Artykuł metodologiczny

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66887

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  , 
1New South Wales Health Statewide Biobank, New South Wales Health Pathology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Streszczenie

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMCs) to niejednorodna populacja monocytów i limfocytów. Kriokonserwowane PBMC mają stabilną żywotność przy długotrwałym przechowywaniu, co czyni je idealnym typem komórek do wielu dalszych celów badawczych, w tym cytometrii przepływowej, testów immunologicznych i sekwencjonowania genomu. Zazwyczaj PBMC są izolowane za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości, jednak jest to przepływ pracy o niskiej przepustowości, który jest trudny i kosztowny do skalowania. W tym artykule przedstawiono wysokoprzepustowy przepływ pracy przy użyciu metody izolacji PBMC opartej na kulkach magnetycznych, która jest szybka do wdrożenia. Porównano całkowite stężenie komórek, żywotność i rozmieszczenie populacji z PBMC uzyskanymi za pomocą izolacji gradientu gęstości, a żywotność komórek i proporcja typów komórek były porównywalne dla obu technik. Wyizolowane PBMC wykazały ponad 70% żywotności do 9 dni po pobraniu krwi, chociaż wydajność zmniejszyła się o połowę po 5 dniach w porównaniu z PBMC przetworzonymi w ciągu 24 godzin od pobrania. Podsumowując, w tym artykule opisano protokół PBMC, który wykorzystuje podejście oparte na koralikach w celu dostosowania się do przepływu pracy o wysokiej przepustowości i pokazuje, że zarówno ręczne, jak i zautomatyzowane metody oparte na koralikach mogą zwiększyć wydajność przetwarzania i zapewnić elastyczność dla różnych budżetów.

Wprowadzenie

Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) to technika, która oddziela i izoluje limfocyty i monocyty od innych składników krwi pełnej. PBMC to wszechstronny typ komórek używany do wielu zastosowań, w tym między innymi do immunoterapii, opracowywania szczepionek, identyfikacji celu lub biomarkerów oraz opracowywania przeciwciał/leków małocząsteczkowych1,2. Komórki te mogą być izolowane od osób zdrowych lub chorych i mogą być natychmiast wykorzystane w dalszych procesach lub kriokonserwowane do przyszłych badań3. W niektórych przypadkach dalszy cel jest znany, podczas gdy w innych, jak to zwykle bywa w biobankowaniu, PBMC są izolowane i przechowywane dla przyszłych nieokreślonych aplikacji4.

Wirowanie w gradionym gradinie gęstości jest tradycyjną techniką izolowania PBMCs5,6,7 od krwi pełnej, wykorzystując różnicową separację typów komórek składowych na podstawie gęstości komórek podczas wirowania. Chociaż może istnieć pewna różnica w tej metodzie, krew pełna jest zwykle rozcieńczana solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), nakładana warstwami na podłoże o gradionym gradifikacji gęstości w specjalistycznej lub standardowej probówce wirówkowej, a następnie wirowana. Powstają cztery odrębne warstwy: górna warstwa osocza jest wzbogacona płytkami krwi, cienka warstwa PBMC znajduje się powyżej pożywki gradientu gęstości, a dolna warstwa składa się z czerwonych krwinek (RBC) i granulocytów. Chociaż metoda ta była wcześniej określana jako "złoty standard"8, istnieją ograniczenia dotyczące zwiększania skali, takie jak długi czas przetwarzania, wydajność wirówki, trudności w porcjowaniu innych produktów krwiopochodnych (tj. osocza i erytrocytów) oraz pracochłonność automatyzacji. Chociaż automatyzacja jest możliwa dla tej metody9, wymaga ona kompleksowego programowania maszyny do obsługi cieczy (z modułem wirowania, aby była w pełni zautomatyzowana) i pozostałaby długotrwałym procesem.

