Ograniczone ściółkowanie i gniazdowanie jako model przeciwności losu we wczesnym okresie życia u myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje model zwierzęcy do badania, jak przeciwności losu we wczesnym okresie życia, sprowokowane przez zubożałe środowisko i nieprzewidywalną opiekę matki we wczesnym okresie poporodowym, wpływają na rozwój mózgu i przyszłe ryzyko zaburzeń psychicznych.

Streszczenie

Przeciwności losu we wczesnym okresie życia (ELA), takie jak znęcanie się, zaniedbanie, brak zasobów i nieprzewidywalne środowisko domowe, są znanym czynnikiem ryzyka rozwoju zaburzeń neuropsychiatrycznych, takich jak depresja. Modele zwierzęce ELA zostały wykorzystane do zbadania wpływu przewlekłego stresu na rozwój mózgu i zazwyczaj polegają na manipulowaniu jakością i/lub ilością opieki nad matką, ponieważ jest to główne źródło doświadczeń we wczesnym okresie życia u ssaków, w tym ludzi. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół stosowania modelu Limited Bedding and Nesting (LBN) u myszy. Model ten naśladuje środowisko o niskich zasobach, które prowokuje fragmentaryczne i nieprzewidywalne wzorce opieki nad matką w krytycznym oknie rozwojowym (dni po porodzie 2-9) poprzez ograniczenie ilości materiałów gniazdowych podawanych matce w celu zbudowania gniazda dla jej młodych i oddzielenie myszy od ściółki za pomocą siatki w klatce. Przedstawiono reprezentatywne dane w celu zilustrowania zmian w zachowaniu matki, a także zmniejszonej masy ciała młodych i długoterminowych zmian w podstawowym poziomie kortykosteronu, które wynikają z modelu LBN. Wykazano, że jako dorośli dzieci wychowane w środowisku LBN wykazują nieprawidłową reakcję na stres, deficyty poznawcze i zachowania podobne do anhedonii. Dlatego model ten jest ważnym narzędziem do określenia, w jaki sposób dojrzewanie wrażliwych na stres obwodów mózgowych jest zmieniane przez ELA i skutkuje długoterminowymi zmianami behawioralnymi, które nadają podatność na zaburzenia psychiczne.

Wprowadzenie

Wczesny okres poporodowy to krytyczne okno rozwojowe, w którym wpływy środowiska mogą zmienić trajektorię rozwoju. Na przykład przeciwności losu we wczesnym okresie życia (ELA) mogą zmienić rozwój mózgu, aby wywołać długotrwałe zmiany w funkcjach poznawczych i emocjonalnych. Przykłady ELA obejmują przemoc fizyczną lub emocjonalną, zaniedbanie, niewystarczające zasoby i nieprzewidywalne środowisko domowe występujące w dzieciństwie lub okresie dojrzewania¹. Wiadomo, że ELA jest czynnikiem ryzyka rozwoju zaburzeń, takich jak depresja, zaburzenia związane z używaniem substancji, zespół stresu pourazowego (PTSD) i lęk^2,3,4,5. Jest to ważne, biorąc pod uwagę, że poziom ubóstwa wśród dzieci w USA wzrósł ostatnio ponad dwukrotnie, z 5,2% w 2021 r. do 12,4% w 2022 r⁶, i chociaż ubóstwo samo w sobie niekoniecznie jest ELA, zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia różnych rodzajów ELA⁷.

Modele zwierzęce od dawna są niezbędne do zrozumienia wpływu stresu we wczesnym okresie życia na rozwój mózgu i wyniki dorosłych. Dwa główne modele zwierzęce wykorzystywane w ostatnich latach do analizy tego zjawiska to separacja matek (MS) i zubożałe środowisko wywołane ograniczoną ilością ściółki i materiałów do budowy gniazd (LBN). Stwardnienie rozsiane zostało opracowane jako model deprywacji rodzicielskiej⁸. W nim matki gryzoni są zabierane od swoich młodych, zwykle na kilka godzin, każdego dnia, aż do odsadzenia⁸. Stwierdzono, że paradygmat stwardnienia rozsianego skutkuje zachowaniami depresyjnymi i lękowymi w wieku dorosłym⁹, a także nieprawidłową reakcją na przewlekły stres^10,11. Z drugiej strony, model LBN, po raz pierwszy opracowany w laboratorium Baram ¹², nie oddziela matki od szczeniąt, ale raczej modyfikuje środowisko, w którym młode są hodowane, naśladując środowisko o niskich zasobach^12,13. Zmniejszenie ilości materiału do gniazdowania i uniemożliwienie bezpośredniego dostępu do ściółki w tym modelu powoduje zakłócenie opieki nad matką ze strony matek³. Ponieważ solidna i przewidywalna opieka matczyna jest niezbędna do prawidłowego rozwoju poznawczych i emocjonalnych obwodów mózgu¹⁴, fragmentaryczna opieka matczyna z LBN może skutkować szeregiem wyników, w tym nadaktywną osią podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA), przesuniętą równowagą pobudzająco-hamującą w wielu regionach mózgu, zwiększonym poziomem hormonu uwalniającego kortykotropinę (CRH) i zachowaniem podobnym do depresyjnego u potomstwa^{13,15,16,17,18,19}.

