Artykuł metodologiczny

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komary przenoszą patogeny, które negatywnie wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt. Lepsze zrozumienie ich biologii odżywiania się krwią oraz interakcji z żywicielami i patogenami może zostać wykorzystane do opracowania nowych celów w zakresie zwalczania chorób przenoszonych przez komary. Niestety, sondowanie (tj. gryzienie) zachowań komarów jest słabo poznane, ponieważ występują one w tkankach gospodarza. W tym miejscu opisano nieinwazyjną procedurę wykorzystującą elektropenetrację AC-DC (EPG) do pośredniej wizualizacji i ilościowego określenia zachowań żywieniowych komarów poprzez rejestrowanie zmian w sygnałach elektrycznych generowanych podczas sondowania i spożywania ludzkich rąk. Cienkie złote druty są przymocowane do komarów za pomocą przewodzącego srebrnego kleju i podłączone do instrumentu EPG. Ludzki gospodarz trzyma w ręku sondę napięcia substratu. Sondowanie gospodarza przez przewodowego komara zamyka obwód elektryczny, a sygnały elektryczne są rejestrowane na komputerze jako "przebiegi", które można następnie zmierzyć i zliczyć do analizy. Metodologia ta została wykorzystana do scharakteryzowania zachowań związanych z sondowaniem i połykaniem komarów Aedes aegypti i Culex tarsalis i może być stosowana do innych gatunków komarów. EPG może być używany do badania wpływu patogenów, insektycydów i innych czynników na zachowania żywieniowe komarów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komary powodują cierpienie i straty ekonomiczne na całym świecie ze względu na swoją rolę jako wektory chorób i uciążliwe szkodniki1. Komary Anopheles przenoszą malarię, która rocznie powoduje około 219 milionów przypadków na całym świecie, ponad 400 000 zgonów2 i 12 miliardów dolarów amerykańskich kosztów bezpośrednich3. Komary Aedes są najbardziej znaczącymi wektorami o znaczeniu dla zdrowia publicznego, ponieważ są obecne niemal na całym świecie i przenoszą czynniki Chikungunya, gorączki denga, filariozy limfatycznej, gorączki doliny Rift, żółtej febry i Zika, które odbierają życie, przytłaczają systemy opieki zdrowotnej i powodują przewlekłe cierpienie, zachorowalność przez całe życie i niepełnosprawność4,5. Ponadto komary Culex przenoszą czynniki wywołujące zapalenie mózgu koni, japońskie zapalenie mózgu, filariozę limfatyczną, zapalenie mózgu Saint Louis i gorączkę Zachodniego Nilu, które wpływają zarówno na zdrowie ludzi, jak i zwierząt3,4.

Zwalczanie wektorów za pomocą metod opartych na insektycydach jest wiodącą metodą globalnego zwalczania chorób przenoszonych przez wektory6,7. Jednak liczba dostępnych środków owadobójczych do zwalczania komarów jest ograniczona. Ponadto u wielu gatunków, zwłaszcza u komarów z rodzaju Aedes, ewoluuje odporność na insektycydy, co wpływa na naszą zdolność do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory i zwiększa potrzebę nowych strategii zwalczania6,8. Lepsze zrozumienie biologii komarów, interakcji między komarem a gospodarzem i patogenem oraz procesów regulujących przenoszenie patogenów może ułatwić opracowanie nowych narzędzi do kontroli wektorów6.

Zachowania związane z sondowaniem i przyjmowaniem w tkankach gospodarza mogą wpływać na przenoszenie patogenów i patologię chorób9,10,11,12. Na przykład, więcej mikrofilarii zostało spożytych, gdy Aedes aegypti żywił się bezpośrednio z naczyń włosowatych, a nie gromadził krew na zewnątrz pękniętych naczyń krwionośnych13. W związku z tym podstawowe i stosowane badania na ten temat mogą pomóc w opracowaniu, udoskonaleniu i ocenie strategii zwalczania komarów i innych środków zaradczych w przenoszeniu patogenów. Istnieją jednak znaczne luki w wiedzy na temat tajemniczych zachowań związanych z odżywianiem krwią, które zachodzą pod powierzchnią skóry gospodarza, ponieważ zachowania te często wymagają inwazyjnych procedur na żywych modelach zwierzęcych lub wykorzystują przezroczyste sztuczne podłoża lub płynne diety9,11,14,15. Techniki nieinwazyjnej elektropenetracji (EPG; zwanej również wykresem penetracji elektrycznej) zostały wykorzystane do badania zachowań żywieniowych owadów żywiących się roślinami związanych z przenoszeniem patogenów roślinnych, odpornością roślin żywicielskich i sposobami działania insektycydów, ponieważ pozwalają one naukowcom pośrednio obserwować, rejestrować i określać ilościowo ruchy i zachowania aparatu gębowego, które zachodzą w tkankach gospodarza10,12.

Od lat pięćdziesiątych techniki elektronicznego monitorowania penetracji są stosowane do żywiących się krwią stawonogów, w tym komarów16,17,18,19,20. Jednak EPG nigdy nie został powszechnie przyjęty dla stawonogów żywiących się krwią, ponieważ aktywność biologiczna odpowiadająca kształtom fal nigdy nie została zweryfikowana21. Ponadto projekty i elektronika wczesnych instrumentów skutkowały nadmiernym naciskiem na niektóre sygnały elektryczne, wysokimi stosunkami szumu do sygnału, niską rozdzielczością i zniekształceniami przebiegów oraz podrażnieniem kręgowców hostów12,22. Nowsze urządzenie, monitor AC-DC EPG23, ma zmienne ustawienia i ulepszone przetwarzanie sygnału, dzięki czemu lepiej nadaje się do rejestrowania stawonogów żywiących się krwią i rozszyfrowywania biologicznego pochodzenia przebiegów w eksperymentalnych badaniach korelacji10,12.

Dla EPG, sygnał elektryczny jest podawany do hosta przez sondę napięcia podłoża (tj. elektrodę odniesienia). Stawonóg jest przymocowany do elektrody rejestrującej i umieszczony na żywicielu. Kiedy stawonóg wkłada swoje aparaty gębowe (tj. stylety) do żywiciela, sygnał elektryczny jest przesyłany do monitora AC-DC EPG w celu przetworzenia sygnału. Sygnały elektryczne są następnie wyświetlane na komputerze jako "przebiegi" odpowiadające określonym zachowaniom, takim jak ruchy aparatu gębowego, spożycie, wydzielanie śliny i pozyskiwanie/szczepienie patogenów10,12. Sekwencyjne i niesekwencyjne zmienne odpowiedzi związane z czasem trwania i liczbą przebiegów24,25 na różnych poziomach hierarchicznych (rodziny, typy i podtypy) można następnie obliczyć na podstawie częstotliwości i czasu trwania przebiegów, aby uzyskać wgląd w zachowania żywieniowe, które występują w obrębie gatunków i między gatunkami oraz w odpowiedzi na czynniki biotyczne i abiotyczne, takie jak żywiciele, patogeny, pestycydy i warunki środowiskowe10,12.

Do tej pory monitor AC-DC EPG był używany do charakteryzowania zachowań sondowania i przyjmowania Ae. aegypti26 i Culex tarsalis27 komarów żywiących się ludzkimi rękami, oraz kleszczy Dermacentor variabilis i Amblyomma americanum żerujących na cielętach bydła28. Ponadto niedawno opracowano mysi model dla EPG29, aby ułatwić badania patogenów przy użyciu tego instrumentu. Ludzkie ręce są idealne do początkowej charakterystyki kształtu fali komara, ponieważ ludzcy gospodarze mogą zgłaszać, kiedy czują sondowanie komara, a także inne zachowania, co ułatwia korelację przebiegów z zachowaniami (Tabela 1). Ponadto lepsze zrozumienie plastyczności zachowań żywieniowych komarów w różnych populacjach ludzkich może przyczynić się do opracowania bardziej wyspecjalizowanych interwencji w zakresie zarządzania komarami i przenoszonymi przez nie patogenami.

Tabela 1: Opis rodzin przebiegów używanych do klasyfikacji sygnałów elektrycznych zarejestrowanych z Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą AC-DC EPG. Faza sondowania i aktywność biologiczna odpowiadająca każdej rodzinie przebiegów. Więcej informacji można znaleźć w Cooper et al.27. Skrót: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Aby ułatwić korzystanie z EPG do badania biologii komarów i interakcji gospodarz-wektor, przedstawiono tutaj metodologię ilościowego określania zachowań żywieniowych komarów Cx. tarsalis na ludzkich rękach za pomocą monitora AC-DC EPG. Protokoły te opierają się na podstawowych procedurach AC-DC EPG opisanych w zasobach online30 i zakładają, że użytkownicy mają podstawową wiedzę praktyczną na temat AC-DC EPG i powiązanego oprogramowania31. Przedstawione procedury mogą być modyfikowane dla innych gatunków komarów i żywicieli i stanowią podstawę ułatwiającą oparte na hipotezach badania zachowań żywieniowych komarów.

