AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rosnące dowody sugerują, że translacja mRNA jest procesem silnie skompartmentalizowanym w komórce, a subkomórkowe transportowanie i lokalizacja określonych mRNA jest kluczowym czynnikiem dla zapewnienia, że białka o funkcjach specyficznych dla kompartmentów są produkowane w idealnym środowisku i w odpowiednich ilościach. Jednak techniki do subkomórkowego izolowania i charakteryzacji rybosomów, które translacjują te mRNA, były do tej pory ograniczone, co oznacza, że wiele pozostaje nieznane w kwestii tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji zlokalizowanej translacji mRNA.
Przedstawiamy tutaj AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi), metodę łączącą tagowanie epitopowe, nowo opracowaną optogenetycznie aktywowaną podzieloną ligandę biotyny oraz afinicyjną czyszczenie, aby szybko i specyficznie oznaczyć i odizolować rybosomy zlokalizowane w dowolnym subkomórkowym oddziale zainteresowania. Po pierwsze, edycja CRISPR/Cas9 jest używana do fuzji peptydu AviTag, miejsca kleienia proteazy z wirusa wycinarki tytoniu (TEV) oraz epitope tag FLAG z białkiem rybomalnym. Podzielona liganda biotyny, zfuzjonowana z domeną ukierunkowaną na organelle, jest ekspresowana w tej linii komórkowej i jest nieaktywna pod normalnymi stężeniami biotyny. Po aktywowaniu przez suplementacyjną biotynę i niebieskie światło, ligaza biotynyluje rybosomy z tagiem Avi w bezpośrednim otoczeniu, umożliwiając afinicyjne czyszczenie biotynylowanych rybosomów oraz skojarzonych białek i mRNA na perłach pokrytych streptawidyną. Niedenaturująco eluowane za pomocą kleienia proteazy TEV daje próbki nadające się do dalszej charakteryzacji białek rdzeniowych rybosomów, białek skojarzonych z rybosomami oraz wiązanych z rybosomami mRNA za pomocą sekwencjonowania RNA lub proteomiki spektrometrii mas.
W tym protokole przeglądamy zasady projektowania fuzji AviTag z białkiem rybomalnym oraz ukierunkowania enzymu podzielonej ligandy biotyny na organelle zainteresowania. Demonstrujemy aktywację systemu ALIBi, lizę komórkową, afinicyjne czyszczenie oraz eluowane próbek. Na koniec omawiamy typowe wyniki i rozwiązywanie problemów.
Wprowadzenie
Istnieje istotna potrzeba narzędzi, które mogą izolować próbki biologiczne z określonych podkomórkowych działów, aby lepiej zbadać, jak organizacja podkomórkowa i transport wpływają na procesy komórkowe. Translacja mRNA jest kluczowym przykładem takiego procesu: rosnące dowody sugerują, że translacja jest wysoce skomponowana i w szczególności, że wiele mRNA jest zlokalizowanych w organellach, gdzie będą przebywać ich zakodowane białka1,2. Jednakże mniej wiadomo o podkomórkowej lokalizacji maszyn translacyjnych. Rybosomy zaczynają swoje istnienie w jądełku i jądrze, gdzie zaczyna się ich montaż z białek rybosom....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. hodowla komórek mESC
UWAGA: Przed aktywacją ALIBi i lizą komórki mESC należy obsługiwać stosując standardową sterylną technikę hodowli komórek. Wirowanie nietkniętych komórek mESC powinno odbywać się w warunkach 200 × g przez 3 min w temperaturze pokojowej, o ile nie określono inaczej. Przed użyciem nagrzewać media do 37 °C w kąpieli wodnej, o ile nie określono inaczej. Komórki mESC należy przesadzać do świeżej płytki hodowlanej pokrytej żelatyną na noc (patrz krok 1.1).
- Na dzień przed rozmrożeniem komórek mESC L31-FTA, pokryj dno 10-centymetrowej płytki 5 ml 0,1% żelatyny. Inkubacja w 37 °C przez no....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Western blot (sekcja 6 protokołu) jest najszybszym sposobem wstępnej oceny powodzenia eksperymentu. Po inkubacji membran ze streptawidyną-HRP, lizat z komórek, w których obecne były wszystkie komponenty systemu, powinien zawierać prążek odpowiadający biotynglowanemu L31-FTA (Rysunek 2A, ścieżka 20). Ten sam prążek, zazwyczaj o większym natężeniu, powinien być obecny, jeśli komórki zostały transfektowane pełnowymiarową BirA jako kontrolą pozytywną (Rysunek 2A, śc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
ALIBi oferuje kilka zalet w stosunku do istniejących technik badania translacji subkomórkowej i ma potencjalne przyszłe zastosowania w biologii rybosomów i poza nią. Ten protokół wymaga podobnego lub mniejszej ilości czasu w porównaniu z sekwencyjnym lizysem i wirowaniem21,22 i jest potencjalnie stosowany do każdego subkomórkowego zespołu, który może być genetycznie ukierunkowany za pomocą sekwencji peptydowej lokalizacyjnej. W porównaniu z konstytutywnie aktywny.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.
