Artykuł metodologiczny

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 lipca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące dowody sugerują, że translacja mRNA jest procesem silnie skompartmentalizowanym w komórce, a subkomórkowe transportowanie i lokalizacja określonych mRNA jest kluczowym czynnikiem dla zapewnienia, że białka o funkcjach specyficznych dla kompartmentów są produkowane w idealnym środowisku i w odpowiednich ilościach. Jednak techniki do subkomórkowego izolowania i charakteryzacji rybosomów, które translacjują te mRNA, były do tej pory ograniczone, co oznacza, że wiele pozostaje nieznane w kwestii tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji zlokalizowanej translacji mRNA.

Przedstawiamy tutaj AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi), metodę łączącą tagowanie epitopowe, nowo opracowaną optogenetycznie aktywowaną podzieloną ligandę biotyny oraz afinicyjną czyszczenie, aby szybko i specyficznie oznaczyć i odizolować rybosomy zlokalizowane w dowolnym subkomórkowym oddziale zainteresowania. Po pierwsze, edycja CRISPR/Cas9 jest używana do fuzji peptydu AviTag, miejsca kleienia proteazy z wirusa wycinarki tytoniu (TEV) oraz epitope tag FLAG z białkiem rybomalnym. Podzielona liganda biotyny, zfuzjonowana z domeną ukierunkowaną na organelle, jest ekspresowana w tej linii komórkowej i jest nieaktywna pod normalnymi stężeniami biotyny. Po aktywowaniu przez suplementacyjną biotynę i niebieskie światło, ligaza biotynyluje rybosomy z tagiem Avi w bezpośrednim otoczeniu, umożliwiając afinicyjne czyszczenie biotynylowanych rybosomów oraz skojarzonych białek i mRNA na perłach pokrytych streptawidyną. Niedenaturująco eluowane za pomocą kleienia proteazy TEV daje próbki nadające się do dalszej charakteryzacji białek rdzeniowych rybosomów, białek skojarzonych z rybosomami oraz wiązanych z rybosomami mRNA za pomocą sekwencjonowania RNA lub proteomiki spektrometrii mas.

W tym protokole przeglądamy zasady projektowania fuzji AviTag z białkiem rybomalnym oraz ukierunkowania enzymu podzielonej ligandy biotyny na organelle zainteresowania. Demonstrujemy aktywację systemu ALIBi, lizę komórkową, afinicyjne czyszczenie oraz eluowane próbek. Na koniec omawiamy typowe wyniki i rozwiązywanie problemów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje istotna potrzeba narzędzi, które mogą izolować próbki biologiczne z określonych podkomórkowych działów, aby lepiej zbadać, jak organizacja podkomórkowa i transport wpływają na procesy komórkowe. Translacja mRNA jest kluczowym przykładem takiego procesu: rosnące dowody sugerują, że translacja jest wysoce skomponowana i w szczególności, że wiele mRNA jest zlokalizowanych w organellach, gdzie będą przebywać ich zakodowane białka1,2. Jednakże mniej wiadomo o podkomórkowej lokalizacji maszyn translacyjnych. Rybosomy zaczynają swoje istnienie w jądełku i jądrze, gdzie zaczyna się ich montaż z białek rybosomalnych (RP) i rybosomalnych RNA (rRNA). Następnie są eksportowane do cytoplazmy na końcowe etapy montażu, po których zaczynają translację mRNA3,4. Kanoniczne miejsca translacji obejmują cytoplazmę i siateczkę śródplazmatyczną; w tej ostatniej syntetyzowane są białka integralne błony i białka przeznaczone do organelli związanych z błoną lub wydzielania pozakomórkowego5. Niedawno zidentyfikowane miejsca lokalnej translacji obejmują mitochondria, peroksysomy i przewody neuronalne6,7,8,9,10,11,12. Interesujące jest to, że pojawiają się również dowody na to, że cechy maszyn translacyjnych, takie jak białka związane z rybosomami, modyfikacje posttranslacyjne, modyfikacje rRNA i niekanoniczne stechiometrie rdzeniowych białek rybosomalnych, są zaangażowane w mechanizmy regulacyjne, które rządzą translacją określonych mRNA oraz parametrami takimi jak wierność i szybkość translacji13,14,15,16,17,18,19,20. Na przykład zidentyfikowano setki białek, które współpracują z rybosomem i mogą potencjalnie prowadzić do różnic w składzie podkomórkowych rybosomów13. Jednakże techniki izolowania subkomórkowych populacji rybosomów były ograniczone do tej pory; tym samym wiele pozostaje nieznane na temat tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji lokalnej translacji mRNA. Pojawienie się wszechstronnych metod izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, szczególnie tych kompatybilnych z modelowymi systemami ssaków, pozwoli na badanie tych cech maszyn translacyjnych na poziomie subkomórkowym.