Dokładny mechanizm, dzięki któremu ELA powoduje zwiększone ryzyko zaburzeń neuropsychiatrycznych, nie jest w pełni zrozumiały. Uważa się, że jest to związane ze zmianami w obwodach osi HPA^19,20, a ostatnie dowody wskazują, że może to być spowodowane zmianami w przycinaniu synaps mikrogleju¹⁹. Wykazano, że model LBN jest kluczowym narzędziem do zrozumienia wpływu środowiska okołoporodowego na rozwój mózgu i długoterminowe wyniki behawioralne. Chociaż model ten został początkowo opracowany dla szczurów, został również zaadaptowany dla myszy, aby wykorzystać istniejące narzędzia transgeniczne^12,13. Warto zauważyć, że model jest bardzo podobny u obu gatunków i prowokuje wysoce zbieżne wyniki, takie jak zmiany w osi HPA, deficyty poznawcze i zachowania podobne do depresji, podkreślając w ten sposób jego międzygatunkową użyteczność i potencjał translacyjny. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób zastosować model ograniczonego ściółkowania i gniazdowania u myszy, zbierając i analizując zachowania matek i wyniki potomstwa w celu zweryfikowania skuteczności modelu i oczekiwanych wyników.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt z Uniwersytetu Stanowego Georgia (numer zatwierdzenia A24011). Myszy były hodowane i utrzymywane w obiektach dla zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Georgii. Eksperymenty przeprowadzono na szczepie C57BL/6J w okresie okołoporodowym (dzień po urodzeniu [P] 2-10) i obejmowały mężczyzn i samice. Odczynniki i sprzęt używany do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ustawienia materiału

1. Przegrodę z siatki przyciąć zgodnie z wymiarami klatki, pozostawiając nadmiar 3 cm na dłuższych bokach.
   UWAGA: Siatka podana w tabeli materiałów jest cięta przez producenta.
2. Złóż krawędzie, łącznie z nadmiarem, w taki sposób, aby powstała platforma dopasowana precyzyjnie do krawędzi klatki i o wysokości ~2,5 cm nad podłogą. Umożliwi to przedostawanie się moczu i kału przez przegrodę siatkową bez możliwości odzyskania ściółki z kolb kukurydzy. Na koniec upewnij się, że wszystkie ostre krawędzie są złożone, aby zapobiec obrażeniu zwierząt.
   UWAGA: Przegrody siatkowe są wielokrotnego użytku i należy je dokładnie czyścić między użyciami gorącą wodą z mydłem, a następnie spryskać 70% etanolem.
3. Ustaw kamery na statywach i przygotuj system nagrywania.
   UWAGA: Zaleca się korzystanie z oprogramowania do zarządzania materiałem wizyjnym. W wyniku tych nagrań powstają .mp4 pliki, które są automatycznie łączone w segmenty 1-godzinne.
4. Dostosuj ustawienia do ciągłego nagrywania.
   UWAGA: Dodatkowe zalecane ustawienia to rozdzielczość 1920 x 1080 i 30 klatek/s.
5. Ustaw wynikowe pliki .mp4 tak, aby dzieliły się na segmenty 1-godzinne, jeśli nie zostaną automatycznie wykonane przez oprogramowanie do zarządzania materiałem wizyjnym.
6. Analizując okres wyłączenia światła, użyj oświetlenia w podczerwieni.
   UWAGA: Aby zmniejszyć odblaski z boku klatki, zaleca się wyłączenie podczerwieni (IR) z kamery. Zamiast tego używaj naświetlaczy podczerwieni w pomieszczeniu podczas nagrywania w ciemnej fazie.