Odtąd prezentowany jest alternatywny sposób pracy, który wykorzystuje immunomagnetyczną separację kulek za pomocą magnesu z ośmioma uchwytami do ręcznego przetwarzania lub instrumentu do w pełni zautomatyzowanego przetwarzania. Metoda ta wykorzystuje koktajl przeciwciał, który jest dodawany do komórek i wiąże niepożądane populacje komórek, w tym przypadku płytki krwi, granulocyty i erytrocyty. Te niepożądane populacje są następnie usuwane przez separację magnetyczną, pozostawiając populacje monocytów i limfocytów we frakcji ujemnej, które są gotowe do dalszego przetwarzania10. Ta metoda selekcji negatywnej jest szybsza niż metody selekcji pozytywnej, które wymagają dodatkowych kroków w celu usunięcia przeciwciała i kompleksu kulek magnetycznych z PBMC. Selekcja negatywna jest dodatkowo korzystna, ponieważ została opisana jako sposób na zachowanie funkcjonalności komórki11,12.

Protokół

Próbki krwi do kontroli jakości oraz dane generowane wewnętrznie (takie jak liczba komórek, żywotność i wiek próbki podczas przetwarzania) uzyskano z badań naukowych za zgodą w NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (zatwierdzenie HREC: 2019/ETH06776). Przetworzone (tj. osocze pozbawione), nieprzebadane i pozbawione elementów identyfikujących próbki krwi dorosłego człowieka pobrano w probówkach EDTA. Te próbki krwi w ramach kontroli jakości zostały przetworzone w czasie krótszym niż 72 godziny po pobraniu i zostały wykorzystane do eksperymentów izolacyjnych PBMC porównujących gradient gęstości i metody oparte na kulkach. W celu zapoznania się z metodą rozdzielania w gradionym spadku gęstości zastosowaną w reprezentatywnych wynikach, zob. procedurę przedstawioną w pliku uzupełniającym 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie krwi pełnej

  1. Delikatnie odwróć 10 ml probówek z krwią pełną (pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA], kwasem-cytrynianem-dekstrozą [ACD] lub heparyną litową) 10 razy w temperaturze pokojowej.
  2. Fakultatywnie: Jeśli ma być przechowywana krew pełna, należy ją przelać do krioprobówek w temperaturze -80 °C.
  3. Odwirować probówki za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C przy włączonym hamulcu (9 przyspieszeń / 9 opóźnień).

2. Kolekcja płaszczy Buffy

  1. Po odwirowaniu umieść próbki w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sprawdź, czy nie ma trzech odrębnych warstw (jak pokazano na Rysunek 1).
    UWAGA: Erytrocyty znajdują się w dolnej ciemnoczerwonej warstwie probówki wirówkowej. Biała, nieprzezroczysta warstwa zawierająca białe krwinki i płytki krwi znajduje się nad warstwą RBC, znaną jako kożuch. Górna żółta warstwa zawiera osocze.
  2. Opcjonalnie: Jeśli osocze ma być przechowywane, należy je poddzielić do krioprobówek w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.
  3. Pobrać pipetę o pojemności 1 ml kożucha (materiał wyjściowy) z probówki o pojemności 10 ml i przenieść do probówki określonej i oznaczonej w kroku 3.1 i kroku 4.1 odpowiednio dla metody ręcznej i automatycznej. Zakręć kożuchową powłoką (białą, nieprzezroczystą warstwę) za pomocą końcówki pipety i zbierz kożuchową powłokę, zasysając.
    UWAGA: Podczas aspiracji dopuszczalne jest mniej niż 100 μl osocza i krwinek czerwonych. Jeśli dla jednego uczestnika zostanie pobranych wiele probówek krwi, można połączyć płaszcze buffy; Może to jednak wpływać na stężenie płytek krwi13.
  4. W przypadku przetwarzania ręcznego przejdź do sekcji 3. W przypadku automatycznego przetwarzania należy przejść do sekcji 4.
  5. Opcjonalnie: Jeśli erytrocyty mają być przechowywane, należy je poddzielić do krioprobówek w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie PBMC - metoda ręczna

UWAGA: Do 8 próbek na uchwyt magnesu może być przetworzonych przez jednego operatora.