Najstarsze metody izolowania subkomórkowych ułamków zawierających rybosomy były oparte na zasadach sekwencyjnej lizy i wirowania21,22. Zazwyczaj te metody są ograniczone do określonych organelli i często wymagają długiego czasu przetwarzania. Nowsza metoda opiera się na ligazie biotynowej BirA, która specyficznie biotynyluje substrat peptydu AviTag10,23,24. BirA może być genetycznie zlokalizowany w organelli zainteresowania w komórkach, gdzie rybosomy zostały oznaczone AviTag. Jednakże, ponieważ BirA jest aktywna w fizjologicznych stężeniach biotyny, konieczne jest hodowanie komórek w warunkach niedoboru biotyny, aby uniknąć konstytutywnego i niespecyficznego biotynylacji rybosomów z AviTag10,24. To ogranicza użycie BirA w typach komórek, które są wrażliwe na niedobór biotyny25. Wreszcie, opracowano promiskualne metody biotynylacji, które wykorzystują inżynieryjne enzymy takie jak BioID, TurboID i APEX26,27,28. Po indukcji, te enzymy produkują reaktywny produkt pośredni biotyny, który kowalenie modyfikuje dowolne reszty lizyny w promieniu enzymu. Promiskualne metody biotynylacji są bardzo przydatne do mapowania proteomów podkomórkowych, ale mniej pokazujące na różniczenie białek w ogólnej okolicy zlokalizowanego rybosomów w przeciwieństwie do białek, które są w bliższej odległości z nimi.

Tutaj, prezentujemy naszą niedawno opracowaną metodę oznakowania i izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, zwaną AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi). Ta metoda wykorzystuje inżynieryjny podzielony BirA związany z optogenetycznie ulepszonymi przełącznikami Magnet (eMag) (Rysunek 1A), które heterodimeryzują pod oświetleniem niebieskim29; i tag peptydu składający się z epitopu FLAG, miejsca kleizenia proteazy wirusa wycięcia tytoniu (TEV) i AviTag (FTA) związanego z białkiem rybosomalnym Rpl31 (Rysunek 1B). Podzielony enzym może być genetycznie ukierunkowany na wybrane organelle, jest nieaktywny w fizjologicznych stężeniach biotyny i może być odtworzony w ciągu kilku minut po oświetleniu niebieskim i dodaniu suplementacji biotyny (Rysun

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hodowla komórek mESC

UWAGA: Przed aktywacją ALIBi i lizą komórki mESC należy obsługiwać stosując standardową sterylną technikę hodowli komórek. Wirowanie nietkniętych komórek mESC powinno odbywać się w warunkach 200 × g przez 3 min w temperaturze pokojowej, o ile nie określono inaczej. Przed użyciem nagrzewać media do 37 °C w kąpieli wodnej, o ile nie określono inaczej. Komórki mESC należy przesadzać do świeżej płytki hodowlanej pokrytej żelatyną na noc (patrz krok 1.1).

