Artykuł metodologiczny

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Streszczenie

Komary przenoszą patogeny, które negatywnie wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt. Lepsze zrozumienie ich biologii odżywiania się krwią oraz interakcji z żywicielami i patogenami może zostać wykorzystane do opracowania nowych celów w zakresie zwalczania chorób przenoszonych przez komary. Niestety, sondowanie (tj. gryzienie) zachowań komarów jest słabo poznane, ponieważ występują one w tkankach gospodarza. W tym miejscu opisano nieinwazyjną procedurę wykorzystującą elektropenetrację AC-DC (EPG) do pośredniej wizualizacji i ilościowego określenia zachowań żywieniowych komarów poprzez rejestrowanie zmian w sygnałach elektrycznych generowanych podczas sondowania i spożywania ludzkich rąk. Cienkie złote druty są przymocowane do komarów za pomocą przewodzącego srebrnego kleju i podłączone do instrumentu EPG. Ludzki gospodarz trzyma w ręku sondę napięcia substratu. Sondowanie gospodarza przez przewodowego komara zamyka obwód elektryczny, a sygnały elektryczne są rejestrowane na komputerze jako "przebiegi", które można następnie zmierzyć i zliczyć do analizy. Metodologia ta została wykorzystana do scharakteryzowania zachowań związanych z sondowaniem i połykaniem komarów Aedes aegypti i Culex tarsalis i może być stosowana do innych gatunków komarów. EPG może być używany do badania wpływu patogenów, insektycydów i innych czynników na zachowania żywieniowe komarów.

Wprowadzenie

Komary powodują cierpienie i straty ekonomiczne na całym świecie ze względu na swoją rolę jako wektory chorób i uciążliwe szkodniki1. Komary Anopheles przenoszą malarię, która rocznie powoduje około 219 milionów przypadków na całym świecie, ponad 400 000 zgonów2 i 12 miliardów dolarów amerykańskich kosztów bezpośrednich3. Komary Aedes są najbardziej znaczącymi wektorami o znaczeniu dla zdrowia publicznego, ponieważ są obecne niemal na całym świecie i przenoszą czynniki Chikungunya, gorączki denga, filariozy limfatycznej, gorączki doliny Rift, żółtej febry i Zika, które odbierają życie, przytłaczają systemy opieki zdrowotnej i powodują przewlekłe cierpienie, zachorowalność przez całe życie i niepełnosprawność4,5. Ponadto komary Culex przenoszą czynniki wywołujące zapalenie mózgu koni, japońskie zapalenie mózgu, filariozę limfatyczną, zapalenie mózgu Saint Louis i gorączkę Zachodniego Nilu, które wpływają zarówno na zdrowie ludzi, jak i zwierząt3,4.

Zwalczanie wektorów za pomocą metod opartych na insektycydach jest wiodącą metodą globalnego zwalczania chorób przenoszonych przez wektory6,7. Jednak liczba dostępnych środków owadobójczych do zwalczania komarów jest ograniczona. Ponadto u wielu gatunków, zwłaszcza u komarów z rodzaju Aedes, ewoluuje odporność na insektycydy, co wpływa na naszą zdolność do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory i zwiększa potrzebę nowych strategii zwalczania6,8. Lepsze zrozumienie biologii komarów, interakcji między komarem a gospodarzem i patogenem oraz procesów regulujących przenoszenie patogenów może ułatwić opracowanie nowych narzędzi do kontroli wektorów6.

Zachowania związane z sondowaniem i przyjmowaniem w tkankach gospodarza mogą wpływać na przenoszenie patogenów i patologię chorób9,10,11,12. Na przykład, więcej mikrofilarii zostało spożytych, gdy Aedes aegypti żywił się bezpośrednio z naczyń włosowatych, a nie gromadził krew na zewnątrz pękniętych naczyń krwionośnych13. W związku z tym podstawowe i stosowane badania na ten temat mogą pomóc w opracowaniu, udoskonaleniu i ocenie strategii zwalczania komarów i innych środków zaradczych w przenoszeniu patogenów. Istnieją jednak znaczne luki w wiedzy na temat tajemniczych zachowań związanych z odżywianiem krwią, które zachodzą pod powierzchnią skóry gospodarza, ponieważ zachowania te często wymagają inwazyjnych procedur na żywych modelach zwierzęcych lub wykorzystują przezroczyste sztuczne podłoża lub płynne diety9,11,14,15. Techniki nieinwazyjnej elektropenetracji (EPG; zwanej również wykresem penetracji elektrycznej) zostały wykorzystane do badania zachowań żywieniowych owadów żywiących się roślinami związanych z przenoszeniem patogenów roślinnych, odpornością roślin żywicielskich i sposobami działania insektycydów, ponieważ pozwalają one naukowcom pośrednio obserwować, rejestrować i określać ilościowo ruchy i zachowania aparatu gębowego, które zachodzą w tkankach gospodarza10,12.

Od lat pięćdziesiątych techniki elektronicznego monitorowania penetracji są stosowane do żywiących się krwią stawonogów, w tym komarów16,17,18,19,20. Jednak EPG nigdy nie został powszechnie przyjęty dla stawonogów żywiących się krwią, ponieważ aktywność biologiczna odpowiadająca kształtom fal nigdy nie została zweryfikowana21. Ponadto projekty i elektronika wczesnych instrumentów skutkowały nadmiernym naciskiem na niektóre sygnały elektryczne, wysokimi stosunkami szumu do sygnału, niską rozdzielczością i zniekształceniami przebiegów oraz podrażnieniem kręgowców hostów12,22. Nowsze urządzenie, monitor AC-DC EPG23, ma zmienne ustawienia i ulepszone przetwarzanie sygnału, dzięki czemu lepiej nadaje się do rejestrowania stawonogów żywiących się krwią i rozszyfrowywania biologicznego pochodzenia przebiegów w eksperymentalnych badaniach korelacji10,12.

Dla EPG, sygnał elektryczny jest podawany do hosta przez sondę napięcia podłoża (tj. elektrodę odniesienia). Stawonóg jest przymocowany do elektrody rejestrującej i umieszczony na żywicielu. Kiedy stawonóg wkłada swoje aparaty gębowe (tj. stylety) do żywiciela, sygnał elektryczny jest przesyłany do monitora AC-DC EPG w celu przetworzenia sygnału. Sygnały elektryczne są następnie wyświetlane na komputerze jako "przebiegi" odpowiadające określonym zachowaniom, takim jak ruchy aparatu gębowego, spożycie, wydzielanie śliny i pozyskiwanie/szczepienie patogenów10,12. Sekwencyjne i niesekwencyjne zmienne odpowiedzi związane z czasem trwania i liczbą przebiegów24,25 na różnych poziomach hierarchicznych (rodziny, typy i podtypy) można następnie obliczyć na podstawie częstotliwości i czasu trwania przebiegów, aby uzyskać wgląd w zachowania żywieniowe, które występują w obrębie gatunków i między gatunkami oraz w odpowiedzi na czynniki biotyczne i abiotyczne, takie jak żywiciele, patogeny, pestycydy i warunki środowiskowe10,12.

Do tej pory monitor AC-DC EPG był używany do charakteryzowania zachowań sondowania i przyjmowania Ae. aegypti26 i Culex tarsalis27 komarów żywiących się ludzkimi rękami, oraz kleszczy Dermacentor variabilis i Amblyomma americanum żerujących na cielętach bydła28. Ponadto niedawno opracowano mysi model dla EPG29, aby ułatwić badania patogenów przy użyciu tego instrumentu. Ludzkie ręce są idealne do początkowej charakterystyki kształtu fali komara, ponieważ ludzcy gospodarze mogą zgłaszać, kiedy czują sondowanie komara, a także inne zachowania, co ułatwia korelację przebiegów z zachowaniami (Tabela 1). Ponadto lepsze zrozumienie plastyczności zachowań żywieniowych komarów w różnych populacjach ludzkich może przyczynić się do opracowania bardziej wyspecjalizowanych interwencji w zakresie zarządzania komarami i przenoszonymi przez nie patogenami.

Tabela 1: Opis rodzin przebiegów używanych do klasyfikacji sygnałów elektrycznych zarejestrowanych z Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą AC-DC EPG. Faza sondowania i aktywność biologiczna odpowiadająca każdej rodzinie przebiegów. Więcej informacji można znaleźć w Cooper et al.27. Skrót: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Aby ułatwić korzystanie z EPG do badania biologii komarów i interakcji gospodarz-wektor, przedstawiono tutaj metodologię ilościowego określania zachowań żywieniowych komarów Cx. tarsalis na ludzkich rękach za pomocą monitora AC-DC EPG. Protokoły te opierają się na podstawowych procedurach AC-DC EPG opisanych w zasobach online30 i zakładają, że użytkownicy mają podstawową wiedzę praktyczną na temat AC-DC EPG i powiązanego oprogramowania31. Przedstawione procedury mogą być modyfikowane dla innych gatunków komarów i żywicieli i stanowią podstawę ułatwiającą oparte na hipotezach badania zachowań żywieniowych komarów.

