Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różne procesy jądrowe, takie jak kontrola transkrypcji, zachodzą w dyskretnych strukturach znanych jako ogniska, które można dostrzec za pomocą techniki immunofluorescencji. Badanie dynamiki tych ognisk w różnych warunkach komórkowych za pomocą mikroskopii dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów molekularnych rządzących tożsamością i funkcjami komórkowymi. Jednak przeprowadzanie testów immunofluorescencyjnych na różnych typach komórek i ocena zmian w składaniu, dyfuzji i dystrybucji tych ognisk stanowi wiele wyzwań. Wyzwania te obejmują złożoność przygotowania próbek, określania parametrów analizy danych obrazowych oraz zarządzania znacznymi ilościami danych. Co więcej, istniejące procesy obrazowania są często dostosowane do potrzeb doświadczonych użytkowników, co ogranicza dostępność dla szerszego grona odbiorców.
W tym badaniu wprowadzamy zoptymalizowany protokół immunofluorescencji dostosowany do badania białek jądrowych w różnych typach ludzkich pierwotnych limfocytów T, które można dostosować do dowolnego interesującego białka i typu komórki. Ponadto przedstawiamy metodę bezstronnego ilościowego określania barwienia białek, niezależnie od tego, czy tworzą one wyraźne ogniska, czy wykazują rozproszony rozkład jądrowy.
Nasza proponowana metoda oferuje obszerny przewodnik, od barwienia komórkowego po analizę, wykorzystując półautomatyczny potok opracowany w Jython i wykonywalny na Fidżi. Ponadto udostępniamy przyjazny dla użytkownika skrypt Pythona, który usprawnia zarządzanie danymi, publicznie dostępny w notatniku Google Colab. Nasze podejście wykazało skuteczność w uzyskiwaniu wysoce pouczających analiz immunofluorescencyjnych dla białek o różnych wzorcach organizacji jądrowej w różnych kontekstach.
Wprowadzenie
Organizacja genomu eukariotycznego jest regulowana przez wiele warstw modyfikacji epigenetycznych1, koordynując kilka funkcji jądrowych, które mogą wystąpić w wyspecjalizowanych komorach zwanych ciałami jądrowymi lub kondensatami2. W ramach tych struktur procesy takie jak inicjacja transkrypcji3, przetwarzanie RNA4,5,6, naprawa DNA7,8, biogeneza rybosomów9,10,11, oraz regulacja heterochromatyny12,13 mają miejsce. Regulacja ciał jądrowych dostosowuje się zarówno w wymiarze przestrzennym, jak i czasowym, aby dostosować się do wymagań komórkowych, kierując się zasadami separacji faz14,15. W związku z tym ciała te funkcjonują jako przejściowe fabryki, w których funkcjonalne komponenty montują się i demontują, ulegając zmianom w wielkości i rozkładzie przestrzennym. W związku z tym zrozumienie cech białek jądrowych za pomocą mikroskopii, w tym ich skłonności do tworzenia ciał i ich rozmieszczenia przestrzennego w różnych warunkach komórkowych, dostarcza cennych informacji na temat ich ról funkcjonalnych. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowaną metodą badania białek jądrowych, umożliwiającą ich wykrywanie za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych lub bezpośredniej ekspresji celów za pomocą białka fluorescencyjnego reporter16,17.
W tym kontekście, ciała jądrowe wyglądają jak jasne ogniska lub puncta, z wyraźnym stopniem sferyczności, co czyni je łatwymi do odróżnienia od otaczającego środowiska16,18. Techniki superrozdzielcze, takie jak STORM i PALM, zapewniając lepszą rozdzielczość (do 10 nm)19, umożliwiają bardziej precyzyjną charakterystykę struktury i składu określonych kondensatów20. Ich dostępność jest jednak ograniczona wydatkami na sprzęt i specjalistycznymi umiejętnościami potrzebnymi do analizy danych. Dlatego mikroskopia konfokalna pozostaje popularna ze względu na korzystną równowagę między rozdzielczością a szerszym zastosowaniem. Taka popularność jest ułatwiona dzięki nieodłącznemu usuwaniu nieostrego światła, co zmniejsza zapotrzebowanie na obszerne procedury przetwarzania końcowego w celu dokładnej segmentacji, jego powszechnej dostępności w instytutach badawczych, efektywnego czasu akwizycji i przygotowania próbki, które jest zwykle wydajne. Jednak dokładny pomiar dystrybucji, składania lub dyfuzji białek za pomocą testów immunofluorescencyjnych w różnych warunkach komórkowych stanowi wyzwanie, ponieważ w wielu istniejących metodach brakuje wskazówek dotyczących wyboru odpowiednich parametrów dla białek o różnych wzorcach dystrybucji21. Co więcej, obsługa powstałej w ten sposób dużej ilości danych może być zniechęcająca dla użytkowników z ograniczonym doświadczeniem w analizie danych, potencjalnie zagrażając biologicznemu znaczeniu wyników.
