógł zidentyfikować i zmierzyć cząstki docelowe. Uzyskaj dane na temat mikrosfer, a następnie zaimportuj je do oprogramowania Origin w celu analizy i mapowania wielkości cząstek.

4. Test skuteczności przeciwdrobnoustrojowej

  1. Przygotować 5 ml zawiesiny Staphylococcus aureus (S. aureus) i Escherichia coli (E. coli) o początkowym zmętnieniu bakteryjnym 0,2 mcF przy użyciu płynnej pożywki Luria-Bertani (LB).
  2. Dodaj 10 ml każdego roztworu bakteryjnego do 4 pojedynczych sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 0,5 ml Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS i Fe-ALGMS ALG do każdej probówki i umieść je w wytrząsarce o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C i 200 obr./min na 12 godzin. Dodaj równą ilość soli fizjologicznej do grupy kontrolnej.
  3. Rozcieńczyć każdy roztwór bakteryjny do 105 razy sterylną wodą. Użyj sterylnego szklanego kulki, aby rozprowadzić 200 μl roztworu bakteryjnego na stałym podłożu LB.
  4. Rozprowadź roztwór szybko i równomiernie na płytce powlekającej, unikając poruszania się tam iz powrotem w tym samym obszarze. Następnie umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 12 godzin. Obserwuj kolonie różnych grup.
    UWAGA: Wszystkie procedury aseptyczne należy wykonywać w pobliżu lampy alkoholowej. Sterylizuj naczynia do hodowli drobnoustrojów, przybory do szczepienia i pożywki hodowlane.

5. Testowanie uwalniania narkotyków

  1. Aby ocenić zdolność uwalniania różnych mikrosfer do uwalniania, należy użyć albuminy surowicy bydlęcej (BSA) jako załadowanego leku modelowego. Dodaj 500 μl każdej mikrosfery (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS) do 1 mg/ml zawiesiny BSA przez 24 godziny.
  2. W celu oznaczenia uwalniania leku dodać każdą nasyconą próbkę do 5,0 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; pH 7,4), a następnie mieszać przez 15 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wstrząsaniem przy 80 obr./min.
  3. Użyć 100 μl roztworu i zastąpić pożywkę świeżą po 1, 3, 6, 12, 24, 36 i 48 godzinach.
  4. Określ ilościowo stężenia białka sklarowanego nad osadem w określonych momentach za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościowo zmierz uwolniony lek za pomocą markera enzymatycznego, aby uzyskać odpowiednią absorbancję i przelicz zmierzoną wartość na rzeczywiste stężenie leku zgodnie z krzywą standardową. Oblicz szybkość uwalniania leku, korzystając z następującego wzoru:
    Procent uwolnienia leku = (stężenie leku uwolnionego w określonym punkcie czasowym / początkowe stężenie leku) x 100%
  5. W regularnych odstępach czasu usuwaj równą objętość PBS z każdej studzienki i zastąp ją równą objętością świeżego podłoża.

6. Test hemolizy

  1. Umieścić przygotowane Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS w PBS i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu sformułowania roztworu inkubacyjnego.
  2. Uzyskaj pełną krew od zdrowych myszy BALB / c przez flebotomię oka, zebraną w probówkach przeciwzakrzepowych zawierających cytrynian sodu. Wirować i wirować przy 1509 x g przez 15 minut w celu uzyskania czerwonych krwinek.
  3. Przepłukać czerwone krwinki 2x-3x PBS i przygotować 10% roztwór czerwonych krwinek za pomocą PBS.
  4. Przygotowanie różnych ALGMS: Weź 500 μl każdej mikrosfery dla grupy eksperymentalnej, 1 ml ultraczystej wody (ddH2O) dla pozytywnej grupy kontrolnej i 1 ml roztworu PBS dla negatywnej grupy kontrolnej i wymieszaj każdy z 20 μl roztworu krwinek.
  5. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, odwirować w temperaturze 1509 x g, 15 min. Odstawić supernatant na bok i sfotografować czerwone krwinki w każdej grupie po hemolizie.
  6. Przyjmij, że wskaźnik hemolizy w pozytywnej grupie kontrolnej wynosi 100%, a w grupie kontroli negatywnej wynosi 0%. Zmierzyć wartości absorbancji supernatantów w każdej grupie i obliczyć szybkość hemolizy, korzystając ze wzoru:
    Hemoliza (%) = (Wartości absorbancji supernatantów każdej grupy-
    Wartości absorbancji samej wody destylowanej) / (Wartości absorbancji grupy kontroli dodatniej- Wartości absorbancji samej wody destylowanej) x 100