Tabela 2: Definicje powszechnej terminologii AC-DC EPG. Definicje są oparte na definicjach podanych w zasobach internetowych30,31 i literaturze naukowej32. Skrót: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół (IRB-10729) został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) for Human Research at Kansas State University27 i jest przeznaczony do użytku tylko z komarami wolnymi od patogenów. Ochotnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu i opublikowanie swoich danych. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac ze zwierzętami, ludźmi lub zagrożeniami biologicznymi upewnij się, że wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednie instytucjonalne komitety regulacyjne lub osoby nadzorujące. Szczegółowe informacje na temat całego sprzętu i materiałów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Wstępne przygotowanie i konfiguracja

  1. Skonfiguruj monitor AC-DC EPG (Rysunek 1A), klatkę Faradaya (Rysunek 1B,C) i oprogramowanie zgodnie z wcześniejszym opisem30,31, korzystając z modyfikacji opisanych poniżej (kroki 1.1.1-1.1.5). Zapoznaj się z zasobami online30, aby uzyskać instrukcje krok po kroku dotyczące konfiguracji i użytkowania sprzętu i oprogramowania. Zapisz żądaną konfigurację jako domyślną w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem i przeglądania przebiegów. Tabela 2 zawiera listę popularnych terminów AC-DC EPG i ich definicje.
    1. Podłącz stopień główny amplifier (wzmacniacz główny) i sonda napięcia podłoża do kanału 1 skrzynki sterowniczej.
      UWAGA: Nagrywanie z jednego kanału jest prezentowane, mimo że monitor AC-DC może jednocześnie pomieścić cztery owady i gospodarzy.
    2. Upewnij się, że kanał 1 w skrzynce sterowniczej jest włączony, a odpowiednie kanały Pre-1 i Post-1 w skrzynce interfejsu przełącznika są włączone.
      UWAGA: Kanały, które nie są używane, muszą pozostać wyłączone.
    3. Użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby umożliwić kanałom 1 i 3 na płycie analogowo-cyfrowej DI-710 (ale nie innym) nagrywanie sygnałów przed i po wyprostowaniu.
    4. Sformatuj oprogramowanie do zarządzania sprzętem, aby wyświetlić/nałożyć na siebie przebiegi przed i po wyprostowaniu (np. 1 = 1 dla sygnału wstępnego i 2 = 3 dla sygnału końcowego).
    5. Ustaw częstotliwość próbkowania w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem na 100 próbek na sekundę na kanał (tj. S/s/CHAN: 100).
  2. Zbuduj odcinki owadów26,27,29,30:
    1. Rozgrzej lutownicę do temperatury zalecanej dla konkretnego lutu z rdzeniem kalafoniowym.
    2. Użyj narzędzia do ściągania izolacji z drutu, aby zdjąć plastikową powłokę ~6 cm od końca rolki drutu miedzianego 20 AWG, ale unikaj przecinania lub oznaczania wiązki drutu miedzianego wewnątrz (Rysunek 2A). Następnie odetnij odsłoniętą wiązkę drutu miedzianego i rozwiń na poszczególne pasma (Rysunek 2B).
    3. Za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami owinąć jedno pasmo drutu miedzianego wokół wału odpowiedniej szyldu pod (tj. płaskiej góry), tak aby większość drutu miedzianego wystawała poza kołka. Złóż końcówkę drutu nad sworznia, aby zabezpieczyć drut na miejscu ( Rysunek 2C).
      UWAGA: Zamontuj testowe kołki szyldy, aby zidentyfikować te, które ściśle pasują do portu wzmacniacza głównego (gdy jest wyłączony, odłączony i ustawiony na 106 Ohm (Ω)).
    4. Zaciśnij trzon kołka szyldu w pomocnej dłoni przyrząd lutowniczy tak, aby drut miedziany był skierowany do góry. Następnie nałóż małą kroplę (~0,2 cm) rozpuszczalnego w wodzie topnika na połączenie kołka szyldowego i drutu miedzianego (Rysunek 2D).
      UWAGA: Topnik jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    5. Rozwiń ~10 cm lutu i wyprostuj go. Przyłóż gorącą lutownicę do łba kołka przez kilka sekund, aż topnik się stopi, a metal będzie gorący. Następnie dociśnij końcówkę lutu do główki kołka obok lutownicy, aż lut stopi się i całkowicie pokryje złącze, stapiając kołek i drut w kikut owada.
    6. Gdy kikut owada ostygnie, wyczyść końcówkę lutownicy wełną stalową i wilgotną gąbką.
    7. Po ostygnięciu usuń kikut owada z pomocnych rąk. Opłucz kikut owada w 70% etanolu, a następnie w wodzie, aby usunąć resztki topnika. Przytnij drut miedziany do żądanej długości (~3 cm, Rysunek 2E).
    8. Powtarzaj kroki 1.2.3-1.2.7, aż zostanie zbudowanych 20-30 odcinków owadów.
  3. Złóż aspirator do owadów26,27:
    1. Przełóż końcówkę szklanej pipety Pasteura przez płomień, lekko obracając pipetę. Powtarzaj tę czynność do momentu, gdy końcówka pipety będzie miała odpowiedni rozmiar, aby ściśle przylegać do brzucha owada.
    2. Przykryj duży koniec zmodyfikowanej pipety Pasteura moskitierą, a następnie włóż ją bezpośrednio do silikonowej rurki podłączonej do aspiratora laboratoryjnego i zabezpiecz złącze taśmą izolacyjną, aby utworzyć aspirator dla owadów (Rysunek 2H).
      UWAGA: Pipetę Pasteura i siatkę można włożyć do krótkiego plastikowego rurki wyposażonego w szybkozłączkę ułatwiającą przełączanie między różnymi rozmiarami (Rysunek 2H).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Konfiguracja sprzętu monitorującego AC-DC EPG do nagrywania na ludzkich rękach. (A) Komponenty EPG, w tym (1) skrzynka kontrolna, (2) skrzynka interfejsu przełącznika, (3) zasilacz, (4) płyta A/D DI-710, (5) komputer, (6) regulator mocy, oraz (B) klatka Faradaya zawierająca (C) mikroskop cyfrowy (7) na statywie na gęsiej szyi, (8) folia bąbelkowa i poduszki powietrzne, (9) sonda napięcia podłoża i (10) wzmacniacz stopnia głównego na stanowisku laboratoryjnym. Skróty: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, EPG = elektropenetrograf. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Elektrody rejestrujące do okablowania komarów oraz aspirator do owadów do manipulowania komarami podczas okablowania. (A) Drut miedziany 20 AWG z 6 cm plastikową powłoką usunięty, aby odsłonić wiązkę drutu miedzianego wewnątrz. (B) Poszczególne żyły wiązki drutu miedzianego. (C) Jedna żyła drutu miedzianego owinięta wokół główki mosiężnej szyldu z ogonem drutu złożonym nad kołka. (D) Odrobina topnika na styku mosiężnej szyldu i drutu miedzianego trzymanego przez pomocny pomocnik lutowniczy w ramach przygotowań do. (E) Kompletny kikut owada zbudowany z mosiężnego gwoździa przylutowanego do drutu miedzianego. (F) Elektroda rejestrująca zbudowana ze złotego drutu owiniętego wokół czubka miedzianego drutu kikuta owada i zabezpieczona na miejscu srebrnym klejem. (G) Zbliżenie na złotą pętlę na czubku elektrody rejestrującej. (H) Zmontowany (na górze) i zdemontowany (na dole) aspirator do owadów wykonany ze zmodyfikowanych pipet Pasteura, moskitiery, rurki z tworzywa sztucznego, taśmy izolacyjnej i szybkozłączy męskich, obok rurki aspiratora laboratoryjnego wyposażonej w szybkozłączkę żeńską (u góry po prawej). Podziałka = 1 cm (A-F), 200 μm (G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Okablowanie komarów

