Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

850 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 czerwca 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano kompozytowe hydrożele mimetyczne nerwowe, które mogą być wykorzystywane do badania i wykorzystania proregeneracyjnego zachowania komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu do naprawy urazu rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) powoduje trwały deficyt sensorycyjny poniżej miejsca urazu. Dotyka około ćwierć miliona osób w USA i stanowi niewyobrażalny problem zdrowia publicznego. Przeprowadzono badania mające na celu skuteczne leczenie; jednak SCI nadal jest uważane za nieuleczalne ze względu na złożony charakter miejsca urazu. Badane są różne strategie, w tym dostarczanie leków, przeszczepianie komórek oraz biomateriały do zastrzyków, ale sama jedna z nich ogranicza ich skuteczność w regeneracji. W związku z tym terapie kombinatoryczne zyskały ostatnio na uwadze, aby ukierunkować wielowymiarowe cechy urazu. Wykazano, że macierze zewnątrzkomórkowe (ECM) mogą zwiększać skuteczność przeszczepów komórek w leczeniu rdzenia rdzeniowego. W tym celu opracowano i scharakteryzowano hydrożele 3D składające się z zdecelularyzowanych rdzeni kręgowych (dSC) i nerwów rwy kulszowej (dSN) w różnych proporcjach. Analiza histologiczna dSC i dSN potwierdziła usunięcie składników komórkowych i jądrowych, a po decelularyzacji zachowano natywne architektury tkanek. Następnie powstały kompozytowe hydrożele o różnych proporcjach objętościowych i poddane analizom kinetyki mętności żelacyjnej, właściwości mechanicznych oraz osadzonej w ludzkiej tkance macierzystej (hASC). Nie stwierdzono istotnych różnic w właściwościach mechanicznych między różnymi proporcjami hydrożeli i macierzy rdzenia kręgowego zdecellularizowanego. Ludzkie ASC osadzone w żelach pozostawały żywotne przez cały 14-dniowy cykl kultury. Badanie to umożliwia generowanie tkankowo inżynieryjnych kombinatorycznych hydrożeli, które prezentują specyficzne dla nerwów ECM oraz proregeneracyjne komórki macierzyste mezenchymalne. Ta platforma może dostarczyć nowych informacji na temat strategii neuroregeneracyjnych po SCI w przyszłych badaniach.

Wprowadzenie

Około 296 000 osób cierpi na urazowe SCI, a każdego roku w USA pojawia się około 18 000 nowych przypadków SCI. Urazowe mięśnie rdzenia rdzeniowego najczęściej są spowodowane upadkami, ranami postrzałowymi, wypadkami samochodowymi oraz aktywnościami sportowymi, a często prowadzi do trwałej utraty funkcji sensoryczno-ruchowych poniżej miejsca urazu. Szacowane koszty leczenia SCI w ciągu życia wynoszą od jednego do pięciu milionów dolarów na osobę, przy znacząco niższej oczekiwanej długości życia1. Jednak rdzenie rdzeniowe jest nadal słabo poznane i w dużej mierze nieuleczalne, głównie z powodu złożonych patofizjologicznych konsekwencjipo urazie. Badane były różne strategie, w tym przeszczepy komórek oraz rusztowania oparte na biomateriałach. Chociaż przeszczepianie komórek i biomateriałów wykazało potencjał, wielowymiarowy charakter SCI sugeruje, że podejścia kombinatoryczne mogą być bardziej korzystne3. W rezultacie wiele strategii kombinatorycznych zostało zbadanych, które wykazały lepszą skuteczność terapeutyczną niż pojedyncze składniki. Jednak potrzebne są dalsze badania, aby dostarczyć nowe biomateriały do dostarczania komórek i leków3.