7. Test cytobiozgodności

  1. Umyj różne ALGMS 2x PBS i umieść na szalce Petriego o pojemności 5 ml na 15 minut i wyrzuć supernatant.
  2. Oddzielnie dodać różne ALGMS w ilości 0,2 ml do kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM) zawierającej 10% FBS, inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i przefiltrować roztwór w celu uzyskania odcieku.
  3. Hoduj komórki NIH3T3 do około 70% gęstości komórek na płytkach 24-dołkowych, traktuj komórki NIH3T3 roztworem ługującym mikrosfery i kontynuuj hodowlę z kompletną pożywką przez kolejne 24 godziny.
  4. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki PBS.
  5. Oceń żywotność komórek za pomocą testu Calcein-AM/PI. Weź 2,5 μl roztworu Calcein-AM (4 mM) i 12,5 μl roztworu PI (2 mM) i dodaj je do 5 ml 1x PBS i dobrze wymieszaj, aby uzyskać roztwór roboczy z 2 μM Calcein-AM i 5 μM PI.
  6. Dodać roztwór roboczy do uprzednio wysianych płytek do hodowli komórkowych w ilości 500 μl na studzienkę, inkubować w temperaturze 37 °C pod osłoną świetlną przez 15 minut, a następnie obserwować i fotografować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Skonfiguruj trzy repliki dla każdej grupy.
  7. Oblicz żywotność komórek według następującego wzoru:
    Żywotność komórek (%) = liczba żywotnych komórek / (liczba żywotnych komórek + liczba martwych komórek)

Wyniki

Charakterystyka ALGMS sieciowanego różnymi jonami metali
Morfologia optyczna Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS została przedstawiona na Rysunku 2; wykazują one dobrą sferyczność, gładką powierzchnię, jednolity rozkład wielkości cząstek (Rysunek uzupełniający 2) oraz doskonałą monodyspersyjność. Przeprowadzono dalszą charakterystykę mikroskopową z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i analizy spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS). Jak pokazano na Rysunku 3), mikrosfery były ogólnie sferyczne i charakteryzowały się wyraźną okrągłością. Powierzchnia Zn-ALGMS była nierównomierna, wydając się bardziej chropowata z licznymi zmarszczkami. Wykonano spektroskopię dyspersyjną energii, aby określić rozkład zawartości jonów metali uczestniczących w reakcji sieciowania w żelu. Warto zauważyć, że wielkość mikrosfer można regulować poprzez zmianę parametrów, takich jak odległość zbierania, stężenie żelu i napięcie pola elektrycznego12. W opisanym protokole, poprzez dostosowanie parametrów urządzenia mikrofluidycznego oraz stężenia cieczy, można łatwo uzyskać cząstki o różnych rozmiarach zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

Ocena właściwości przeciwdrobnoustrojowych
Zdolność przeciwdrobnoustrojową różnych mikrosfer oceniono metodą dyfuzyjną na płytkach, jak pokazano na ryc. 4. Różne mikrosfery wykazały aktywność przeciwbakteryjną wobec E. coli oraz S. aureus, przy czym Cu-ALGMS i Zn-ALGMS wykazały najsilniejsze właściwości przeciwbakteryjne. Zwiększoną skuteczność można przypisać aktywności przeciwdrobnoustrojowej metali, mianowicie miedzi (Cu) i cynku (Zn)13. Sukhodub i wsp. wykazali, że Fe3+, Zn2+, Ca2+ oraz Cu2+ wykazują synergistyczne działanie przeciwbakteryjne z chitozanem, podczas gdy próbki bez chitozanu nie wykazały takiej aktywności, co potwierdza synergistyczny efekt przeciwbakteryjny utworzonych kompleksów14. Uzyskane wyniki są zgodne z tym badaniem, a Cu-ALGMS i Zn-ALGMS okazały się skuteczniejsze od innych mikrosfer hydrożelowych w leczeniu bakteryjnych chorób zakaźnych.