Tabela 2: Definicje powszechnej terminologii AC-DC EPG. Definicje są oparte na definicjach podanych w zasobach internetowych30,31 i literaturze naukowej32. Skrót: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Protokół

Niniejszy protokół (IRB-10729) został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board, IRB) ds. badań z udziałem ludzi na Uniwersytecie Kansas State27 i jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z komarami wolnymi od patogenów. Ochotnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu oraz publikację swoich danych. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac ze zwierzętami, ludźmi lub materiałami biologicznymi niebezpiecznymi należy upewnić się, że wszystkie procedury zostały przejrzane i zatwierdzone przez odpowiednie instytucjonalne komitety regulacyjne lub osoby nadzorujące. Szczegółowe informacje na temat całego sprzętu i materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Wstępne przygotowania i konfiguracja

  1. Skonfiguruj monitor AC-DC EPG (Rysunek 1A), klatkę Faradaya (Rysunek 1B,C) oraz oprogramowanie zgodnie z wcześniejszymi opisami30,31, stosując modyfikacje opisane poniżej (kroki 1.1.1-1.1.5). W celu uzyskania szczegółowych instrukcji krok po kroku dotyczących konfiguracji i użytkowania sprzętu oraz oprogramowania należy skorzystać z zasobów online30. Zapisz pożądaną konfigurację jako domyślną w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem i przeglądania przebiegów. Listę powszechnie stosowanej terminologii AC-DC EPG wraz z definicjami zawiera Tabela 2.
    1. Podłącz wzmacniacz głowicowy (head amp) i sondę napięcia podłoża do kanału 1 skrzynki sterującej.
      UWAGA: Przedstawiono rejestrację z jednego kanału, mimo że monitor AC-DC może jednocześnie obsługiwać cztery owady i gospodarzy.
    2. Upewnij się, że kanał 1 w skrzynce sterującej jest włączony, a odpowiadające mu kanały Pre-1 i Post-1 w skrzynce interfejsu przełączającego są aktywne.
      UWAGA: Kanały nieużywane muszą pozostać wyłączone.
    3. Użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby włączyć kanały 1 i 3 na płycie A/D DI-710 (ale nie pozostałe), w celu rejestracji sygnałów przed i po prostowaniu.
    4. Sformatuj oprogramowanie do zarządzania sprzętem tak, aby wyświetlać/nakładać na siebie przebiegi przed i po prostowaniu (np. 1 = 1 dla sygnału przed prostowaniem i 2 = 3 dla sygnału po prostowaniu).
    5. Ustaw częstotliwość próbkowania w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem na 100 próbek na sekundę na kanał (tj. S/s/CHAN: 100).
  2. Przygotuj wypustki do owadów26,27,29,30:
    1. Rozgrzej lutownicę do temperatury zalecanej dla konkretnego spoiwa z rdzeniem kalafoniowym.
    2. Użyj ściągacza do izolacji, aby zdjąć plastikową powłokę na długości ok. 6 cm od końca miedzianego drutu 20 AWG, unikając przy tym przecięcia lub uszkodzenia wiązki miedzianych drucików wewnątrz (Rysunek 2A). Następnie odetnij odsłoniętą wiązkę miedzianego drutu i rozpleć ją na pojedyncze pasma (Rysunek 2B).
    3. Za pomocą szczypiec z wąskimi szczękami owiń jedno pasmo miedzianego drutu wokół trzpienia odpowiedniego gwoździa tapicerskiego poniżej łebka (tj. płaskiej góry), tak aby większość drutu wystawała poza łebek gwoździa. Zagnij koniec drutu nad łebkiem gwoździa, aby go unieruchomić (Rysunek 2C).
      UWAGA: Przetestuj gwoździe tapicerskie, aby zidentyfikować te, które ściśle pasują do gniazda wzmacniacza głowicowego (gdy jest on wyłączony, odłączony od zasilania i ustawiony na 106 Ohm (Ω)).
    4. Zamocuj trzpień gwoździa tapicerskiego w pomoce lutowniczej „trzecia ręka” tak, aby miedziany drut był skierowany w górę. Następnie nałóż małą kroplę (~0,2 cm kulki) rozpuszczalnego w wodzie topnika na miejsce połączenia gwoździa i miedzianego drutu (Rysunek 2D).
      OSTROŻNIE: Topnik jest toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
    5. Odwiń ok. 10 cm spoiwa i wyprostuj je. Przytrzymaj gorącą lutownicę przy łebku gwoździa przez kilka sekund, aż topnik się stopi, a metal rozgrzeje. Następnie dociśnij końcówkę spoiwa do łebka gwoździa obok lutownicy, aż spoiwo się stopi i całkowicie pokryje połączenie, stapiając gwóźdź i drut w wypustkę do owadów.
    6. Podczas stygnięcia wypustki oczyść końcówkę lutownicy wełną stalową i wilgotną gąbką.
    7. Po ostygnięciu wyjmij wypustkę z pomocy lutowniczej. Przepłucz wypustkę w 70% etanolu, a następnie w wodzie, aby usunąć pozostałości topnika. Przytnij miedziany drut do pożądanej długości (~3 cm, Rysunek 2E).
    8. Powtarzaj kroki 1.2.3-1.2.7, aż przygotujesz 20-30 wypustek do owadów.
  3. Zmontuj aspirator do owadów26,27:
    1. Przesuń końcówkę szklanej pipety Pasteura przez płomień, lekko nią obracając. Powtarzaj czynność, aż końcówka pipety osiągnie odpowiedni rozmiar, aby ściśle przylegać do odwłoka owada.
    2. Zakryj szeroki koniec zmodyfikowanej pipety Pasteura siatką przeciwkomarową, a następnie włóż ją bezpośrednio do rurki silikonowej podłączonej do aspiratora laboratoryjnego i zabezpiecz połączenie taśmą izolacyjną, tworząc aspirator do owadów (Rysunek 2H).
      UWAGA: Pipetę Pasteura i siatkę można włożyć do krótkiego odcinka plastikowej rurki wyposażonej w szybkozłączkę, co ułatwia wymianę między różnymi rozmiarami (Rysunek 2H).

Konfiguracja laboratorium elektrofizjologicznego do rejestracji EEG; obejmuje wzmacniacz, komputer, klatkę Faradaya i czujniki.
Rysunek 1: Konfiguracja sprzętu monitorującego AC-DC EPG do rejestracji na ludzkich dłoniach. (A) Komponenty EPG, w tym (1) moduł sterujący, (2) interfejs przełącznika, (3) zasilacz, (4) płyta A/D DI-710, (5) komputer, (6) regulator napięcia oraz (B) klatka Faradaya zawierająca (C) mikroskop cyfrowy (7) na statywie z gęsimi szyjami, (8) folię bąbelkową i poduszki powietrzne, (9) sondę napięcia podłoża oraz (10) wzmacniacz przedwzmacniacza na statywie laboratoryjnym. Skróty: AC = prąd zmienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Proces montażu cewnika z rurkami, drutem i narzędziami; schemat układu eksperymentalnego do transferu cieczy.
Rycina 2: Elektrody rejestrujące do okablowania komarów oraz aspirator do owadów do manipulowania komarami podczas okablowania. (A) Miedziany drut 20 AWG z usuniętą 6 cm plastikową izolacją w celu odsłonięcia wiązki drutów miedzianych wewnątrz. (B) Pojedyncze pasma wiązki drutu miedzianego. (C) Pojedyncze pasmo drutu miedzianego owinięte wokół łebka mosiężnego gwoździa tapicerskiego z końcem drutu zagiętym nad łebkiem. (D) Kropelka topnika na połączeniu mosiężnego gwoździa tapicerskiego i drutu miedzianego, utrzymywana przez trzecią rękę do lutowania w przygotowaniu do lutowania. (E) Gotowy trzpień do owadów wykonany z mosiężnego gwoździa przylutowanego do drutu miedzianego. (F) Elektroda rejestrująca wykonana ze złotego drutu owiniętego wokół końcówki drutu miedzianego trzpienia do owadów i zamocowana srebrnym klejem. (G) Zbliżenie złotej pętli na końcówce elektrody rejestrującej. (H) Złożony (góra) i rozłożony (dół) aspirator do owadów wykonany z zmodyfikowanych pipet Pasteura, siatki przeciwkomarowej, plastikowych rurek, taśmy izolacyjnej i męskich szybkozłączy, obok laboratoryjnej rurki aspiracyjnej wyposażonej w szybkozłącze żeńskie (prawy górny róg). Paski skali = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Okablowanie komarów