  1. Oznaczyć 3 x 5 ml probówki polistyrenowe literami AC
    UWAGA: Użyj numeracji sekwencyjnej, jeśli wykonujesz więcej niż jedną próbkę, tj. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
  2. Dodać 60 μl 0,1 M EDTA (dla końcowego stężenia EDTA 6 mM, pH 8,0, patrz Plik Uzupełniający 2 dla receptury) do probówki A zawierającej kożuchową powłokę przeniesioną w kroku 2.3.
  3. Dodać 50 μl probówki do mieszania koktajli (patrz tabela materiałów) do probówki A, mieszać pipetując w górę i w dół co najmniej 3 razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 890 μl PBS do probówki A i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 3 razy.
  5. Wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi (patrz Tabela materiałów) przez 30 sekund.
  6. Dodać 50 μl kulek magnetycznych do probówki A i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 3 razy.
  7. Natychmiast umieść probówkę A w stojaku magnetycznym i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki B, zbierając klarowną frakcję bez / z minimalną (<100 μl) krwinkami czerwonymi w celu optymalnego odzysku PBMC.
    UWAGA: Nie naruszaj koralików przywiązanych do magnesu. Zalecana jest pipeta transferowa.
  9. Wyjmij rurkę A ze stojaka magnetycznego i wyrzuć.
  10. Dodać 50 μl kulek magnetycznych do zawiesiny komórek w probówce B i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 3 razy.
  11. Natychmiast umieść probówkę B w stojaku magnetycznym i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki C, zbierając tylko klarowną frakcję.
    UWAGA: Nie naruszaj koralików przywiązanych do magnesu. Zalecana jest pipeta transferowa.
  13. Wyjmij rurkę B ze stojaka na magnes i wyrzuć.
  14. Natychmiast umieść probówkę C w stojaku magnetycznym i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do oznakowanej probówki wirówkowej i uzupełnić do 2 ml PBS.
  16. Przenieść 50 μl zawiesiny komórek do kubka na próbkę automatycznego licznika komórek. Aby uzyskać liczbę komórek w rozcieńczeniu 1:10, dodać 450 μl PBS. Przejdź do sekcji 5, aby zapoznać się z krokami zliczania komórek.

4. Oczyszczanie PBMC - metoda automatyczna

UWAGA: Do 4 próbek może być przetworzonych przez jeden zautomatyzowany instrument PBMC. Wiele urządzeń może być uruchamianych równolegle przez jednego operatora.