Aby sprostać tym wyzwaniom, wprowadzamy szczegółowy protokół krok po kroku do przygotowania immunofluorescencji i analizy danych, mający na celu zapewnienie bezstronnej metody ilościowego oznaczania barwienia białek za pomocą różnych wzorców organizacji (Rysunek 1). Ten półautomatyczny potok jest przeznaczony dla użytkowników o ograniczonej wiedzy specjalistycznej w zakresie analizy obliczeniowej i obrazowej. Łączy w sobie funkcje dwóch uznanych wtyczek Fidżi: FindFoci22 i 3D suite23. Integrując możliwości precyzyjnej identyfikacji ognisk FindFoci z funkcjami identyfikacji obiektów i segmentacji w przestrzeni 3D oferowaną przez pakiet 3D, nasze podejście generuje dwa pliki CSV na kanał dla każdego pola akwizycji. Pliki te zawierają informacje uzupełniające, które ułatwiają obliczanie metryk odpowiednich dla różnych typów dystrybucji sygnałów, takich jak liczba ognisk na komórkę, odległość ognisk od centroidu jądrowego oraz współczynnik niejednorodności (IC), który wprowadziliśmy dla dyfuzyjnego barwienia białek. Ponadto zdajemy sobie sprawę, że ekstrapolacja danych może być czasochłonna dla użytkowników o ograniczonych umiejętnościach w zakresie obsługi danych. Aby usprawnić ten proces, udostępniamy skrypt w języku Python, który automatycznie kompiluje wszystkie zebrane pomiary w jednym pliku dla każdego eksperymentu. Użytkownicy mogą wykonać ten skrypt bez konieczności instalowania jakiegokolwiek oprogramowania języka programowania. Udostępniamy kod wykonywalny na Google Colab, platformie opartej na chmurze, która umożliwia pisanie skryptów Pythona bezpośrednio w przeglądarce. Dzięki temu nasza metoda jest intuicyjna i łatwo dostępna do natychmiastowego użycia.
Wykazujemy skuteczność naszego protokołu w analizie i ilościowym określaniu zmian w dystrybucji sygnału dwóch białek jądrowych: białka zawierającego bromodomenę 4 (BRD4) i supresora zeste-12 (SUZ12). BRD4 jest dobrze udokumentowanym białkiem koaktywującym w kompleksie Mediator, o którym wiadomo, że tworzy kondensaty związane z inicjacją transkrypcji zależną od polimerazy II24,25. SUZ12 jest składnikiem białkowym kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2) odpowiedzialnym za regulację odkładania modyfikacji histonów H3K27me326,27. Białka te wykazują różne wzorce w dwóch różnych typach komórek: świeżo wyizolowanych ludzkich naiwnych limfocytach T CD4 +, które są w stanie spoczynku i wykazują powolne tempo aktywności transkrypcyjnej, oraz zróżnicowanych in vitro komórkach TH1 CD4 +, które są wyspecjalizowanymi, proliferującymi komórkami efektorowymi wykazującymi zwiększoną transkrypcję28.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użycie próbek ludzkich do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Komisje Etyki Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Mediolan), a od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę (numery autoryzacji: 708_2020). Protokół jest podzielony na trzy podstawowe sekcje: wykonywanie immunofluorescencji, akwizycja obrazu i analiza obrazu. Średnio potrzeba 4 dni roboczych na ukończenie (Rysunek 1).