  1. Przygotowanie komarów i srebrnego kleju (poprzedniego dnia po południu/wieczorem przed EPG):
    1. Hodowla i utrzymanie komarów Cx. tarsalis szczepu KNWR zgodnie z wcześniejszym opisem27.
    2. Głodzenie dorosłych samic komarów, od 5 do 17 dni po wyjściu z poczwarki, przez 8-12 h w celu zwiększenia częstotliwości prób kłucia, zapewniając im jednak dostęp do wody, aby uniknąć śmiertelności.
    3. Przygotowanie świeżego srebrnego kleju26,27,28,29,30:
      1. Do zlewki o pojemności 20 mL wsypać 510 mg srebrnych płatków o wielkości 4-8 µm. Wyzerować wagę i dodać do zlewki, na wierzch srebrnych płatków, 1 100 mg nietoksycznego kleju szkolnego.
      2. Wyzerować wagę, dodać do zlewki na wierzch kleju 510 mg srebrnych płatków o wielkości 8-10 µm, a następnie za pomocą pipety dodać 1 000 µL wody.
      3. Ostrożnie włożyć do zlewki mieszadło magnetyczne i umieścić ją na mieszadle. Rozpocząć powolne mieszanie, stopniowo zwiększając obroty do ustawienia „szybkiego” i mieszać przez 4 min. Upewnić się, że wszystkie składniki zostały dokładnie wymieszane.
      4. Za pomocą pipety transferowej (z odciętą końcówką) przenieść srebrny klej do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
      5. Górne części probówek z srebrnym klejem owinąć Parafilmem i przechowywać na blacie do momentu użycia.
        UWAGA: Srebrny klej zachowuje odpowiednią konsystencję do 2 dni, jednak zaleca się przygotowanie świeżego kleju wieczorem przed użyciem30.
  2. Przygotowanie elektrod rejestrujących26,27,29,30:
    1. Przed użyciem intensywnie wymieszać srebrny klej w wortexie.
    2. Owinąć blok piankowy świeżą folią spożywczą, aby utrzymać przygotowane trzpienie dla owadów oraz okablowane komary.
      UWAGA: Pianka musi być wystarczająco duża, aby okablowane komary mogły stać na powierzchni bez dotykania się nawzajem, ale na tyle mała, by zmieścić się w pudełku do przechowywania. OSTROŻNIE: Krople wydalnicze uwalniane po pobraniu krwi mogą zawierać patogeny. Po użyciu odpowiednio zutylizować folię spożywczą i blok piankowy.
    3. Usunąć nalot (oraz stary srebrny klej w przypadku ponownego użycia trzpieni) z końcówki drutu miedzianego, zdrapując górny 1 cm drutu miedzianego żyletką, aż będzie błyszczący z każdej strony. Przygotować jeden trzpień dla każdego komara oraz kilka dodatkowych.
    4. Odciąć złoty drut o średnicy 0,025 mm na kawałki o długości 4-5 cm. Drut zawsze trzymać pęsetą samozamykającą oklejoną taśmą, aby uniknąć jego odkształcenia.
      UWAGA: Złoty drut jest znacznie lepiej widoczny na czarnym tle.
    5. Ułożyć koniec złotego drutu wzdłuż czystej końcówki drutu miedzianego trzpienia i delikatnie owinąć złoty drut 3 razy wokół drutu miedzianego.
    6. Za pomocą sondy do sekcji nałożyć srebrny klej, aby unieruchomić złoty drut. Upewnić się, że nie pozostał żaden wystający koniec. Umieścić trzpień w piance, aż klej wyschnie.
    7. Delikatnie wygładzić złoty drut przymocowany do trzpienia, nadając mu kształt długiego, łagodnego łuku (Rysunek 2F). Przyciąć drut do pożądanej długości (~2,5-3 cm).
    8. Pracując pod mikroskopem sekcyjnym, użyć pęsety precyzyjnej, aby wykonać złotą pętlę na końcówce złotego drutu, a następnie zgiąć pętlę pod kątem 90°, zgodnie z opisem poniżej (kroki 2.2.8.1-2.2.8.4; Rysunek 2E,F). Upewnić się, że złota pętla jest całkowicie zamknięta. Przenieść trzpień z powrotem do bloku piankowego.
      1. Trzymając trzpień niedominującą ręką za mosiężny gwóźdź, tak aby końcówka złotego drutu dotykała stolika mikroskopu, chwycić sam koniec złotego drutu pęsetą precyzyjną w dominującej ręce.
      2. Za pomocą pęsety precyzyjnej przekrzyżować końcówkę złotego drutu nad drutem miedzianym trzpienia w pobliżu miejsca przyklejenia złotego drutu. Przycisnąć koniec pęsety i złotego drutu do stolika mikroskopu.
      3. Delikatnie pociągnąć za trzpień, aż złoty drut utworzy małą pętlę wokół końcówki pęsety precyzyjnej (nie ciągnąć zbyt mocno). Zwolnić złoty drut i ostrożnie usunąć pęsetę.
      4. Nadal trzymając trzpień w niedominującej ręce, chwycić złotą pętlę pęsetą precyzyjną tak, aby pęseta znajdowała się pod kątem prostym do szyjki drutu, a końcówka pęsety obejmowała środek złotej pętli, chwytając obie jej strony. Delikatnie pociągnąć za trzpień, jednocześnie lekko obracając pęsetą w stronę przeciwną do trzpienia, aż pętla zostanie zgięta pod kątem 90° względem szyjki drutu (Rysunek 2G).
  3. Mocowanie elektrod rejestrujących do komarów26,27,29,30 (rano w dniu EPG):
    1. Znieczulić głodzone komary gazem CO2 do całkowitego ustania ruchów. Umieścić komary na plecach na podkładce do znieczulania, odwłokami skierowanymi w stronę badacza.
    2. Pod mikroskopem sekcyjnym położyć kawałek taśmy laboratoryjnej o długości ~2 cm stroną klejącą do dołu. Nanieść na taśmę kroplę srebrnego kleju o średnicy 0,5 cm (~10 µL).
    3. Wciągnąć odwłok znieczulonego komara do zmodyfikowanej pipety Pasteura, stosując ssanie tylko przez czas niezbędny do osadzenia odwłoka w miejscu. Przytrzymać komara nad srebrnym klejem za pomocą aspiratora, korzystając z mikroskopu sekcyjnego.
      UWAGA: Skrzydła mogą znajdować się wewnątrz lub na zewnątrz końcówki zmodyfikowanej pipety Pasteura, jednak ich umieszczenie wewnątrz zapobiegnie wypadnięciu komara. Należy unikać zginania lub uszkadzania skrzydeł.
    4. Szybko zanurzyć szpilkę minutien w srebrnym kleju i nanieść cienką warstwę na pronotum komara (tzn. grzbietową powierzchnię klatki piersiowej). Jeśli to możliwe, niezwłocznie przejść do następnego kroku (lub ponownie znieczulić komara w razie potrzeby).
      UWAGA: Zaleca się usunięcie łusek z pronotum poprzez pocieranie szpilką w przód i w tył, aby ułatwić penetrację kleju przez pory w kutykuli. Należy unikać naniesienia kleju na jakąkolwiek inną część komara.
    5. Szybko zanurzyć złotą pętlę na końcówce elektrody rejestrującej w srebrnym kleju i umieścić ją na plamie srebrnego kleju na pronotum komara. Poruszać pętlą w przód i w tył, aby upewnić się, że przylega ona ściśle do pronotum. Przytrzymać drut, aż klej wyschnie (~20-25 s).
    6. Umieścić trzpień w piance pod takim kątem, aby okablowany komar mógł wygodnie stać po przebudzeniu. Przejść do okablowania kolejnego komara.
      UWAGA: Zaleca się sporządzanie notatek dotyczących jakości każdego procesu okablowania.
    7. Po okablowaniu pożądanej liczby komarów umieścić blok piankowy w pudełku do przechowywania. Utrzymywać komary w normalnych warunkach hodowlanych do momentu użycia.