  1. Przygotuj komary i srebrny klej (po południu/wieczorem przed EPG):
    1. Hoduj i utrzymuj komary szczepu Cx. tarsalis KNWR zgodnie z wcześniejszym opisem27.
    2. Szybkie dorosłe samice komarów, 5-17 dni po eklozji, przez 8-12 godzin, aby zwiększyć tempo sondowania, ale umożliwić dostęp do wody, aby uniknąć śmiertelności.
    3. Przygotuj świeży srebrny klej26,27,28,29,30:
      1. Dodać 510 mg płatków srebra o wielkości 4-8 μm do zlewki o pojemności 20 ml. Wytaruj wagę i dodaj 1,100 mg nietoksycznego kleju szkolnego do zlewki na wierzchu płatka srebra.
      2. Wytaruj wagę, dodaj 510 mg płatków srebra o grubości 8-10 μm do zlewki na wierzchu kleju, a następnie dodaj 1000 μl wody za pomocą pipety.
      3. Delikatnie dodaj mieszadło do zlewki i umieść je na talerzu do mieszania. Zacznij powoli mieszać, stopniowo zwiększaj do ustawienia "szybki" i mieszaj przez 4 minuty. Upewnij się, że cała zawartość jest włączona.
      4. Za pomocą pipety transferowej (z odciętą końcówką) przenieś srebrny klej do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      5. Owiń górne części srebrnych tubek kleju Parafilm i przechowuj na blacie do czasu użycia.
        UWAGA: Srebrny klej ma odpowiednią konsystencję do 2 dni, ale zaleca się zrobienie świeżego kleju wieczorem przed użyciem30.
  2. Przygotuj elektrody rejestrujące26,27,29,30:
    1. Przed użyciem energicznie wymieszaj srebrny klej.
    2. Owiń blok pianki świeżą folią, aby pomieścić przygotowane kikuty owadów i komary drutowe.
      UWAGA: Pianka musi być wystarczająco duża, aby komary z drutu mogły stać na powierzchni bez dotykania się nawzajem, ale wystarczająco mała, aby zmieścić się w pudełku do przechowywania. UWAGA: Kropelki wydalnicze uwalniane po karmieniu krwią mogą zawierać patogeny. Po użyciu należy odpowiednio wyrzucić plastikową folię/blok pianki.
    3. Usuń nalot (i stary srebrny klej w przypadku ponownego użycia kikutów owadów) z końcówki drutu miedzianego, zeskrobując górny 1 cm drutu miedzianego żyletką, aż będzie błyszczący ze wszystkich stron. Przygotuj jeden kikut owada na każdego komara plus kilka dodatków.
    4. Pokrój złoty drut o średnicy 0,025 mm na kawałki o długości 4-5 cm. Zawsze trzymaj drut w samozamykających się kleszkach zamaskowanych taśmą, aby uniknąć wgniecenia drutu.
      UWAGA: Złoty drut jest znacznie łatwiejszy do zobaczenia na czarnym tle.
    5. Umieść koniec złotego drutu wzdłuż czystej końcówki drutu miedzianego kikuta owada i delikatnie owiń złoty drut 3x wokół drutu miedzianego.
    6. Użyj sondy preparucyjnej, aby nałożyć srebrny klej, aby utrzymać złoty drut na miejscu. Upewnij się, że nie ma ogona ani luźnego końca. Umieść kikut owada w piance, aż klej wyschnie.
    7. Delikatnie pogłaszcz złoty drut przymocowany do kikuta owada, aby go wygładzić i uformować w długi, delikatny łuk (Rysunek 2F). Przytnij drut do żądanej długości (~2,5-3 cm).
    8. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, użyj cienkich kleszczyków, aby zrobić złotą pętlę na końcu złotego drutu i zegnij pętlę pod kątem 90°, jak opisano poniżej (kroki 2.2.8.1-2.2.8.4; Rysunek 2E,F). Upewnij się, że złota pętla jest całkowicie zamknięta. Umieść kikut owada z powrotem w bloku piankowym.
      1. Używając ręki niedominującej, przytrzymaj kikut owada za mosiężny gwóźdź, tak aby końcówka złotego drutu dotykała stolika mikroskopu. Używając dominującej ręki, chwyć sam koniec złotego drutu cienkimi kleszczami.
      2. Za pomocą kleszczyków precyzyjnych skrzyżuj końcówkę złotego drutu nad miedzianym drutem kikuta owada w pobliżu miejsca, w którym przyklejony jest złoty drut. Dotknij końcem szczypiec precyzyjnych i złotego drutu do stolika mikroskopu.
      3. Delikatnie pociągnij za kikut owada, aż złoty drut utworzy małą złotą pętlę wokół końcówki cienkich kleszczyków punktowych (nie ciągnij zbyt mocno). Zwolnij złoty drut i ostrożnie wyjmij kleszcze.
      4. Trzymając kikut owada w niedominującej ręce, chwyć złotą pętlę cienkimi kleszczami punktowymi tak, aby kleszcze były pod kątem prostopadłym do szyjki drutu, a końcówka kleszczy obejmowała środek złotej pętli, chwytając w ten sposób obie strony pętli. Delikatnie pociągnij za kikut owada, jednocześnie lekko obracając kleszcze od kikuta owada, aż pętla zostanie zgięta pod kątem 90° do szyjki drutu (Rysunek 2G).
  3. Podłącz elektrody rejestrujące do komarów26,27,29,30 (poranek EPG):
    1. Znieczulenie komarów na czczo gazem CO2 do momentu ustania całego ruchu. Ułóż komary na plecach na podkładce anestezjologicznej, tak aby ich brzuchy były skierowane w stronę badacza.
    2. Umieść ~2 cm kawałek taśmy laboratoryjnej pod mikroskopem preparacyjnym, lepką stroną do dołu. Umieść 0,5 cm kropli (~ 10 μl) srebrnego kleju na taśmie.
    3. Zassać brzuch znieczulonego komara do zmodyfikowanej pipety Pasteura, używając ssania tylko na tyle długiego, aby osadzić brzuch na miejscu. Przytrzymaj komara pod lunetą sekcyjną nad srebrnym klejem za pomocą aspiratora.
      UWAGA: Skrzydełka mogą znajdować się wewnątrz lub na zewnątrz końcówki zmodyfikowanej pipety Pasteura, ale umieszczenie ich w środku zapobiegnie wypadnięciu komara. Unikaj zginania lub uszkadzania skrzydeł.
    4. Pracując szybko, zanurz maleńką szpilkę w srebrnym kleju i nałóż cienką warstwę na przedplecze komara (tj. grzbietową powierzchnię klatki piersiowej). Jeśli to możliwe, natychmiast przejdź do następnego kroku (lub w razie potrzeby ponownie znieczul komara).
      UWAGA: Zaleca się usuwanie łusek na przedpleczu poprzez pocieranie szpilki w przód iw tył, aby zapewnić penetrację kleju przez pory w naskórku. Unikaj kontaktu kleju z żadną inną częścią komara.
    5. Szybko zanurz złotą pętlę na końcu elektrody nagrywającej w srebrnym kleju i umieść ją w srebrnym miejscu kleju na przedpleczu komara. Kołysz pętlą w przód iw tył, aby upewnić się, że przylega równo do przedplecza. Przytrzymaj drut, aż klej wyschnie (~20-25 s).
    6. Wymień kikut owada w piance pod kątem, który pozwoli komarsowi wygodnie stać, gdy się obudzi. Kontynuuj okablowanie następnego mosquito.
      UWAGA: Zaleca się robienie notatek na temat jakości każdego zadania okablowania.
    7. Po okablowaniu żądanej liczby komarów umieść blok pianki w pudełku do przechowywania. Utrzymuj komary w normalnych warunkach chowu do czasu użycia.