Jednym z obiecujących podejść do wytwarzania naturalnych hydrożeli jest decelularyzacja tkanek. Proces decelularyzacji wykorzystuje metody jonowe, niejonowe, fizyczne i kombinatoryczne, aby usunąć wszystkie lub większość materiałów komórkowych i jądrowych, zachowując jednocześnie komponenty ECM. Usuwając wszystkie lub większość składników komórkowych, hydrożele pochodzące z ECM są mniej immunoaktywne dla gospodarza po wszczepieniu/wstrzyknięciu4. Istnieje kilka parametrów, które należy zmierzyć, aby ocenić jakość zdecellularyzowanych tkanek: usunięcie zawartości komórkowej/jądrowej, właściwości mechaniczne oraz zachowanie ECM. Ustalono następujące kryteria, aby uniknąć niepożądanych odpowiedzi immunologicznych: 1) mniej niż 50 ng dwuniciowego DNA (dsDNA) na mg suchej masy ECM, 2) długość fragmentu DNA poniżej 200 bp oraz 3) prawie lub wcale widoczny materiał jądrowy zabarwiony 4'6-diamidino-2-fenuylindolem (DAPI)5. Właściwości mechaniczne można ilościowo ocenić za pomocą testów rozciągania, kompresji i/lub reologii, a powinny być podobne do oryginalnej tkanki6. Ponadto zachowanie białek można oceniać za pomocą proteomiki lub testów ilościowych koncentrujących się na głównych składnikach zdecellularyzowanych tkanek, takich jak laminina, glikozaminoglikan (GAG) i proteoglikan siarczanu chondroityny (CSPG) dla rdzenia kręgowego 7,8. Zweryfikowane hydrożele pochodzące z ECM mogą być recelularyzowane różnymi typami komórek, aby wspomóc terapię komórkową9.

Badano różne typy komórek, takie jak komórki Schwanna, komórki otulające węch, komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (MSC) oraz komórki macierzyste/progenitorowe nerwowe, pod kątem naprawy rdzenia rdzeniowego 10,11,12. Jednak kliniczne wykorzystanie tych komórek jest ograniczone ze względu na kwestie etyczne, rzadką integrację z sąsiednimi komórkami/tkankami, brak źródeł tkanek dla wysokiej wydajności, brak możliwości samoodbudowy i/lub ograniczoną zdolność proliferacji 13,14,15. W przeciwieństwie do tych typów, ludzkie tłuszczowe MSC (hASC) są atrakcyjnym kandydatem, ponieważ łatwo izolują je w sposób minimalnie inwazyjny za pomocą lipoaspiratów, a można uzyskać dużą liczbę komórek16. Ponadto hASC mają zdolność wydzielania czynników wzrostu i cytokin o potencjale neuroochronnym, angiogenetycznym, gojeniu ran, regeneracji tkanek oraz immunosupresji 17,18,19,20,21.

Jak opisano, przeprowadzono wiele badań22, 23, 24 i wiele z nich wyciągnęło wnioski, ale niejednorodne cechy rdzenia rdzeniowego ograniczyły ich skuteczność w wspieraniu funkcjonalnego powrotu do zdrowia. W związku z tym zaproponowano podejścia kombinatoryczne w celu zwiększenia skuteczności leczenia SCI. W tym badaniu opracowano kompozytowe hydrożele poprzez połączenie zdecellularizowanych rdzeni kręgowych i nerwów kulszowych w trójwymiarowej (3D) hodowli hASC. Skuteczną decelularyzację potwierdzono analizami histologicznymi i DNA, a różne proporcje kompozytowych hydrożeli nerwowych charakteryzowano kinetyką żelowania i testami kompresyjnymi. Badana jest żywotność hASC w kompozytowych hydrożelach nerwowych, aby udowodnić, że ten hydrożel może być wykorzystywany jako platforma do hodowli komórek 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Tkanki wieprzowe były pozyskiwane komercyjnie, więc komisja etyczna ds. zwierząt nie wymagała zatwierdzenia.

1. Decelularyzacja rdzenia kręgowego u wieprzi (szacowany czas: 5 dni)

UWAGA: Wykonaj decelularyzację przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów z modyfikacjami25,26. Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie roztwory powinny być filtrowane sterylnie za pomocą filtra na pokrywce (pory 0,2 μm) do butelek z autoklawem. Zabiegi przeprowadzane w temperaturze 37 °C można wykonywać w inkubatorze lub czystym piekarniku ustawionym na 37 °C.