Podziękowania
Autorzy dziękują członkom Barna Lab za pomocne dyskusje.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| -80 °C składowanie | Do hodowania komórek | ||
| 0,1% żelatyna w wodzie | MilliporeSigma | ES-006-B | Do hodowania komórek |
| Filtry 0,2 µm | Fisher | 04-977-158 | Do hodowania komórek |
| 0,5% trypsyna-EDTA (10X) | ThermoFisher | 15400-054 | Do hodowania komórek |
| 1 M MgCl2 | ThermoFisher | AM9010 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 1 M Tris pH 7,5 | ThermoFisher | 15567027 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 1 M Tris pH 8 | ThermoFisher | AM9855G | Opcjonalnie: do wstawiania FTA w endogenne locus białka rybosomalnego |
| 1,5 i 2 mL probówki mikrowirówkowe, autoklawowane | Do transfekcji | ||
| 1,5, 2 mL i 5 mL probówki mikrowirówkowe do białek o niskiej adsorpcji | Eppendorf | 022431081, 022431102, 0030108302 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 10 cm naczynia do hodowli tkankowej | Do hodowania komórek | ||
| 10 M NaOH | MilliporeSigma | 72068-100ML | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 10x bufor Tris/glicyna/SDS | Bio-Rad | 1610772 | Do Western blot |
| 37 °C inkubator do hodowli tkankowej x 2 | Do hodowania komórek. Jeden z nich służy jako główny inkubator do hodowli komórek i iluminacji transfekowanych komórek. Tymczasowa przestrzeń jest potrzebna w drugim inkubatorze w dniu aktywacji ALIBi, aby pomieścić transfekowane komórki podczas przygotowywania transiluminatora w głównym inkubatorze. | ||
| 37 °C kąpiel wodna | Do hodowania komórek | ||
| 5 M NaCl | ThermoFisher | AM9010 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 50 mM biotin | ThermoFisher | B20656 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| 6x bufor Laemmli | FIsher | 50-196-784 | Do Western blot |
| 70% etanol | Do dezynfekcji | ||
| Acetonitryl | Fisher | A955 | Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej |
| Zestaw AcTEV proteazy | ThermoFisher | 12575015 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| Plasmid ALiBi C-fragment | Addgene | #235615, 235636 – 235641 | Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep |
| Plasmid ALiBi N-fragment | Addgene | #235614, 235635, 235642, 235643 | Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep |
| Guma aluminiowa | Do lizy i czyszczenia pokrewnego | ||
| Bicarbonat amonowy | MilliporeSigma | 5.3305 | Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej |
| Przeciwciało anty-FLAG | MilliporeSigma | F3165 | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-GAPDH | Cell Signaling | 5174 | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-mysie | GE Healthcare | NA931V | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-królicze | GE Healthcare | NA934V | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-Rpl12 | Abcam | ab175219 | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-Rpl31 | Abcam | ab103991 | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-Rpl5 | ProteinTech | 15430-1-AP | Do Western blot |
| Przeciwciało anty-V5 | ThermoFisher | R960-25 | Do Western blot |
| Apyraza | NEB | M0398L | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| Beta-merkatoprol (55 mM) | ThermoFisher | 21985-023 | Do hodowania komórek |
| Światło transiluminatora niebieskiego | Clare Research Chemical | DR46B (mały) lub DR196 (duży) | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| Albumina bydlęca (BSA) | Fisher | BP1600-100 | Do Western blot |
| Wstążki C18 (OMIX C18 tips) | Agilent | A57003100 | Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej |
| Pojemnik do zamrażania komórek | Do hodowania komórek | ||
| Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 15 mL i/lub 50 mL | Do hodowania komórek | ||
| Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5-2 mL | Do lizy i czyszczenia pokrewnego. Powinna być wydajna do chłodzenia do 4 C i prędkości do 17 000 g. Idealnie znajduje się w pomieszczeniu, które można tymczasowo zaciemnić podczas przenoszenia probówek wewnątrz i na zewnątrz. | ||
| Zestaw Clarity ECL | Bio-Rad | 170-5061 | Do Western blot |
| Zestaw Criterion gel | Bio-Rad | 1656001 | Do Western blot |
| Zestaw Criterion TGX wstępnie żelowanych żeli, 4-20% | Bio-Rad | 5671095 | Do Western blot. Dostępne dodatkowe rozmiary i układy formacji |
| Cykloheksymid | MilliporeSigma | C7698-5G | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| Deoksicholan | MilliporeSigma | S1827 | Do lizy i czyszczenia pokrewnego |
| Dytiotreitol | ThermoFisher |
Bibliografia
- Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
- Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
- Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
- Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
- Aviram N, Schuldiner M. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