2. Paradygmat ograniczonego legowiska i zagnieżdżania (LBN)

1. Sparuj 1-4 samice z pojedynczym samcem hodowcą.
   UWAGA: Zalecany wiek dla pierwszego parowania u eksperymentalnych samic to P75. Używanie nieródek samic jest idealne, ale w sytuacjach, w których nie jest to wykonalne, na przykład w przypadku cennych linii myszy transgenicznych, wieloródki mogą kontynuować rozmnażanie przez około cztery miesiące później. Zaleca się, choć nie jest to wymagane, codzienne sprawdzanie czopów dopochwowych w celu potwierdzenia dnia krycia (dzień embrionalny [E]0).
   1. Gdy tamy są w ciąży, utrzymuj zakłócenia na minimalnym poziomie.
      UWAGA: Wieloródki mogą być na ogół ponownie wykorzystane do wyprodukowania do pięciu miotów, zanim płodność spadnie. Jeżeli zapory są ponownie wykorzystywane w doświadczeniu, powinny być preferencyjnie używane do każdego czasu w tych samych warunkach lub tylko przełączane z kontroli na LBN, ale nigdy na odwrót, aby uniknąć wszelkich pozostałości długoterminowych skutków LBN dla zapory.
2. Na E17 (lub jeśli zatyczki nie zostały sprawdzone, gdy samice wyglądają na ewidentnie w ciąży), oddziel samice do ich własnej standardowej klatki z pleksiglasu i daj im jedno bawełniane gniazdo (5 x 5 cm) na zbudowanie gniazda.
   UWAGA: Optymalne jest przeniesienie oddzielonych samic do cichego, małego pomieszczenia z dala od głównego pomieszczenia kolonii z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i minimalnymi zakłóceniami ze strony personelu podczas konfiguracji kontroli i LBN.
3. Zapisz datę urodzenia (około E19).
4. W P2 policz i określ płeć szczeniąt. Losowo przypisz mioty do warunków LBN lub kontrolnych (jeśli jest to pierwszy miot matki). Ta interakcja ze szczeniętami powinna zostać zakończona między 1 a 4 godziną po włączeniu świateł.
   1. Ostrożnie umieść szczenięta w nowej, czystej klatce, aby zostały posortowane według płci. Odległość odbytu i narządów płciowych między odbytem a genitaliami jest większa u mężczyzn niż u kobiet i może być używana jako identyfikator.
   2. Podziel samce i samice na grupy, aby je policzyć.
   3. Mioty z więcej niż 8 młodymi należy wybrakować, a mioty z mniej niż 4 młodymi należy odrzucić. Optymalna wielkość miotu to 4-8 młodych, ponieważ wszystko, co wykracza poza ten zakres, może zakłócać dystrybucję opieki matczynej podczas badania.
      UWAGA: Zmienne, na które może mieć wpływ wielkość miotu, to waga młodego, możliwość karmienia i interakcje między matką a młodym, które mogą zakłócić eksperyment. Idealnie byłoby, gdyby myszy nie były hodowane krzyżowo, ponieważ mają mniejsze szanse na przeżycie niż szczury.
5. Skonfiguruj warunki Control i LBN, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
   1. Kontrola: Użyj standardowej wielkości klatki na buty dla myszy (19,4 cm x 13,0 cm x 38,1 cm) z ~220 g ściółki z kolb kukurydzy (w zależności od wymiarów klatki, dążąc do wysokości ~1 cm) i jednego standardowego kwadratowego bawełnianego gniazda (5 x 5 cm).
      1. Aby pomóc myszom zaaklimatyzować się w tym nieznanym środowisku, umieść po jednym z ich kałów ze starej klatki w każdym rogu nowej klatki. Ponadto umieść niewielką ilość zużytego bawełnianego gniazda z poprzedniej klatki na nowym gnieździe
      .
   2. LBN: Umieść wcześniej przygotowaną przegrodę siatkową w standardowej klatce na buty z ~110 g ściółki z kolb kukurydzy (dążąc do wysokości ~0,5 cm). Siatka powinna zapobiegać bezpośredniemu kontaktowi myszy ze ściółką z kolb kukurydzy.
      1. Na koniec dodaj połowę bawełnianego kwadratu gniazdowego (2,5 x 5 cm). Powtórz wszystkie powyższe kroki, aby pomóc w aklimatyzacji.
         UWAGA: Zaleca się przechowywanie koszyków na buty na standardowych, niewentylowanych stojakach, ponieważ wykazano, że ta konfiguracja jest cicha i nie wywołuje hipotermii u szczeniąt hodowanych w klatkach LBN²¹. Może to jednak nie mieć miejsca w przypadku zwiększonego przepływu powietrza w wentylowanych klatkach; Dlatego naukowcy powinni mierzyć poziomy hałasu i temperaturę rdzenia PUP w swoim systemie, jeśli używają wentylowanych klatek.
6. Dodaj szczenięta do wyznaczonej klatki i umieść je na gnieździe. Następnie umieść matkę w klatce przodem do szczeniąt, ponieważ pomoże jej to szybciej zauważyć, że są one obecne. Upewnij się, że w zestawie znajduje się wystarczająca ilość jedzenia i wody na co najmniej 8 dni, aby uniknąć zakłócania pracy klatki do końca eksperymentu w P10.
7. Umieść kamerę na statywie przed klatką, aby uzyskać wyraźny widok z boku na matkę i jej młode. Opcjonalnie umieść lustra wokół klatki, aby lepiej uchwycić wszystkie kąty. Chociaż wystarczy przeanalizować tylko 1 godzinę nagrania wideo dziennie, kamera jest skonfigurowana tak, aby nagrywać w sposób ciągły 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu podczas eksperymentu, dzięki czemu można monitorować zakłócenia.
   UWAGA: Myszy można również obserwować osobiście, a zachowanie matki może być oceniane ręcznie, chociaż lepiej jest nagrywać na wideo, aby zapobiec zakłóceniom spowodowanym obecnością eksperymentatora w pomieszczeniu. W przypadku korzystania z wentylowanych stojaków może być również konieczne zastosowanie innej procedury rozmieszczenia kamer do nagrywania opieki nad matką niż opisana tutaj.
8. Rankiem P10 należy umieścić wszystkie zwierzęta w standardowych warunkach umieszczania w sadzach (najlepiej identycznych z powyższymi warunkami kontrolnymi) i zważyć młode.
9. Traktuj wszystkie szczenięta tak samo i odstaw od piersi w wieku P21 w grupy po 2-5 rodzeństwa z miotu tej samej płci.
   UWAGA: Staraj się trzymać rodzeństwo z miotu tej samej płci razem, gdy tylko jest to możliwe, ale jeśli to konieczne, trzymaj razem potomstwo tej samej płci z różnych miotów w tym samym stanie. Zaleca się, aby unikać kontroli w pomieszczeniach i potomstwa LBN razem (zobacz Yang et al., aby zapoznać się z wpływem składu klatkowca na fenotypy behawioralne²²).