  1. Na dzień przed rozmrożeniem komórek mESC L31-FTA, pokryj dno 10-centymetrowej płytki 5 ml 0,1% żelatyny. Inkubacja w 37 °C przez noc.
  2. Połącz składniki mediów mESC (Tabela 2) i przefiltruj przez filtr o rozmiarze 0,2 μm. Przechowuj w 4 °C do 1 miesiąca.
  3. W dniu rozmrożenia, rozgrzej 5 ml alikwot mediów do rozcieńczania rozmrożonych komórek i 10 ml alikwot do ich zasiewu.
  4. Pobierz kriowialkę zawierającą ~5 × 106 komórek mESC L31-FTA z cieczy azotu i natychmiast rozmroź przez obracanie dnem kriowialki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Delikatnie wymieszaj 0,5-1 ml mediów z alikwotem 5 ml z zawartością kriowialki, o ile pojemność kriowialki to pozwala, a następnie przenieś zawartość kriowialki z powrotem do 5 ml mediów.
  6. Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.
  7. Resuspenduj pellet komórek z 10 ml alikwotem mediów.
  8. Odsącz żelatynę z 10 cm płytki i natychmiast przenieś zawiesinę komórek do płytki. Inkubacja w 37 °C.
  9. Co 24 godziny (z wyjątkiem dni przesadzania), odsącz stare medium z płytki i wymień na 10 ml świeżego mediów.
  10. Kiedy kolonie osiągają 70-80% konfluencji (zwykle 48 godzin po zasianiu), odsącz stare medium i dwukrotnie przepłucz 10 ml buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).
  11. Po odsączeniu DPBS, pokryj płytkę 2 ml 0,05% trypsyny (Tabela 2). Inkubacja w 37 °C przez 5 min.
  12. Neutralizuj trypsynę dodając 4 ml zimnego mediów mESC do płytki. Natychmiast użyj 5 lub 10 ml pipety serologicznej do przepompowywania w górę i w dół 15x w płytce, aby odłączyć kolonie w jednokomórkową zawiesinę.
  13. Przenieś zawiesinę do stężonej epruwetki. Opcjonalnie, pobierz alikwot do zliczenia komórek za pomocą licznika komórek.
  14. Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.
  15. Resuspenduj pellet komórek w świeżym medium. Przesadź 5 × 106 komórek (zwykle stosunek przesadzania 1:6) do świeżej pokrytej żelatyną 10 cm płytki i inkubacja w 37 °C. Powtórz kroki 1.9-1.15 w miarę potrzeby, aż będzie gotowy do przejścia do transfekcji.
  16. Aby zamrozić kultury komórek, trypsynizuj płytkę mESC (jak w krokach 1.10-1.14). Resuspenduj pellet komórek w medium do zamrażania (250-500 μl na 5 × 106 komórek), podziel na kriowialki i powoli zamroź w pojemniku do zamrażania komórek w -80 °C przez noc przed przeniesieniem do cieczy azotu.

2. Transfekcja

UWAGA: Przeprowadź transfekcję w dniu, w którym komórki mESC są gotowe do przesadzenia. Plasmidy mogą zacząć się ekspresować już 3-5 godzin po transfekcję. Po rozpoczęciu ekspresji zalecamy obsługę komórek w ciemności i minimalizowanie narażenia na temperatury poniżej 37 °C, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że domeny optogenetyczne Magnet dimerizują nie tylko pod wpływem niebieskiego światła, ale także po ekspozycji na zimno31. Trzymaj płytki w dedykowanym inkubatorze lub zabezpiecz półkę w wspólnym inkubatorze przed światłem folią aluminiową. Podczas obsługi komórek spoza inkubatora, włącz lub zablokuj wszystkie światła w pokoju i okna przed ręką, a do widzenia użyj czerwonego lampki na głowę. Nie zostawiaj otwartych drzwi inkubatora dłużej niż konieczne. Wyjmuj tylko małe partie płytek z inkubatora na raz i opieraj płytki na izolującej powierzchni (np. czysta pokrywa pudełka styropianowego), podczas gdy obsługujesz, aby zminimalizować kontakt z powierzchniami roboczymi w temperaturze pokojowej. W pełni rozgrzej medium przed użyciem. Nie inspekcjonuj płytek w mikroskopie emitującym światło.

