Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Implantacja zarodka to pierwszy krok do udanej ciąży. Model implantacji zarodka in vitro ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań biologicznych, opracowywania leków i badań przesiewowych. W artykule przedstawiono prosty, szybki i wysoce wydajny model implantacji zarodków in vitro. W tym protokole najpierw wprowadzamy akwizycję blastocysty myszy i preparat ludzkich komórek gruczolakoraka endometrium (Ishikawa) do implantacji, a następnie metodę kohodowli zarodków myszy i komórek Ishikawy. Na koniec przeprowadziliśmy badanie mające na celu ocenę wpływu różnych stężeń 17-β-estradiolu (E2) i progesteronu (P4) na wskaźniki adhezji zarodków w oparciu o ten model. Nasze odkrycia wykazały, że wysokie stężeniaE2 znacznie zmniejszyły adhezję zarodków, podczas gdy dodanie progesteronu może przywrócić wskaźnik adhezji. Model ten oferuje prostą i szybką platformę do oceny i badań przesiewowych cząsteczek biorących udział w procesie adhezji, takich jak cytokiny, leki i czynniki transkrypcyjne kontrolujące implantację i receptywność endometrium.
Wprowadzenie
Implantacja zarodka, pierwszy krok udanej ciąży, jest kluczowa dla zrozumienia jej biologicznych podstaw i sprostania wyzwaniom związanym z niepłodnością. Jednak ograniczenia etyczne stanowią poważne ograniczenia w pobieraniu klinicznych próbek zarodków ludzkich, utrudniając badania nad skomplikowanymi interakcjami między ludzkimi embrionami a endometrium we wczesnej ciąży1. Dogłębne zrozumienie tych złożonych mechanizmów jest niezbędne do postępu w podstawowych badaniach biologicznych, odkrywaniu leków i zdrowiu reprodukcyjnym.
Poprzednie modele in vitro wykorzystywały modele adhezyjne, w których jednowarstwowe ludzkie komórki nabłonka endometrium (RL95-2)2 były hodowane wspólnie z embrionalnymi substytutami, takimi jak BeWo, JAr, lub Jeg-33 komórki raka kosmówki. Niemniej jednak wybór wielkości sferoid, w zakresie 70-100 μm, był kluczowy, ponieważ większe lub mniejsze agregaty komórkowe mogły zagrozić dokładności eksperymentu. Warto zauważyć, że tylko 25% sferoid w każdym preparacie spełniało normę dla odpowiedniego rozmiaru4, a różnice były znaczące w porównaniu z warunkami fizjologicznymi blastocyst.
Ponadto, trójwymiarowe (3D) systemy hodowli endometrium i blastocysty oferują bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko5, ale wymagają wysokiej wiedzy technicznej, powolnego wzrostu komórek, wysokich kosztów zasobów i utrzymania, trudności w standaryzacji i niskiej odtwarzalności6.
W tym protokole prezentujemy opłacalny i szybki model implantacji zarodka in vitro, który może być opracowany i wykorzystany w większości laboratoriów. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie wiarygodnej i powtarzalnej platformy do badania interakcji między zarodkami a endometrium w kontrolowanym środowisku. Poprzez symulację kluczowych zdarzeń związanych z implantacją zarodka in vitro, model ten ma na celu wypełnienie luki między modelami zwierzęcymi a warunkami klinicznymi, umożliwiając bardziej precyzyjne i ukierunkowane badania.
W porównaniu do substytutów embrionalnych, użycie blastocyst myszy oferuje bardziej fizjologicznie istotną reprezentację procesu implantacji zarodka in vivo7. Ponadto linia komórkowa Ishikawy, wywodząca się z ludzkiego gruczolakoraka endometrium, posiada mieszane cechy nabłonka gruczołowego i nabłonka światła macicy1, umożliwiając ekspresję enzymów, białek strukturalnych i funkcjonalnych receptorów steroidowych podobnych do tych znajdujących się w normalnym endometrium, zapewniając w ten sposób fizjologicznie istotny substrat do implantacji zarodka. Prostota i szybkość systemu kohodowli umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe i testy na obecność narkotyków8,9,10. Zapewniając solidną i powtarzalną platformę, metoda ta daje możliwość pogłębienia naszej wiedzy na temat implantacji zarodków i jej wpływu na zdrowie człowieka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania eksperymentalne na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zwierząt Instytutu Technologii Biomedycznych i Farmaceutycznych w Szanghaju. Zapewnij procedury bezpieczeństwa: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z chemikaliami lub materiałami biologicznymi.