  1. Oznaczyć 2 probówki po 14 ml literami A i B, 1 probówkę wirówkową o pojemności 50 ml z literą C oraz 1 probówkę wirówkową o pojemności 50 ml z napisem "odpad".
    UWAGA: Do każdego uruchomienia na zautomatyzowanym urządzeniu PBMC wymagany jest tylko jeden pojemnik na odpady. Użyj numeracji sekwencyjnej, jeśli wykonujesz więcej niż jedną próbkę, tj. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
  2. Dodać 60 μl 0,1 M EDTA (dla końcowego stężenia EDTA 6 mM) do probówki A zawierającej kożuchową powłokę przeniesioną w kroku 2.3.
  3. Wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi (patrz Tabela materiałów) przez 30 sekund.
  4. Włącz automatyczny instrument PBMC, włączając zasilanie z przodu urządzenia.
  5. Na ekranie głównym automatycznego instrumentu PBMC wybierz profile i wybierz żądany protokół.
    UWAGA: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 - buffy coat był profilem protokołu wybranym dla tej izolacji PBMC. Zapoznaj się ze standardową procedurą producenta dla tego profilu w protokole report14.
  6. Wprowadzić objętość początkową (ilość kożuchy zasysanej do probówki A) i powtórzyć te czynności dla każdej próbki.
  7. Wybierz wszystkie ćwiartki, które będą używać tego samego zestawu odczynników.
    UWAGA: Jeśli ten sam protokół jest używany dla więcej niż jednego kwadrantu, automatyczny instrument PBMC zasugeruje użycie tego samego zestawu odczynników dla wszystkich kwadrantów14.
  8. Załaduj karuzelę instrumentu oznaczonymi materiałami eksploatacyjnymi, końcówkami filtra i pojemnikiem buforowym. Zestaw odczynników zawierający probówkę z kulkami magnetycznymi i probówkę do mieszania koktajli należy załadować do ćwiartki 1.
    UWAGA: Przyrząd zapyta, czy użytkownik chce użyć 1 zestawu odczynników do wszystkich kwadrantów. Wybierz "tak" i zaznacz wszystkie ćwiartki za pomocą zestawu odczynników.
  9. Po zakończeniu ładowania zdejmij pokrywki z materiałów eksploatacyjnych i odczynników, a następnie wybierz opcję uruchom na ekranie instrumentu.
  10. Po zakończeniu biegu wybierz rozładunek i usuń próbki (zawierające zawiesinę PBMC oznaczoną w probówce C) z karuzeli urządzenia. Przechowuj probówkę z kulkami magnetycznymi, probówkę do koktajli i pojemnik buforowy w temperaturze 4 °C. Wyrzuć probówki oznaczone jako A, B i odpady (patrz krok 4.1) oraz końcówki filtra.
    UWAGA: W przypadku metody automatycznej nie jest konieczne uzupełnianie PBS, ponieważ zawiesina PBMC wytwarza końcową objętość 7 ml.
  11. Przenieść 500 μl komórek do kubka na próbkę, aby uzyskać liczbę komórek bez rozcieńczania. Przejdź do sekcji 5 dotyczącej zliczania komórek.

5. Zliczanie komórek

  1. Przeprowadź liczenie komórek i żywotność przy użyciu metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta15.
    UWAGA: W przypadku wewnętrznych procesów autora analiza komórek jest wykonywana przy użyciu automatycznego licznika komórek z następującymi ustawieniami w celu uzyskania PBMCs.
    Współczynnik rozcieńczenia = 10 (dla protokołu ręcznego, jeśli zawiesina komórek ma małą objętość) lub 1 (dla protokołu automatycznego)
    Typ ogniwa: PBMC
    Zakres stężeń = 5 x 104 do 1 x 107 komórek/ml
    Zakres wielkości (średnica) = od 8 μm do 50 μm
    Liczba obrazów = 50

6. Przygotowanie do kriokonserwacji

  1. Odwirować (za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego) probówki z próbkami o ciśnieniu 300 x g przez 8 minut w temperaturze 22 °C przy włączonym hamulcu (9 przyspieszeń/9 opóźnień).
  2. Po odwirowaniu umieścić próbki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Za pomocą pipety ostrożnie usunąć supernatant. Niewielką ilość supernatantu można pozostawić w pastylce PBMC, aby upewnić się, że nie zostanie ona zakłócona.
  4. Zawiesić osad w 3 ml zimnego podłoża do kriokonserwacji. Powoli i delikatnie mieszać zawiesinę w górę i w dół, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    UWAGA: Objętość pożywki do cyrokonserwacji można regulować w oparciu o pożądane końcowe stężenie PBMC.
  5. Dozować 1 ml zawieszonego PBMC do wcześniej przypisanej krioprobówki i umieścić ją w pojemniku do zamrażania z kontrolną szybkością na co najmniej 4 godziny w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Objętość PBMC podawanych do każdej krioprobówki można dostosować w zależności od preferencji badacza.
  6. Po przechowywaniu krioprobówek w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny, należy przenieść krioprobówki do zbiornika z fazą parową ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

7. Analiza danych statystycznych

  1. Reprezentatywne dane wynikowe analizowano przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego, jak określono w pliku uzupełniającym 3.