  1. Na dzień przed transfekcją, pokryj 10 cm płytkę żelatyną.
  2. W dniu transfekcji, odsącz żelatynę z płytki i dodaj 7,5 ml mediów do nagrzania w 37 °C. Nagrzej zredukowane medium bez surowicy w 37 °C do resuspendowania komórek.
  3. Rozcień 18,75 μl reagentu transfekcyjnego w 250 μl zredukowanego medium bez surowicy. Delikatnie potnij, aby wymieszać

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (sekcja 6 protokołu) jest najszybszym sposobem wstępnej oceny powodzenia eksperymentu. Po inkubacji membran ze streptawidyną-HRP, lizat z komórek, w których obecne były wszystkie komponenty systemu, powinien zawierać prążek odpowiadający biotynglowanemu L31-FTA (Rysunek 2A, ścieżka 20). Ten sam prążek, zazwyczaj o większym natężeniu, powinien być obecny, jeśli komórki zostały transfektowane pełnowymiarową BirA jako kontrolą pozytywną (Rysunek 2A, ścieżki 1–4). Prążek ten powinien być słabszy lub nieobecny w próbkach, w których pominięto jeden lub więcej komponentów systemu (Rysunek 2A, wszystkie pozostałe ścieżki). Ponieważ komórki ssaków zawierają kilka endogennych biotynglowanych białek karboksylazy w zakresie 70–80 i 120–130 kDa34,35, zazwyczaj obserwuje się prążki o tych masach cząsteczkowych we wszystkich próbkach lizatu. Membrany można również inkubować z przeciwciałem anty-V5, aby potwierdzić ekspresję fragmentów split BirA.

Analiza Western blot próbek lizatu, frakcji przepływowej i eluatu pozwala ocenić, czy eksperyment oczyszczania powinowactwem zakończył się sukcesem (Rysunek 2B). Zmniejszenie ilości biotynilowanego L31-FTA w frakcji przepływowej w stosunku do lizatu wskazuje, że znaczna część biotynilowanych rybosomów została wychwycona podczas oczyszczania powinowactwem. Ponieważ streptawidyna wiąże się z AviTag oddalonym od miejsca cięcia TEV w L31-FTA, biotynilowana część L31-FTA zostaje odcięta podczas elucji za pośrednictwem TEV, w związku z czym w eluacie nie powinno znajdować się biotynilowane L31-FTA. L31-FTA w stanie niebiotynilowanym, biotynilowanym oraz po cięciu TEV są wykrywalne za pomocą przeciwciała anty-FLAG, co powinno wykazać, że eluat zawiera prążek odciętego L31-FTA o nieco niższej masie cząsteczkowej niż nienaruszony L31-FTA. Należy zauważyć, że prążki L31-FTA w lizacie i frakcji przepływowej często mają porównywalną intensywność po detekcji przeciwciałem anty-FLAG; ponieważ aktywacja jest przeprowadzana krótko, tylko niewielka frakcja całkowitego L31-FTA zostaje biotynilowana i wychwycona metodą powinowactwa. Detekcja innych białek rybosomalnych, takich jak Rps12, wykazuje obecność małej podjednostki rybosomu w eluacie, co sugeruje, że oczyszczanie powinowactwem biotynilowanego L31-FTA pozwala na wychwycenie całych rybosomów. Z kolei detekcja przeciwciałem anty-V5 pokazuje, że białka niewiążące się z rybosomem, takie jak same fragmenty split BirA, są nieobecne w eluacie.

Wyznaczenie optymalnego stosunku kulek do lizatu jest istotne, a Rysunek 2C obrazuje malejącą użyteczność zwiększania ilości lizatu ponad pojemność kulek. W tym eksperymencie zastosowano 2,5-krotnie więcej lizatu przy tej samej objętości 450 µL kulek pokrytych streptawidyną. W konsekwencji znaczna ilość biotynilowanego L31-FTA pozostała w frakcji przepływowej. Działo się tak częściowo dlatego, że endogenne białka biotynilowane również zajmują miejsca wiążące na kulkach pokrytych streptawidyną, co potwierdza ich częściowe wyczerpanie we frakcji przepływowej. Endogenne białka biotynilowane nie są wykrywalne w elucie, ponieważ nie zostają uwolnione z kulek podczas elucji za pośrednictwem TEV, lecz są odzyskiwane po podgrzaniu kulek poelucyjnych w buforze Laemmli.