1. Preparat immunofluorescencyjny
UWAGA: Ten protokół immunofluorescencji można łatwo dostosować do różnych typów komórek i celów białkowych, dostosowując warunki fiksacji i przepuszczalności. Przygotowanie immunofluorescencyjne trwa zazwyczaj krócej niż 3 dni, przy czym czas trwania inkubacji przeciwciał pierwotnych różni się w zależności od jakości przeciwciała i białka docelowego (Rysunek 1).
- Przygotowanie próbki
- Wyizolować ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przez wirowanie w gradiencie gęstości za pomocą pożywki o gęstości około 1,077 g/ml zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów).
- Wyizolować limfocyty T CD4+ z PBMC za pomocą kulek magnetycznych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
- Wybarwić komórki przeciwciałami dla CD4, CD45RA i CD45RO (tabela materiałów) i przystąpić do sortowania FACS naiwnych limfocytów T CD4 + jako komórek T CD4 + / CD45RA + / CD45RO, zgodnie z opisem w innym miejscu29,30.
UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami sortera FACS używanego w tym protokole. - Indukuj różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + w T pomocniczy 1 (komórki TH1 CD4 +), jak opisano w 29. Krótko mówiąc, posadź 1,5 x 106 komórek / ml naiwnych limfocytów T CD4 + posortowanych przez FACS w pożywceT H1, stymulując je kulkami magnetycznymi anty-CD3 / anty-CD28 w stosunku 1: 1. Policz komórki i podziel je, gdy osiągną 1,5 × 106 komórek/ml co 2-3 dni (patrz Tabela 1 dla składu pożywkiT H1).
- Oceń wydzielanie cytokin funkcji efektorowej po 7 dniach różnicowania, zgodnie z opisem w 29.
- Utrwalanie i przenikanie komórek
UWAGA: Wszystkie te procedury zostały opisane w 30,31 z niewielkimi dostosowaniami.- Aby zapewnić optymalną przyczepność komórek, szkiełka nakrywkowe (10 mm, grubość 1,5 H) należy traktować roztworem powlekającym (tabela 1) w następujący sposób:
- Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe, najpierw myjąc je wodą destylowaną (ddH2O), a następnie spłucz 70% etanolem (EtOH) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
- Umieść umyte szkiełka nakrywkowe w 24-dołkowej płytce dla etapów 1.2.1.3-1.3.
- Nanieś kroplę 200 μl roztworu powlekającego na szklane szkiełko nakrywkowe. Po 5 minutach usuń kroplę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
- Umyj szkiełka nakrywkowe, nakładając kroplę 200 μl ddH2O. Po 5 minutach usuń kroplę i wysusz na powietrzu.
- Powtórz 3 x kroki 1.2.1.3-1.2.1.4.
- Ponownie zawiesić naiwne limfocyty T CD4 + i komórkiT H1 CD4 + w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przy stężeniu 2 × 106 komórek/ml.
UWAGA: Wskazane stężenie jest zalecane szczególnie dla małych komórek, takich jak ludzkie pierwotne limfocyty T. W przypadku ogniw adherentnych obróbka powłoki szklanej nie jest konieczna. Zamiast tego należy przystąpić bezpośrednio do hodowli komórek na powierzchni szkła przy użyciu odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych. - Nanieść 200 μl kropli zawiesiny komórek na szklane szkiełko nakrywkowe. Pozwól komórkom wysiać się w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut; Następnie usuń kroplę.
- Utrwalić komórki świeżo przefiltrowanym 3% paraformaldehydem (roztwór PFA, Tabela 1) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szklane szkiełko nakrywkowe TPBS (tabela 1) przez 3 x 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć TPBS i dodać roztwór do przepuszczalności (Tabela 1) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odrzucić roztwór permeabilizacyjny i inkubować próbkę w roztworze do przechowywania (tabela 1) przez 1 godzinę do nocy (ON) w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Na tym etapie protokół można bezpiecznie zatrzymać, a szklane szkiełka nakrywkowe można przechowywać w roztworze do przechowywania na 24-dołkowej płytce przez 3-4 tygodnie.
- Aby zapewnić optymalną przyczepność komórek, szkiełka nakrywkowe (10 mm, grubość 1,5 H) należy traktować roztworem powlekającym (tabela 1) w następujący sposób:
- Immunofluorescencji
- (Opcjonalnie) Usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i szybko zamrozić na suchym lodzie przez 30 s, rozmrozić w temperaturze suchej masy, a następnie umyć szklane szkiełko nakrywkowe w wstępnie napełnionym dołku roztworem do przechowywania.
