Tutaj przedstawiamy niedrogą i powtarzalną metodę demonstrującą transport błonowy histydyny w jelicie kozy. Proces ten zachodzi poprzez kotransport jonów histydyny i sodu, co jest możliwe dzięki gradientowi sodu przez błonę enterocytów. Metoda ta wykorzystuje pedagogikę uczenia się przez doświadczenie, aby lepiej zrozumieć ruch substancji rozpuszczonej przez błony biologiczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Histydyna jest niezbędnym aminokwasem, który jest również prekursorem metabolitów związanych z układem odpornościowym, wentylacją płuc i krążeniem naczyniowym. Wchłanianie histydyny w diecie opiera się w dużej mierze na sprzężonym z sodem transporcie aminokwasów obojętnych przez transporter aminokwasów obojętnych (B, 0AT) obecny na błonie wierzchołkowej enterocytów. Tutaj pokazujemy wchłanianie histydyny przez enterocyty kosmków jelitowych ze światła za pomocą odwróconych worków jelita czczego kóz. Pęcherzyki jelita czczego wystawione na działanie różnych stężeń sodu i histydyny oznaczono w celu określenia stężenia histydyny wewnątrz worków w funkcji czasu. Wyniki wskazują na aktywne wchłanianie histydyny. Zwiększenie stężenia soli skutkowało wyższym wchłanianiem histydyny, co sugeruje symuls wchłaniania sodu i histydyny w odwróconych workach jelitowych kóz. Protokół ten może być stosowany do wizualizacji ruchliwości jelitowej aminokwasów lub innych metabolitów z odpowiednimi modyfikacjami. Proponujemy ten eksperyment jako empiryczne narzędzie pedagogiczne, które może pomóc studentom studiów licencjackich zrozumieć koncepcję transportu membranowego.
Wprowadzenie
Komórki biologiczne są otoczone dwuwarstwą lipidową błony, która oddziela wewnątrzkomórkową cytozol od zawartości zewnątrzkomórkowej. Membrana służy jako półprzepuszczalna bariera, która reguluje ruch substancji rozpuszczonych1. Na transport przez błony biologiczne ma wpływ współczynnik przepuszczalności substancji rozpuszczonej, który zależy od kilku czynników, w tym stężenia i ładunku substancji rozpuszczonej. Ogólnie rzecz biorąc, substancje rozpuszczone przemieszczają się przez błonę za pomocą trzech mechanizmów (Rysunek 1): Dyfuzja pasywna, dyfuzja ułatwiona i transport aktywny2. Prosta dyfuzja to proces, w którym rozpuszczalne, nienaładowane i niepolarne substancje rozpuszczone przechodzą w dół gradientu stężeń przez półprzepuszczalną membranę (Rysunek 1A). Białka błonowe nie pomagają w tym procesie, ponieważ obejmuje on przemieszczanie się substancji rozpuszczonych z obszaru o wyższym stężeniu do regionu o niższym stężeniu. Szybkość dyfuzji jest oparta na prawie Ficka3. Z drugiej strony, ułatwiona dyfuzja jest transportem zależnym od białka, w którym błona pozwala tylko selektywnym substancjom rozpuszczonym przechodzić wzdłuż gradientu stężeń bez wydatkowania energii (Rysunek 1B). Ten rodzaj transportu jest specyficzny i różni się od prostej dyfuzji kinetyką nasycenia.
Aktywny transport to zależny od białka transport cząsteczek w kierunku przeciwnym do ich gradientu stężenia, tj. z obszaru o niższym stężeniu do obszaru o wyższym stężeniu za pomocą ATP lub gradientów jonów (Rysunek 1C). Kiedy transporter hydrolizuje ATP, transport ten jest określany jako pierwotny transport aktywny (Rysunek 1C; lewy panel). Inną formą transportu aktywnego jest wtórny transport aktywny (Rysunek 1C; prawy panel). W wtórnym transporcie aktywnym substancje rozpuszczone są przemieszczane w oparciu o gradient elektrochemiczny. Ma to miejsce, gdy białko transportowe sprzęga ruch jonu (zwykle Na+) w dół jego gradientu stężeń z ruchem innej cząsteczki lub jonu w kierunku przeciwnym do jego gradientu stężenia. Ten rodzaj ruchu substancji rozpuszczonej może być kotransportem (Symport), w którym zarówno substancja rozpuszczona, jak i jon poruszają się w tym samym kierunku lub wymianą (antyport), w którym to przypadku substancja rozpuszczona i jon poruszają się w przeciwnych kierunkach.