3. Konfiguracja i przygotowanie EPG (rano w dniu poprzedzającym EPG)

  1. Włącz monitor AC-DC EPG (poprzez przełączenie przełącznika na zasilaczu) co najmniej 30 min przed rozpoczęciem rejestracji, aby umożliwić ustabilizowanie się instrumentu oraz przeprowadzenie ewentualnego rozwiązywania problemów.
    UWAGA: Kanały używane w jednostce sterującej i w skrzynce interfejsu przełącznikowego mogą pozostać włączone.
  2. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do zarządzania sprzętem.
    UWAGA: Jeśli sygnały nie pojawiają się w formie płaskich, cienkich linii, wymagane jest przeprowadzenie rozwiązywania problemów (patrz sekcja dyskusja).
  3. Wykonaj test dotykowy27,30 w celu weryfikacji sprawności sprzętu:
    1. Podczas uziemienia (tj. dotykając klatki Faradaya gołą skórą), przekręć pokrętło w przedwzmacniacz głowicowy Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 106 Ω i włóż trzpień adaptera do owada do otworu.
      UWAGA: Przeprowadzenie testu dotykowego przy wyższym poziomie rezystancji wejściowej (Ri) może uszkodzić przedwzmacniacz głowowy.
    2. Po uziemieniu włącz wzmacniacz przedwzmacniacza i trzykrotnie mocno chwyć miedziany drut wyprowadzenia owada palcem wskazującym i kciukiem. Jeśli system EPG działa prawidłowo, na ekranie pojawią się trzy duże piki zarówno w sygnale przednim, jak i pomierzonym. W przeciwnym razie konieczne jest przeprowadzenie diagnostyki problemów (patrz sekcja dyskusja).
  4. Dostosuj ustawienia instrumentu do 150 mV prąd przemienny (AC) z an Ri wynoszące 107 Ω, a wzmocnienie sprzętowe 20–40x, a ujemne przesunięcie, a naturalna linia bazowaoraz a wzmocnienie programowe z 8-16x27,30zgodnie z poniższym opisem (kroki 3.4.1–3.4.3).
    1. Ustaw napięcie, rodzaj prądu, wzmocnienie sprzętowe (zakres, wzmocnienie i mnożnik), przesunięcie oraz linię bazową (zero) za pomocą przełączników i pokręteł na kanale 1 jednostki sterującej.
      UWAGA: Odpowiednie ustawienie wzmocnienia sprzętowego zależy od jakości okablowania i kleju srebrowego, dlatego należy spodziewać się różnic w optymalnych ustawieniach wzmocnienia pomiędzy poszczególnymi komarami oraz z dnia na dzień. Wzmocnienie sprzętowe może wymagać korekty w trakcie rejestracji, jeśli sygnał osiągnie wartość maksymalną (zdefiniowaną w Tabela 2 i przedstawiono w Rycina 3A,C) lub jest zbyt mały, aby można go było zwizualizować. Wszelkie zmiany wzmocnienia sprzętowego będą na stałe wpływać na nagranie (pokazane w Rycina 3A,C).
    2. Ustaw poziom Ri za pomocą pokrętła w przedwzmacniaczu głowicowym.
    3. Ustaw i dostosuj wzmocnienie programowe za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem (np. wybierz sygnał przed lub po wzmocnieniu, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zwiększyć wzmocnienie programowe, lub prawym przyciskiem myszy, aby je zmniejszyć).
      UWAGA: Wszelkie zmiany wzmocnienia wprowadzone w oprogramowaniu NIE wpłyną trwale na nagranie.
  5. Skonfiguruj nowe nagranie w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem, ale nie rozpoczynaj nagrywania do momentu wykonania kroku 4.3 w następnej sekcji.

4. EPG na ludzkich dłoniach26,27 :

  1. Po uzyskaniu świadomej zgody (zgodnie z wytycznymi IRB danej instytucji), poproś gospodarza o usiądnięcie obok klatki Faradaya z jedną ręką wewnątrz, trzymając sondę napięcia podłoża poniżej wzmacniacza przedwzmacniaczowego (head amp).
    UWAGA: Ramię musi spoczywać wygodnie na folii bąbelkowej lub podobnym nieprzewodzącym podłożu. Dłoń i sonda napięcia podłoża nie mogą stykać się z klatką Faradaya ani ze wzmacniaczem przedwzmacniaczowym podczas rejestracji. Aby uniknąć uszkodzeń, absolutnie ważne jest, aby wolontariusz nie dotykał wzmacniacza przedwzmacniaczowego po jego włączeniu. W przypadku przypadkowego dotknięcia wzmacniacza przedwzmacniaczowego, należy przeprowadzić opisany powyżej test dotyku w celu oceny jego funkcjonalności.
  2. Gdy gospodarz zajmie pozycję, odwróć wzmacniacz przedwzmacniaczowy bokiem. Wyjmij okazy komara z drutem z pudełka do przechowywania i podłącz go do instrumentu, wkładając mosiężny pin trzpienia owadziego do portu we wzmacniaczu przedwzmacniaczowym. Pozostaw komara swobodnie zwisającego.
    UWAGA: Trzymaj w pobliżu butelkę z rozpylaczem zawierającą 70% etanol, aby kontrolować komary, które mogą oderwać się od drutu.
  3. Rozpocznij rejestrację za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem. Ustaw wzmacniacz przedwzmacniaczowy nad dłonią w taki sposób, aby komar mógł wygodnie stanąć i próbować pobrać krew (probing).
  4. Włącz wzmacniacz przedwzmacniaczowy przy uziemieniu. Uruchom timer na 10 min. W razie potrzeby dostosuj pozycję dłoni gospodarza, aby ułatwić udane pobieranie krwi.
    UWAGA: W przypadku komarów wykazujących skłonność do natychmiastowego pobierania krwi, włącz wzmacniacz przedwzmacniaczowy przed umieszczeniem komara na dłoni. Cienki drewniany kołek lub nieprzewodząca rączka pędzla mogą posłużyć do wygięcia miedzianego drutu trzpienia owadziego w celu dalszej korekty pozycji komara. Lupa lub mikroskop cyfrowy na statywie z gęsią szyją mogą pomóc w obserwacji komara podczas EPG, szczególnie w badaniach korelacji behawioralnych.
  5. Używaj oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby tworzyć obserwacje z sygnaturą czasową (np. markery zdarzeń) podczas rejestracji w odniesieniu do reakcji gospodarza, zachowań komarów, zmian wzmocnienia itp.). W razie potrzeby dostosuj pozycję sygnałów na ekranie oraz wzmocnienie programowe, aby oba sygnały były wyraźnie widoczne na ekranie. Dostosuj wzmocnienie sprzętowe, jeśli sygnał(e) ulegają obcięciu (przesterowaniu) (Rycina 3A,C oraz Tabela 2) lub jeśli przebiegi wydają się zbyt małe przy maksymalnym wzmocnieniu programowym. Dostosuj offset, jeśli zaobserwowano załamanie prostownika (rectifier foldover) (Rycina 3C,C' oraz Tabela 2). Szczegółowe instrukcje dotyczące wprowadzania tych korekt znajdują się w podręczniku do oprogramowania31 oraz w zasobach online30.
    1. Aby dostosować pozycję sygnałów na ekranie, wybierz sygnał przed (pre) lub po (post) signal (np. poprzez kliknięcie w
      1 = 1       lub 2 = 3), a następnie przeciągnij sygnał do pożądanej pozycji na ekranie (idealnie w pobliżu środka ekranu, ale bez nakładania się sygnałów).
    2. Aby dostosować wzmocnienie programowe, użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem opisanego w kroku 3.4.3.
    3. Aby dostosować wzmocnienie sprzętowe, zacznij od obrotu pokrętła wzmocnienia dla kanału 1 (Gain Dial for Channel 1) w prawo lub w lewo, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć wzmocnienie. Jeśli ta korekta nie jest wystarczająca do wyeliminowania obcięcia sygnału (zbyt wysokie wzmocnienie; Rycina 3A,C) lub nie pozwala na wyraźną wizualizację szczegółów sygnału (zbyt niskie wzmocnienie), przełącz przełączniki zakresu i mnożnika kanału 1 (Channel 1 Range and Multiplier Switches), aby dalej dostosować wzmocnienie.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie markerów zdarzeń do rejestrowania momentu dostosowania wzmocnienia sprzętowego, co ułatwia interpretację danych przebiegów falowych.
    4. Aby dostosować offset, przełącz przełącznik offsetu kanału 1 (Channel 1 Offset Switch) na panelu sterowania na pozycję neg, a następnie obracaj pokrętło offsetu kanału 1 (Channel 1 Offset Dial) , aż piki w sygnałach przed i po wystąpią w tym samym kierunku na ekranie komputera. Jeśli pokrętło offsetu zostanie przekręcone zbyt mocno, sygnał po (post-signal) ponownie się odwróci.
  6. Jeśli komar nie rozpocznie pobierania krwi w ciągu 10 min (lub w innym zdefiniowanym punkcie czasowym), wyłącz wzmacniacz przedwzmacniaczowy. Jeśli komar znajduje się w trakcie pobierania krwi w momencie osiągnięcia limitu czasu, pozwól mu skończyć przed wyłączeniem wzmacniacza przedwzmacniaczowego. Poproś gospodarza o ostrożne zabranie ręki, a następnie usuń komara wraz z przymocowanym trzpieniem owadziego. Umieść komara z powrotem w pudełku do przechowywania.
  7. Zatrzymaj/zamknij rejestrację za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem. Przejdź do EPG z następnym komarem (Krok 4.2).
    UWAGA: Pamiętaj o zmianie nazwy pliku po każdym komarze.
  8. Po zakończeniu sesji wyłącz wzmacniacz przedwzmacniaczowy oraz źródło zasilania i zamknij oprogramowanie.
  9. Przejrzyj z wolontariuszem Oświadczenie o Odprawie Uczestnika (Participant Debriefing Statement) lub podobny dokument, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB.
  10. Utylizuj komary zgodnie z wymaganiami protokołu. Usuń folię plastikową z bloku piankowego i zutylizuj ją w odpowiedni sposób.
  11. Po zakończeniu całego procesu gromadzenia danych przejrzyj i zmierz przebiegi falowe oraz przeanalizuj dane zgodnie z wcześniejszym opisem24,25,26,27,29,30. Skorzystaj z zasobów online30, aby uzyskać instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z oprogramowania do przeglądania przebiegów, tworzenia rycin przedstawiających przebiegi, pomiaru przebiegów falowych, eksportowania danych do analizy, przeprowadzania analizy statystycznej oraz szczegółowe wyjaśnienie typowych zmiennych odpowiedzi przebiegów falowych.

