Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie ruchów zębów ortodontycznych u myszy

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66884

⸱

2 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Diagnosis and Pathology, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais, 3Department of Physiology and Biophysics, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 4Private Clinic, 5Department of Metallurgical and Materials Engineering, School of Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais, 6Laboratory of Immunopharmacology, Department of Biochemistry and Immunology, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Department of Orthodontics, School of Dental Medicine, University of Pittsburgh, 8Department of Oral Surgery, Pathology and Clinical Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania ortodontycznego ruchu zębów (OTM), służący jako odpowiedni model do badania mechanizmów adaptacji kości, resorpcji korzeni i reakcji komórek kostnych na bodźce mechaniczne. Ten obszerny przewodnik zawiera szczegółowe informacje na temat modelu OTM, akwizycji mikrotomografii komputerowej i późniejszej analizy.

Streszczenie

Ortodontyczny ruch zębów (OTM) reprezentuje dynamiczny proces, w którym kość wyrostka zębodołowego ulega resorpcji w miejscach ucisku i odkładaniu się w miejscach napięcia, koordynowanym odpowiednio przez osteoklasty i osteoblasty. Mechanizm ten służy jako cenny model do badania różnych aspektów adaptacji kości, w tym resorpcji korzeni i odpowiedzi komórkowej na bodźce siły mechanicznej. Przedstawiony tutaj protokół oferuje proste podejście do badania OTM, ustalając 0,35 N jako optymalną siłę w modelu mysim wykorzystującym sprężynę śrubową niklowo-tytanową (NiTi). Wykorzystując analizę mikrotomografii komputerowej, określiliśmy ilościowo OTM, oceniając rozbieżność w odległości liniowej na styku cementu i szkliwa. Ocena obejmowała również analizę zapalnej resorpcji korzeni wywołanej przez ortodoncję, oceniając takie parametry, jak gęstość mineralna korzeni i procent objętości korzenia na całkowitą objętość. Ten kompleksowy protokół przyczynia się do pogłębienia naszej wiedzy na temat procesów przebudowy kości i zwiększenia zdolności do opracowywania skutecznych strategii leczenia ortodontycznego.

Wprowadzenie

Przebudowa kości to ciągły proces organizowany przez osteoklasty, osteoblasty, komórki wyściółki kostnej i osteocyty, niezbędny do utrzymania integralności dorosłego szkieletu1,2. Ten dynamiczny proces, napędzany głównie przez różnicowanie i aktywność osteoklastów i osteoblastów, obejmuje resorpcję i odkładanie się kości, wyzwalane przez naprężenia mechaniczne i obciążenie3,4,5.

Eksperymenty na zwierzętach odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu skomplikowanych biologicznych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw ortodontycznego ruchu zębów (OTM)6,7. Proces ten obejmuje różnorodny zestaw typów komórek, takich jak osteoblasty, osteoklasty, osteocyty, fibroblasty i komórki odpornościowe, takie jak makrofagi i limfocyty T, zlokalizowane w obrębie kości szczęki i więzadła przyzębia7,8. Komórki te dynamicznie reagują na bodźce mechaniczne i zmiany w środowisku lokalnym, wpływając na skład i architekturę otaczającej je kości7,8. Co więcej, wywołują również reakcję zapalną na poziomie komórkowym, mimo że nie ma żadnych patogenów. Ta reakcja zapalna odgrywa rolę w zwiększaniu obrotu tkanki kostnej9.

Różne modele zwierzęce, w tym myszy, szczury, króliki, psy i małpy, zostały wykorzystane w eksperymentalnych badaniach OTM7,8,10. Wśród nich gryzonie, zwłaszcza myszy, są preferowane do badania początkowych faz ruchu zębów i przebudowy kości6. Wcześniejsze badania podkreślały zalety stosowania modeli mysich w porównaniu z modelami szczurzymi, przede wszystkim ze względu na powszechną dostępność genetycznie modyfikowanych szczepów, umożliwiając szczegółową eksplorację wpływów genetycznych w OTM7,11. Obecnie do wywoływania ruchu zębów u myszy stosuje się dwa główne modele. Pierwsza metoda polega na włożeniu niklowo-tytanowej (NiTi) sprężyny śrubowej między pierwszy górny trzonowiec a górne siekacze4,12. Drugie podejście polega na umieszczeniu elastycznej opaski w przestrzeni międzyzębowej między pierwszym a drugim górnym zębem trzonowym13. Pierwszorzędowe analizowane wyniki zazwyczaj obejmują wielkość ruchu zęba i mikroarchitekturę kości, najlepiej oceniane za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT)14. Idealnie, ocena integralności korzeni zębowych jest ważna, aby upewnić się, że odpowiednie siły są stosowane do wytworzenia OTM4.