3. Przygotowanie i przygotowanie EPG (rano przed EPG)

  1. Włącz monitor AC-DC EPG (przestawiając przełącznik na zasilaczu) co najmniej 30 minut przed nagrywaniem, aby umożliwić wyrównanie instrumentu i rozwiązywanie problemów.
    UWAGA: Kanały używane w skrzynce sterowniczej i skrzynce interfejsu przełącznika mogą pozostać włączone.
  2. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do zarządzania sprzętem.
    UWAGA: Jeśli sygnały nie są wyświetlane jako płaskie, cienkie linie, wymagane jest rozwiązywanie problemów (patrz sekcja dyskusji).
  3. Wykonaj test dotykowy27,30, aby sprawdzić funkcjonalność sprzętu:
    1. Po uziemieniu (tj. dotykając klatki Faradaya gołą skórą), przekręć pokrętło na wzmacniaczu głowicy na 106 Ω i włóż trzonek króćca owadów do portu.
      UWAGA: Przeprowadzenie testu dotykowego na wyższym poziomie rezystancji wejściowej (Ri) może spowodować uszkodzenie wzmacniacza głównego.
    2. Po uziemieniu włącz wzmacniacz głowicy i mocno chwyć miedziany drut króćca owada między palcem wskazującym a kciukiem trzy razy. Jeśli EPG działa poprawnie, na ekranie pojawią się trzy duże piki zarówno w sygnałach przed, jak i po. Jeśli tak nie jest, wymagane jest rozwiązywanie problemów (patrz sekcja dyskusji).
  4. Dostosuj ustawienia instrumentu do prądu przemiennego (AC) 150 mV z Ri 107 Ω, wzmocnieniem sprzętowym 20-40x, ujemnym przesunięciem, natywną linią bazową i wzmocnieniem programowym 8-16x27,30, jak opisano poniżej (kroki 3.4.1-3.4.3).
    1. Ustaw napięcie, typ prądu, wzmocnienie sprzętowe (zakres, wzmocnienie i mnożnik), przesunięcie i linię bazową (zero) za pomocą przełączników i pokręteł na kanale 1 skrzynki sterowniczej.
      UWAGA: Odpowiednie ustawienie wzmocnienia sprzętowego zależy od jakości okablowania i srebrnego kleju, więc oczekuje się zmian w optymalnych ustawieniach wzmocnienia od komara do komara i z dnia na dzień. Wzmocnienie sprzętowe może wymagać regulacji w trakcie nagrywania, jeśli sygnał osiąga szczyt (zdefiniowany w Tabeli 2 i pokazany w Rysunek 3A, C) lub jest zbyt mały do wizualizacji. Wszelkie zmiany wzmocnienia sprzętowego będą miały trwały wpływ na nagrywanie (pokazane w Rysunek 3A,C).
    2. Ustaw poziom Ri za pomocą pokrętła na wzmacniaczu głównym.
    3. Ustaw i dostosuj wzmocnienie oprogramowania za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem (np. wybierz sygnał przed lub po sygnale, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zwiększyć wzmocnienie oprogramowania lub kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmniejszyć wzmocnienie oprogramowania).
      UWAGA: Wszelkie zmiany wzmocnienia dokonane w oprogramowaniu NIE wpłyną trwale na nagranie.
  5. Skonfiguruj nowe nagranie w oprogramowaniu do zarządzania sprzętem, ale nie rozpoczynaj nagrywania do kroku 4.3 w następnej sekcji.

4. EPG na ludzkich rękach26,27 :

  1. Po uzyskaniu świadomej zgody (zgodnie z IRB instytucji macierzystej), niech gospodarz usiądzie obok klatki Faradaya z jedną ręką w środku, chwytając sondę napięcia podłoża i trzymając ją poniżej głowicy amp.
    UWAGA: Ramię musi wygodnie spoczywać na folii bąbelkowej lub podobnym nieprzewodzącym podłożu. Ręka i substate voltage sonda nie może stykać się z klatką Faradaya lub głową amp podczas nagrywania. Aby uniknąć uszkodzeń, konieczne jest, aby ochotnik nie dotykał wzmacniacza głównego, gdy jest on włączony. Jeśli wzmacniacz head zostanie przypadkowo dotknięty, wykonaj test dotykowy opisany powyżej, aby ocenić jego funkcjonalność.
  2. Gdy host znajdzie się na swoim miejscu, obróć wzmacniacz głowicy na bok. Wyjmij przewodową komara, która jest w pudełku do przechowywania i podłącz ją do instrumentu, wkładając mosiężny kołek króćca owadów do portu w wzmacniaczu głowy. Zostaw zwisającego komara.
    UWAGA: Trzymaj w pobliżu butelkę z rozpylaczem 70% etanolu, aby kontrolować wszelkie komary, które odczepiają się od drutu.
  3. Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem. Umieść głowicę amp nad ręką, aby komar mógł wygodnie stać i sondować.
  4. Włącz wzmacniacz główny, gdy jest uziemiony. Uruchom 10-minutowy timer. Dostosuj pozycję ręki gospodarza zgodnie z potrzebami, aby pomóc w pomyślnym pomiarze.
    UWAGA: W przypadku używania komarów skłonnych do natychmiastowego sondowania, włącz głowicę amp przed umieszczeniem komara na dłoni. Cienki drewniany kołek lub nieprzewodzący uchwyt pędzla może być użyty do zgięcia miedzianego drutu kikuta owada, aby jeszcze bardziej dostosować pozycję komara. Szkło powiększające lub mikroskop cyfrowy na stojaku na gęsiej szyi może pomóc w obserwacji komara podczas EPG, szczególnie w przypadku badań korelacji behawioralnych.
  5. Użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem, aby dokonywać obserwacji ze znacznikami czasu (np. znaczników zdarzeń) podczas nagrywania dotyczących reakcji gospodarza, zachowań komarów, zmian wzmocnienia itp.). Dostosuj położenie sygnałów na ekranie i wzmocnienie oprogramowania zgodnie z potrzebami, aby oba sygnały były wyraźnie widoczne na ekranie. Dostosuj wzmocnienie sprzętowe, jeśli sygnał(y) osiąga szczyt (Rysunek 3A, C i Tabela 2) lub jeśli fale wydają się zbyt małe, gdy wzmocnienie programowe jest maksymalne. Dostosuj przesunięcie, jeśli obserwuje się zagięcie prostownika (Rysunek 3C, C' i Tabela 2). Szczegółowe instrukcje dotyczące wprowadzania tych zmian można znaleźć w instrukcji oprogramowania31 oraz w zasobach online30.
    1. Aby dostosować położenie sygnałów na ekranie, wybierz sygnał przed lub po (np. klikając
      1 = 1       lub 2 = 3), a następnie przeciągnij sygnał w żądane miejsce na ekranie (najlepiej blisko środka ekranu, ale nie nakładając
      2. się na siebie).
    2. Aby dostosować wzmocnienie oprogramowania, użyj oprogramowania do zarządzania sprzętem opisanego w kroku 3.4.3.
    3. Aby wyregulować wzmocnienie sprzętowe, zacznij od przekręcenia pokrętła wzmocnienia kanału 1 w prawo lub w lewo, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć wzmocnienie. Jeśli ta regulacja nie jest wystarczająca do wyeliminowania szczytowego wyjścia (zbyt wysokie wzmocnienie; Rysunek 3A,C) lub pozwól na wyraźną wizualizację szczegółów sygnału (zbyt niskie wzmocnienie), przestaw przełączniki zakresu kanału 1 i mnożnika, aby jeszcze bardziej dostosować wzmocnienie.
      UWAGA: Używanie znaczników zdarzeń do rejestrowania, kiedy wzmocnienie sprzętowe zostało wyregulowane, jest zalecane, aby pomóc w interpretacji danych falowych.
    4. Aby wyregulować przesunięcie, przestaw przełącznik przesunięcia kanału 1 na skrzynce sterowniczej w położenie neg, a następnie obracaj pokrętłem przesunięcia kanału 1, aż szczyty w sygnałach przed i po wystąpią w tym samym kierunku na ekranie komputera. Jeśli pokrętło przesunięte zostanie obrócone zbyt daleko, sygnał końcowy zostanie ponownie odwrócony.
  6. Jeśli komar nie sonduje w ciągu 10 minut (lub innego określonego punktu czasowego), wyłącz głowicę amp. Jeśli komar znajduje się w połowie sondy w momencie oznaczenia czasu, pozwól mu zakończyć sondowanie przed wyłączeniem wzmacniacza głowicy. Poproś gospodarza, aby ostrożnie usunął rękę, a następnie usuń komara za pomocą dołączonego kikuta owada. Wymień komar w pudełku do przechowywania.
  7. Zatrzymaj/zamknij nagrywanie za pomocą oprogramowania do zarządzania sprzętem. Kontynuuj z EPG na następnym komarze (krok 4.2).
    UWAGA: Pamiętaj, aby zmienić nazwę pliku po każdym komarze.
  8. Wyłącz wzmacniacz główny i źródło zasilania po zakończeniu sesji i zamknij oprogramowanie.
  9. Zapoznaj się z Oświadczeniem Podsumowującym Uczestnika lub podobnym z wolontariuszem, jak określono w zatwierdzonym IRB.
  10. Utylizuj komary zgodnie z wymaganiami protokołu. Usuń folię z bloku piankowego i odpowiednio ją wyrzuć.
  11. Po zakończeniu zbierania wszystkich danych przejrzyj i zmierz przebiegi, a następnie przeanalizuj dane zgodnie z wcześniejszym opisem24,25,26,27,29,30. Zapoznaj się z zasobami online30, aby uzyskać instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z oprogramowania do przeglądania przebiegów, tworzenia rysunków przedstawiających przebiegi, mierzenia przebiegów, eksportowania danych do analizy, przeprowadzania analizy statystycznej oraz szczegółowego wyjaśnienia typowych zmiennych odpowiedzi na przebiegi.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przykłady nieoptymalnych nagrań spowodowanych przekroczeniem, zmianami wzmocnienia skrzynki kontrolnej, niejasnymi zmianami napięcia spowodowanymi gorszym okablowaniem, zagięciem prostownika i szumami. Kształty fal od komarów Culex tarsalis żerujących do syta na ludzkich rękach, zniekształcone przez (A) wygięcie (niebieska strzałka pozioma) i późniejsze zmiany wzmocnienia skrzynki sterowniczej od 100x do 80x, od 40x, od 60x, od 40x do 20x (pomarańczowe strzałki pionowe), (B) niejasne zmiany napięcia, oraz (C) zagięcie prostownika w sygnale post- (czarnym) w porównaniu z sygnałem przed (czerwonym) (patrz przebieg J, zbliżenie pokazane w panelu C'), szum linii (fala sinusoidalna 11 Hz widoczna tylko w sygnale pre-rektyfikacyjnym (czerwonym), zbliżenie pokazane w panelu C'), szczytowanie (niebieska strzałka pozioma) i zmiana wzmocnienia skrzynki kontrolnej z 500x na 200x (pomarańczowa strzałka pionowa). Nazwy przebiegów są wyświetlane w górnej części każdego panelu. Fioletowe strzałki w prawym dolnym rogu panelu C wskazują, kiedy wzmacniacz główny został wyłączony po zakończeniu sondy i stanowią kolejny przykład zagięcia prostownika. Czerwone poziome linie związane z sygnałem pre-rektyfikacyjnym w panelu C wskazują, kiedy znaczniki zdarzeń zostały użyte do nagrania notatek ze znacznikiem czasu. Poziomy Ri, zastosowane sygnały, skale czasowe i zyski oprogramowania wynoszą (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4,4 s/dz., 128x; oraz (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7,4 s/dz., 2x; (C') 0,2 s/działkę, 8x. Skróty: AC = prąd przemienny, DC = prąd stały, Ri = rezystancja wejściowa, mV = miliwolt, Ω = Ohm, s/div = sekundy na działkę. Rysunek ten został przygotowany na podstawie danych z Cooper et al.27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagrania AC-DC EPG krwi komarów Cx. tarsalis żywiących się ludzkimi rękami (Rysunek 4) wygenerowały możliwe do interpretacji przebiegi nadające się do analizy i publikacji27. Interpretowalne przebiegi zawierały odrębne, rozróżnialne powtarzające się wzorce, które można było sklasyfikować do rodzin przebiegów (Tabela 1 i Rysunek 4), typów i podtypów, gdy kompresja (zdefiniowana w Tabeli 2) i wzmocnienie programowe zostały dostosowane w oprogramowaniu do przeglądu przebiegów27,31. Wszystkie rodziny przebiegów (J, K, L, M, N) i typy (L1, L2, M1, M2) wcześniej opisane w Ae. aegypti feeding on human hands26 zostały zidentyfikowane w przebiegach generowanych przez Cx. tarsalis żywiących się ludzkimi rękami, weryfikując poprawność opisanych tu metod. Ponadto zidentyfikowano trzy nowe typy fal (M3, N1, N2) oraz liczne podtypy L1, L2, M1 i M227. Ponadto spadek napięcia z powrotem do wartości wyjściowej, gdy aparaty gębowe są usuwane z hosta, został nazwany rodziną przebiegów W27.