  1. Przygotowanie roztworów decelularyzacji
    UWAGA: Wszystkie roztwory są obliczane na 1 L. Użytkownicy mogą potrzebować dostosować ostateczną wymaganą objętość do swoich potrzeb eksperymentalnych.
    1. Rozcieńcz 500 mL 0,05% trypsyny/etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA) z 500 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby uzyskać 0,025% trypsynę/EDTA.
    2. Rozcieńcz 300 mL 10% Triton X-100 z 700 mL PBS, aby uzyskać 3% Triton X-100. Wymieszaj 0,56 g NaCl, 1,31 gNaH,2 PO4H2O oraz 10,85 g HNa2O4P·7H2O na 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 100 mM Na/50 mM buforu phos.
    3. Wymieszaj 32,4 g sacharozy z 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 1 M sacharozy. Wymieszaj 40 g deoksycholatu sodu (SD) z 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 4% roztwór SD. Rozcieńcz 6,7 mL 15% kwasu nadoctowego z 993,3 mL 4% etanolu.
  2. Przygotowanie świńskiego rdzenia kręgowego
    UWAGA: Rdzenie kręgowe były transportowane zamrożone bez roztworu i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    1. Rozmrażaj rdzeń kręgowy w 4 °C w lodówce przez 18-24 godziny przed decelularyzacją. Użyj sterylnych nożyczek, aby ostrożnie usunąć oporządzenie twarde.
    2. Przetnij rdzeń kręgowy na małe kawałki (około 1 cm długości). Umieść jedną część w probówce 15 mL lub maksymalnie trzy kawałki w probówce 50 mL.
  3. Decelularyzacja rdzenia kręgowego
    UWAGA: Po każdym kroku roztwory decelularyzacyjne są ręcznie wlewane do dużej zlewki, aby je wyrzucić. Małe, autoklawowalne sitko ze stali nierdzewnej może pomóc w usuwaniu roztworów decellularyzacyjnych bez utraty tkanek potrzebnych na każdy etap. Rdzeń kręgowy był pobudzony przy 83 obr./min, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Płukaj rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 18-24 godziny w temperaturze 4 °C i 60 obr./min.
    2. Płukaj rdzeń kręgowy 0,025% trypsyną/EDTA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 40 obr./min. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 15 minut, 2 razy.
    3. Płukaj rdzeń kręgowy 3% Triton X-100 przez 2 godziny. Przepłukaj rdzeń kręgowy buforem fosyalnym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 2 razy.
    4. Płukaj rdzeń kręgowy 1 M sacharozą przez 1 godzinę. Następnie płucz rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 1 godzinę.
    5. Płukaj rdzeń kręgowy 4% SD przez 2 godziny. Następnie płucz rdzeń kręgowy buforem fosforowym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 2 razy.
    6. Płukaj rdzeń kręgowy 0,1% kwasem nadoctowym w 4% etanolu przez 4 godziny. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 1 godzinę.
    7. Płukaj rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 1 godzinę, 2 razy. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 1 godzinę.
    8. Liofilizuj rdzeń kręgowy w temperaturze 0,01 mbar i -56 °C przez 3 dni i przechowuj suchy do użycia.

2. Decelularyzacja nerwu kulszowego wieprzowego (szacowany czas: 5 dni)

UWAGA: Wykonaj decelularyzację według wcześniej ustalonego protokołu27. Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie roztwory powinny być filtrowane sterylnie za pomocą filtra na pokrywce (pory 0,2 μm) do butelek z autoklawem. Procedury przeprowadzane w temperaturze 37 °C można wykonywać w inkubatorze lub czystym piekarniku ustawionym na 37°C.