Wyniki

Zmierzono proporcje limfocytów, monocytów, neutrofili, eozynofili i bazofili przed (tj. w krwi pełnej) oraz po izolacji PBMC, gdy PBMC izolowano metodą opartą na koralikach lub metodą separacji gradientem gęstości. Proporcje limfocytów i monocytów uległy znacznemu wzbogaceniu w obu metodach (Rycyna 2A,B). Dodatkowo, proporcje neutrofili, eozynofili i bazofili (tj. granulocytów) były znacząco niższe w PBMC izolowanych metodą opartą na koralikach (Rycina 2C-F). Nie stwierdzono istotnych różnic w proporcjach limfocytów, monocytów, neutrofili, eozynofili, bazofili i granulocytów pomiędzy metodą gradientu gęstości a metodą opartą na koralikach (Rycina 2). Obliczono również procentowy odzysk dla wyżej wymienionych typów komórek (patrz Rycina uzupełniająca 1). Średnia żywotność komórek wyniosła ponad 95% dla obu metod i nie różniła się istotnie (Rycina 3A). PBMC policzono również w zakresie wielkości (średnica) od 8 µm do 50 µm, przy czym metoda separacji gradientem gęstości dała około dwukrotnie wyższą całkowitą liczbę komórek (Rycina 3B).

Następnie zautomatyzowaną metodę z użyciem kulek porównano z metodą manualną. Nie stwierdzono istotnych różnic w przeżywalności komórek (Rycina 4A) lub całkowitej liczby komórek (Rycina 4B) przy użyciu metody ręcznej lub zautomatyzowanej. Porównano czas przetwarzania tych 8 próbek, uwzględniając czas bezobsługowy, niewymagający ingerencji operatora. Całkowity czas przetwarzania 8 próbek wyniósł 43 min kontra57 min dla instrukcji obsługi kontrametoda zautomatyzowana. Metoda zautomatyzowana obejmowała 35 min przetwarzania bez udziału operatora (Rycina 4C).

Procedura izolacji PBMC oparta na kuleczkach (z jednoczesnym rozdzielaniem krwi pełnej i osocza) była testowana przez 9 miesięcy, podczas których wyizolowano 1410 próbek PBMC z nieprzesiewionej krwi ludzkiej, stosując platformę manualną dla pierwszych 820 uczestników, a następnie metodę zautomatyzowaną dla kolejnych 590 uczestników. Przetwarzanie przeprowadzano w tym samym dniu lub do 10 dni po pobraniu, zgodnie z kryteriami akceptacji badania, przy czym opóźnienia w przetwarzaniu wynikały głównie z czasu transportu próbek. Zarówno w metodzie manualnej, jak i zautomatyzowanej, PBMC przetworzone w ciągu 24 h od pobrania wykazywały najwyższą żywotność i odzysk (Rysunek 5). Średnia żywotność komórek wynosiła >90% dla PBMC przetworzonych w ciągu 5 dni oraz >70% dla PBMC przetworzonych w ciągu 10 dni (Rysunek 5A). Średnie wydajności PBMC spadły o 50% po 5 dniach w porównaniu do próbek przetworzonych w ciągu 24 h (Rysunek 5B).