Chociaż mikrotomografia komputerowa jest powszechnie uznawana za złoty standard oceny mikroarchitektury zmineralizowanych tkanek14, brak standardowych metodologii i protokołów skanowania, analizy i raportowania danych często stanowi wyzwanie w rozpoznawaniu zastosowanych precyzyjnych procedur, interpretacji wyników i ułatwianiu porównań między różnymi modelami OTM14,15.

Tutaj prezentujemy przewodnik krok po kroku po modelu myszy OTM, w tym akwizycję mikro-CT i analizę OTM, mikrostruktury kości i korzeni zębowych. Metoda ta polega na przyłożeniu kontrolowanej siły mechanicznej do pierwszego zęba trzonowego w celu wywołania ruchu w obrębie kości szczęki. Wybór tej metody wynika z kilku czynników, w tym wykonalności, trafności i precyzji. Takie podejście umożliwia szczegółową analizę ilościową, dostarczając cennych informacji na temat procesów biologicznych leżących u podstaw ortodontycznego ruchu zębów i ułatwiając opracowanie ulepszonych strategii leczenia ortodontycznego w przyszłości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury ściśle przestrzegały standardów etycznych ustalonych przez Komisję Etyki Universidade Federal de Minas Gerais (nr 166/2022). Przed każdym eksperymentem obowiązkowa jest obliczona wielkość próby. Użyj 8-10-tygodniowego samca myszy typu dzikiego C57BL6/J o wadze około 20-30 g. Myszy muszą być trzymane w klatce w pomieszczeniu utrzymywanym w temperaturze 25 °C, zgodnie z cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Po założeniu cewki zwierzę powinno być karmione miękką dietą. Codzienny monitoring powinien obejmować ocenę masy ciała i ogólnego stanu zdrowia.