Obrazy immunofluorescencyjne pokazujące lokalizację rozdzielonego enzymu w docelowych organellach, a także wyniki innych eksperymentów systemowych, takich jak RNA-seq i proteomika MS eluatów, można znaleźć w naszej niedawnej publikacji30.

Proces znakowania białek za pomocą ALBi, proteazy TEV; schemat rybosomu, rozszczepionej BirA, aktywacji światłem.
Rycina 1: Schemat komponentów ALIBi i przebiegu eksperymentu. (A) Rola każdego komponentu podczas aktywacji, oczyszczania powinowactwa i elucji. (B) Położenie FLAG-TEV-AviTag w sekwencji kodującej Rpl31 oraz położenie Rpl31 na strukturze rybosomu (PDB 4V6X). (C) Struktura fragmentu N (różowy) i fragmentu C (fioletowy) rozszczepionego enzymu BirA, gdzie grot strzałki oznacza miejsce rozszczepienia (PDB 1BIB). (D) Przykłady par konstruktów użytych do kierowania fragmentów rozszczepionego enzymu BirA do organelli. (E) Harmonogram typowego eksperymentu. Rycina została zaadaptowana z Zhang et al.30. Skróty: ? = hipotetyczne białka współoczyszczane; ALIBi = AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation; TEV = tobacco etch virus; MS = spektrometria mas; CDS = sekwencja kodująca; ER = retikulum endoplazmatyczne; eMag = enhanced Magnet; NES = sekwencja eksportu jądrowego; MAVS = białko mitochondrialne sygnałowania przeciwwirusowego. Zaadaptowano za zgodą Zhang et al.30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza western blot oddziaływań białkowych z mESCs; przedstawia wiązanie biotyny i streptawidyny.
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki western blot. (A) Biotynilacja L31-FTA, wykryta za pomocą streptawidyny-HRP, w warunkach obejmujących różne kombinacje komponentów ALIBi. Przeciwciało anty-V5 wykrywa fragmenty N- i C-końcowe odpowiednio o niższej i wyższej masie cząsteczkowej. GAPDH służy jako kontrola załadunku. Pełnowymiarowa BirA służy jako kontrola pozytywna. Ścieżki z GFP wyrażonym zamiast enzymów rozszczepionych lub z mESCs bez znacznika służą jako kontrole negatywne. Panel ten został zaadaptowany z pracy Zhang et al.30 (B) Ilość biotynilowanego L31-FTA (wykryta za pomocą streptawidyny-HRP), całkowitego L31-FTA (wykryta za pomocą przeciwciała anty-FLAG), fragmentów enzymu rozszczepionego (wykryte za pomocą przeciwciała anty-V5) oraz białka małej podjednostki rybosomalnej Rps12 w frakcjach lizatu, przepływu i eluatu. Procenty wskazują proporcję całkowitej objętości próbki, która została załadowana. (C) Ilość biotynilowanego L31-FTA, całkowitego L31-FTA oraz fragmentów enzymu rozszczepionego w frakcjach z eksperymentu affinity pulldown, w którym wykorzystano 2,5-krotność ilości lizatu przy standardowej objętości 450 μL kulek powlekanych streptawidyną. W przypadku ścieżki 4 kulki po elucji podgrzano do 95 °C przez 10 min w 450 μL 1x buforu Laemmli. Skróty: ALIBi = AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation; HRP = peroksydaza chrzanowa; GFP = zielone białko fluorescencyjne; mESCs = mysie embrionalne komórki macierzyste. Panel (A) został zaadaptowany za zgodą Zhang et al.30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Sekwencje lokalizacji subkomórkowej. Sekwencje peptydowe użyte do kierowania rozdzielonymi enzymami do wybranych organelli36,37,38,39,40,41. Adaptacja za zgodą Zhang i wsp.30.