- (Opcjonalnie) Powtórz 3 x krok 1.3.1.
- Myć w roztworze przepuszczalnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj przez 2 x 5 min z TPBS w RT.
- Inkubować w 0,1 N HCl przez 12 minut w temperaturze pokojowej.
- Wykonaj dwa szybkie mycia w 1x PBS.
UWAGA: Określone warunki przenikania komórek, w tym etapy zamrażania i rozmrażania oraz traktowanie HCl, są optymalne do barwienia składników jądrowych w komórkach charakteryzujących się gęsto upakowaną chromatyną. Jednak w przypadku komórek charakteryzujących się mniej zagęszczoną chromatyną zaleca się ograniczenie lub unikanie tych kroków. Dodatkowo, w celu celowania w składniki cytoplazmatyczne, należy rozważyć zmniejszenie lub wyeliminowanie leczenia HCl. - Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym (BRD4, 1:500 lub SUZ12, 1:100) rozcieńczonym w buforze do rozcieńczania przeciwciał (Tabela 1) (200 μl na każde szklane szkiełko nakrywkowe) w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Immunofluorescencję można przeprowadzić przez multipleksowanie więcej niż jednego przeciwciała pierwszorzędowego, w zależności od potrzeb eksperymentalnych, przeciwciał drugorzędowych i systemów wykrywania. - Myć 3 x 5 min PBS-T (Tabela 1) w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem.
- Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze do rozcieńczania przeciwciał (200 μl na każde szklane szkiełko nakrywkowe) przez 1 godzinę w temperaturze RT.
UWAGA: Należy wybrać przeciwciało drugorzędowe, które najlepiej odpowiada potrzebom eksperymentu i dostępnym systemom wykrywania. Należy upewnić się, że każde przeciwciało drugorzędowe jest ukierunkowane na gatunek, z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe. Dodatkowo należy wybrać fluorofory, które są kompatybilne z filtrami i źródłem światła mikroskopu. Bardzo ważne jest, aby uniknąć nakładania się widma między wybranym fluoroforem a widmem emisyjnym barwienia jądrowego. - Myć 3 x 5 min PBS-T w temperaturze RT z łagodnym wstrząsaniem.
- Barwienie 1 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w 1x PBS przez 5 minut w RT.
UWAGA: Alternatywne barwniki mogą być stosowane do barwienia jądrowego, o ile nie pokrywają się z widmem emisyjnym przeciwciał drugorzędowych. - Wykonaj kilka szybkich prań w 1x PBS.
- Zamontuj szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym z nośnikiem mocującym zapobiegającym blaknięciu.
2. Akwizycja obrazu
UWAGA: Czas pozyskiwania obrazu zależy od instrumentu i wybranych ustawień.
- Akwizycja mikroskopu konfokalnego
- Rejestruj obrazy 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego, ustawiając rozmiar kroku 0,25 μm w z i rozmiar piksela 0,1-0,2 μm.
UWAGA: Aby osiągnąć optymalną rozdzielczość ograniczoną dyfrakcją światła w naszym obiektywie olejowym 63x 1,4 NA, ustawiliśmy rozmiar otworka na 0,8 AU, średnią liniową 2x, a rozmiar klatki 1024 × 1024 pikseli. Laser wzbudzający, jak również sekwencja akwizycji kanałów, zostały celowo dobrane, aby zapobiec zakłóceniom lub przesłuchom między używanymi fluoroforami. Jednak regulacja parametrów powinna być dostosowana do konkretnej charakterystyki mikroskopu i próbki. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami mikroskopu konfokalnego używanego w tym protokole. - Uzyskaj stałą liczbę losowych pól, aby objąć około 50 komórek na kontrpróbę biologiczną.
- Rejestruj obrazy 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego, ustawiając rozmiar kroku 0,25 μm w z i rozmiar piksela 0,1-0,2 μm.
3. Analiza obrazu
- Instalacja oprogramowania
- Pobierz i zainstaluj najnowszą dostępną wersję Fiji z oficjalnej strony pobierania Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
- Zainstaluj pakiet 3D Suite za pośrednictwem witryny aktualizacji Fiji lub ręcznie, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na stronie internetowej 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
- Zainstaluj GDSC (FindFoci) za pośrednictwem witryny aktualizacji Fidżi lub ręcznie, postępując zgodnie z instrukcjami w repozytorium GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
- Konwersja TIFF
- Pobierz skrypt "convert_to_TIFF.py" (plik uzupełniający 1).