Rysunek 1: Przykład konfiguracji klatki. Klatka po lewej stronie obrazu przedstawia klatkę standardową kontrolną (CTL) zawierającą pełną ilość ściółki i pełne gniazdo. Klatka po prawej stronie pokazuje ograniczoną konfigurację ściółki i gniazda (LBN) z połową ilości ściółki, połową gniazda i siatkową przegrodą do oddzielania zwierząt od ściółki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Punktacja zachowania matki

1. Chociaż w tej konfiguracji zbierane są nagrania ciągłe, analizuj tylko 1 godzinę od P3 do P6. Zaleca się analizowanie filmów nagranych nie wcześniej niż 1 godzinę po zmianie świateł, aby umożliwić przyzwyczajenie się i analizowanie filmów ze stałej pory każdego dnia.
   UWAGA: Okres od P3 do P6 zazwyczaj zawiera największe różnice w opiece nad matką ze względu na LBN; Dlatego konieczne jest tylko przeanalizowanie tych dni. Sugerowany czas obserwacji/rejestracji pozwala na uchwycenie aktywności po przejściu z cyklu aktywnego do nieaktywnego lub odwrotnie. Jednak faza nieaktywna to moment, w którym matka najprawdopodobniej zaangażuje się w opiekę nad matką i wcześniej wykazano, że zawiera największe różnice grupowe w zachowaniu matki³.
   UWAGA: Zapisy P2 należy rejestrować później niż w inne dni, ponieważ myszy potrzebują co najmniej 1 godziny, aby przyzwyczaić się do zmiany klatki. O ile nie jest to zmienna będąca przedmiotem zainteresowania, odrzuć ten dzień z analizy.
2. Oceń wszystkie zachowania przedstawione w Tabeli 1. Zazwyczaj zachowania są oceniane przez pierwsze 50 minut po rozpoczęciu czasu zbierania danych.
   UWAGA: Można to zrobić ręcznie lub elektronicznie za pomocą interaktywnego oprogramowania do obserwacji behawioralnej (BORIS, oprogramowanie typu open source) lub podobnego typu oprogramowania. Poniższe instrukcje dotyczą ręcznego oceniania i można je dostosować do dowolnego wybranego oprogramowania.
3. W wydrukowanej tabeli zapisz zaobserwowane zachowanie, używając skrótu, czasu rozpoczęcia i czasu trwania walki oraz wszelkich notatek opisowych. Na przykład, jeśli matka aktywnie karmi piersią, a następnie opuszcza gniazdo, ale młode są nadal do niej przyczepione, zanotuj to jako AN, a następnie O. Opis szczeniąt (i ich liczba) nadal dołączonych powinien być zachowany jako notatka z boku na wypadek, gdyby była potrzebna później.
   UWAGA: Wszelkie zachowania krótsze niż 3 s nie są analizowane. Ta reguła pomaga odfiltrować chwilowe zachowania spowodowane zakłóceniami zewnętrznymi, takimi jak hałas otoczenia. Wyjątek stanowi sytuacja, gdy następuje widoczna przerwa w ataku AN (np. przez duży ruch lub rozciąganie), która jest szybko wznawiana. W tym przypadku odnotowane zachowanie to AN, po którym następuje N-AN, zgodnie z opisem w Tabeli 1.
4. W przypadku, gdy wiele zachowań dzieje się jednocześnie, nagraj najbardziej aktywne. Przykładem tego jest to, że matka jest nisko karmiona, ale później zaczyna lizać i pielęgnować, zauważa się, że niskie karmienie ustaje, a następne zachowanie powinno być oznaczone jako LG z notatką, że miało to miejsce podczas LN.