Systematyczne zmienianie ustawień instrumentu (aktualny typ i poziomy Ri) przy jednoczesnym przestrzeganiu opisanych tutaj procedur pozwoliło na określenie optymalnych ustawień do nagrywania Cx. tarsalis żerujących na ludzkich rękach, elektrycznego pochodzenia każdego przebiegu, średniego czasu trwania w sekundach kompletnych i niekompletnych sond na komara, oraz do statystycznego porównania czasu trwania fali w sekundach na owada (WDI), liczba zdarzeń falowych na owada (NWEI) i czas trwania fali w sekundach na zdarzenie na owada (WDEI) w ustawieniach27. Komary były również przerywane podczas różnych przebiegów i analizowane w celu określenia, który przebieg był skorelowany ze spożyciem krwi27. Podobne badanie przeprowadzono dla Ae. aegypti przy użyciu porównywalnej metodologii26.

Ze względu na wrażliwą i skomplikowaną naturę EPG, nie wszystkie nagrania były tak nieskazitelne, jak te pokazane na Rysunek 4. Szczytowanie (Rysunek 3A,C), zmiany wzmocnienia sprzętowego (Rysunek 3A,C), gorsze zadania okablowania (Rysunek 3B), zagięcie prostownika w przebiegu J (Rysunek 3C,C') i szum elektryczny (Rysunek 3C,C') czasami zniekształcały i maskowały przebiegi falowe, co sprawiało, że nie nadawały się one do wykorzystania w danych dotyczących jakości publikacji oraz utrudniały ocenę i analizę. W związku z tym zaleca się wysiłek front-end, aby doskonalić umiejętności okablowania, optymalizować ustawienia wzmocnienia i napięcia, dostosowywać przesunięcie i kontrolować szum elektryczny. Co ciekawe, zagięcie prostownika zaobserwowano tylko w rodzinie fal J dla Cx. tarsalis (Rysunek 3C,C') i nie powtórzyło się po początkowym dostosowaniu przesunięcia, nawet gdy użyto innych gatunków komarów (Ae. aegypti i Culex quinquefasciatus) (dane nie pokazane). Ponadto rozwiązywanie problemów wykazało, że niekontrolowany szum elektryczny pokazany w Rysunek 3 (panele C i C') wynikał z wadliwej klatki Faradaya. Nagrania wykonane w wadliwej klatce Faradaya nadal nadawały się do użytku, ale problemy z szumami zostały rozwiązane, gdy zbudowano ulepszoną klatkę Faradaya (Rysunek 1B).

Nawet pomimo podjęcia wszelkich środków ostrożności i optymalizacji front-endu, niewielkie różnice w jakości mocowania elektrody do komara i inne nieznane czynniki, które zniekształcały sygnał i zmieniały stosunek sygnału do szumu, okresowo powodowały, że konieczne było dostosowanie wzmocnienia sprzętowego w trakcie nagrywania, aby upewnić się, że sygnał był w zakresie widzialnym, a rozdzielczość szczytów w każdym kształcie fali była wystarczająca do identyfikacji i charakterystyki przebiegu. Niestety, dostosowanie wzmocnienia sprzętowego w trakcie nagrywania może spowodować nagłe zmiany napięcia (Rysunek 3A, C), co sprawia, że przebiegi nie nadają się do publikacji, ale nadal nadają się do użytku (w całości lub częściowo) do pomiarów i analiz.

figure-results-1
Rysunek 4: Reprezentatywne przebiegi z sondy Culex tarsalis na ludzkiej dłoni zarejestrowane z Ri 107 Ω przy użyciu przyłożonego sygnału 250 mV AC. Nazwy przebiegów na poziomie rodziny (NP, J, K, L, M, W) są wyświetlane w górnej części każdego panelu. Dolne panele pokazują powiększenia wybranych regionów w panelu A. Wstawione panele pokazują powiększenia wskazanych obszarów. Skale czasowe i zyski z oprogramowania wynoszą (A) 7,0 s/działkę, 16x; (B) 1,0 s/działkę, 64x; (B') 0,2 s/działkę, 64x; (C) 1,0 s/działkę, 64x; (C') 0,2 s/działkę, 32x; (D) 1,0 s/działkę, 64x; (D') 0,2 s/działkę, 64x. Skróty: AC = prąd przemienny, Ri = rezystancja wejściowa, mV = miliwolt, Ω = Ohm, s/div = sekundy na działkę. Ten rysunek został przygotowany na podstawie danych z Cooper et al.27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas korzystania z AC-DC EPG bardzo ważne jest, aby mieć podstawową wiedzę na temat obsługi sprzętu i oprogramowania30 oraz uważnie postępować zgodnie z opisanymi w nim protokołami, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu. Przede wszystkim unikaj dotykania wzmacniacza głównego, gdy jest włączony, chyba że jest uziemiony na klatce Faradaya. Zaleca się nagrywanie jak najdalej w klatce Faradaya30. Drzwi klatki niekoniecznie muszą być zamknięte, aby uzyskać możliwe do interpretacji przebiegi, chyba że nagrywa się w środowisku o nadmiernym hałasie elektrycznym otoczenia. W klatce Faradaya nie może znaleźć się nic, co jest zmotoryzowane. Ważne jest, aby pamiętać, że sama klatka Faradaya musi być uziemiona elektrycznie wyłącznie przez wzmacniacz główny, aby działała poprawnie. Osiąga się to poprzez podłączenie wzmacniacza czołowego do metalowego statywu laboratoryjnego z farbą zeszlifowaną z jednej stopy statywu, aby umożliwić przewodzącą ścieżkę dla energii elektrycznej przechwyconej przez klatkę Faradaya do stanowiska laboratoryjnego, do metalowej obudowy wzmacniacza głównego, w dół przewodu do skrzynki sterowniczej, Poprzez zasilacz do prawidłowo uziemionego gniazdka ściennego, a do ziemi przez uziemienie budynku30. Multimetr może być używany do sprawdzania jakości połączenia między elementami wewnątrz klatki poprzez pomiar rezystywności (która jest odwrotnością przewodności) między różnymi punktami. Bezprzewodowe radio AM można również umieścić wewnątrz klatki Faradaya, aby sprawdzić, czy dźwięk jest znacznie zredukowany (lub najlepiej wyeliminowany) po zamknięciu drzwi, potwierdzając, że klatka Faradaya odpowiednio przechwytuje sygnały elektryczne w powietrzu (E. Backus per. Comm.).