Ocena właściwości uwalniania leku
Ocena uwalniania leku z różnych mikrosfer hydrożelowych alginianowych na bazie metali z wykorzystaniem BSA jako modelowego leku wykazała różnice w ich profilach uwalniania (Supplementary Figure 3). Jony wykazały lepszą zdolność do powolnego uwalniania leku niż pozostałe materiały. Szybkość uwalniania leku w przypadku Fe2+ była stosunkowo wyższa niż w przypadku pozostałych trzech jonów, natomiast szybkość uwalniania leku dla Ca2+ i Zn2+ była stosunkowo niższa. Wyniki te podkreślają różnice w wpływie poszczególnych jonów na uwalnianie leku. Przypuszczamy, że Fe2+ prawdopodobnie oddziałuje z lekiem lub wiąże się z nim w sposób, który ułatwia uwalnianie, podczas gdy Ca2+ i Zn2+ wiążą się z lekiem silniej lub istnieją inne czynniki ograniczające szybkość uwalniania. To przedłużone uwalnianie leku z mikrosfer hydrożelowych może być związane z siłą sieciowania między metalem a polisacharydem alginianowym. Dodatkowo, różnica w pojemności adsorpcyjnej różnych metali w stosunku do BSA prawdopodobnie przyczyniła się do obserwowanych różnic w zdolnościach do opóźniania uwalniania leku.

Ocena biozgodności
Dobra biozgodność jest warunkiem wstępnym dla nośników leków w zastosowaniach klinicznych. Dlatego oceniliśmy hemokompatybilność mikrosfer za pomocą testu hemolizy in vitro. Jako kontrolę pozytywną zastosowano wodę oczyszczoną, a jako kontrolę negatywną roztwór PBS. Wyniki doświadczalne przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 4, z których wynika, że erytrocyty w zawiesinie pozostały nienaruszone po kontakcie z różnymi mikrosferami, co wskazuje na minimalną hemolizę wywołaną przez mikrosfery. Wyniki cytobiozgodności wykazały, że mikrosfery nie wpływały na aktywność komórkową (Rysunek uzupełniający 5). Wyniki te wskazują, że mikrosfery charakteryzują się dobrą kompatybilnością z komórkami krwi.