1. Mechanicznie wywołana przebudowa kości wyrostka zębodołowego

  1. Za pomocą szczypiec do cięcia dystalnego przytnij sprężynę śrubową NiTi o wymiarach 0.25 x 0.76 cala do następujących wymiarów sześciu pętli i dwóch końców w kształcie pętli ustawionych prostopadle do sprężyny za pomocą ortodontycznych szczypiec Weingart.
  2. Uformuj okrągły drut chromowo-niklowy (CrNi) o średnicy 0,20 mm do żądanej konfiguracji z końcami w kształcie pętli za pomocą pęsety Mathieu i okrągłego przyrządu jako odniesienia rozmiaru.
  3. Połącz ze sobą końcówki cewki w kształcie pętli i okrągły drut CrNi o średnicy 0,20 mm.
  4. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym 0,2 ml roztworu zawierającego ksylazynę (10 mg/kg) i ketaminę (100 mg/kg). Przed rozpoczęciem zabiegu należy ocenić głębokość znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania. Ostrożnie uszczypnij jeden z palców zwierzęcia za pomocą pęsety. Brak odruchu wskazuje na odpowiednią płaszczyznę znieczulenia ogólnego. Aby uniknąć urazów rogówki i bólu pooperacyjnego, po znieczuleniu zwierzęcia nałóż lubrykant do oka.
  5. Ułóż zwierzę w odleżynie grzbietowej na stole operacyjnym, unieruchamiając jego kończyny, aby ograniczyć ruch i umożliwić dostęp wewnątrzustny.
  6. Użyj otwieracza do ust, wykonanego z drutu o średnicy 0,50 mm i zabezpieczonego drutem o średnicy 0,08 mm, aby ułatwić pełną wizualizację, jednocześnie zapobiegając ruchom głowy. Użyj prawej strony jako strony eksperymentalnej (strona OTM), a lewej strony jako kontroli bez cewki ortodontycznej (strona kontrolna).
    UWAGA: Ulepszoną wizualizację struktur wewnątrzustnych należy uzyskać za pomocą mikroskopu stereoskopowego i systemu światła optycznego.
  7. Oczyść i wytraw prawą powierzchnię pierwszych zębów trzonowych i siekaczy za pomocą odpowiednio acetonu i podkładu samotrawiącego. System jest samotrawiący, co oznacza, że nie wymaga wcześniejszego kondycjonowania kwasem.
    1. Nałożyć podkład w jednym kroku, który działa jednocześnie jako kwas i klej. Za pomocą mikroszczoteczki zbierz niewielką ilość samotrawiącego podkładu i nałóż go na powierzchnię zgryzową górnego pierwszego trzonowca i siekaczy. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że samotrawiący podkład nie dotrze do proksymalnej powierzchni między pierwszymi i drugimi zębami trzonowymi, ponieważ może to spowodować sklejanie się elementów zębowych, uniemożliwiając ruch zębów. Światłem utwardź podkład na powierzchni zgryzowej zębów trzonowych i siekaczy przez 30 s.
  8. Przymocuj dystalny koniec sześciopętlowej sprężyny z otwartą cewką NiTi do powierzchni okluzyjnej prawego pierwszego trzonowca szczęki za pomocą żywicy światłoutwardzalnej i utwardzaj światłem przez 30 s. Dodaj dodatkowy przyrost żywicy do krawędzi drutu, aby uniknąć uszkodzenia myszy i utwardzaj światłem przez 30 s.
  9. Aktywuj cewkę za pomocą specjalnie zaprojektowanego aparatu składającego się z szyny i mechanizmu korbowego przymocowanego do stołu operacyjnego. Umożliwia to przesuwanie się ruchu wzdłużnego do przodu i do tyłu.
  10. Podłącz wolny koniec okrągłego drutu 0.20 mm w kształcie pętli do haka miernika naprężenia.
  11. Po uruchomieniu korby przesuwaj stół chirurgiczny wzdłuż szyny, aż dynamometr zarejestruje siłę 0,35 N.
  12. Przymocuj okrągły drut o średnicy 0,20 mm do obu górnych siekaczy, aby zakotwiczyć cewkę. W okresie eksperymentalnym nie przeprowadza się dalszej reaktywacji. Przetnij drut, aby odłączyć zwierzę od dynamometru. Dodaj kolejną porcję żywicy, aby metalowa krawędź urządzenia nie była odsłonięta i nie zraniła zwierzęcia. Utwardzanie światłem przez 30 s. Zdemontuj zwierzę ze stołu.
  13. Prawy górny pierwszy ząb trzonowy z urządzeniem wywierającym siłę 0,35 N w kierunku mezjalnym składa się ze strony doświadczalnej. Użyj lewej strony szczęki (bez aparatu ortodontycznego) jako kontrolnej4,16.
  14. Utrzymuj to urządzenie przez okres 12 dni bez konieczności aktywacji. Nie należy stosować żadnych leków przeciwbólowych. Ruch ortodontyczny zachodzi w procesie zapalnym, a leki przeciwbólowe mogą negatywnie wpływać na kaskadę kwasu arachidonowego, wpływając na tempo przebudowy kości i potencjalnie unieważniając wyniki.
  15. Po zakończeniu zabiegu należy potraktować zwierzęta podskórnym wstrzyknięciem roztworu soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia w okresie adaptacji z urządzeniem. Trzymaj zwierzę w indywidualnej klatce z ogrzewaniem do czasu całkowitego wyzdrowienia i dopiero po tym okresie umieść zwierzę w klatkach zbiorczych.
  16. Eutanazja myszy w 12 dniu przeprowadzona przez sedację z dootrzewnowym wstrzyknięciem 0,2 ml roztworu zawierającego ksylazynę (10 mg / kg) i ketaminę (100 mg / kg), a następnie ścięcie głowy ostrymi nożyczkami.