  1. Przygotowanie roztworów decelularyzacji
    UWAGA: Wszystkie roztwory są obliczane na 1 L. Użytkownicy mogą potrzebować dostosować ostateczną wymaganą objętość do swoich potrzeb eksperymentalnych.
    1. Przygotuj bufor 50 mM Na/10 mM phos, mieszając 1,86 g NaCl, 0,262 g d NaH2PO4H2O oraz 2,17 g HNa2O 4P·7H2O w 1 L wody dejonizowanej.
    2. Przygotuj roztwór sulfobetainy-10 (SB-10) o pojemności 125 mM przez wymieszanie 38,4 g SB-10 w 1 L buforu 50 mM Na/10 mM fosforu.
    3. Przygotuj roztwór 3% SD/0,6 mM sulfobetainy-16 (SB-16), mieszając 30 g SD i 0,24 g SB-16 w 1 L buforu 50 mM Na/10 mM phos.
  2. Przygotowanie nerwu kulszowego wieprzowego
    UWAGA: Nerwy kulszowe były transportowane zamrożone z PBS i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    1. Rozmroź nerw kulszowy w 4 °C w lodówce 18-24 godziny przed decelularyzacją.
    2. Przetnij nerw kulszowy na małe kawałki (około 1 cm długości). Umieść jedną część w probówce 15 mL lub maksymalnie trzy kawałki w probówce 50 mL.
  3. Decellularyzacja nerwu kulszowego
    UWAGA: Po każdym kroku roztwory decelularyzacyjne są ręcznie wlewane do dużej zlewki do wyrzucenia, a do odrzucania można użyć małego, autoklawowego sito ze stali nierdzewnej, aby pomóc w odrzucaniu roztworów decelularyzacyjnych bez utraty tkanek potrzebnych na każdy etap. Nerw kulszowy był pobudzony przy 15 obr./min, chyba że zaznaczyono inaczej.
    1. Płukaj nerw kulszowy wodą dejonizowaną przez 7 godzin. Następnie płucz nerw kulszowy 125 mM sulfobetainy-10 (SB-10) w buforze 50 mM Na/10 mM phos przez 18 godzin.
    2. Płukaj nerw kulszowy buforem fosowym 100 mM Na/50 mM na 15 minut. Następnie płucz nerw kulszowy 3% SD/0,6 mM sulfobetainy-16 (SB-16) w buforze fosowym 50 mM Na/10 mM przez 2 godziny.
    3. Przepłukaj nerw kulszowy buforem fosforowym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 3 razy. Następnie płucze nerw kulszowy 125 mM SB-10 w buforze fosowym 50 mM Na/10 mM fosforu przez 7 godzin.
    4. Płukaj nerw kulszowy buforem fosowym 100 mM Na/50 mM na 15 minut. Następnie płucz nerw kulszowy 3% SD/0,6 mM SB-16 w buforze 50 mM Na/10 mM phos przez 1,5 godziny.
    5. Przepłukaj nerw kulszowy buforem fosforowym 50 mM Na/10 mM przez 15 minut, 3 razy. Następnie spłukać nerw kulszowy 75 U/mL deoksyrybonukleazy (DNazy) przez 3 godziny bez pobudzenia.
    6. Przepłucz nerw kulszowy buforem fosowym 50 mM Na/10 mM na 1 godzinę, 3 razy. Następnie płucz nerw kulszowy 0,2 U/mL chondroitinazy ABC przez 16 godzin bez pobudzenia w temperaturze 37 °C.
    7. Płukaj nerw kulszowy PBS przez 3 godziny, 3 razy. Liofilizuj nerw kulszowy w temperaturze 0,01 mbar i -56 °C przez 3 dni i przechowuj suchy do użycia.

3. Trawienie zdecelularyzowanych tkanek i wytwarzanie kompozytowych hydrożeli (szacowany czas: 4 dni)

  1. Posiekaj lub zmiel zdecellularizowane tkanki na proszek za pomocą nożyczek lub homogenizatora. Sterylizuj narzędzia do cięcia lub mielenia tkanek za pomocą autoklawu w temperaturze 121 °C przez 45 minut. Metoda tlenku etylenu również jest stosowana.
  2. Tkanki trawić osobno w roztworze 0,01 N kwasu solnego (HCl) zawierającym 1 mg/mL pepsyny w stężeniu 15 mg/mL. Szacowane masy zdecellularyzowanego rdzenia kręgowego i nerwu kulszowego to odpowiednio 50-100 mg i 100-150 mg na osobę.
  3. Umieść pręt magnetyczny i mieszaj w temperaturze 500 obr./min i 4 °C przez co najmniej 4 dni, aby uzyskać roztwory preżelowe.
  4. Zmieszaj pregel nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego w następujących proporcjach objętościowych: 2:1, 1:1 i 1:2. Reguluj pH 7,4 używając 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) i HCl, a następnie rozcieńcz do pożądanego stężenia za pomocą podłoża M199 i 1x PBS. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
    UWAGA: Dodawaj NaOH po 1 μL na raz. Medium M199 może być używane jako wskaźnik pH, ponieważ gdy pH wynosi 7,4, staje się jasnoróżowe, ale do potwierdzenia poziomu pH powinny być użyte paski pH.