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Składy buforów. Zawiera bufory stosowane do hodowli komórek, lizy komórek, oczyszczania powinowactwa/eluowania oraz western blotu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Warunki analizy Western blot. Zawiera rozcieńczenia sond/przeciwciał oraz warunki etapów blokowania, płukania i inkubacji z sondą/przeciwciałem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Przykładowa strategia insercji FTA do endogennego genu białka rybosomalnego za pomocą CRISPR.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa S1: Przykład strategii CRISPR w celu insercji FLAG-TEV-AviTag do endogennego genu białka rybosomalnego. Dwa plazmidy oparte na PX459, z których każdy koduje białko Cas9 połączone z T2A i białkiem oporności na puromycynę, a także guide RNA, są transfektowane do mESC typu dzikiego w celu wytworzenia dwóch kompleksów Cas9-gRNA. Jednocześnie transfektowany jest plazmid donora. Kompleksy Cas9-gRNA przecinają następnie DNA genomowe w miejscach otaczających kodon stop oraz plazmid donora, aby uwolnić zlinearyzowany matrycowy dsDNA do naprawy. Umożliwia to naprawę DNA genomowego za pomocą mechanizmu HDR (homology-directed repair). W pomyślnie zmodyfikowanym DNA genomowym oryginalne miejsca cięcia gRNA zawierają teraz mutacje, aby zapobiec ponownemu przecięciu. Skróty: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; TEV = tobacco etch virus; puroR = białko oporności na puromycynę; gRNA = guide RNA; mESCs = mysie embrionalne komórki macierzyste; RP = białko rybosomalne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2: Zalecany projekt starterów do przesiewowego genotypowania klonów po edycji CRISPR. Konfiguracje A i B przedstawiają zalecane rozmieszczenie starterów, w których co najmniej jeden starter w każdej parze znajduje się dystalnie względem 300 bp regionów flankujących. Konfiguracja C nie jest zalecana ze względu na ryzyko wyniku fałszywie dodatniego wynikającego z amplifikacji resztkowego plazmidu donora. Skróty: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; gRNA = guide RNA; RP = ribosomal protein. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi oferuje kilka zalet w stosunku do istniejących technik badania translacji subkomórkowej i ma potencjalne przyszłe zastosowania w biologii rybosomów i poza nią. Ten protokół wymaga podobnego lub mniejszej ilości czasu w porównaniu z sekwencyjnym lizysem i wirowaniem21,22 i jest potencjalnie stosowany do każdego subkomórkowego zespołu, który może być genetycznie ukierunkowany za pomocą sekwencji peptydowej lokalizacyjnej. W porównaniu z konstytutywnie aktywnym BirA10,24, ta metoda nie wymaga hodowania komórek w mediach pozbawionych biotyny. Wcześniej zgłaszane stężenia biotyny w surowicy wołowej płodowej wahają się od 0,04 μM do 0,2 μM25,42,43; tym samym nasze media mESC, które zawierają 15% surowicy wołowej płodowej i żadnych innych składników zawierających biotynę, mają szacowaną koncentrację biotyny na poziomie 0,006–0,03 μM. W porównaniu z rozpuszczalnymi metodami biotynizacji zbliżeniowej26,27,28, to podejście izoluje subkomórkowe maszyny translacyjne, a nie subkomórkowe proteomy. Dodatkowo pozwala na niedenaturujące elucję, dzięki czemu elucjonowana maszyna translacyjna jest teoretycznie odpowiednia do dalszych analiz wymagających natywnych kompleksów.