NIE

Typ zachowania		skrót	Opis
Lizanie / pielęgnacja		Lg	Dama jest zajęta lizaniem/pielęgnacją swoich szczeniąt.
Aktywne pielęgniarstwo		NA	Tama karmi swoje szczenięta na stojąco, podczas gdy jej plecy są wygięte w łuk.
Nowe aktywne pielęgniarstwo		N-AN	To zachowanie jest szczególnie używane, gdy tama przerwała karmienie, ale szybko wznawiała działanie. Jest to wyjątek od reguły 3s.
Niskie pielęgniarstwo		Ln	Matka aktywnie opiekuje się swoimi młodymi, ale jej grzbiet jest niski lub prawie płaski. To zachowanie często następuje po AN po pewnym czasie.
Pielęgniarstwo boczne		Sn	Zapora leży na boku podczas karmienia (znane również jako pielęgniarstwo pasywne).
Wyłączone gniazdo		O	Tama nie jest na gnieździe i nie je/nie pije. Można to zaobserwować u niej chodzącej po klatce lub eksplorującej teren.
Jedzenie/picie		E	Tama jest poza gniazdem, je lub pije.
Samodzielna pielęgnacja		Sg	Tama sama się oczyszcza.
Noszenie szczeniąt		Z	Tama nosi młode, zazwyczaj w celu przeniesienia ich z powrotem do gniazda.
Budowanie gniazda		Nb	Zapora aktywnie buduje lub przenosi gniazdo.
Przenieś się na gniazdo		M	Tama porusza się na gnieździe. Objawia się to interakcją matki ze szczeniętami w inny sposób niż LG lub jakikolwiek rodzaj karmienia, taki jak wąchanie, odchowywanie lub deptanie szczeniąt.

Tabela 1: Opis zachowań związanych z opieką nad matką.

4. Analiza danych dotyczących zachowania matki

1. Skompiluj wyniki punktacji w arkuszu kalkulacyjnym.
2. Jeśli filmy były analizowane elektronicznie, usuń zachowania z atakami krótszymi niż 3 s, zgodnie z opisem w kroku 3.
3. Oblicz średnią długość ataku, średnią częstotliwość i całkowity czas trwania lizania i pielęgnacji dla każdego dnia obserwacji.
   UWAGA: Statystyki opisowe mogą być wykonywane dla każdego z ocenianych zachowań, ale lizanie i pielęgnacja zazwyczaj stanowią najbardziej widoczne zakłócenie pod względem fragmentacji przez LBN (tj. krótsze, częstsze ataki). Zmienne te mogą być analizowane jako średnia z P3-P6 lub jako powtarzające się pomiary w ciągu dnia w celu wyszukania wszelkich zmian w czasie, jeśli jest to interesujące.

5. Obliczanie entropii

UWAGA: Entropia, czyli nieprzewidywalność, zachowań związanych z opieką nad matką jest obliczana na podstawie metody zaproponowanej przez Vegetabile et al.²³. Metoda ta opiera się na założeniu, że zachowania związane z opieką nad matką działają jak łańcuch Markowa, który można wykorzystać do oszacowania wskaźnika entropii sekwencji behawioralnej. Sekwencja zachowań każdej zapory jest scharakteryzowana za pomocą empirycznej macierzy przejścia

ij> _{i,j = 1...7} warunkowych prawdopodobieństw przejścia od jednego zachowania (i) do innego zachowania (j), a współczynnik entropii jest obliczany na tej podstawie, jak opisano wcześniej3^,23 i w następujący sposób:

gdzie p_ij jest warunkowym prawdopodobieństwem, że zachowanie j jest obserwowane jako następne po zaobserwowaniu zapory wykonującej zachowanie i, π_i jest częstotliwością, z jaką obserwuje się zachowanie i, a M (= 7) jest całkowitą liczbą różnych zachowań. Czytelnik jest odsyłany do Vegetabile et al.²³ w celu omówienia teoretycznych podstaw równań; w tym miejscu nacisk kładziony jest na to, jak zastosować metodę w modelu LBN.