4. Weryfikacja decelularyzacji

  1. Barwienie hematoksylyny i eozyny (H&E; Szacowany czas: 8 dni)
    UWAGA: Po każdym kroku płukania roztwory są ręcznie wlewane do dużej zlewki do odrzucania.
    1. Utrwalić świeży i zdecellularizowany rdzeń kręgowy oraz nerw kulszowy w 3,7% formaldehydu w temperaturze 4 °C przez 18 godzin. Włóż jeden kawałek do probówki 15 mL.
    2. Usuń formaldehyd i umieść chusteczki w 10% sacharozie na jeden dzień. Usuń 10% sacharozy i umieść tkanki w 30% sacharozy na 6 dni.
    3. Napełnij odpowiednio dopasowany kryomold optymalną temperaturą cięcia (OCT) do połowy. Umieść zdecellularizowane tkanki, pokryj je OCT i pozwól im wchłonąć OCT przez 1 dzień.
    4. Po 1 dniu zamroz tkanki na noc w temperaturze -80 °C. Kriosekcję tkanek o grubości 10 μm za pomocą kriostatu.
    5. Płukaj 1x PBS przez 5 minut, 2x. Następnie płucz wodą z kranu przez 5 minut.
    6. Barwić roztworem hematoksyliny przez 1 minutę. Płukaj wodą z kranu przez 1 minutę, 3 razy.
    7. Barw roztworem eozyny przez 1 minutę. Płukaj etanolem 95% przez 1 minutę, 2 razy i 100% etanolem przez 1 minutę, 3 razy.
    8. Płukaj ksylenem przez 1 minutę, 2 minuty, a potem 1 minutę. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez 5 minut.
    9. Użyj patyczka watowego, aby przekroczyć 3–4 krople roztworu dibutyloftalanu polistyren-ksylenowego (DPX) na preparaty. Nakładki nakładkowe na slajdach pokrytych DPX. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez noc.
  2. Analiza DNA (szacowany czas: 1 godzina)
    1. Waż się tkanki decelularizowane i liofilizowane. Izoluj i ilościowo określ DNA za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Charakterystyka kompozytowych hydrożeli

  1. Test mętności żelacyjną (szacowany czas: 1 godzina)
    1. Umieść 100 μL roztworów preżelowych w każdej jamie na 96-dołowej płycie na lodzie. Mierz absorpcję przy 405 nm co 2 minuty przez 45 minut za pomocą czytnika płytowego.
    2. Oblicz znormalizowaną absorbancję za pomocą następującego równania:
      (Absorpcja - początkowaabsorpcja) / (Maksymalna absorpcja -początkowa absorpcja)
    3. Oblicz nachylenie krzywej oraz czas potrzebny na osiągnięcie żelacji 50% i 95%, odpowiednio t1/2 it 95.
  2. Test kompresji (szacowany czas: 1 min na hydrogel)
    1. Wytwarzaj kompozytowe hydrożele o stężeniu 12 mg/mL o średnicy 8 mm i wysokości 2 mm.
    2. Użyj reometru do sprężania próbek z obciążeniem 250 N pomiędzy stalowymi płytami równoległymi ze stali nierdzewnej z częstotliwością odkształcenia 10% wysokości próbki na minę. Oprogramowanie dostarczające odczyty reometru dostarcza krzywą naprężenia-odkształcenia, stosując siłę i mierząc odkształcenie aż do pęknięcia hydrożeli.
    3. Oblicz moduł Younga z nachylenia liniowego obszaru krzywych naprężenie-odkształcenie.