Przydatność tej metody została zilustrowana w naszych ostatnich pracach30, w których pierwotne użycie podejścia umożliwiło bezprecedensowe porównanie subpopulacji rybosomów w komórkach ssaków poprzez charakterystykę związanych mRNA i białek związanych z rybosomami. Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne subkomórkowe przedziały, w których opisano zlokalizowany przekład. Inne cechy maszyn translacyjnych, takie jak modyfikacje potranslacyjne, izoformy splicingu RP i modyfikacje rRNA, pozostają również do zbadania na poziomie subkomórkowym. Poza dodatkowymi zastosowaniami do biologii rybosomów, ALIBi w zasadzie może być również wykorzystany do badania subkomórkowych populacji innych kompleksów białkowych.

Ta metoda, jednak, ma pewne ograniczenia i wyzwania. Po pierwsze, wymaga wprowadzenia FTA do białka rybosomalnego i ekspresji konstrukcji podzielonego enzymu, co może okazać się trudne w systemach modelowych z ograniczonymi środkami do manipulacji genetycznej. Wymaga również pracy w warunkach ciemności przez część protokołu i utrzymania kontroli temperatury próbek, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji. Dlatego kluczowe jest minimalizowanie ekspozycji na światło i temperatury poniżej 37 °C po transfekcję i przed aktywacją oraz przejście przez aktywację, lizę i afinicyjną czyszczenie bez opóźnień. Po schłodzeniu podczas lizy, próbki nie powinny się nagrzewać powyżej 4 °C, aby zminimalizować degradację i ciągłą aktywność BirA. 

Rozwiązywanie problemów może być wymagane, jeśli nie zaobserwuje się oczekiwanego stopnia biotynizacji L31-FTA. Jeśli nie wykryje się żadnej biotynizacji w lizatach po aktywacji, najpierw potwierdź, że wszystkie komponenty są obecne (L31-FTA, podzielone fragmenty BirA N- i C-, suplementarna biotyna, niebieskie światło) i sprawdź, czy biotynizacja jest wykrywana w dodatniej próbce kontrolnej wyrażającej pełną długość BirA. Dodatkowo, z naszych doświadczeń, mESC wyrażają wystarczająco wysokie poziomy endogennych białek zbiotynizowanych (Rysunek 2B, C), które mogą służyć do potwierdzenia, że streptawidyna-HRP odpowiednio wykrywa biotynizację. Rozważ zwiększenie czasu aktywacji, ilości lizatu naładowanego na SDS-PAGE i czasu ekspozycji na chemiluminescencję wykrywania Western blot. Jeśli używasz wcześniej nieprzetestowanej linii komórkowej z oznaczeniem FTA lub enzymu podzielonego docelowego organellum, rozważ, czy część rybosomalna zawierająca FTA ma wystarczającą interakcję z podzielonym enzymem, aby nastąpiła biotynizacja.

Odwrotnie, obserwowanie znacznej biotynizacji w nieaktywowanych próbkach kontrolnych również byłoby niepożądanym rezultatem, ponieważ sugerowałoby, że biotynizacja AviTag zachodzi poza okresem aktywacji. Ponieważ rybosoмы i przedrybosoмы przemieszczają się między przedziałami subkomórkowymi (tj. między nukleolusem i jądrem do cytoplazmy podczas biogenezy3,4, lub z cytoplazmy do RE za pośrednictwem dokowania opartego na cząsteczce rozpoznawania sygnałów do translokonu 5), rybosoмы, które zostały zbiotynizone przed punktem czasowym aktywacji/lizy, mogą już nie być zlokalizowane w ciekawym organolecie i tym samym mogą nie mieć już charakterystyk specyficznych dla organoleu. Jeśli pomimo minimalnego narażenia na światło i wycieki temperatury wystąpi tło biotynizacji, rozważ zmniejszenie ilości transfekowanego plazmidu enzymu podzielonego i zbadanie, czy jakiekolwiek składniki media zawierają wyższy niż przewidywany poziom biotyny. Chociaż wyeliminowanie c