- Przeciągnij i upuść skrypt na Fidżi i uruchom kod.
- W wyświetlonym panelu przejdź do ścieżki, w której jest przechowywany eksperyment. Podfolder zawierający przekonwertowane pliki TIFF jest tworzony w tym samym folderze eksperymentu.
- Zainicjuj ustawienia w Menedżerze 3D.
- Otwórz panel opcji Menedżer 3D, klikając Wtyczki | 3DSuite | Opcje Menedżera 3D.
- W oknie opcji Menedżer 3D zaznacz pola wyboru odpowiadające następującym pomiarom: Objętość (jednostka), Średnia wartość szarości, Obwiednia (pix), Standardowa wartość odcienia szarości deweloperskiej, Środek ciężkości (piksel) i Środek ciężkości (jednostka).
- Zaznacz następujące opcje: Wyklucz obiekty na krawędziach XY i Wyklucz obiekty na krawędziach Z i kliknij OK.
UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko raz, aby wstępnie skonfigurować metryki, które będą przechowywane w plikach informacji przestrzennych i ilościowych. Wybrane metryki są niezbędne do zapewnienia prawidłowego funkcjonowania pipeline'u. W tym kroku można uwzględnić opcjonalne dodatkowe metryki, zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w sekcji Dyskusja.
- Ustaw parametry w FindFoci GUI.
UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko raz, aby skonfigurować półautomatyczny potok z optymalnymi parametrami, które następnie zostaną włączone do skryptów.- Otwórz obraz testowy. Zduplikuj kanał białka, w tym stos (Ctrl + Shift + D), zaznacz pole wyboru hyperstack i określ odpowiedni numer kanału w polu Kanały (c), a następnie zmień jego odpowiednią nazwę.
- Uruchom rejestrator makr Fidżi, przechodząc do Wtyczki | Makra | Rekord.
- Otwórz wtyczkę FindFoci (kliknij Wtyczki | GDSC | FindFoci | FindFoci GUI) i wybierz obraz do analizy z menu rozwijanego "Obraz".
- Ustaw parametry w następujący sposób (Rysunek 2A): Rozmycie gaussowskie = 1,5; metoda tła = SD powyżej średniej; parametr tła = 9; metoda wyszukiwania = ułamek piku - tło; parametr wyszukiwania = 0,7; metoda piku = względna nad tłem; parametr piku = 0,2; minimalny rozmiar = 5; maksymalne piki = 1 000 000,
UWAGA: Wskazane parametry zostały dobrane na podstawie naszych studiów przypadków i mogą nie być odpowiednie do innych procedur barwienia. - Aby poprawić identyfikację ognisk, dostosuj następujące parametry:
- Rozmycie gaussowskie określa zakres wygładzania w celu uzyskania lepszych ognisk segmentowych. Trzymaj go blisko średnicy ognisk (pikseli).
- Parametr tła ustawia próg, aby odróżnić tło od sygnału ognisk. Zwiększ wartości, aby nałożyć bardziej rygorystyczne progi.
- Parametr wyszukiwania określa procent fluorescencji od piku, który jest uwzględniany w rozpoznawaniu sygnału. Zmniejsz wartości, aby uwzględnić obszary bardziej oddalone od piku fluorescencji.
- Parametr piku określa stopień, w jakim dwa szczyty sygnału są uważane za ciągłe lub rozdzielone. Zmniejszenie wartości spowoduje rozdzielenie pików.
- Maksymalna liczba pików określa maksymalną liczbę możliwych do zidentyfikowania ognisk. Ustaw wysokie liczby, aby uwzględnić wszystkie ogniska na obrazie.
- Uruchom FindFoci i skopiuj ciąg, który pojawi się w oknie rejestratora (Krok 3.4.2, Rysunek 2B), który zawiera wybrane parametry, z wyłączeniem cudzysłowów. Aby uzyskać więcej informacji na temat ustawień, zapoznaj się z instrukcją obsługi wtyczki 22.