6. Trójwymiarowa hodowla ludzkich ASC w kompozytowych hydrożelach nerwowych

  1. Przygotowanie trójwymiarowej (3D) platformy (szacowany czas: 3 godziny)
    1. Trawienie płytki krzemowej fotorezystorem SU-8, aby uzyskać okrągłe wzory o głębokości 200 μm i średnicy 4 mm.
    2. Zmieszaj bazę polidimetylosiloksanu (PDMS) i środek utwardzający w proporcji 10:1. Wlej mieszankę na płytkę krzemową i pozostawij ją na 20 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powstające podczas mieszania bazy PDMS i środka utwardzającego.
    3. Włóż go do piekarnika i utwardzaj przez 2 godziny w temperaturze 70 °C. Rozbij utwardzony arkusz PDMS i wybij go za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 8 mm, aby uzyskać mikrootwory PDMS.
    4. Umieść mikrootwory w płycie z 96 dołkami i umieść płytkę w czyścicielu plazmy powietrznej, aby sterylizować mikrootwory PDMS.
    5. Funkcjonalizuj mikrowstudnie PDMS z 1% polietyleiminy (PEI) i 0,1% glutaraldehydu (GA) odpowiednio przez 10 i 20 minut. Myj mikrodołki wodą destylowaną 2 razy.
  2. Przygotowanie hASC (szacowany czas: 7 dni)
    1. Hodować komórki przechodzące przez 2-5 przejść w ośrodku wzrostu hASC (podłoże bazalne hASC uzupełnione surowicą płodową (FBS) oraz penicyliną/streptomycyną (Pen-streptokok)) aż do połączenia się. Przejdź i oblicz liczbę komórek za pomocą hemacytometru lub licznika komórek.
  3. Hydrożele kompozytowe z nerwami obsadzonymi w ASC (szacowany czas: 2 godziny)
    1. Zmieszaj pregel nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego w proporcjach objętościowych 2:1, 1:1, 1:2 i przygotuj hydrogel wyłącznie z rdzenia kręgowego, nie mieszając żadnego preżelu nerwu kulszowego.
    2. Dodaj podłoże M199 i dostosuj pH 7,4 za pomocą 1 N NaOH i HCl. Ponownie zawiesij hASC z podłożem wzrostowym w preżelu o gęstości 1 x 106 komórek /mL.
      UWAGA: Ilość M199 i zawiesiny komórkowej powinna stanowić 10% pregelu.
    3. Rozcieńcz preżel do 12 mg/mL przy użyciu 1x PBS. Umieść preżel na mikrodołkach i inkubuj przez 30 minut. Hodowanie hydrożeli bogatych w ASC w podłożu wzrostu hASC.
  4. Test żywotności komórek (szacowany czas: 4 godziny dziennie)
    1. Przygotowuj roztwory testowe z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych odczynników zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Aspiruj media w dniach 1, 4, 7 i 14. Dodaj odczynnik do dołków i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 godziny zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Odczytuj fluorescencję przy wzbudzeniu/emisji 560/590 nm za pomocą czytnika płyt. Oblicz różnicę procentową za pomocą następującego równania:
      [(próbka fluorescencyjna –blank fluorescencyjny) /blank fluorescencyjny] x 100