Wykres danych elektrofizjologicznych ilustrujący przejściowe zmiany amplitudy sygnału w czasie.
Rysunek 3: Przykłady nieoptymalnych zapisów spowodowanych przesterowaniem, zmianami wzmocnienia w jednostce sterującej, niejasnymi zmianami napięcia wynikającymi z niskiej jakości okablowania, zjawiskiem fold-over prostownika oraz szumem. Kształty fal z komarów Culex tarsalis żerujących do sytości na dłoniach ludzi, zniekształcone przez (A) przesterowanie (niebieska pozioma strzałka) i następujące po nim zmiany wzmocnienia w jednostce sterującej ze 100x na 80x, potem na 40x, 60x, 40x i 20x (pomarańczowe pionowe strzałki), (B) niejasne zmiany napięcia oraz (C) zjawisko fold-over prostownika w sygnale po prostowaniu (czarny) w porównaniu do sygnału przed prostowaniem (czerwony) (patrz kształt fali J, powiększenie pokazane na panelu C'), szum sieciowy (sinusoida 11 Hz widoczna tylko w sygnale przed prostowaniem (czerwony), powiększenie pokazane na panelu C'), przesterowanie (niebieska pozioma strzałka) oraz zmianę wzmocnienia w jednostce sterującej z 500x na 200x (pomarańczowa pionowa strzałka). Nazwy kształtów fal są podane u góry każdego panelu. Fioletowe strzałki w prawym dolnym rogu panelu C wskazują moment wyłączenia wzmacniacza głowicowego po zakończeniu pomiaru sondą i stanowią kolejny przykład zjawiska fold-over prostownika. Czerwone poziome linie powiązane z sygnałem przed prostowaniem w panelu C wskazują momenty użycia znaczników zdarzeń (Event Markers) do zapisywania notatek z sygnaturą czasową. Poziomy Ri, sygnały przyłożone, skale czasu i wzmocnienia programowe wynoszą (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; oraz (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x. Skróty: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, Ri = rezystancja wejściowa, mV = miliwolt, Ω = Ohmy, s/div = sekundy na dywizję. Rysunek ten został przygotowany na podstawie danych z publikacji Cooper et al.27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Rejestracje AC-DC EPG żerowania krwi komarów Cx. tarsalis na ludzkich dłoniach (Rycina 4) wygenerowały interpretowalne przebiegi falowe odpowiednie do analizy i publikacji27. Interpretowalne przebiegi zawierały wyraźne, rozróżnialne powtarzalne wzorce, które można było zaklasyfikować do rodzin przebiegów falowych (Tabela 1 i Rycina 4), typów i podtypów po dostosowaniu kompresji (zdefiniowanej w Tabeli 2) oraz wzmocnienia programowego w oprogramowaniu do przeglądania przebiegów27,31. Wszystkie rodziny przebiegów (J, K, L, M, N) i typy (L1, L2, M1, M2) opisane wcześniej dla żerowania Ae. aegypti na ludzkich dłoniach26 zostały zidentyfikowane w przebiegach wygenerowanych przez Cx. tarsalis żerujące na ludzkich dłoniach, co potwierdziło poprawność opisanych tutaj metod. Ponadto zidentyfikowano trzy nowe typy przebiegów (M3, N1, N2) oraz liczne podtypy L1, L2, M1 i M227. Dodatkowo spadek napięcia do poziomu bazowego w momencie wycofania części gębowych z gospodarza nazwano rodziną przebiegów falowych W27.

Systematyczna zmiana ustawień instrumentu (rodzaj prądu i poziomy Ri) zgodnie z opisanymi tutaj procedurami pozwoliła na wyznaczenie optymalnych ustawień do rejestracji żerowania Cx. tarsalis na ludzkich dłoniach, określenie elektrycznego pochodzenia każdej formy fali, obliczenie średniego czasu trwania w sekundach pełnych i niepełnych prób nakłucia na komara oraz przeprowadzenie porównania statystycznego czasu trwania fali w sekundach na owada (WDI), liczby zdarzeń falowych na owada (NWEI) oraz czasu trwania fali w sekundach na zdarzenie na owada (WDEI) dla poszczególnych ustawień27. Przerwano również proces żerowania komarów podczas różnych form fal, a następnie wykonano sekcje w celu ustalenia, która forma fali korelowała z pobraniem krwi27. Podobne badanie przeprowadzono dla Ae. aegypti przy zastosowaniu porównywalnej metodologii26.

Ze względu na wrażliwy i złożony charakter EPG, nie wszystkie rejestracje były tak czyste, jak te przedstawione na Rysunku 4. Przebicia (Rysunek 3A,C), zmiany wzmocnienia sprzętowego (Rysunek 3A,C), niskiej jakości połączenia przewodów (Rysunek 3B), zjawisko foldover prostownika w przebiegu J (Rysunek 3C,C') oraz szumy elektryczne (Rysunek 3C,C') okazjonalnie zniekształcały i maskowały przebiegi, co sprawiało, że nie nadawały się one do wykorzystania w rycinach o jakości publikacyjnej i utrudniało scoring oraz analizę. Dlatego zaleca się podjęcie wstępnych starań w celu udoskonalenia umiejętności okablowania, optymalizacji ustawień wzmocnienia i napięcia, dostrojenia offsetu oraz kontrolowania szumów elektrycznych. Co ciekawe, zjawisko foldover prostownika zaobserwowano jedynie w rodzinie przebiegów J dla Cx. tarsalis (Rysunek 3C,C') i nie pojawiło się ono ponownie po początkowej regulacji offsetu, nawet w przypadku użycia innych gatunków komarów (Ae. aegypti i Culex quinquefasciatus) (dane nie pokazano). Ponadto analiza problemów wykazała, że niekontrolowane szumy elektryczne przedstawione na Rysunku 3 (panele C i C') wynikały z uszkodzonej klatki Faradaya. Rejestracje wykonane w uszkodzonej klatce Faradaya były nadal użyteczne, jednak problemy z szumami rozwiązano po zbudowaniu ulepszonej klatki Faradaya (Rysunek 1B).

Nawet przy zastosowaniu wszelkich środków ostrożności i optymalizacji wstępnej, niewielkie różnice w jakości mocowania elektrod do komara oraz inne nieznane czynniki zniekształcające sygnał i zmieniające stosunek sygnału do szumu sprawiały, że okresowo konieczna była regulacja wzmocnienia sprzętowego w trakcie rejestracji. Miało to na celu zapewnienie, że sygnał znajdował się w zakresie widoczności, a rozdzielczość pików w każdym przebiegu była wystarczająca do identyfikacji i charakterystyki przebiegu. Niestety, regulacja wzmocnienia sprzętowego w trakcie rejestracji może prowadzić do nagłych skoków napięcia (Rysunek 3A, C), co sprawia, że przebiegi nie nadają się do publikacji, lecz wciąż pozostają użyteczne (w całości lub w części) do pomiarów i analizy.