1. Pozyskiwanie embrionów myszy
UWAGA: Ta sekcja opisuje proces pozyskiwania embrionów myszy. Dorosłe samice myszy (6-8 tygodni, hybrydy C57BL/6 i DBA/2) utrzymywano w standardowych warunkach środowiskowych 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w temperaturze 20-25 °C i wilgotności 40-60% z pożywieniem i wodą dostarczaną ad libitum.
- Samicom myszy wstrzyknąć dootrzewnowo 10 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG), a następnie wstrzyknąć 10 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w odstępie 42-48 godzin.
- Połącz każdą samicę myszy z samcem w podobnym wieku i sprawdź, czy następnego ranka nie ma czopa dopochwowego.
UWAGA: Korek dopochwowy to jasnożółta grudka czopka powstała po zestaleniu się nasienia w otworze pochwy. - Poddaj eutanazji samice myszy za pomocą czopów dopochwowych przez wdychanie CO2 .
- Otwórz brzuch i zlokalizuj żeńskie narządy płciowe; rozciągnij jajowód, jajnik i poduszeczki tłuszczowe za pomocą kleszczy; przetnij jajowód i jajnik nożyczkami; a następnie przetnij jajowód i macicę (Rysunek 1).
- Otrzymany jajowód przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wstępnie wypełnioną pożywką M2.
UWAGA: Pożywkę M2 należy podgrzewać w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 30 minut. - Nakłuć powiększoną bańkę jajowodu igłą 25 G, aby uwolnić lub uszczypnąć kompleks wzgórko-zygotowy (Ryc. 2).
- Za pomocą kleszczy przenieś kompleks wzgórka-zygota do roztworu M2 zawierającego 0,5 mg/ml hialuronidazy i inkubuj przez kilka minut, aż komórki wzgórka ulegną dysocjacji (Ryc. 3).
- Zebrać zygoty za pomocą pipety do przenoszenia jaj i umyć je w pożywce M2 zawierającej 4 mg/ml BSA w celu usunięcia pozostałości hialuronidazy, komórek wzgórka i zanieczyszczeń.
2. Hodowla in vitro zarodka myszy
UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje proces hodowli in vitro embrionów myszy od zygot do blastocyst. Mikrokrople do hodowli KSOM należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem, aby zapewnić równowagę temperaturową i gazową.
- Przygotować 12 mikrokropelek pożywki KSOM o objętości 20 μl każda na dnie szalki Petriego o średnicy 35 mm. Przykryj mikrokropelki 3-5 ml oleju mineralnego (Rysunek 4) i umieść szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zrównoważenia.
- Przenieś zarodki myszy z pożywki M2 na pożywkę KSOM za pomocą pipety transferowej w celu dokładnego umycia.
UWAGA: Ten krok wymaga mikroskopu stereoskopowego z podgrzewaniem o temperaturze 37 °C stage. Zminimalizuj czas obchodzenia się z zarodkami poza inkubatorem. - Umyte zarodki umieścić w przygotowanych mikrokropelkach KSOM i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni.
UWAGA: Aby zapewnić odpowiednie odżywianie, należy wyhodować 5-10 zarodków na 20 μL mikrokropli. - Wybierz korzystne blastocysty w zależności od ich wielkości (100-130 μm), wewnętrznej masy komórkowej (wewnętrzna masa komórkowa składa się z wielu komórek, które są zbite), liczby komórek trofoblastu (trofektoderma składa się z wielu komórek, które są spoiste i upakowane razem) oraz stopnia ekspansji (blastocoel zajmuje 80-100% zarodka).
3. Przygotowanie komórek endometrium
- Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego odessać 1 ml 2% żelatyny za pomocą pipety i dozować do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie obróć płytkę, aby zapewnić całkowite pokrycie dna żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Następnie odessać nadmiar żelatyny i pozostawić spód płytki do całkowitego wyschnięcia.
- Po zakończeniu procesu powlekania należy wyhodować ludzkie komórki gruczolakoraka endometrium (Ishikawa) za pomocą DMEM/F12 (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów), 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny i 100 IU / ml penicyliny, wysiewać je na pokrytych żelatyną 12-dołkowych płytkach (2 × 105komórek/dołk) i inkubować przez 24 godziny.