Właściwe i ustandaryzowane przygotowanie kleju srebrnego oraz przymocowanie elektrod rejestrujących do owadów mają kluczowe znaczenie dla uzyskania użytecznych nagrań. Naskórek owada jest izolatorem i działa jak kondensator, jeśli srebrny klej nie wnika odpowiednio w pory naskórka, aby stworzyć ścieżkę dla elektryczności przemieszczającej się z wnętrza owada do złotego drutu na powierzchni przedplecza30. Przygotuj srebrny klej w tym samym czasie przed każdą sesją EPG, pracuj ze świeżym srebrnym klejem z tubki i często zastępuj go energicznie wirowanym srebrnym klejem podczas procedury okablowania. Upewnij się, że złota pętla jest umieszczona przy klatce piersiowej tak, aby cała pętla stykała się z naskórkiem i nie była przechylona na jedną stronę ani oddzielona grubą warstwą srebrnego kleju i łusek, aby pomóc w utworzeniu silnego połączenia elektrycznego, a także zapobiec oderwaniu się i ucieczce komara z drutu.

Opisane tutaj protokoły muszą być zoptymalizowane podczas pracy z różnymi gatunkami komarów. Optymalne ustawienia EPG (poziom Ri, napięcie, typ prądu i wzmocnienie sprzętowe) do nagrywania na danym stawonogu muszą być eksperymentalnie określone12,30. Jednak po dostosowaniu przesunięcia nie będzie trzeba go ponownie regulować podczas pracy z podobnymi komarami. Określono optymalne ustawienia dla AC-DC EPG z Ae. aegypti26 i Cx. tarsalis27. Biblioteki przebiegów (zdefiniowane w tabeli 2) dla dodatkowych gatunków ułatwią przyjęcie EPG w odniesieniu do komarów. Konieczne jest również zoptymalizowanie znieczulenia dla interesującego go komara, ponieważ zachowanie związane z odżywianiem się krwią może być różnie zakłócone w zależności od gatunku komara i wyboru znieczulenia. Na przykład Cx. tarsalis wymaga 4-godzinnego okresu rekonwalescencji po 15 minutach znieczuleniaCO2, podczas gdy w przypadku Ae. aegypti 15-minutowy okres rekonwalescencji jest wystarczający po 15-minutowym okresie znieczulenia lodem. Culex tarsalis są jednak trudne do strącenia przy ekspozycji na zimno, dlatego CO2 jest głównie stosowany pomimo długiego okresu rekonwalescencji.

Chociaż monitor AC-DC EPG jest prosty w obsłudze po przejrzeniu zasobów online30,31 lub szkoleniu z doświadczonym użytkownikiem, wymagane jest pewne rozwiązywanie problemów. Początkowo, nagrania EPG sond komarów miały nieoczekiwaną falę znakową 11 Hz w sygnale wstępnym, która nie została zaobserwowana ani zgłoszona przez Wayadandei współpracowników. Konsultacje z E. Backusem wykazały, że klatka Faradaya była prawdopodobnie problemem z powodu zakłócających pętli uziemienia. Nowa klatka Faradaya zbudowana z wysoce przewodzącego miedzianego ekranu połączonego z aluminiową ramą przykręconą do dużej aluminiowej płyty podłogowej wspartej na gumowych nóżkach w celu odizolowania jej od poniższego stołu (ilustracja 1B), rozwiązała problem sygnału szumów 11 Hz (rysunek 3C,C'). Dodatkowo, od czasu do czasu, gdy zasilacz EPG był po raz pierwszy włączany, sygnały przed i po rektyfikacji pojawiały się jako grube, rozmyte linie zamiast prostych, gładkich, cienkich linii. Zwykle naprawiano to poprzez wyłączenie przyrządu i sprawdzenie wszystkich połączeń przewodów. Jeśli to się nie udało, odłączenie instrumentu na 1-3 minuty zwykle pomagało. Bardzo rzadko sygnały przed i po stają się gęste i rozmyte podczas pracy, co zostało rozwiązane poprzez wyłączenie przyrządu i podłączenie go do innego gniazdka lub użycie regulatora napięcia i kondycjonera sieciowego do podłączenia EPG przed podłączeniem go do ściany. Idealnie byłoby, gdyby dedykowana linia do monitora EPG wyeliminowała szumy linii pochodzące z lodówek i innych urządzeń podłączonych do tego samego obwodu elektrycznego co EPG30.

Obecnie istnieją dwa główne ograniczenia w stosowaniu EPG do badania komarów. Po pierwsze, przeprowadzono kilka badań korelacyjnych w celu sprawdzenia, które zachowania sondujące odpowiadają przebiegom. Chociaż istnieją silne hipotezy na temat tego, co dzieje się podczas każdej rodziny fal (Tabela 1) i niektórych typów fal (M1 i M2), niewiele z tych hipotez zostało potwierdzonych eksperymentalnie, z wyjątkiem tego, że spożycie krwi jest skorelowane z rodziną fal M26,27. Co najważniejsze, należy zidentyfikować przebiegi odpowiadające zdarzeniom wydzielania śliny, ponieważ wiele patogenów jest przenoszonych w ślinie. Korelacja przebiegów EPG z aktywnością biologiczną u komarów będzie wymagana do znaczącej interpretacji istotnych różnic w czasie trwania fali i liczbie między grupami leczonymi. Po drugie, wskaźniki sondowania i przyjmowania podczas EPG mogą być znacznie niższe niż oczekiwano27. Indywidualne przywiązywanie komarów do krótkich przewodów i umieszczanie ich bezpośrednio na żywicielu może zapobiec długodystansowym poszukiwaniom żywiciela i społecznym zachowaniom żywieniowym, co może wpływać na zachowania związane z sondowaniem i połykaniem. Prawidłowo okablowane owady mogą normalnie chodzić i latać. Mimo to komary często ciągną za druty, a czasami plączą się lub trzymają pod nienaturalnymi kątami, co wskazuje, że bycie podłączonym do drutu wpływa w pewnym stopniu na ich zachowanie. Autorzy przetestowali wiele strategii mających na celu zwiększenie częstości sondowania podczas EPG, a poszczenie komarów przez noc, przy użyciu starszych osób, wystawianie ich na działanie ludzkiego oddechu bezpośrednio przed umieszczeniem ich na dłoni i nakładanie ludzkiej śliny na rękę było najbardziej skuteczne, a także przy użyciu gospodarzy, którzy stale dokonywali precyzyjnych korekt pozycji dłoni, aby upewnić się, że komar był w idealnej pozycjido sondowania.