1. Aby to obliczyć, należy określić format wymagany do analizy.
   1. Połącz AN, LN, SN i N-AN w jedną zmienną o nazwie N, sumując czasy, ponieważ wszystkie dotyczą pielęgniarstwa.
      UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą 1, aby zapoznać się z opisem zachowań związanych z opieką nad matką.
   2. Dodaj zachowania, które nie są związane z zachowaniami kierowanymi przez siebie lub szczeniaki (M i O) do O.
   3. Wprowadź osobno LG, E, SG, C i NB, aby uzyskać łącznie 7 zachowań.
2. Utwórz arkusz kalkulacyjny z kolumnami w następującej kolejności: Identyfikator myszy, Identyfikator miotu, Miot #, Leczenie, Dzień, Godzina, Zachowanie i Status.
   1. W identyfikatorze myszy dodaj linię myszy/genotyp matki.
   2. W identyfikatorze miotu należy wpisać identyfikator matki, a następnie numer miotu.
   3. W miocie # należy wskazać liczbę miotów, które matka miała.
   4. Upewnij się, że leczenie jest LBN lub kontrolne, zgodnie z warunkami, w których zwierzęta zostały umieszczone.
   5. Należy wskazać dzień jako odpowiadający mu analizowany dzień po urodzeniu.
   6. Wskaż czas jako sygnaturę czasową w filmie, kiedy zachowanie się rozpoczęło i zakończyło (względem początku nagrywania).
   7. Wybierz zachowanie z siedmiu opisanych wcześniej (N, O, LG, E, SG, C i NB) (Tabela 1).
   8. Zaznacz dwa typy stanów, START i STOP. W związku z tym każde zachowanie pojawi się dwukrotnie; Pierwszy zapis oznacza początek, a drugi stop.
3. Zgodnie z tym formatem należy uwzględnić informacje o wszystkich analizowanych dniach.
4. W środowisku języka R zaimportuj zestawy danych, które zostały sformatowane zgodnie z powyższym.
5. Zainstaluj pakiety dostępne pod adresem https://github.com/bvegetabile/entropyRate.
   UWAGA: Uruchomienie tego kodu powoduje utworzenie folderu o nazwie LBN; Niezależnie od warunku, ten folder zawiera obliczoną entropię. Dodatkowo, entropia każdego dnia może być następnie uśredniona przez badanego dla P3-P6 i porównana między warunkami.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pokazują, jak ELA, narzucone przez zubożałe środowisko w klatkach LBN, wpływa na opiekę matki i wyniki fizjologiczne potomstwa. Dzienna entropia zachowań związanych z opieką nad matką jest wyższa w LBN w dniach P3-P6 (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094; Rysunek 2A), a także średnią entropię każdej z zapór z tego okresu (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085; Rysunek 2B). Warto zauważyć, że nie ma znaczącej różnicy w średnim współczynniku entropii między różnymi miotami z tej samej matki, gdy są utrzymywane w tej samej grupie poddanej działaniu substancji (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58; Rysunek 2C), sugerując, że wskaźnik entropii może być w miarę stabilną cechą dla każdej tamy. Spośród wszystkich zachowań, lizanie i pielęgnacja jest tym, które zostało wykazane jako najbardziej rozdrobnione przez LBN³. Samice LBN wykazują większą częstotliwość lizania i pielęgnacji swoich młodych (LG) (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010; Rysunek 2D) oraz w krótszych seriach (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050; Rysunek 2E). Nie ma jednak istotnej różnicy w całkowitym czasie trwania LG między matkami kontrolnymi i LBN (t₁₆ = 1,52, p = 0,15; Rysunek 2F).

Rysunek 2: Analiza zachowań matczynych. (A) Dzienny wskaźnik entropii jest wyższy w przypadku matek z ograniczoną ściółką i gniazdowaniem (LBN) w porównaniu z tamami. kontroli (CTL) analizowanej za pomocą modelu efektów mieszanych (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094). (B) Średni wskaźnik entropii jest wyższy w zaporach LBN w porównaniu z tamami CTL (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085). (C) Średni współczynnik entropii (P3-P6) nie różni się znacząco w wielu miotach w obrębie tej samej matki, gdy jest utrzymywany w tej samej grupie poddawanej działaniu substancji (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58). Każda linia reprezentuje pojedynczą zaporę. (D) Skumulowana częstość zdarzeń związanych z lizaniem i pielęgnacją (LG) jest wyższa w przypadku matek LG w porównaniu z matkami LG. CTL (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010). (E) Średnia długość walki LG jest krótsza dla matek LG w porównaniu z CTL (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050). (F) Skumulowany czas spędzony na LG nie różni się znacząco ze względu na LBN (t₁₆ = 1,52, p = 0,15). Dane są średnie ± SEM, * p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szczenięta, które były hodowane w warunkach LBN, są znacznie mniejsze przy P10 (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001; Rysunek 3A). Różnica ta zwykle utrzymuje się w wieku odsadzenia (t₆₂ = 6,29, p = <0,0001; Rysunek 3B) ale nie jest już obserwowany w wieku dorosłym (t₃₈ = 1,08, p = 0,29; Rysunek 3C). Jednak poziom kortykosteronu jest zwiększony na początku badania w wieku dorosłym (t_18,79 = 2,23, p = 0,038; Rysunek 3D), sugerujący trwałe fizjologiczne efekty LBN. Są to oczekiwane różnice w udanej konfiguracji eksperymentalnej. W przypadku nieoptymalnej konfiguracji, wartości długości napadu LG, entropii i wagi szczeniąt mogą nie wykazywać żadnych różnic, prawdopodobnie z powodu zestresowanej grupy "kontrolnej". Na potrzeby tego artykułu płeć została załamana podczas analizy wyników potomstwa, ponieważ różnice płci nie są zwykle obserwowane w opisanych tutaj wynikach fizjologicznych; Jednak różnice płci w innych typach wyników, takich jak zachowania poznawcze i emocjonalne, są często zgłaszane w tym modelu i powinny być dalej badane⁴.