Schematy równowagi statycznej przedstawiające analizę sił; wykresy podkreślają równania ΣFx=0, ΣFy=0.
Rysunek 4: Reprezentatywne przebiegi falowe z sondy Culex tarsalis na ludzkiej dłoni, zarejestrowane przy Ri wynoszącym 107 Ω przy użyciu sygnału przyłożonego 250 mV AC. Nazwy przebiegów falowych na poziomie rodziny (NP, J, K, L, M, W) są widoczne u góry każdego panelu. Dolne panele przedstawiają powiększenia wybranych obszarów w panelu A. Wstawione panele pokazują powiększenia wskazanych obszarów. Skale czasu i wzmocnienia oprogramowania wynoszą (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Skróty: AC = prąd przemienny, Ri = rezystancja wejściowa, mV = miliwolty, Ω = Ohmy, s/div = sekundy na dywizję. Rysunek ten został przygotowany na podstawie danych z pracy Cooper et al.27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podczas korzystania z AC-DC EPG bardzo ważne jest, aby mieć podstawową wiedzę na temat obsługi sprzętu i oprogramowania30 oraz uważnie postępować zgodnie z opisanymi w nim protokołami, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu. Przede wszystkim unikaj dotykania wzmacniacza głównego, gdy jest włączony, chyba że jest uziemiony na klatce Faradaya. Zaleca się nagrywanie jak najdalej w klatce Faradaya30. Drzwi klatki niekoniecznie muszą być zamknięte, aby uzyskać możliwe do interpretacji przebiegi, chyba że nagrywa się w środowisku o nadmiernym hałasie elektrycznym otoczenia. W klatce Faradaya nie może znaleźć się nic, co jest zmotoryzowane. Ważne jest, aby pamiętać, że sama klatka Faradaya musi być uziemiona elektrycznie wyłącznie przez wzmacniacz główny, aby działała poprawnie. Osiąga się to poprzez podłączenie wzmacniacza czołowego do metalowego statywu laboratoryjnego z farbą zeszlifowaną z jednej stopy statywu, aby umożliwić przewodzącą ścieżkę dla energii elektrycznej przechwyconej przez klatkę Faradaya do stanowiska laboratoryjnego, do metalowej obudowy wzmacniacza głównego, w dół przewodu do skrzynki sterowniczej, Poprzez zasilacz do prawidłowo uziemionego gniazdka ściennego, a do ziemi przez uziemienie budynku30. Multimetr może być używany do sprawdzania jakości połączenia między elementami wewnątrz klatki poprzez pomiar rezystywności (która jest odwrotnością przewodności) między różnymi punktami. Bezprzewodowe radio AM można również umieścić wewnątrz klatki Faradaya, aby sprawdzić, czy dźwięk jest znacznie zredukowany (lub najlepiej wyeliminowany) po zamknięciu drzwi, potwierdzając, że klatka Faradaya odpowiednio przechwytuje sygnały elektryczne w powietrzu (E. Backus per. Comm.).

Właściwe i ustandaryzowane przygotowanie kleju srebrnego oraz przymocowanie elektrod rejestrujących do owadów mają kluczowe znaczenie dla uzyskania użytecznych nagrań. Naskórek owada jest izolatorem i działa jak kondensator, jeśli srebrny klej nie wnika odpowiednio w pory naskórka, aby stworzyć ścieżkę dla elektryczności przemieszczającej się z wnętrza owada do złotego drutu na powierzchni przedplecza30. Przygotuj srebrny klej w tym samym czasie przed każdą sesją EPG, pracuj ze świeżym srebrnym klejem z tubki i często zastępuj go energicznie wirowanym srebrnym klejem podczas procedury okablowania. Upewnij się, że złota pętla jest umieszczona przy klatce piersiowej tak, aby cała pętla stykała się z naskórkiem i nie była przechylona na jedną stronę ani oddzielona grubą warstwą srebrnego kleju i łusek, aby pomóc w utworzeniu silnego połączenia elektrycznego, a także zapobiec oderwaniu się i ucieczce komara z drutu.

Opisane tutaj protokoły muszą być zoptymalizowane podczas pracy z różnymi gatunkami komarów. Optymalne ustawienia EPG (poziom Ri, napięcie, typ prądu i wzmocnienie sprzętowe) do nagrywania na danym stawonogu muszą być eksperymentalnie określone12,30. Jednak po dostosowaniu przesunięcia nie będzie trzeba go ponownie regulować podczas pracy z podobnymi komarami. Określono optymalne ustawienia dla AC-DC EPG z Ae. aegypti26 i Cx. tarsalis27. Biblioteki przebiegów (zdefiniowane w tabeli 2) dla dodatkowych gatunków ułatwią przyjęcie EPG w odniesieniu do komarów. Konieczne jest również zoptymalizowanie znieczulenia dla interesującego go komara, ponieważ zachowanie związane z odżywianiem się krwią może być różnie zakłócone w zależności od gatunku komara i wyboru znieczulenia. Na przykład Cx. tarsalis wymaga 4-godzinnego okresu rekonwalescencji po 15 minutach znieczuleniaCO2, podczas gdy w przypadku Ae. aegypti 15-minutowy okres rekonwalescencji jest wystarczający po 15-minutowym okresie znieczulenia lodem. Culex tarsalis są jednak trudne do strącenia przy ekspozycji na zimno, dlatego CO2 jest głównie stosowany pomimo długiego okresu rekonwalescencji.

Chociaż monitor AC-DC EPG jest prosty w obsłudze po przejrzeniu zasobów online30,31 lub szkoleniu z doświadczonym użytkownikiem, wymagane jest pewne rozwiązywanie problemów. Początkowo, nagrania EPG sond komarów miały nieoczekiwaną falę znakową 11 Hz w sygnale wstępnym, która nie została zaobserwowana ani zgłoszona przez Wayadandei współpracowników. Konsultacje z E. Backusem wykazały, że klatka Faradaya była prawdopodobnie problemem z powodu zakłócających pętli uziemienia. Nowa klatka Faradaya zbudowana z wysoce przewodzącego miedzianego ekranu połączonego z aluminiową ramą przykręconą do dużej aluminiowej płyty podłogowej wspartej na gumowych nóżkach w celu odizolowania jej od poniższego stołu (ilustracja 1B), rozwiązała problem sygnału szumów 11 Hz (rysunek 3C,C'). Dodatkowo, od czasu do czasu, gdy zasilacz EPG był po raz pierwszy włączany, sygnały przed i po rektyfikacji pojawiały się jako grube, rozmyte linie zamiast prostych, gładkich, cienkich linii. Zwykle naprawiano to poprzez wyłączenie przyrządu i sprawdzenie wszystkich połączeń przewodów. Jeśli to się nie udało, odłączenie instrumentu na 1-3 minuty zwykle pomagało. Bardzo rzadko sygnały przed i po stają się gęste i rozmyte podczas pracy, co zostało rozwiązane poprzez wyłączenie przyrządu i podłączenie go do innego gniazdka lub użycie regulatora napięcia i kondycjonera sieciowego do podłączenia EPG przed podłączeniem go do ściany. Idealnie byłoby, gdyby dedykowana linia do monitora EPG wyeliminowała szumy linii pochodzące z lodówek i innych urządzeń podłączonych do tego samego obwodu elektrycznego co EPG30.

Obecnie istnieją dwa główne ograniczenia w stosowaniu EPG do badania komarów. Po pierwsze, przeprowadzono kilka badań korelacyjnych w celu sprawdzenia, które zachowania sondujące odpowiadają przebiegom. Chociaż istnieją silne hipotezy na temat tego, co dzieje się podczas każdej rodziny fal (Tabela 1) i niektórych typów fal (M1 i M2), niewiele z tych hipotez zostało potwierdzonych eksperymentalnie, z wyjątkiem tego, że spożycie krwi jest skorelowane z rodziną fal M26,27. Co najważniejsze, należy zidentyfikować przebiegi odpowiadające zdarzeniom wydzielania śliny, ponieważ wiele patogenów jest przenoszonych w ślinie. Korelacja przebiegów EPG z aktywnością biologiczną u komarów będzie wymagana do znaczącej interpretacji istotnych różnic w czasie trwania fali i liczbie między grupami leczonymi. Po drugie, wskaźniki sondowania i przyjmowania podczas EPG mogą być znacznie niższe niż oczekiwano27. Indywidualne przywiązywanie komarów do krótkich przewodów i umieszczanie ich bezpośrednio na żywicielu może zapobiec długodystansowym poszukiwaniom żywiciela i społecznym zachowaniom żywieniowym, co może wpływać na zachowania związane z sondowaniem i połykaniem. Prawidłowo okablowane owady mogą normalnie chodzić i latać. Mimo to komary często ciągną za druty, a czasami plączą się lub trzymają pod nienaturalnymi kątami, co wskazuje, że bycie podłączonym do drutu wpływa w pewnym stopniu na ich zachowanie. Autorzy przetestowali wiele strategii mających na celu zwiększenie częstości sondowania podczas EPG, a poszczenie komarów przez noc, przy użyciu starszych osób, wystawianie ich na działanie ludzkiego oddechu bezpośrednio przed umieszczeniem ich na dłoni i nakładanie ludzkiej śliny na rękę było najbardziej skuteczne, a także przy użyciu gospodarzy, którzy stale dokonywali precyzyjnych korekt pozycji dłoni, aby upewnić się, że komar był w idealnej pozycjido sondowania.