Układ separacji faz ciekłych; eksperyment z kapaniem kapilarnym, analiza wyników mieszania rozpuszczalników.
Rycina 1: Przygotowanie mikrosfer hydrożelowych z alginianu. (A) Instalacja technologii mikrofluidycznego elektrozraszania. (B) Obraz procesu mikrofluidycznego elektrozraszania w czasie rzeczywistym. (C) Przygotowane mikrosfery hydrożelowe z alginianu Ca2+, Cu2+, Zn2+ i Fe3+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy Zn, Ca, Cu, Fe-ALGMS; struktura mikrokapsułek; badanie z zakresu nauki o materiałach.
Rycina 2: Mikrografia mikrosfer hydrożelowych z alginianu. Mikrografia (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS oraz (D) Fe-ALGMS w PBS (pH 7.4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza SEM-EDS mikrosfer; mapowanie pierwiastków; mapy rozkładu Zn, Ca, Cu, Fe; badania.
Rysunek 3: Skaningowa mikroskopia elektronowa i spektroskopia dyspersyjna energii. Obrazy przedstawiają charakterystykę (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS oraz (D) Fe-ALGMS, gdzie i oraz ii oznaczają dane z mikroskopii skaningowej, a iii-v dane spektroskopowe. Obrazy iii-v przedstawiają mapowanie EDS, w którym EDS wybiera obszar na powierzchni próbki do skanowania w celu uzyskania informacji o rozkładzie pierwiastków w całym obszarze. Tryb skanowania mapy jest stosowany w analizach składu, analizach stref fazowych oraz rozkładu wielkości cząstek materiałów, gdzie każdy pierwiastek jest reprezentowany przez inny kolor, jak pokazano na rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment redukcji wzrostu bakterii; szalki Petriego i wykresy wyników dla preparatów z E. coli i S. aureus.
Rysunek 4. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe mikrosfer. (A) Właściwości przeciwdrobnoustrojowe poszczególnych grup przebadano metodą posiewu bakterii. (B, C) Ilościowe określenie wyników liczenia kolonii na płytkach z posiewem bakterii dla każdej grupy. Próbki kontrolne wykazują kolonie wyhodowane na medium LB bez żadnych dodatków. Względną liczbę kolonii dla pozostałych bakterii obliczono, przyjmując liczbę klonów w grupie kontrolnej za 100% i traktując ją jako linię bazową. Słupek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Szklana rurka jest połączona ze strzykawką za pomocą długiej gumowej rurki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Wielkość cząstek. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Dla wszystkich próbek zastosowano stężenie molowe 5%. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Uwalnianie leku. Krzywa uwalniania leku z Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS i Fe-ALGMS w PBS (pH 7.4). Słupki błędu: odchylenie standardowe, n = 3 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Test hemolizy dla Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS oraz Fe-ALGMS. PC (kontrola dodatnia): ddH2O; NC (kontrola ujemna): PBS. Słupek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Cytotoksyczność mikrosfer sieciowanych różnymi jonami. Przeprowadzono ocenę biokompatybilności Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS oraz Fe-ALGMS. Do wykonania testu wykorzystano Calcein-AM/PI, a w celu uzyskania przedstawionych wyników losowo wybrano 5 pól widzenia. Do analizy stosunku żywych komórek do martwych komórek w celu wyznaczenia względnej żywotności komórek wykorzystano program ImageJ. 1.PC, kontrola pozytywna, 2.NC, kontrola negatywna, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS. Słupek błędu: odchylenie standardowe, n = 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę przygotowania ALGMS w oparciu o technologię elektrorozpylania mikroprzepływowego. Metoda jest prosta w obsłudze i pozwala uzyskać dużą liczbę mikrosfer o jednolitej okrągłości i kontrolowanej średnicy. Takie podejście zapewnia wygodę naukowcom i może promować badania i zastosowanie mikrosfer hydrożelowych. Ponadto, poprzez sieciowanie z różnymi jonami metali, poprawiono stabilność i bioaktywność ALGMS. W eksperymentach przeciwdrobnoustrojowych Cu-ALGMS i Zn-ALGMS wykazywały znaczące działanie hamujące działanie bakteryjne.

Mikrosfery hydrożelowe są elastycznymi mikrostrukturami o doskonałej plastyczności, umożliwiającymi skuteczne dostarczanie leków dzięki określonemu doborowi materiałów i projektowaniu konstrukcji. Alginian, naturalny polisacharyd, który żeluje w łagodnych warunkach, jest biokompatybilny, biodegradowalny i nietoksyczny. Mikrosfery alginianu sodu w skali mikronowej są szeroko stosowane w biochemii i biomedycynie, w tym w badaniach farmaceutycznych, dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej. Kluczową zaletą mikrosfer alginianu sodu w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków jest ich zdolność do długotrwałego uwalniania leku, zapewniająca utrzymanie wysokich stężeń aktywnego składnika farmaceutycznego przez dłuższy czas14. Nasze eksperymenty z przedłużonym uwalnianiem leków wykazały, że ALGMS z różnymi jonowymi sieciami mają zdolność do podtrzymywania uwalniania leków i mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Typowe metody wytwarzania mikrosfer hydrożelowych obejmują emulgowanie wsadowe, rozdrabnianie mechaniczne, litografię, emulsję mikroprzepływową i elektrorozpylanie 8,15. Zalety metod emulgowania wsadowego i kruszenia mechanicznego polegają na prostocie metody wytwarzania i wysokiej wydajności wyjściowej. Za pomocą tych metod trudno jest jednak kontrolować kształt poszczególnych mikrosfer hydrożelowych. Fotolitografia polega na skupieniu światła na płytce maski lub formie w celu utwardzenia sieciowania i utworzenia mikrosfer hydrożelowych. Jednak na wydajność produkcji tej metody łatwo wpływa płytka maskująca, źródło światła i pleśń. Co więcej, metoda emulsji mikroprzepływowej może lepiej kontrolować proces formowania mikrosfer hydrożelowych i wytwarzać mikrosfery hydrożelowe o określonych kształtach; Jednak jego wydajność produkcji jest niska16. W porównaniu z tymi metodami, metoda elektrorozpylania mikroprzepływowego może wytwarzać mikrosfery hydrożelowe o jednolitym rozmiarze, regularnym kształcie i regulowanej wielkości cząstek17. Kluczowym krokiem w tym protokole jest przygotowanie mikrosfer. Rozmiar i kształt mikrosfer może się różnić w zależności od płaskości szklanej rurki, wartości napięcia i natężenia przepływu18. Istnieją również pewne ograniczenia w stosowaniu technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego do przygotowania mikrosfer, takie jak tendencja mikrokanalików do zapychania się i ograniczona wydajność, ograniczona kompatybilność materiałów i trudność w zwiększaniu skali procesu oraz trudność w kontroli i monitorowaniu procesu. Ogranicza to w pewnym stopniu ich powszechne stosowanie19.