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tkanki decelularizowane zostały przygotowane według wcześniej ustalonych protokołów z niewielkimi modyfikacjami26,27. Po decelularyzacji, liofilizacji i trawieniu powstały hydrożele kompozytowe nerwowe o stosunkach SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 oraz hydrożele wyłącznie rdzenia kręgowego (Rysunek 1). Usunięcie komponentów jądrowych potwierdzono za pomocą barwienia H&E (Rysunek 2A). Aby ilościowo ocenić decelulary...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powszechnie uważa się, że patofizjologia rdzenia rdzeniowego jest złożona i wielowymiarowa. Chociaż pojedyncze terapie, takie jak transplantacja komórek, podawanie leków czy biomateriały, dostarczyły cennych informacji o SCI, skomplikowany charakter SCI może ograniczać ich indywidualną skuteczność 28,29,30,31. W związku z tym wzrosły wysiłki na rzecz opracowania skutecznych terapii kombinatoryc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez PhRMA Foundation oraz National Institutes of Health poprzez nagrodę o numerze P20GM139768 i R15NS121884 przyznanych YS. Chcemy podziękować dr Kartikowi Balachandranowi oraz dr Raj Rao z Wydziału Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Arkansas za umożliwienie nam korzystania z ich sprzętu. Chcemy również podziękować dr Jin-Woo Kimowi oraz panu Patrickowi Kuczwarze z Wydziału Inżynierii Biologicznej i Rolniczej Uniwersytetu Arkansas za szkolenie z zakresu reometru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solena wewnętrzna 3-(Decyldimetylamonio)propanowego sulfonianuSigma-AldrichD4266Stosowane podczas decelularyzacji nerwu kulszowego, SB-10
3-(N,N-Dimetylpalmitylammonio)sulfonian propanuSigma-AldrichH6883Stosowany podczas decellularyzacji nerwu kulszowego, SB-16
Odczynnik AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Stosowane podczas testu wiejlności komórek AlamaBlue
Chondroitinaza ABCSigma-AldrichC3667Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego
KriostatLeicaCM1860
DeoksyrybonuklazaSigma-AldrichD4263Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego
Heptahydrat fosforanu sodowegoVWRBDH9296Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego
DNeasy Blood & Zestaw do produkcji chusteczekQiagen69506Wykorzystywane podczas analizy DNA
Montaż Dpx do histologii, medium montażowe na zamkuSigma-Aldrich6522Używany podczas H& Barwienie E
EozynąSigma-AldrichHT110216Używany podczas H& Barwienie E
EtanolVWR89125-172
FormaldehydSigma-Aldrich252549Używany podczas H& Barwienie E
Glutaraldehyd (GA)Sigma-AldrichG6257Stosowane podczas funkcjonalizacji powierzchni PDMS
Medium wzrostu hASCLonzaPT-4505Stosowany do hodowli hASC, zawierających surowicę płodową bydła oraz penicylinę/streptomycynę
HematoksylinąVWR26041-06Używany podczas H& Barwienie E
Komórka macierzysta pochodząca z ludzkiego tłuszczuLonzaPT-5006
Kwas solny (HCl)Sigma-Aldrich320331Używany do trawienia zdecelularyzowanych tkanek i korygowania roztworów preżeli
Medium M199Sigma-AldrichM0650Używany do rozcieńczania preżeli do pożądanego stężenia
Optymalna mieszanka temperatualnaTissue-Tek4583
PepsynaSigma-AldrichP7000Wykorzystywane do trawienia zdecelularyzowanych tkanek
Kwas nadoctowyLab AlleyPAA1001Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)VWR97062-948
Czytnik tablicBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polietyleimina (PEI)Sigma-Aldrich181978Stosowane podczas funkcjonalizacji powierzchni PDMS
Nerw kulszowy wieprzowyTissue Source LLCŻywe świnie, bez danych identyfikowalnych i bez szczegółów dotyczących śledzenia
Rdzeń kręgowy u wieprzowinkiTissue Source LLCŻywe świnie, bez danych identyfikowalnych i bez szczegółów dotyczących śledzenia
System dsDNA QuantiFluorPromegaE2670Wykorzystywane do analizy zawartości DNA
RheometrTA InstrumentsDHR 2
Wytrzymały rotatorGlas-co099A RD4512Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego
Chlorek sodu (NaCl)VWRBDH9286Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego
Deoksycholatan soduSigma-AldrichD6750
Monohydrat diwodrowego soduVWRBDH9298Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego
Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)Sigma-Aldrich415443Stosowany do regulacji roztworów preżeli
SU-8Materiały zaawansowane do kajakuSU8-100Używane do pokrywania płytki krzemowej
SacharozaSigma-AldrichS8501Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego
Zestaw Sylgard 184 silikonowego elastomeruDOW1317318Polidimetyloksyloksanu (PDMS) baza i środek utwardzający
Triton X-100Sigma-AldrichX100Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermo Fisher25300062Stosowane podczas pracy z hASC oraz podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego
Rotator rewolweru rurowegoThermo Fisher88881001Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego
KsylenVWRMK866816Używany podczas H& Barwienie E

Bibliografia

  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Hydrożele decelularyzowanemacierz zewnątrzkomórkowatransplantacja komórekludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z tkanki tłuszczowejinżynieria tkankowaneuroregeneracjacharakterystyka hydrożeli
Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.