Pomimo tych ograniczeń, AC-DC EPG ma wiele zalet w porównaniu z innymi podejściami do badania zachowań sondowania i przyjmowania. Systemy takie jak BiteOScope11, flyPAD15 i Automated Biomaterial Platform14, które zostały zaprojektowane do ilościowego określania zachowań związanych z sondowaniem i spożywaniem oraz wydzielania śliny podczas karmienia krwią, wykorzystują przezroczyste sztuczne podłoża i płynne diety, które nie mają normalnych systemów tkanek gospodarza i wskazówek gospodarza. Chociaż te syntetyczne platformy są przydatne do wielu celów eksperymentalnych, wyraźną zaletą AC-DC EPG jest możliwość badania tych zachowań stawonogów i zmiennych będących przedmiotem zainteresowania w naturalnych systemach gospodarza. Co więcej, zdefiniowana przez użytkownika zdolność adaptacji systemu AC-DC EPG stanowi dodatkową przewagę nad innymi przyrządami EPG22,33 i elektronicznymi urządzeniami monitorującymi podobnymi do EPG16,21, które nie mają regulowanych poziomów Ri, typów prądów i poziomów napięcia, które są potrzebne do uzyskania przebiegów z maksymalną ilością informacji i zminimalizowania niekorzystnego wpływu na szeroki zakres gospodarzy i stawonogów22, Lokal mieszkalny 23. Techniki elektromiografii (EMG) są również wykorzystywane do badania karmienia krwią. Jednak obwód elektryczny zwykle obejmuje tylko stawonoga i rejestrowane są tylko potencjały mięśniowe znajdujące się najbliżej elektrody rejestrującej, więc przebiegi nie dostarczają informacji o szczegółowych czynnościach zachodzących na granicy żywiciel-owad, takich jak pęknięcia komórek, lokalizacje i działania styletów oraz potencjały strumieniowe przez aparaty gębowe28,34. Techniki mikroskopii przyżyciowej mogą być wykorzystywane do bezpośredniej wizualizacji szczegółowych ruchów i czynności aparatu gębowego w żywych tkankach gospodarza, ale techniki te obejmują inwazyjne procedury na żywych modelach zwierzęcych9. Tylko monitor AC-DC EPG może dostarczyć bardzo szczegółowych informacji w czasie rzeczywistym na temat zachowań związanych z sondowaniem, spożyciem i wydzielaniem śliny, które występują w żywych, nieprzezroczystych tkankach gospodarza bez konieczności wykonywania inwazyjnych procedur i można go dostosować do stosowania u szerokiej gamy stawonogów10,12.