2. Pomiary mikrotomografii komputerowej

  1. Zbierz kość szczęki ostrymi nożyczkami, przecinając całą tkankę miękką, kość jarzmową w płaszczyźnie strzałkowej oraz szew czołowo-nosowy i synchorozę klinowo-potyliczną w płaszczyźnie czołowej. Zanurz kość szczęki w 10% obojętnej buforowanej formalinie (pH = 7,4) na okres utrwalenia 48 godzin. Po tym okresie zmień roztwór formaldehydu na 70% alkoholu.
  2. Do skanów o wysokiej rozdzielczości należy wykonać mikrotomografię komputerową kości szczęki z następującymi parametrami: izotropowa wielkość woksela od 9 do 18 μm, ustawienia promieniowania rentgenowskiego 50 kV, filtr aluminiowy 0,5 mm i kąt obrotu 0,5°. Podczas skanowania mikrotomografią komputerową można zmieścić więcej niż jedną szczękę.
  3. Rekonstrukcję uzyskanych obrazów należy wykonać za pomocą programu rekonstrukcji mikrotomografii wskazanego przez producenta zastosowanej mikrotomografii komputerowej (microCT) 17.
  4. Ustawić zrekonstruowane obrazy za pomocą programu do kontroli 3D wskazanego przez producenta zastosowanej mikrotomografii.
  5. Określ ilościowo OTM, mierząc różnicę w odległości liniowej między połączeniem cementowo-szkliwowym (CEJ) pierwszego i drugiego zęba trzonowego prawej półzęby szczękowej (strona OTM) w stosunku do lewej półzęba szczęki (strona kontrolna). Do tego pomiaru użyj odpowiedniego oprogramowania analizatora mikrotomografii komputerowej z narzędziem liniowym17,18,19,20.
  6. Należy sprawdzić próbki pod kątem obecności zapalnej resorpcji korzeni wywołanej przez ortodoncję (OIIRR). Wybierz obszar zainteresowania (ROI) korzenia dystalno-przedsionkowego pierwszego zęba trzonowego szczęki za pomocą nieregularnego, anatomicznego obszaru zainteresowania narysowanego ręcznie metodą konturowania. Zmierz następujące parametry: gęstość mineralną korzeni (RMD; g/cm3) i procent objętości korzenia na całkowitą objętość (RV/TV; %). Do tego pomiaru użyj odpowiedniego oprogramowania analizatora mikrotomografii komputerowej z narzędziem wolumetrycznym 3D16,21.
  7. Przeprowadź rekonstrukcję pierwszego zęba trzonowego szczęki za pomocą oprogramowania Mimics i przeanalizuj uzyskane dane, aby wyciągnąć wnioski dotyczące OTM i OIIRR w modelu eksperymentalnym16,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia badanie modelu mysiego OTM z wykorzystaniem sprężyny coil z NiTi. Przy zastosowaniu siły 0,35 N średnia odległość CEJ po stronie kontrolnej między pierwszym a drugim trzonowcem wynosiła 243.69 µm (Rysunek 1A, linia A), natomiast po stronie OTM zmierzono w 284.66 µm (Rycina 1A, linia B). Różnica między stroną OTM a stroną kontrolną wynosiła 40.97 µm (Rysunek 1B)Odległość liniowa między CE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany protokół mający na celu wyjaśnienie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw przebudowy kości podczas OTM. Dokładne zrozumienie tych mechanizmów u myszy wymaga skrupulatnie zaplanowanego protokołu, aby zapewnić dokładność i niezawodność 7,11. Badania przeprowadzone przez naszą grupę badawczą wykazały, że protokół ten skutecznie zmniejsza zmienność operatora poprzez włączenie miernika naprężenia i specjalni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Pragniemy wyrazić nasze szczere uznanie dla Pani Beatriz M. Szawka za jej wkład w stworzenie schematu ideowego oraz dla Pani Ilmy Marçal de Souza za jej wsparcie techniczne. J.A.A.A. jest laureatem stypendium przyznanego przez Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-26/200.331/2024), Brazylia. Badanie to było wspierane przez Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (406928/2023-1), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (kod finansowy 001), Brazylia. Autorzy dziękują prof. dr Eduardo H. M. Nunesowi z LabBio/UFMG za analizę mikrotomografii rentgenowskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonSigma-Aldrich67-64-1
Szczypce do cięcia dystalnegoQuinelatoQO.700.00
DynamometrSHIMPO FGE-5XY
Oświetlacz światłowodowyCole-ParmerN/A
Ø 0,20 mm okrągły chromowo-niklowy (CrNi)Morelli55.01.208
Okrągły twardy elastyczny drut ortodontyczny CrNi Ø 0.50 mm (.020 cala)Morelli55.01.050
Okrągły drut wiązałkowy CrNi & Oslash; 0,20 mm (0,008 cala)Morelli55.01.208
Mikroskop stereoskopowyQuimisQ7740SZ
Transbond Plus Samotrawiący podkład3MLE-Q100-1004-7
Szczypce WeingartQuinelatoQO.120.00
KsylazynaSyntec23076-35-9
Analiza mikrotomografii komputerowej
Skyscan 1174v2Bruker1174v2
Software
NReconSkyscanN/A
DataViewerSkyscanN/A
CTAnSkyscanN/A
NaśladujeMaterialiseN/A
ketamina Syntec 100477-72-3 Sprężyna z otwartą cewką NiTi 0,25 x 0,76 Lancer Ortodoncja