Pomimo tych ograniczeń, AC-DC EPG ma wiele zalet w porównaniu z innymi podejściami do badania zachowań sondowania i przyjmowania. Systemy takie jak BiteOScope11, flyPAD15 i Automated Biomaterial Platform14, które zostały zaprojektowane do ilościowego określania zachowań związanych z sondowaniem i spożywaniem oraz wydzielania śliny podczas karmienia krwią, wykorzystują przezroczyste sztuczne podłoża i płynne diety, które nie mają normalnych systemów tkanek gospodarza i wskazówek gospodarza. Chociaż te syntetyczne platformy są przydatne do wielu celów eksperymentalnych, wyraźną zaletą AC-DC EPG jest możliwość badania tych zachowań stawonogów i zmiennych będących przedmiotem zainteresowania w naturalnych systemach gospodarza. Co więcej, zdefiniowana przez użytkownika zdolność adaptacji systemu AC-DC EPG stanowi dodatkową przewagę nad innymi przyrządami EPG22,33 i elektronicznymi urządzeniami monitorującymi podobnymi do EPG16,21, które nie mają regulowanych poziomów Ri, typów prądów i poziomów napięcia, które są potrzebne do uzyskania przebiegów z maksymalną ilością informacji i zminimalizowania niekorzystnego wpływu na szeroki zakres gospodarzy i stawonogów22, Lokal mieszkalny 23. Techniki elektromiografii (EMG) są również wykorzystywane do badania karmienia krwią. Jednak obwód elektryczny zwykle obejmuje tylko stawonoga i rejestrowane są tylko potencjały mięśniowe znajdujące się najbliżej elektrody rejestrującej, więc przebiegi nie dostarczają informacji o szczegółowych czynnościach zachodzących na granicy żywiciel-owad, takich jak pęknięcia komórek, lokalizacje i działania styletów oraz potencjały strumieniowe przez aparaty gębowe28,34. Techniki mikroskopii przyżyciowej mogą być wykorzystywane do bezpośredniej wizualizacji szczegółowych ruchów i czynności aparatu gębowego w żywych tkankach gospodarza, ale techniki te obejmują inwazyjne procedury na żywych modelach zwierzęcych9. Tylko monitor AC-DC EPG może dostarczyć bardzo szczegółowych informacji w czasie rzeczywistym na temat zachowań związanych z sondowaniem, spożyciem i wydzielaniem śliny, które występują w żywych, nieprzezroczystych tkankach gospodarza bez konieczności wykonywania inwazyjnych procedur i można go dostosować do stosowania u szerokiej gamy stawonogów10,12.

Jest to pierwsza szczegółowa procedura krok po kroku dotycząca okablowania komarów, skonstruowania aspiratora owadów i wykonania EPG na ludzkich gospodarzach. Oczekuje się, że protokoły te ułatwią przyjęcie AC-DC EPG u komarów żywiących się ludzkimi gospodarzami. Przykłady przyszłych wysiłków badawczych z wykorzystaniem AC-DC EPG mogą obejmować badania nad podstawowymi mechanizmami odżywiania się krwią i uszkodzeniem tkanek gospodarza10, w tym identyfikację stereotypowych sekwencji zachowań sondujących poprzedzających spożycie krwi, badanie przepływu krwi przez aparat gębowy oraz porównanie plastyczności karmienia w obrębie i między gatunkami stawonogów/etapami rozwojowymi26. EPG może być również stosowany do ilościowego określania działania insektycydów, środków przeciwpaszowych i repelentów12. Przedstawione tutaj procedury wykorzystania AC-DC EPG do badania komarów na ludzkich dłoniach przyspieszą te badania i umożliwią nowy wgląd w biologię komarów żywiących krew.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Wnioski zawarte w niniejszym raporcie są wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy USDA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni prof. Astri Wayadande z Oklahoma State University za pionierskie opracowanie procedury okablowania dla komarów, a także dr Elaine Backus z USDA-ARS w Parlier, CA, oraz panu Andrew Dowellowi z EPG Technologies Inc. w Gainesville, FL, za pomoc w rozwiązywaniu problemów ze sprzętem EPG. Dziękujemy również dr Dustinowi Swansonowi i panu Williamowi Yarnellowi z USDA-ARS Insectary na Manhattanie, KS, za dostarczenie komarów, oraz Pani Miriam Ruhinda z Kansas State University na Manhattanie, KS za pomoc w kręceniu filmów proceduralnych. Prace te były możliwe dzięki dostępowi do Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) na Uniwersytecie Stanowym Kansas. Badania te były wspierane przez USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) oraz Hatch Multistate Project (NE1943). Niniejszy manuskrypt jest wkładem nr 24-194-J z Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materiały