Jest to pierwsza szczegółowa procedura krok po kroku dotycząca okablowania komarów, skonstruowania aspiratora owadów i wykonania EPG na ludzkich gospodarzach. Oczekuje się, że protokoły te ułatwią przyjęcie AC-DC EPG u komarów żywiących się ludzkimi gospodarzami. Przykłady przyszłych wysiłków badawczych z wykorzystaniem AC-DC EPG mogą obejmować badania nad podstawowymi mechanizmami odżywiania się krwią i uszkodzeniem tkanek gospodarza10, w tym identyfikację stereotypowych sekwencji zachowań sondujących poprzedzających spożycie krwi, badanie przepływu krwi przez aparat gębowy oraz porównanie plastyczności karmienia w obrębie i między gatunkami stawonogów/etapami rozwojowymi26. EPG może być również stosowany do ilościowego określania działania insektycydów, środków przeciwpaszowych i repelentów12. Przedstawione tutaj procedury wykorzystania AC-DC EPG do badania komarów na ludzkich dłoniach przyspieszą te badania i umożliwią nowy wgląd w biologię komarów żywiących krew.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Wnioski zawarte w niniejszym raporcie są wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy USDA.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni prof. Astri Wayadande z Oklahoma State University za pionierskie opracowanie procedury okablowania dla komarów, a także dr Elaine Backus z USDA-ARS w Parlier, CA, oraz panu Andrew Dowellowi z EPG Technologies Inc. w Gainesville, FL, za pomoc w rozwiązywaniu problemów ze sprzętem EPG. Dziękujemy również dr Dustinowi Swansonowi i panu Williamowi Yarnellowi z USDA-ARS Insectary na Manhattanie, KS, za dostarczenie komarów, oraz Pani Miriam Ruhinda z Kansas State University na Manhattanie, KS za pomoc w kręceniu filmów proceduralnych. Prace te były możliwe dzięki dostępowi do Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) na Uniwersytecie Stanowym Kansas. Badania te były wspierane przez USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) oraz Hatch Multistate Project (NE1943). Niniejszy manuskrypt jest wkładem nr 24-194-J z Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprzyrządowanie
AC-DC 4-kanałowy elektropenetrografEPG Technologies, Inc.W przypadku EPG obejmuje zasilacz, skrzynkę sterowniczą, skrzynkę interfejsu przełącznika, cztery wzmacniacze stopnia głównego, cztery sondy napięcia podłoża i powiązane przewody Poduszki
powietrzneAmazon.comludzkiego gospodarza, na którym można oprzeć rękę/ramię podczas EPG
DI-710 Sprzęt do akwizycji danych (AD Board)DATAQ Instruments Inc.do digitalizacji analogowych sygnałów EPG, aby można je było zobrazować na komputerze
Ściemnialna lampa powiększająca LED, duża lupa 5X bez użycia rąk ze światłem i stojakiem do czytania Hobby Rękodzieło Stół warsztatowy do szyciaAmazon.comdo obserwacji behawioralnej podczas EPG; używaj tylko odłączonego podczas EPG, w przeciwnym razie może to spowodować hałas
Mikroskop cyfrowy Dino-Lite Edge (powiększenie 250x)Dino-LiteAF4915ZTdo obserwacji behawioralnej podczas EPG
Stojak biurkowy Dino-Lite Flex-armDino-LiteMS22Bdo trzymania i manipulowania kamerą
Stalowa podstawka retorty Eisco i zestaw prętówFisher ScientificS41740do trzymania wzmacniacza stopnia głównego i uziemienia klatki Faradaya (musi być wykonana z metalu)
Warsztaty online EPGRozszerzenieUF IFAShttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "zasoby online" do nauki EPG (konfiguracja instrumentu, gromadzenie i analiza danych, budowa Faradaya, przygotowanie kleju do srebra, budowa kikuta owada itp.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power ConditionerAmazon.comdo redukcji szumów linii
Mała bąbelkowa folia amortyzującaAmazon.comdo stosowania jako bariera między gospodarzem a klatką Faradaya
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121do trzymania stopnia głównego amplifier i uziemienie klatki Faradaya (musi być wykonany z metalu i nie pokryty plastikiem)
Komputer z systemem WindowsBest Buydo analizy EPG i statystycznej
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS Rozszerzenie UF IFAShttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/do analizy statystycznej danych przebiegowych
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programy SASUF IFASExtension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/do przygotowania plików do analizy statystycznej danych falowych
SAS wersja 9.4SAS Institute Inc.do analizy statystycznej danych przebiegowych
WinDaq Lite DATAQ Instruments Inc.do rejestrowania i przeglądania danych EPG.  Obejmuje oprogramowanie WinDaq Hardware Manager (AKA, "oprogramowanie do zarządzania sprzętem") oraz oprogramowanie WinDaq Waveform Browser (AKA, "oprogramowanie do przeglądania przebiegów"). Do użytku tylko na komputerach z systemem Windows. 
Faraday Cage
Aluminiowa rama ekranuHome DepotMSCF5167dla  ściany klatki Faradaya
Blacha aluminiowa o grubości 0,125 (1/8) 3003-H14Metals DepotS318na podstawę klatki Faradaya
Szelki narożne, 1" Home Depot339547dla  ścian klatki Faradaya
maszynowe Phillips z płaskim, #6-32 x 1"Home Depot459999do budowy klatki Faradaya
Podkładki płaskie, #6 Home Depot638977do budowy klatek Faradaya
Multimetr cyfrowy Fluke 15B+ do zastosowań elektrycznych mierzy napięcie i prąd AC/DC do 1000 V i 10 A, a także rezystancję, ciągłość, diodę i pojemnośćAmazon.comdo testowania koszyka Faradaya
Przenośne radio AM FM, radio tranzystorowe Goodes z głośnym głośnikiem, gniazdo słuchawkowe, radio na baterie 2AA do odbioru dalekiego zasięgu, radio kieszonkowe do użytku wewnętrznego, zewnętrznego i awaryjnegoAmazon.comdo testowania klatki Faradaya
Ekran z czystej miedzi, siatka 16 x 16 o średnicy drutu 0,11, ekranymetradla  ścian klatki Faradaya
maszynowe combo z okrągłym, #6-32 x 3/4 "Home Depot528466do budowy klatki Faradaya
Papier ścierny, 1/2" na 1", 150Grit Home Depot19036-20-CCdo usuwania farby z dna stojaka laboratoryjnego
Narożniki ramy ekranu, 5/16" Home DepotWCORN516dla  ścian klatki Faradaya
Wielowypust ekranowy, 0,14" Home Depot3034719dla  ścian klatki Faradaya
Insect Stubs
Spilki do szyldów z mosiądzuHome Depot801294do budowy klocków przeciw owadom   
Drut miedziany, 20 AWGAmazon.comdo budowy klocków przeciw owadom   
Grypa rozpuszczalna w wodzie Harrisa Home Depot355398do pomocy w powlekania drutu króćca owadów i tworzenia mocnego połączenia
Szczypce z igłamiHome Depotdo gięcia drutu podczas konstruowania klocków owadów
Zestaw Pro's Kit 900-015 Pomocne dłonie Pomoc lutowniczaAmazon.comdo przytrzymywania kołków szyldu podczas
Lut (z rdzeniem kalafonii)Home Depot296497do budowy króćców owadów   
Narzędzie do ściągania izolacji z drutuHome Depotdo zdejmowania izolacji i cięcia drutu miedzianego podczas konstruowania kikutów owadów
Lutownica YIHUA 928D-III, 110 W o dużej mocy, w pełni cyfrowa lutownica z wyświetlaczemAmazon.comdo konstruowania odcinków owadów; w zestawie podstawka, gąbka i wełna stalowa do czyszczenia
Aspirator do owadów
Aspirator laboratoryjny Accuris ASPIREInstrumenty AccurisV0020do zasysania do aspiratora owadów; zawiera ręczny sterownik podciśnienia, adapter z cienką końcówką (40 mm) ze stali nierdzewnej oraz adapter końcówki do pipet
Chemglass Life Sciences Pasteur, długość 5 3/4"Fisher ScientificNC0230004do stosowania jako aspirator do owadów podczas okablowania komarów
Komercyjna elektryczna kolorowa winylowa taśma izolacyjnaHome Depotdo mocowania zmodyfikowanej pipety Pasteura do przewodu próżniowego
Moskitiera z tkaniny użytkowej, kwadratowa 10 x 10 cm JoannFabrics16651622do zapobiegania zasysaniu komarów do pompy próżniowej
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914do szybkiego i łatwego przełączania między różnymi zmodyfikowanymi pipetami Pasteura
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (od 3/8 do 7/16 cala) Dowód osobisty)Fisher Scientific15-315Bdo szybkiego i łatwego przełączania między różnymi zmodyfikowanymi pipetami Pasteura
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comdo przygotowania kleju do srebra
Silver Flake 99,9% czystości,  4-8 &mikro; mThermoFisher786.09do przygotowania kleju do srebra
Silver Flake 99,95% czystości, 8-10 &mikro; mInframat Advanced Materials47MR-12Fdo przygotowania kleju srebrnego
Znieczulenie na owady
zestaw bełkotkowy, 1000 mL, #9 Korek gumowyFlyStuff59-181do zapobiegania wysuszaniu owadów podczas korzystania z podkładki Flypad
  rama, standardowy rozmiarFlyStuff59-118zapobiegająca spadaniu komarów z podkładki
Flystation SzczotkaFlyStuff59-205do redukcji elektryzowania się podczas pracy na moskitierze
Flystuff  Flypad  standardowy rozmiarFlyStuff59-114AKA "podkładka anestezjologiczna" do znieczulania komarów
Lejek (średnica 4 cali)Amazon.comdo gazowania kubków komarów przed przeniesieniem na flypad
Szkło plexi lub płaska plastikowa pokrywka (przycięta na wymiar)Home DepotMC-27do zakrycia poduszki, jeśli komary zaczną się budzić
Wąż z tworzywa sztucznego odcinający Zaciski jednopozycyjne i regulowane otwarte (wariant 1/8 "do 1/2")Amazon.comdo kierowania gazu między flypad a lejkiem
Jednostopniowy regulator CO2FlyStuff59-142do regulacji przepływu gazu ze zbiornika CO2
" T” Złączka do rurki ID 1/8 calaFlyStuff59-123do podłączenia zarówno flypada, jak i lejka do zbiornika CO2
Rurki, przezroczyste FlyStuff59-124Cdo podłączenia lejka i flypada do regulatora na zbiorniku CO2
Insect Wiring
karton, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.327826aby ułatwić wizualizację złotego drutu
kwadrat z papieru budowlanego 3,5 "x 4,0"Zszywki956221aby złoty drut był łatwiejszy do wizualizacji
WacikiAmazon.comna czczo komary
Pianka rzemieślnicza #12 blok (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Sklep z tkaninami i rękodziełem Joann1941079do trzymania komarów przewodowych
Deflecto Ribbon Dozownik, przezroczystyAmazon.comdo przechowywania złotego drutu
Lekkie jak piórko kleszcze entomologiczneFisher ScientificS72110do manipulacji owadami
Cienkie kleszcze (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20do tworzenia złotej pętli podczas okablowania komarów
Pędzel drobno punktowyAmazon.comdo manipulowania komarami podczas okablowania i EPG; musi mieć plastikową lub drewnianą rączkę, jeśli jest używany do EPG
Standardowe pipety transferowe z cienką końcówką, wąskie, 5,8 mlThomas Scientific7761D21do przygotowania kleju do srebra
Złoty drut, czystość 99,99%, grubość 0,025 mmGoodfellowAU005121do okablowania komarów
Szpilki Minutien, końcówka 0,2 mm, 1 cmNC9681411 Fisher Scientificdo nakładania kleju na komary
Kubki papierowe Sztywna rurkana czczo komary     
Imadło sworznioweFisher Scientific50-996-811do przytrzymywania szpilki minutien podczas okablowania owadów
Plastikowe pudełko do przechowywania z pokrywką (7 cali x 9 cali x 14 cali)Amazon.comdo transportu komarów przewodowych
Szkło pleksi lub płaska plastikowa pokrywka (przycięta na wymiar)Home DepotMC-27do zakrycia podkładki przeciw owadom, jeśli komary zaczną się budzić
Kleszcze samozamykająceFisher Scientific08-906do trzymania i manipulowania złotym drutem
Compressed Gas
CO2 gasMatheson Gazdo znieczulania komarów za pomocą flypad
Common Lab Items
Jednorazowe worki autoklawe Biohazard, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591do usuwania komarów karmionych krwią
Palnik Bunsena lub palnik propanowyAmazon.comdo modyfikacji pipet Pasteura
Kolorowa taśma laboratoryjnaDaigger SuppliesEF9763Rdo etykietowania, przygotowania kleju srebrnego i kleszczy maskujących
Jednorazowe końcówki do pipet, 1000 i mikro; LFisher Naukowy do porcjowania wody podczas wytwarzania kleju srebrnego
Mikroskop preparacyjnyLeica Microsystemsdo okablowania komarów Sonda
preparcyjnaFisher ScientificNC9109673do mieszania  i nakładania srebrnego kleju
Kolba Erlenmeyera, 1000 mlFisher Scientific do zapobiegania wysuszaniu się owadów podczas korzystania z podkładki
Etanol, 70% Fisher Scientific04-355-122do odzyskiwania zbiegłych komarów
Szklane szalki PetriegoFisher Scientific08-747Bdo znieczulania komarów lodem
RękawiceFisher Scientificdo ochrony osobistej
Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe marki KimTech Science Fisher Scientific06-666do miażdżenia komarów
Fartuchy laboratoryjneFisher Scientificdo ochrony osobistej
Butelki z rozpylaczem LiBa, puste butelki z rozpylaczem wielokrotnego napełniania (bezpieczne do nacierania alkoholem)Amazon.comdo odzyskiwania komarów
Mieszadło magnetyczne o długości 2 cmFisher Scientific do mieszania srebrnego kleju
Pipeta mechaniczna jednokanałowa, 1000 &mikro; LFisher Naukowy 13-690-032do porcjowania wody podczas wytwarzania kleju srebrnego Probówki
do mikrowirówek, 1,5 mlFisher Scientific 780420do przechowywania kleju srebrnego
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944do uszczelniania tubek z klejem srebrnym
Folia Amazon.comdo przykrycia bloku piankowego
Pyrex Zlewka 20 mlFisher Scientific 07-250-051do mieszania kleju do srebra
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370do ważenia kleju i płatków srebra
Pisak Sharpie, Amazon.comdo etykietowania
Jednoostrzowa żyletkaMikroskopia elektronowaSciences 71980do czyszczenia kikutów owadów
Standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific 133-711-7mLdo przenoszenia srebrnego kleju do probówki do przechowywania 
Mieszaj płytkęFisher Scientific do mieszania srebrnego kleju
Timer/stoperFisher Scientificdo pomiaru czasu, jak długo żywiciel jest narażony na działanie każdego owada
Ultraczysta (18 MΩ) wodaFisher Scientific do przygotowania kleju do srebra
Nożyczki użytkoweFisher Scientific08-945do cięcia drutu złotego
Mieszalnik wirowyFisher Scientific do mieszania komarów srebrnego kleju
Study Organisms
Culex tarsalisUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research na Manhattanie, KSdo wykorzystania jako obiekty badań
dla 36" x 12' CO, papierowa , które uciekły Komary z drobną końcówką

Bibliografia

  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zachowanie żerowania komarówzachowanie sondowaniazachowanie spożyciażerowanie na krwirejestracja sygnałów elektrycznychtransmisja patogenówzłota elektroda drutowainterakcja z ludzkim gospodarzem
Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.