Rysunek 3: Wyniki potomstwa. (A) Ograniczone legowisko i gniazdowanie (LBN) zmniejsza wagę szczeniąt mierzoną na poziomie P10, tuż przed powrotem do standardowych klatek (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001). (B) Waga jest nadal zmniejszana przez LBN w wieku odsadzeniowym (t₆₂ = 6,29, p < 0,0001). (C) Masa ciała dorosłego nie różni się już ze względu na LBN (t₃₈ = 1,08, p = 0,29). (D) Wyjściowe stężenie kortykosteronu w wieku dorosłym jest zwiększane przez LBN, zgodnie z analizą testu t Welcha (t_18,79 = 2,23, p = 0,038). Na wszystkich wykresach kobiety są pokazane z okręgami, a mężczyźni z trójkątami. Dane są średnie ± SEM, *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół stosowania modelu LBN u myszy. Model ten jest ważnym narzędziem do zrozumienia, w jaki sposób etologicznie i translacyjnie istotna forma przewlekłego stresu we wczesnym okresie życia przyczynia się do rozwoju zaburzeń neuropsychiatrycznych u^potomstwa13. Jest również przydatny do badania zachowań matek i wszelkich zmian w mózgu matek z perspektywy molekularnej, neuroendokrynnej lub opartej na obwodach²⁴. W przypadku tego typu pytań wieloparzystość może być ważniejszą zmienną do rozważenia. Zaobserwowaliśmy, że wyniki entropii zachowania matki pozostają spójne w wielu miotach w obrębie tej samej matki (Rysunek 2C), co sugeruje, że entropia może być nieco stabilną cechą dla każdej matki. Odkrycie to może uzasadniać wykorzystanie wieloródek samic myszy, gdy nie jest możliwe użycie tylko nieródek, tak jak w przypadku kosztownych lub rzadkich myszy transgenicznych. Ze względu na możliwy niezamierzony wpływ wielorózdności na inne zmienne (np. środowisko wewnątrzmaciczne), zaleca się, aby eksperymentator statystycznie kontrolował wykorzystanie wieloródek podczas analizy danych.

Należy zauważyć, że model ten jest bardzo wrażliwy na zakłócenia środowiskowe. Wiele czynników może zakłócać pracę zwierząt, powodując problemy i nieoptymalne wyniki, takie jak zalanie klatki lub głośne dźwięki, takie jak pobliskie budowy. Zazwyczaj zakłócenia te spowodują, że zwierzęta kontrolne będą zestresowane, a zatem nie będzie różnic między warunkami kontrolnymi i LBN. Wskaźnikiem tych problemów mogą być podobne wagi u szczeniąt kontrolnych i LBN na poziomie P10 oraz podobne wartości entropii w zachowaniach związanych z opieką nad matką. Z tego powodu idealnym miejscem jest pokój opieki nad matką, który jest używany wyłącznie do tego celu, cichy i z dala od kolonii i innego personelu laboratoryjnego. Zaburzenia mogą również prowadzić do kanibalizmu młodych, zwłaszcza u matek młodszych niż P75. Ryzyko utraty młodych z powodu kanibalizmu jest mniejsze u matek po P75 i często po pierwszym miocie. Alternatywna wersja tej metody przesuwa czas eksperymentalnej manipulacji na P4-P11, aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko kanibalizmu^25,26; chociaż nie jest to konieczne w obecnych warunkach laboratoryjnych. Inna wersja LBN nie wykorzystuje przegrody siatkowej, ale nadal ogranicza ilość ściółki i materiału gniazdowego przez cały okres przed odsadzeniem po urodzeniu²⁷. Ważne jest, aby pamiętać, że zmiana osi czasu może prowadzić do różnych wyników, takich jak znęcanie się nad matką, co z kolei może skutkować różnymi wynikami dla potomstwa, takimi jak zachowania podobne do lęku^25,28. Inne częste problemy obejmują utratę danych o zachowaniu matki z powodu kąta kamery i dużego rozmiaru gniazda; Aby temu zapobiec, zaleca się umieszczenie lustra z tyłu klatki i upewnienie się, że w stanie kontrolnym jest tylko jedno gniazdo, aby zapobiec zbyt dużemu gniazdu i ukryciu szczeniąt przed kamerą. Wreszcie, niezbędne jest upewnienie się, że siatka jest prawidłowo dopasowana do klatki, aby zapobiec utknięciu lub zranieniu szczeniąt.