- Linia kwantyfikacji białek jądrowych
- Pobierz skrypt "nuclear_prot_q.py" (Plik uzupełniający 2).
- Przeciągnij i upuść skrypt na Fidżi i kliknij uruchom, aby wykonać kod.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami w wyświetlonym oknie dialogowym, aby przetworzyć obrazy.
- Kanał jądra: wprowadź numer odpowiadający kanałowi DAPI (lub dowolnemu barwieniu jądrowemu).
- Rozmycie gaussowskie jądra: wprowadź wartość sigma potrzebną do rozmycia obrazu do segmentacji.
UWAGA: Utrzymuj ten parametr bliżej średnicy jądra (tj. 5-6 μm). Wyższe wartości sigma są wskazane w przypadku barwienia niejednorodnego. - Kanał białkowy: wprowadź numer odpowiadający kanałowi interesującego nas barwienia.
- Parametr FindFoci: wklej ciąg uzyskany z kroku nagrywania makr we fragmencie 3.4.6 (Rysunek 2B).
- (Opcjonalnie) Kontrola jakości: sprawdź jakość segmentowanych jąder. Spowoduje to wstrzymanie skryptu i umożliwi ręczne sprawdzenie każdego wygenerowanego obszaru zainteresowania jądrowego (ROI).
- Wybierz katalog obrazów: kliknij przycisk Przeglądaj, aby przejść do folderu zawierającego pliki TIFF do analizy.
- Po skompilowaniu wszystkich pól kliknij przycisk OK, aby kontynuować wykonywanie.
- Jeśli jądro nie jest prawidłowo podzielone na segmenty i nie spełnia wymagań jakościowych, usuń je lub zmodyfikuj, jak wskazano w Rysunek 2C.
- Sprawdź listę ROI w oknie ROIManager3D; jeśli lista jest pusta, wybierz okno scalania i kliknij Quantify 3D, aby odświeżyć menedżera. Następnie zamknij tabelę wyników Quantify 3D. Wybierz kanał jądra i kliknij Live-ROI do ON.
- Wybierz ROI należący do tego samego jądra i naciśnij Scal lub naciśnij Delete w przypadku niepożądanych jąder.
- Kliknij przycisk Zaznacz wszystko i kontynuuj analizę, klikając przycisk OK w oknie Sprawdzanie maski.
- Aby uzyskać wyniki, należy zajrzeć do folderu Kwantyfikacja w ścieżce pliku wskazanej w kroku 3.5.3.6, zawierającym plik txt z zapisami parametru użytego do analizy.
- Potok w Google Colab
- Pobierz notatnik "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (plik uzupełniający 3).
- Otwórz notatnik w Google Colab (https://colab.research.google.com/).
- Prześlij wszystkie foldery zawierające pliki .csv każdego pola obrazu do preferowanego folderu na Dysku Google.
- Wskaż w notesie ścieżkę folderu, w którym są przechowywane podfoldery wynikowe, i uruchom wszystkie komórki. Po zakończeniu kompilacji kodu końcowy plik arkusza kalkulacyjnego zawierający wszystkie skompilowane dane jest tworzony w tym samym folderze, w którym zostały przekazane pliki .csv.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany w niniejszej metodzie protokół umożliwia wizualizację i kwantyfikację zmian w barwieniu białek jądrowych w pierwotnych limfocytach T człowieka i może być dostosowany do różnych typów komórek oraz białek docelowych. W ramach studiów przypadku przeprowadzono i przeanalizowano barwienie białek BRD4 i SUZ12 w naiwnych limfocytach T orazH1 CD4+ komórki
BRD4 wykazuje punktowy wzór barwienia zarówno w spoczynczych naiwnych, jak i zróżnicowanych komórkach...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiono metodę przeprowadzania eksperymentów immunofluorescencyjnych na białkach jądrowych w ludzkich limfocytach T. Metoda ta zapewnia elastyczność w stosowaniu z różnymi typami komórek dzięki niewielkim modyfikacjom etapów fiksacji i przepuszczalności, jak opisano wcześniej30,31.