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom Barna Lab za pomocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 °C składowanieDo hodowania komórek
0,1% żelatyna w wodzieMilliporeSigmaES-006-BDo hodowania komórek
Filtry 0,2 µmFisher04-977-158Do hodowania komórek
0,5% trypsyna-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Do hodowania komórek
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Do lizy i czyszczenia pokrewnego
1 M Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Do lizy i czyszczenia pokrewnego
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpcjonalnie: do wstawiania FTA w endogenne locus białka rybosomalnego
1,5 i 2 mL probówki mikrowirówkowe, autoklawowaneDo transfekcji
1,5, 2 mL i 5 mL probówki mikrowirówkowe do białek o niskiej adsorpcjiEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Do lizy i czyszczenia pokrewnego
10 cm naczynia do hodowli tkankowejDo hodowania komórek
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLDo lizy i czyszczenia pokrewnego
10x bufor Tris/glicyna/SDSBio-Rad1610772Do Western blot
37 °C inkubator do hodowli tkankowej x 2Do hodowania komórek. Jeden z nich służy jako główny inkubator do hodowli komórek i iluminacji transfekowanych komórek. Tymczasowa przestrzeń jest potrzebna w drugim inkubatorze w dniu aktywacji ALIBi, aby pomieścić transfekowane komórki podczas przygotowywania transiluminatora w głównym inkubatorze.
37 °C kąpiel wodnaDo hodowania komórek
5 M NaClThermoFisherAM9010Do lizy i czyszczenia pokrewnego
50 mM biotinThermoFisherB20656Do lizy i czyszczenia pokrewnego
6x bufor LaemmliFIsher50-196-784Do Western blot
70% etanolDo dezynfekcji
AcetonitrylFisherA955Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Zestaw AcTEV proteazyThermoFisher12575015Do lizy i czyszczenia pokrewnego
Plasmid ALiBi C-fragmentAddgene#235615, 235636 – 235641Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep
Plasmid ALiBi N-fragmentAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep
Guma aluminiowaDo lizy i czyszczenia pokrewnego
Bicarbonat amonowyMilliporeSigma5.3305Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Przeciwciało anty-FLAGMilliporeSigmaF3165Do Western blot
Przeciwciało anty-GAPDHCell Signaling5174Do Western blot
Przeciwciało anty-mysieGE HealthcareNA931VDo Western blot
Przeciwciało anty-króliczeGE HealthcareNA934VDo Western blot
Przeciwciało anty-Rpl12Abcamab175219Do Western blot
Przeciwciało anty-Rpl31Abcamab103991Do Western blot
Przeciwciało anty-Rpl5ProteinTech15430-1-APDo Western blot
Przeciwciało anty-V5ThermoFisherR960-25Do Western blot
ApyrazaNEBM0398LDo lizy i czyszczenia pokrewnego
Beta-merkatoprol (55 mM)ThermoFisher21985-023Do hodowania komórek
Światło transiluminatora niebieskiegoClare Research ChemicalDR46B (mały) lub DR196 (duży)Do lizy i czyszczenia pokrewnego
Albumina bydlęca (BSA)FisherBP1600-100Do Western blot
Wstążki C18 (OMIX C18 tips)AgilentA57003100Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Pojemnik do zamrażania komórekDo hodowania komórek
Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 15 mL i/lub 50 mLDo hodowania komórek
Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5-2 mLDo lizy i czyszczenia pokrewnego. Powinna być wydajna do chłodzenia do 4 C i prędkości do 17 000 g. Idealnie znajduje się w pomieszczeniu, które można tymczasowo zaciemnić podczas przenoszenia probówek wewnątrz i na zewnątrz.
Zestaw Clarity ECLBio-Rad170-5061Do Western blot
Zestaw Criterion gelBio-Rad1656001Do Western blot
Zestaw Criterion TGX wstępnie żelowanych żeli, 4-20%Bio-Rad5671095Do Western blot. Dostępne dodatkowe rozmiary i układy formacji
CykloheksymidMilliporeSigmaC7698-5GDo lizy i czyszczenia pokrewnego
DeoksicholanMilliporeSigmaS1827Do lizy i czyszczenia pokrewnego
DytiotreitolThermoFisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biologianumer 233numer 233W tym miesi cu w JoVEnumer

Powiązane artykuły