Podsumowując, technologia elektrorozpylania mikroprzepływowego jest dojrzałą metodą przygotowania mikrosfer, oferującą zaletę jednoetapowej syntezy. Optymalizując parametry wielkości kanału przepływowego oraz kontrolując stężenie materiału i natężenie przepływu, można łatwo uzyskać mikrosfery o różnych morfologiach i rozmiarach. Warto zauważyć, że proces ten obejmuje tylko fazę wodną i nie zawiera dodatkowych środków powierzchniowo czynnych, dzięki czemu jest przyjazny dla środowiska i prosty w obsłudze, co pozwala uniknąć konieczności stosowania skomplikowanych procesów mycia. Metoda ta zapewnia strategię wytwarzania mikrosfer z materiałów hydrożelowych podobną do procesu żelowania alginianów.

Oświadczenia

Nie ujawnia się żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez projekt badawczy Uniwersytetu Zhejiang Shuren (2023R053 i 2023KJ237).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekran o siatce 120Solarbio, ChinyYA0946
Palnik alkoholowySolarbio, ChinyYA2320
Myszy BALB / cWukong Biotechnology, Chiny
Odczynnik do oznaczania kwasu bicynchoninowegoMeilunbio, ChinyMA0082
Albumina bydlęcaLablead, Chiny9048-46-8
CaCl2& nbsp; proszekAladdin, Chiny10043-52-4
Calcein-AM / PIBiosharp, ChinyBL130A
Probówki wirówkoweCorning, Ameryka430290
CuSO4  proszekJnxinyuehuagong, Chiny7758-99-8
DMEMGibicol, ChinyC11995500BT
FeCl3  proszekAladdin, Chiny7705-08-0
Surowica bydlęcapłodu HAKATA, ChinyHN-FBS
Szklane rurkiSartorius, NiemcyCC0028
Mikroskopia lekkaEvidentscientific, JaponiaBX53 (LED)
Mikroprzepływowa pompa strzykawkowaLongerpump, AngliaLSP01-3A
NIH3T3HyGyte, ChinyTCM-C752
szalka PetriegoThermofisher,Ameryka150464
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaThermofisher,Ameryka3002
Skaningowy mikroskop elektronowyThermofisher,AmerykaAxia ChemiSEM
Alginian sodu w proszku Bjbalb, ChinyY13095
ZnSO4 w proszkuJnxinyuehuagong, Chiny7733-02-0

Bibliografia

  1. Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
  2. Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
  3. Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
  4. Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
  5. Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
  6. El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
  7. Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
  8. Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
  9. Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
  10. Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
  11. Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
  12. Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
  13. Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
  14. Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
  15. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
  16. Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  17. Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
  18. Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
  19. Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Siatkowane mikrosferysieciowanie jonami metalimikrosfery hydrożelowedostarczanie lekówwłaściwości przeciwdrobnoustrojoweuwalnianie lekuocena biokompatybilnościskaningowa mikroskopia elektronowa
Otrzymywanie usieciowanych mikrosfer alginianu sodu z różnymi jonami metali z wykorzystaniem technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.