4. Przyczepienie zarodka
- Delikatnie umieść 5-15 świeżych blastocyst w każdym dołku 12-dołkowej płytki zawierającej komórki Ishikawy przygotowane w poprzednim kroku do wspólnej hodowli (Ryc. 5).
- Po 48 godzinach inkubacji obserwuj zarodki pod mikroskopem, aby ocenić ich stan przyczepienia. Aby zaobserwować przyczepienie się zarodka, szybko przesuń płytkę trzy razy. Nieprzyłączone zarodki będą wykazywać ruch unoszący się lub toczący się po powierzchni komórek Ishikawy.
- Obliczyć wskaźnik zagnieżdżenia się zarodka za pomocą równania (1); użyć wskaźnika adhezji zarodka do przedstawienia efektu implantacji.
Wskaźnik implantacji zarodków = (Dołączone zarodki/Całkowita liczba zagnieżdżonych zarodków) × 100% (1)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W procesie technik wspomaganego rozrodu kluczowym etapem jest kontrolowana hiperstymulacja owulacji (COH), która prowadzi do znaczącego podniesienia poziomu estrogenów u pacjentek, przekraczającego 10-20 krotnie wartości występujące w cyklach naturalnych11. W tym kontekście postanowiliśmy sprawdzić, czy wysokie stężenia estrogenów w surowicy wpływają na implantację zarodków podczas świeżego transferu zarodków. W oparciu o ten model implantacji zarodków zbadaliśmy wpływ różnych stężeń E2...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Prostota i szybkość proponowanego modelu implantacji zarodków in vitro oferuje niezwykłe korzyści w badaniach przesiewowych leków na wczesnym etapie i innych zastosowaniach badawczych. Prosty protokół, w połączeniu z wysokoprzepustowym charakterem linii komórkowych Ishikawy, sprawia, że jest to idealny kandydat do badań przesiewowych na dużą skalę, szczególnie na wczesnych etapach odkrywania leków. Liang13 odkrył, że knockdown TAGLN2 zmniejszył zdolność do inwazji komórek trofoblastu. Gre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów finansowych lub innych.
Podziękowania
Nasze badania były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82171603), Fundację Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (202140341), Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (23JC1403803) oraz Program Promocji Innowacji NHC i Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | Najsilniejszy hormon estrogenny ssaków |
| BD Falcon | BD | 353001 | Bakteriologiczne szalki Petriego Styl 35 x 10 mm ze szczelną pokrywą, krystaliczny polistyren pierwotny, sterylny |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | ESCO | klasa  BSC | Operacje aseptyczne, przygotowywanie szalek hodowlanych, rozdzielanie odczynników itp |
| CO2 Inkubator | Thermo | 8000DH | Hodowla zarodków |
| Płytka | hodowlana Corning | 3506 | Hodowla komórkowa |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), płyn 1:1, zawiera L-glutaminę i 15 mM bufor HEPES |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10099141 | Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenie australijskie |
| Żelatyna | SIGMA | G9391 | Typ B, proszek, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe, 50 IU / ml |
| Hialuronidazy | SIGMA | V900833 | Klasa odczynnika, proszek |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Proszek, bez czerwieni fenolowej, 5 x 10 ml |
| L-glutaminy | Gibco | 25030081 | L-glutamina-200 mM (100x), płyn |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medium (1x), Płyn, z czerwienią fenolową |
| Olej mineralny | SIGMA | M8410 | nadaje się do stosowania jako warstwa wierzchnia do kontroli parowania i zanieczyszczenia krzyżowego w różnych zastosowaniach biologii molekularnej |
| Penicylina-Streptomycyna, płyn | Gibco | 15140122 | 10 000 jednostek penicyliny (zasada) i 10 000 jednostek streptomycyny (zasada), wykorzystując penicylinę G (sól sodowa) i siarczan streptomycyny w 0,85% soli |
| fizjologicznej PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe, 50 IU / ml |
| Progesteron | SIGMA | 5341 | Hormon steroidowy wydzielany przez ciałko żółte w drugiej połowie cyklu miesiączkowego |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360070 | Pirogronian sodu jest powszechnie dodawany do pożywki do hodowli komórkowych jako źródło węgla oprócz glukozy |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus | SZX7 | Pobieranie zarodków i obserwacja rozwoju zarodków |
Bibliografia
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