Nasz proces obrazowania opiera się na sprawdzonych technikach opisanych w literaturze, w szczególności na FindFoci i 3D Suite
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
R.V. współpracuje naukowo ze start-upem T-One Therapeutics Srl; B.B. i F.M. są współzałożycielami startupu T-One Therapeutics Srl; E.P. jest obecnie zatrudniony w T-One Therapeutics Srl; Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy za naukową i techniczną pomoc Zakładu Obrazowania INGM, w szczególności C. Cordiglieri i A. Fasciani, oraz sortowni INGM FACS, w szczególności M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Mediolan, Włochy). Dziękujemy M. Giannaccari za jego wsparcie techniczne i informatyczne. Praca ta została sfinansowana z następujących grantów: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) i Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) dla F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) oraz Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) dla B. Ur.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL probówki Safe-Lock | Eppendord | #0030121503 | Sekcja protokołu 1 |
| Pipety serologiczne 10 ml | VWR | #612-3700 | Sekcja protokołu 1 |
| 20 &mikro; L barierowa końcówka do pipety | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protokół sekcja 1 |
| 50 mL Polipropylenowa rurka stożkowa | Falcon | #352070 | Sekcja protokołu 1 |
| 200 &mikro; Końcówka do pipety barierowej L | Thermo Scientific | #2069-HR | Protokół sekcja 1 |
| roztwór zapobiegający blaknięciu - ProlongGlass - mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Krok 1.3.12 |
| BSA (albumina surowicy bydlęcej) | Sigma | #A7030 | Krok 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Zestaw do izolacji komórek | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Krok 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) | Zapraszam | kota#D1306 | Krok 1.3.10. |
| Suchy lód | Krok 1.3.1. | ||
| Dynabeads Ludzki aktywator T anty-CD3 / anty-CD28 koralik | Life Technologies | #1131D | kulki magnetyczne krok 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Krok 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Krok 1.1.3. Wyposażony w oprogramowanie BD FACSDiva w wersji 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bull Bour Serum) | Life Technologies | #10270106 | Krok 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Krok 1.1.1. |
| FIJI Wersja 2.14.0 | - | - | Sekcja protokołu 3 |
| Szkiełko nakrywkowe (10 mm, grubość 1,5 H) | Nauki o mikroskopii elektronowej | #72298-13 | Krok 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Krok 1.2.7-1.3.1. |
| Kozie przeciwciało anty-królicze AF568 drugorzędowe | Invitrogen | A11036 | Krok 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Krok 1.3.4. |
| ludzki neutralizujący anty-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Krok 1.1.4. |
| ludzka rekombinowana IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Krok 1.1.4. |
| ludzka rekombinowana IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Krok 1.1.4. |
| Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5 | Leica Microsystems-Protocol | sekcja 2, Wyposażony w obiektyw zanurzeniowy HCX PL APO 63x, 1,40 NA, z dodatkowym 3-krotnym zoomem. Rozmiar otworka: 0,8 AU. Średnia linii 2&razy;. Rozmiar ramy 1024 razy; 1024 pikseli. | |
| MEM Aminokwasy endogenne Solution | Life Technologies | #11140035 | Krok 1.1.4. |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | #631-1552 | Krok 1.3.12. |
| Mysi monoklonalny anty-ludzki CD4 APC-Cy7 (klon RPA-T4) | BD Bioscience | #557871 | Krok 1.1.3. |
| Mysi monoklonalny anty-ludzki CD45RA PECy5 (klon 5H9) | BD Bioscience | #552888 | Krok 1.1.3. |
| Mysi monoklonalny anty-ludzki CD45RO APC (klon UCHL1) | Miltenyi Biotec | # 130-113-546 | Krok 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Sekcja protokołu 1 |
| Normalna surowica kozia | Invitrogen | PCN5000 | Krok 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Sekcja protokołu 1 |
| Roztwór penicyliny/streptomycyny | Life Technologies | #15070063 | Krok 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Krok 1.2.4. |
| poli-L-lizyna | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe - BRD4 | Abcam | #ab128874 | Krok 1.3.6. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe - SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Krok 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Krok 1.1.4. |
| Technologie życia | pirogronianu sodu | #11360039 | Krok 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Krok 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Krok 1.3. |
| Pęseta | - | Protokół sekcja 1 |
Bibliografia
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
- Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225 (2021).
- Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
- Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
- Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646(2011).
- Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379(2019).
- Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562(2019).
- Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
- Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
- Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
- Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
- Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
- Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
- Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
- Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749(2014).
- Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), 3958(2018).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
- Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082(2021).
- Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
- Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
- Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
- Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