Aminokwasy i monosacharydy z pożywienia są wchłaniane w jelicie cienkim. Jelito cienkie można funkcjonalnie podzielić na trzy segmenty: dwunastnicę, jelito kręte i jelito kręte (Ryc. 2). Wchłanianie substancji rozpuszczonej zachodzi w całym jelicie cienkim, przy czym maksymalne wchłanianie zachodzi w jelicie czczym i na bliższym końcu jelita krętego. Enterocyty jelitowe są komórkami spolaryzowanymi, a ścisłe połączenia łączące dwie sąsiednie komórki tworzą dwa odrębne miejsca błony - podstawno-boczne i wierzchołkowe miejsce błony (Ryc. 2). Absorpcja substancji rozpuszczonych w świetle generowanych przez trawienie zachodzi w miejscu błony wierzchołkowej4.
Transport histydyny w enterocytach jelitowych na błonie wierzchołkowej jest przykładem wtórnego aktywnego symportu, który jest zależny od sodu. Na końcu podstawno-bocznym histydyna wchodząca do enterocytów przesuwa się w dół gradientu stężeń do krążenia wrotnego wątroby. Wewnątrzkomórkowe stężenia sodu w enterocytach utrzymują się na poziomie 12 mmol/L1, czyli mniej niż stężenia zewnątrzkomórkowe/świetlne, ze względu na aktywne wypompowywanie sodu z komórki przez Na+ K + ATPazę znajdującą się na błonie podstawno-bocznej (Rysunek 3). Na błonie wierzchołkowej enterocytów B0AT i transporter aminokwasów obojętnych sodu (SNAT) 5 są głównymi transporterami, które nie tylko transportują histydynę, ale także aminokwasy, takie jak asparagina i glutamina, w kotransporcie zależnym od sodu5,6. Inne białko transportowe o nazwie Transporter Dużych Aminokwasów (LAT)1 obecne na błonie podstawno-bocznej enterocytów transportuje przez błonę duże neutralne aminokwasy, takie jak leucyna, tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina7.
Mając na celu nauczanie koncepcji transportu membranowego zintegrowanej z technikami takimi jak spektrofotometria i rutynowe testy biochemiczne poprzez pedagogikę uczenia się przez doświadczenie, konieczne jest opracowanie metodologii, które mogą nie tylko zademonstrować koncepcję w łatwych do zrozumienia terminach, ale także umożliwić partycypacyjne uczenie się dla studentów studiów licencjackich. Obecnie studenci mają do dyspozycji ograniczone zasoby do praktycznego zaangażowania w naukę takich pojęć biochemii. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół demonstracji transportu histydyny przez błonę jelitową kozy, który jest łatwy do odtworzenia w laboratoriach licencjackich i może być dostosowany do oceny transportu innych metabolitów. Co ważniejsze, metoda wykorzystuje niedrogie materiały w laboratorium licencjackim, umożliwiając w ten sposób naukę przez doświadczenie nawet w najprostszych warunkach laboratoryjnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Cały protokół wraz ze wszystkimi krokami jest przedstawiony jako schemat ideowy w Rysunek 4. Metoda została zaadaptowana z poprzedniego badania z użyciem jelit szczurów8. Eksperyment został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Próbki użyte w tym badaniu zostały pozyskane od komercyjnego dostawcy.
UWAGA: Noś rękawiczki podczas tego eksperymentu.
1. Przygotowanie odwróconych worków Jejunum
- Wstępnie potraktuj i oczyść kozie jelito czcze.
- Zaopatrz się w wnętrzności świeżo złożonej w ofierze zdrowej kozy od licencjonowanego sprzedawcy.
- Umieść wnętrzności w wystarczającej ilości 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS), tak aby były całkowicie zanurzone do czyszczenia.
- Oddziel jelito cienkie od jelita grubego i upewnij się, że zewnętrzna tkanka łączna została usunięta za pomocą nożyczek.
- Delikatnie przepłukać jelito cienkie 1x PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, upewniając się o usunięciu niestrawionego materiału pokarmowego, aby uzyskać pustą torebkę jelita cienkiego. Powtórz ten proces co najmniej trzy razy, aby skutecznie oczyścić.
UWAGA: Unikaj używania nadmiernej siły lub igieł podczas spłukiwania. Użycie siły może spowodować przebicie ścian jelita, a tym samym uszkodzenie enterocytów jelitowych. - Zmierz całkowitą długość jelita cienkiego za pomocą linijki, aby uzyskać trzy części: dwunastnicę (1/4 jelita cienkiego), a pozostałą część podzieloną równomiernie na jejunum i jelito kręte.
- Kontynuuj eksperyment, używając części Jejunum.
- Przygotuj odwrócone Jejunum.
- Oczyść część jelita czczego, usuwając całą tkankę łączną za pomocą ostrza.
- Pokrój jelito czcze na porcje o długości 12-15 cm, umyj 1x PBS i umieść na szalce Petriego zawierającej PBS.
- Odwróć części jelita czczego za pomocą szklanego pręta, aby umożliwić odsłonięcie części kosmków na zewnątrz.
UWAGA: Unikaj używania szklanego pręta o ostrych krawędziach. Ponadto średnica pręta szklanego nie powinna być większa niż średnica worka.