Zaletą modelu LBN jest to, że można go łatwo dostosować i połączyć z innymi czynnikami eksperymentalnymi. Przykładami zmiennych, które można dodać do tego protokołu, są dieta^29,30, wyzwania immunologiczne^30,31, różne linie transgeniczne^32,33 i chemogenetyka¹⁹. Co więcej, niektóre wersje tego modelu wykorzystują ramy czasowe P10-P17 i łączą je z separacją matek (MS)34,35,36. Ten paradygmat został również zaadaptowany jako stresor prenatalny, w którym matki są trzymane w środowisku LBN od E14 do E19^37,38, ale młode nigdy nie są bezpośrednio narażone na stres. Wreszcie, niektóre badania wykorzystują model dwóch trafień, który obejmuje ELA w połączeniu z różnymi testami warunków skrajnych na potomstwie, gdy osiąga dorosłość^19,39.

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie ma ona dużej przepływności. Ilość generowanych danych jest ograniczona liczbą kamer i przestrzenią dostępną w tym samym czasie, chociaż śmieci można łatwo rozłożyć w czasie. Ręczna ocena zachowania matki jest szczególnie czasochłonna i może wprowadzać stronniczość obserwatora, ale automatyczna ocena jest obecnie rozwijana⁴⁰, dzięki pojawieniu się podejść opartych na uczeniu maszynowym. Jeśli dane są oceniane ręcznie, zaleca się, aby ta sama osoba oceniła wszystkie filmy w jednym eksperymencie w celu zmniejszenia zmienności między obserwatorami. Innym ograniczeniem jest to, że model ten jest przeznaczony dla gryzoni, które polegają głównie na opiece matczynej, co utrudnia badanie opieki dwurodzicielskiej. Jednak niektóre grupy przyjęły deprywację ojcowską jako alternatywę dla stwardnienia rozsianego u gatunków dwurodzicielskich, takich jak mysz kalifornijska^41,42, więc można sobie wyobrazić, że LBN może być również przystosowany do tych gatunków.

Oprócz LBN, separacja matki jest drugim najbardziej widocznym modelem ELA, ponieważ inne formy stresu stosowane u dorosłych (tj. stres związany z powściągliwością) nie są etologicznie istotne i nie wpływają w ten sam sposób na młode. LBN różni się od stwardnienia rozsianego, ponieważ jest to forma przewlekłego stresu, która wywołuje fragmentaryczne i nieprzewidywalne zachowanie matki, podczas gdy w stwardnieniu rozsianym deprywacja jest przerywana i zwykle występuje w przewidywalnych porach^{każdego dnia}. Co ciekawe, oba modele mogą powodować zmiany w osi HPA i zachowania podobne do depresji u gryzoni, chociaż LBN może być bardziej powtarzalnym protokołem z mniejszą interakcją eksperymentatora i wyższą spójnością we wszystkich laboratoriach 1,11,13,16. Chociaż protokół ten jest przydatny w łagodzeniu niektórych źródeł zmienności (takich jak związane z eksperymentatorem), inne aspekty, takie jak różnice w obiektach dla zwierząt, pochodzenie zwierząt lub szczep, mogą wpływać na wyniki. Na przykład wiadomo, że myszy BALB/c mają wyraźniejszą reakcję na przewlekły stres związany z powściągliwością i mogą być inaczej wrażliwe na ELA niż C57BL/6J^27,44.

Podsumowując, model LBN wykorzystuje środowisko o niskich zasobach z nieprzewidywalną opieką matczyną i jest użytecznym podejściem do zrozumienia, w jaki sposób stres we wczesnym okresie życia wpływa na wiele różnych procesów, takich jak fizjologiczne adaptacje do stresu, zachowanie matki i rozwój mózgu. Warto zauważyć, że model ten został wykorzystany do zrozumienia, w jaki sposób i dlaczego ELA jest czynnikiem ryzyka zaburzeń neuropsychiatrycznych 1,5,9,12. W przyszłości zastosowanie LBN poszerzy naszą wiedzę na temat biologicznych podstaw zaburzeń zarówno psychicznych, jak i fizycznych oraz pomoże wyjaśnić nowe cele terapeutyczne w leczeniu skutków stresu w wrażliwym okresie okołoporodowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-calowa kamera sieciowa 4 MP z 4-krotnym zoomem IR Mini PT Dome	Hikvision	DS-2DE2A404IW-DE3(S6)
Amazon Basics Aluminiowy statyw fotograficzny z etui - zestaw 2, 2,8 - 6,7 stopy, 3,66 funta,	Amazon		od Amazon
Niebieska tęczówka	Niebieska tęczówka Bezpieczeństwo		niebieskiej tęczówki Opcjonalne oprogramowanie
do zarządzania materiałem wizyjnymCAMVATE 1/4"-20 Mini głowica kulowa z uchwytem sufitowym do CCTV i Uchwyt do monitorów ściennych wideo - 1991	Camvate		od Amazon
Ściółka z kolb kukurydzy	Gniazdo bawełniane Andersons	4B
	Ancare	NES3600
Przegroda siatkowa	McNICHOLS	4700313244	Standard, aluminium, stop 3003-H14, 3/16" nr .032 Standard (podniesiony), 70% otwarta przestrzeń
Oświetlacz podczerwieni Tendelux DI20	Tendelux		od Amazonka