2

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprzyrządowanie
AC-DC 4-kanałowy elektropenetrografEPG Technologies, Inc.W przypadku EPG obejmuje zasilacz, skrzynkę sterowniczą, skrzynkę interfejsu przełącznika, cztery wzmacniacze stopnia głównego, cztery sondy napięcia podłoża i powiązane przewody Poduszki
powietrzneAmazon.comludzkiego gospodarza, na którym można oprzeć rękę/ramię podczas EPG
DI-710 Sprzęt do akwizycji danych (AD Board)DATAQ Instruments Inc.do digitalizacji analogowych sygnałów EPG, aby można je było zobrazować na komputerze
Ściemnialna lampa powiększająca LED, duża lupa 5X bez użycia rąk ze światłem i stojakiem do czytania Hobby Rękodzieło Stół warsztatowy do szyciaAmazon.comdo obserwacji behawioralnej podczas EPG; używaj tylko odłączonego podczas EPG, w przeciwnym razie może to spowodować hałas
Mikroskop cyfrowy Dino-Lite Edge (powiększenie 250x)Dino-LiteAF4915ZTdo obserwacji behawioralnej podczas EPG
Stojak biurkowy Dino-Lite Flex-armDino-LiteMS22Bdo trzymania i manipulowania kamerą
Stalowa podstawka retorty Eisco i zestaw prętówFisher ScientificS41740do trzymania wzmacniacza stopnia głównego i uziemienia klatki Faradaya (musi być wykonana z metalu)
Warsztaty online EPGRozszerzenieUF IFAShttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "zasoby online" do nauki EPG (konfiguracja instrumentu, gromadzenie i analiza danych, budowa Faradaya, przygotowanie kleju do srebra, budowa kikuta owada itp.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power ConditionerAmazon.comdo redukcji szumów linii
Mała bąbelkowa folia amortyzującaAmazon.comdo stosowania jako bariera między gospodarzem a klatką Faradaya
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121do trzymania stopnia głównego amplifier i uziemienie klatki Faradaya (musi być wykonany z metalu i nie pokryty plastikiem)
Komputer z systemem WindowsBest Buydo analizy EPG i statystycznej
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS Rozszerzenie UF IFAShttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/do analizy statystycznej danych przebiegowych
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programy SASUF IFASExtension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/do przygotowania plików do analizy statystycznej danych falowych
SAS wersja 9.4SAS Institute Inc.do analizy statystycznej danych przebiegowych
WinDaq Lite DATAQ Instruments Inc.do rejestrowania i przeglądania danych EPG.  Obejmuje oprogramowanie WinDaq Hardware Manager (AKA, "oprogramowanie do zarządzania sprzętem") oraz oprogramowanie WinDaq Waveform Browser (AKA, "oprogramowanie do przeglądania przebiegów"). Do użytku tylko na komputerach z systemem Windows. 
Faraday Cage
Aluminiowa rama ekranuHome DepotMSCF5167dla  ściany klatki Faradaya
Blacha aluminiowa o grubości 0,125 (1/8) 3003-H14Metals DepotS318na podstawę klatki Faradaya
Szelki narożne, 1" Home Depot339547dla  ścian klatki Faradaya
maszynowe Phillips z płaskim, #6-32 x 1"Home Depot459999do budowy klatki Faradaya
Podkładki płaskie, #6 Home Depot638977do budowy klatek Faradaya
Multimetr cyfrowy Fluke 15B+ do zastosowań elektrycznych mierzy napięcie i prąd AC/DC do 1000 V i 10 A, a także rezystancję, ciągłość, diodę i pojemnośćAmazon.comdo testowania koszyka Faradaya
Przenośne radio AM FM, radio tranzystorowe Goodes z głośnym głośnikiem, gniazdo słuchawkowe, radio na baterie 2AA do odbioru dalekiego zasięgu, radio kieszonkowe do użytku wewnętrznego, zewnętrznego i awaryjnegoAmazon.comdo testowania klatki Faradaya
Ekran z czystej miedzi, siatka 16 x 16 o średnicy drutu 0,11, ekranymetradla  ścian klatki Faradaya
maszynowe combo z okrągłym, #6-32 x 3/4 "Home Depot528466do budowy klatki Faradaya
Papier ścierny, 1/2" na 1", 150Grit Home Depot19036-20-CCdo usuwania farby z dna stojaka laboratoryjnego
Narożniki ramy ekranu, 5/16" Home DepotWCORN516dla  ścian klatki Faradaya
Wielowypust ekranowy, 0,14" Home Depot3034719dla  ścian klatki Faradaya
Insect Stubs
Spilki do szyldów z mosiądzuHome Depot801294do budowy klocków przeciw owadom   
Drut miedziany, 20 AWGAmazon.comdo budowy klocków przeciw owadom   
Grypa rozpuszczalna w wodzie Harrisa Home Depot355398do pomocy w powlekania drutu króćca owadów i tworzenia mocnego połączenia
Szczypce z igłamiHome Depotdo gięcia drutu podczas konstruowania klocków owadów
Zestaw Pro's Kit 900-015 Pomocne dłonie Pomoc lutowniczaAmazon.comdo przytrzymywania kołków szyldu podczas
Lut (z rdzeniem kalafonii)Home Depot296497do budowy króćców owadów   
Narzędzie do ściągania izolacji z drutuHome Depotdo zdejmowania izolacji i cięcia drutu miedzianego podczas konstruowania kikutów owadów
Lutownica YIHUA 928D-III, 110 W o dużej mocy, w pełni cyfrowa lutownica z wyświetlaczemAmazon.comdo konstruowania odcinków owadów; w zestawie podstawka, gąbka i wełna stalowa do czyszczenia
Aspirator do owadów
Aspirator laboratoryjny Accuris ASPIREInstrumenty AccurisV0020do zasysania do aspiratora owadów; zawiera ręczny sterownik podciśnienia, adapter z cienką końcówką (40 mm) ze stali nierdzewnej oraz adapter końcówki do pipet
Chemglass Life Sciences Pasteur, długość 5 3/4"Fisher ScientificNC0230004do stosowania jako aspirator do owadów podczas okablowania komarów
Komercyjna elektryczna kolorowa winylowa taśma izolacyjnaHome Depotdo mocowania zmodyfikowanej pipety Pasteura do przewodu próżniowego
Moskitiera z tkaniny użytkowej, kwadratowa 10 x 10 cm JoannFabrics16651622do zapobiegania zasysaniu komarów do pompy próżniowej
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914do szybkiego i łatwego przełączania między różnymi zmodyfikowanymi pipetami Pasteura
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (od 3/8 do 7/16 cala) Dowód osobisty)Fisher Scientific15-315Bdo szybkiego i łatwego przełączania między różnymi zmodyfikowanymi pipetami Pasteura
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comdo przygotowania kleju do srebra
Silver Flake 99,9% czystości,  4-8 &mikro; mThermoFisher786.09do przygotowania kleju do srebra
Silver Flake 99,95% czystości, 8-10 &mikro; mInframat Advanced Materials47MR-12Fdo przygotowania kleju srebrnego
Znieczulenie na owady
zestaw bełkotkowy, 1000 mL, #9 Korek gumowyFlyStuff59-181do zapobiegania wysuszaniu owadów podczas korzystania z podkładki Flypad
  rama, standardowy rozmiarFlyStuff59-118zapobiegająca spadaniu komarów z podkładki
Flystation SzczotkaFlyStuff59-205do redukcji elektryzowania się podczas pracy na moskitierze
Flystuff  Flypad  standardowy rozmiarFlyStuff59-114AKA "podkładka anestezjologiczna" do znieczulania komarów
Lejek (średnica 4 cali)Amazon.comdo gazowania kubków komarów przed przeniesieniem na flypad
Szkło plexi lub płaska plastikowa pokrywka (przycięta na wymiar)Home DepotMC-27do zakrycia poduszki, jeśli komary zaczną się budzić
Wąż z tworzywa sztucznego odcinający Zaciski jednopozycyjne i regulowane otwarte (wariant 1/8 "do 1/2")Amazon.comdo kierowania gazu między flypad a lejkiem
Jednostopniowy regulator CO2FlyStuff59-142do regulacji przepływu gazu ze zbiornika CO2
" T” Złączka do rurki ID 1/8 calaFlyStuff59-123do podłączenia zarówno flypada, jak i lejka do zbiornika CO2
Rurki, przezroczyste FlyStuff59-124Cdo podłączenia lejka i flypada do regulatora na zbiorniku CO2
Insect Wiring
karton, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.327826aby ułatwić wizualizację złotego drutu
kwadrat z papieru budowlanego 3,5 "x 4,0"Zszywki956221aby złoty drut był łatwiejszy do wizualizacji
WacikiAmazon.comna czczo komary
Pianka rzemieślnicza #12 blok (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Sklep z tkaninami i rękodziełem Joann1941079do trzymania komarów przewodowych
Deflecto Ribbon Dozownik, przezroczystyAmazon.comdo przechowywania złotego drutu
Lekkie jak piórko kleszcze entomologiczneFisher ScientificS72110do manipulacji owadami
Cienkie kleszcze (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20do tworzenia złotej pętli podczas okablowania komarów
Pędzel drobno punktowyAmazon.comdo manipulowania komarami podczas okablowania i EPG; musi mieć plastikową lub drewnianą rączkę, jeśli jest używany do EPG
Standardowe pipety transferowe z cienką końcówką, wąskie, 5,8 mlThomas Scientific7761D21do przygotowania kleju do srebra
Złoty drut, czystość 99,99%, grubość 0,025 mmGoodfellowAU005121do okablowania komarów
Szpilki Minutien, końcówka 0,2 mm, 1 cmNC9681411 Fisher Scientificdo nakładania kleju na komary
Kubki papierowe Sztywna rurkana czczo komary     
Imadło sworznioweFisher Scientific50-996-811do przytrzymywania szpilki minutien podczas okablowania owadów
Plastikowe pudełko do przechowywania z pokrywką (7 cali x 9 cali x 14 cali)Amazon.comdo transportu komarów przewodowych
Szkło pleksi lub płaska plastikowa pokrywka (przycięta na wymiar)Home DepotMC-27do zakrycia podkładki przeciw owadom, jeśli komary zaczną się budzić
Kleszcze samozamykająceFisher Scientific08-906do trzymania i manipulowania złotym drutem
Compressed Gas
CO2 gasMatheson Gazdo znieczulania komarów za pomocą flypad
Common Lab Items
Jednorazowe worki autoklawe Biohazard, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591do usuwania komarów karmionych krwią
Palnik Bunsena lub palnik propanowyAmazon.comdo modyfikacji pipet Pasteura
Kolorowa taśma laboratoryjnaDaigger SuppliesEF9763Rdo etykietowania, przygotowania kleju srebrnego i kleszczy maskujących
Jednorazowe końcówki do pipet, 1000 i mikro; LFisher Naukowy do porcjowania wody podczas wytwarzania kleju srebrnego
Mikroskop preparacyjnyLeica Microsystemsdo okablowania komarów Sonda
preparcyjnaFisher ScientificNC9109673do mieszania  i nakładania srebrnego kleju
Kolba Erlenmeyera, 1000 mlFisher Scientific do zapobiegania wysuszaniu się owadów podczas korzystania z podkładki
Etanol, 70% Fisher Scientific04-355-122do odzyskiwania zbiegłych komarów
Szklane szalki PetriegoFisher Scientific08-747Bdo znieczulania komarów lodem
RękawiceFisher Scientificdo ochrony osobistej
Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe marki KimTech Science Fisher Scientific06-666do miażdżenia komarów
Fartuchy laboratoryjneFisher Scientificdo ochrony osobistej
Butelki z rozpylaczem LiBa, puste butelki z rozpylaczem wielokrotnego napełniania (bezpieczne do nacierania alkoholem)Amazon.comdo odzyskiwania komarów
Mieszadło magnetyczne o długości 2 cmFisher Scientific do mieszania srebrnego kleju
Pipeta mechaniczna jednokanałowa, 1000 &mikro; LFisher Naukowy 13-690-032do porcjowania wody podczas wytwarzania kleju srebrnego Probówki
do mikrowirówek, 1,5 mlFisher Scientific 780420do przechowywania kleju srebrnego
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944do uszczelniania tubek z klejem srebrnym
Folia Amazon.comdo przykrycia bloku piankowego
Pyrex Zlewka 20 mlFisher Scientific 07-250-051do mieszania kleju do srebra
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370do ważenia kleju i płatków srebra
Pisak Sharpie, Amazon.comdo etykietowania
Jednoostrzowa żyletkaMikroskopia elektronowaSciences 71980do czyszczenia kikutów owadów
Standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific 133-711-7mLdo przenoszenia srebrnego kleju do probówki do przechowywania 
Mieszaj płytkęFisher Scientific do mieszania srebrnego kleju
Timer/stoperFisher Scientificdo pomiaru czasu, jak długo żywiciel jest narażony na działanie każdego owada
Ultraczysta (18 MΩ) wodaFisher Scientific do przygotowania kleju do srebra
Nożyczki użytkoweFisher Scientific08-945do cięcia drutu złotego
Mieszalnik wirowyFisher Scientific do mieszania komarów srebrnego kleju
Study Organisms
Culex tarsalisUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research na Manhattanie, KSdo wykorzystania jako obiekty badań
dla 36" x 12' CO, papierowa , które uciekły Komary z drobną końcówką

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zachowanie erowania komar wzachowanie sondowaniazachowanie spo yciaerowanie na krwirejestracja sygna w elektrycznychtransmisja patogen wz ota elektroda drutowainterakcja z ludzkim gospodarzem

Powiązane artykuły