UWAGA: W tym momencie można uwidocznić kosmki pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 4). - Delikatnie przepłucz odwrócone części jelita czczego 1x PBS.
- Sprawdź, czy nie ma wycieków z boków odwróconego jelita czczego.
- Pokrój odwrócone części jelita czczego na woreczki o długości 5 cm.
- Zawiąż jeden koniec sznurkiem i ponownie sprawdź, czy na zawiązanym końcu nie ma widocznych wycieków, wypełniając woreczki PBS.
- Zawiąż drugi koniec, aby utworzyć pusty odwrócony worek z kosmkami na zewnętrznej powierzchni.
- Ponownie sprawdź, czy nie ma wycieków zewnętrznych, poklepując odwrócony worek na bibule filtracyjnej.
- Zrównoważ odwrócone woreczki w 1x PBS.
- Kontynuuj eksperyment tego samego dnia lub przechowuj woreczki przez noc w 1x PBS w temperaturze 4 °C.
2. Eksperymentalna konfiguracja transportu histydyny
- Zebrać dwa zestawy po trzy probówki o pojemności 50 ml zgodnie z różnymi stężeniami chlorku sodu, jak podano w tabeli 1.
- Zanurz przygotowane worki jelitowe w określonych probówkach na 30 minut i 60 minut dla każdego z zestawów.
- Po upływie wyznaczonego czasu opróżnij roztwór z worka w oddzielnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i oznacz objętość.
- Zassać płyn do wnętrza woreczka za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Alternatywnie odwiąż jeden koniec woreczka i zbierz zawartość do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
- Oznaczyć 0,1 ml pobranych próbek do oszacowania histydyny i obliczyć stężenie przy użyciu wykresu wzorcowego.
3. Ocena histydyny za pomocą reakcji Pauly'ego
- Przygotuj krzywą wzorcową dla histydyny.
- Przygotować roztwory o różnych stężeniach histydyny, jak wskazano w Tabeli 2, używając roztworów podstawowych histydyny (5 mM) i wody.
- Dodać kwas sulfanilowy (0,5 ml) i azotan sodu (0,5 ml) do każdej probówki.
- Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać po 1 ml węglanu sodu i etanolu do każdej probówki.
- Inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (~20 °C) i zanotować absorbancję przy długości fali 490 nm.
- Wykreślić standardową krzywą absorbancji w funkcji stężenia histydyny.
UWAGA: Ten test na histydynę opiera się na właściwości histydyny do tworzenia związku diazowego (Rysunek 5).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat doświadczenia służący do wykazania mobilności jelitowej histydyny poprzez wchłanianie histydyny przez kosmki jelitowe do światła wyewersyjnych worków przedstawiono na Rysunku 4, w Tabeli 1 oraz Tabeli 2. Przeprowadzono trzy niezależne układy doświadczalne, a reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 6.
W podanych warunkach doświadczalnych oznaczenie histydyny z wykorzystaniem reakcji Pauli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Transport membranowy jest jednym z najbardziej podstawowych pojęć nauczanych studentom studiów licencjackich wszystkich głównych dyscyplin nauk biologicznych, podstawowych lub stosowanych. Tradycyjnie, ruch przez błony był wizualizowany przy użyciu metabolitów znakowanych izotopami promieniotwórczymi. Jednak metody te są niezwykle niebezpieczne i niewykonalne w nauczaniu lub uczeniu się. Chociaż uczenie się przez doświadczenie jest najlepszą techniką pedagogiczną do zrozumienia tak złożonych koncepcji, jest to wyzwanie, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte przez Wydział Biochemii, Sri Venkateswara College, University of Delhi. Autorzy dziękują personelowi laboratorium za wsparcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml | TARSONS | 500020 | |
| 10 ml probówki | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 ml sterylne probówki Falcon | TARSONS | 546041 | |
| 500 ml zlewka | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 ml kolba stożkowa | BOROSIL | 691467 | |
| D-Glucose | SRL | 42738 | |
| Cyfrowy spektrofotometr | SYSTRONICS | 2710 | |
| Etanol | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| Szklany pręt mieszadła | BOROSIL | 9850107 | |
| L-histydyna | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| Rękawice nitrylowe | KIMTECH | 112-4847 | |
| Szalka Petriego | TARSONS | 460090 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (pH 7,4) | SRL | 95131 | |
| Końcówki do pipet | ABDOS | P10102 | |
| Węglan sodu | SRL | 89382 | |
| Azotan sodu | SRL | 44618 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny) | SRL | 53046 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy (bezwodny) | SRL | 22249 | |
| Kwas sulfanilowy | Zobacz materiał SRL | 15354 |
Bibliografia
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition. , W.H. Freeman and Company. (2017).
- Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
- Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
- Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
- Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
- Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
- Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
- Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
- Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins. I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
- Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
- Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
- Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
- Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