Bibliografia

  1. Kohli, N., et al. Bone remodelling in vitro: Where are we headed?: -A review on the current understanding of physiological bone remodelling and inflammation and the strategies for testing biomaterials in vitro. Bone. 110, 38-46 (2018).
  2. Epsley, S., et al. The effect of inflammation on bone. Front Physiol. 11, 511799(2021).
  3. Bolamperti, S., Villa, I., Rubinacci, A. Bone remodeling: an operational process ensuring survival and bone mechanical competence. Bone Res. 10 (1), 48(2022).
  4. Taddei, S. R., et al. Experimental model of tooth movement in mice: a standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. J Biomech. 45 (16), 2729-2735 (2012).
  5. Guerrero, J. A., et al. Maxillary suture expansion: A mouse model to explore the molecular effects of mechanically-induced bone remodeling. J Biomech. 108, 109880(2020).
  6. Ibrahim, A. Y., Gudhimella, S., Pandruvada, S. N., Huja, S. S. Resolving differences between animal models for expedited orthodontic tooth movement. Orthod Craniofac Res. 20, Suppl 1 72-76 (2017).
  7. Kirschneck, C., Bauer, M., Gubernator, J., Proff, P., Schröder, A. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 12154(2020).
  8. Huang, H., Williams, R. C., Kyrkanides, S. Accelerated orthodontic tooth movement: molecular mechanisms. Am J Orthod Dentofac Ortho. 146 (5), 620-632 (2014).
  9. Ariffin, S. H. Z., Yamamoto, Z., Abidin, I. Z., Wahab, R. A. M., Ariffin, Z. Cellular and molecular changes in orthodontic tooth movement. Sci World J. 11, 1788-1803 (2011).
  10. Alhasyimi, A. A., Pudyani, P. P., Asmara, W., Ana, I. D. Enhancement of post-orthodontic tooth stability by carbonated hydroxyapatite-incorporated advanced platelet-rich fibrin in rabbits. Orthod Craniofac Res. 21, 112-118 (2018).
  11. Klein, Y., et al. Immunorthodontics: in vivo gene expression of orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 8172(2020).
  12. Fujimura, Y., et al. Influence of bisphosphonates on orthodontic tooth movement in mice. Eur J Orthod. 31 (6), 572-577 (2009).
  13. Waldo, C. M., Rothblatt, J. M. Histologic response to tooth movement in the laboratory rat; procedure and preliminary observations. J Dental Res. 33 (4), 481-486 (1954).
  14. Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
  15. Trelenberg-Stoll, V., Wolf, M., Busch, C., Drescher, D., Becker, K. Standardized assessment of bone micromorphometry around teeth following orthodontic tooth movement: A µCT split-mouth study in mice. J Orofac Ortho. 83 (6), 403-411 (2022).
  16. Santos, M. S., et al. Targeting phosphatidylinositol-3-kinase for inhibiting maxillary bone resorption. J Cell Physiol. 238 (11), 2651-2667 (2023).
  17. Macari, S., et al. Oestrogen regulates bone resorption and cytokine production in the maxillae of female mice. Arch Oral Biol. 60 (2), 333-341 (2015).
  18. Macari, S., et al. Lactation induces increases in the RANK/RANKL/OPG system in maxillary bone. Bone. 110, 160-169 (2018).
  19. Pereira, L. J., et al. Aerobic and resistance training improve alveolar bone quality and interferes with bone-remodeling during orthodontic tooth movement in mice. Bone. 138, 115496(2020).
  20. Silva, F. R. F., et al. Protective effect of bovine milk extracellular vesicles on alveolar bone loss. Mol Nutri Food Res. 68 (3), 2300445(2024).
  21. Amaro, E. R. S., et al. Estrogen protects dental roots from orthodontic-induced inflammatory resorption. Arch Oral Biol. 117, 104820(2020).
  22. Xu, X., Zhou, J., Yang, F., Wei, S., Dai, H. Using micro-computed tomography to evaluate the dynamics of orthodontically induced root resorption repair in a rat model. PLoS One. 11 (3), e0150135(2016).
  23. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Mineral Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  24. Kanou, K., et al. Effect of age on orthodontic tooth movement in mice. J Dent Sci. 19 (2), 828-836 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model mysiprzebudowa kościresorpcja korzeniasprężyna niklowo-tytanowamikrotomografia komputerowakość szczękiaktywność osteoklastówbodźce sił mechanicznychgęstość mineralna korzenia
Badanie ruchów zębów ortodontycznych u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.