Schemat przetwarzania próbek krwi: wirowanie, izolacja komórek, przechowywanie kriogeniczne w celu badania żywotności.
Rycina 1: Schematyczny przebieg procedury izolacji PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat) z wykorzystaniem kulek magnetycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie metod izolacji komórek; wykresy liniowe A-F przedstawiają dane dotyczące limfocytów, monocytów i granulocytów.
Rysunek 2: Proporcje limfocytów, monocytów, neutrofili, eozynofili, bazofili i granulocytów w krwi pełnej przed i po izolacji PBMC metodą gradientu gęstości oraz metodą opartą na kuleczkach. Procent limfocytów (A), monocytów (B), neutrofili (C), eozynofili (D), bazofili (E) i granulocytów (F) w dopasowanej krwi pełnej przed izolacją PBMC (kwadraty) oraz w PBMC po izolacji za pomocą gradientu gęstości (otwarte koła) lub metody opartej na kuleczkach (zamknięte koła) (n = 8). ns = brak istotności statystycznej, a *p < 0.05 określone za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (A i B) lub testu Friedmana (C-F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dane z badania żywotności komórek; wykluczanie błękitu trypanu; wykres porównujący metody gradientu gęstości i metody oparte na kuleczkach.
Rycina 3: Żywotność i całkowita liczba komórek PBMC wyizolowanych metodą gradientu gęstości oraz metodą opartą na kuleczkach. (A) Średnia (± SD) żywotność komórek dla próbek przetwarzanych przy użyciu gradientu gęstości (kwadraty, ciemny słupek) vs. metod opartych na kuleczkach (koła, jasny słupek) dla 8 par próbek. ns = brak istotności statystycznej w teście t-test dla prób zależnych. (B) Całkowita liczba komórek dla próbek przetwarzanych przy użyciu gradientu gęstości (kwadraty, ciemny słupek) vs. metod opartych na kuleczkach (koła, jasny słupek) dla 8 par próbek. *p < 0,05 wyznaczone za pomocą testu t-test dla prób zależnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Żywotność komórek, całkowita liczba komórek, czas przetwarzania; wykresy porównawcze; metody manualne vs automatyczne.
Rycina 4: Porównanie manualnych i automatycznych metod opartych na kuleczkach. (A) Średnia żywotność komórek (± SD) dla próbek przetwarzanych przy użyciu manualnych (kwadraty, ciemny słupek) vs. automatycznych (koła, jasny słupek) metod opartych na kuleczkach dla 8 par próbek. ns = brak istotności statystycznej w teście Mann-Whitneya. (B) Całkowita liczba komórek dla próbek przetwarzanych przy użyciu manualnych (kwadraty) vs. automatycznych (koła) metod opartych na kuleczkach dla 8 par próbek. ns = brak istotności statystycznej w sparowanym t-teście. (C) Czas przetwarzania 8 próbek przy użyciu metod manualnych vs. automatycznych, z uwzględnieniem czasu pracy manualnej (jasny słupek) i czasu bezobsługowego (ciemny słupek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie żywotności i wydajności komórek; wykresy słupkowe; dni przetwarzania; metody manualne vs automatyczne.
Rycina 5: Żywotność i wydajność PBMC izolowanych metodą opartą na kuleczkach manualnie lub z wykorzystaniem automatyzacji, w zależności od czasu pomiędzy pobraniem próbki a przechowywaniem PBMC. (A) Średnia (± 95% CI) żywotność komórek dla próbek uczestników przetwarzanych przy użyciu manualnych (ciemny słupek) vs. automatycznych (jasny słupek) metod opartych na kuleczkach. Tabela szczegółowo określająca liczbę uczestników. ns = brak istotności statystycznej. na = nie dotyczy. *p < 0.05 testem wielokrotnych porównań Tukeya. (B) Całkowita liczba komórek dla próbek uczestników przetwarzanych przy użyciu manualnych (ciemny słupek) vs. automatycznych (jasny słupek) metod opartych na kuleczkach. Tabela szczegółowo określająca liczbę uczestników. ns = brak istotności statystycznej. na = nie dotyczy. *p < 0.05 testem wielokrotnych porównań Tukeya. Brak wartości dla automatyzacji w dniu 10 ze względu na liczbę powtórzeń mniejszą niż 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek uzupełniający 1: Wykres procentowej odzyskiwalności komórek z zastosowaniem metody gradientu gęstości oraz metody opartej na kuleczkach. Procent obliczono na podstawie bezwzględnej liczby komórek przed izolacją w krwi pełnej oraz w zawiesinie komórkowej po izolacji metodą gradientu gęstości (kwadraty, ciemny słupek) i metodą opartą na kuleczkach (okręgi, jasny słupek) (n = 8). ns = brak istotności, a *p < 0,05 określono za pomocą nieparzystego t-testu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokół gradientu gęstości. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przygotowanie 0,1 M EDTA, pH 8,0 w PBS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Szczegółowe procedury wykonane w celu wygenerowania reprezentatywnych danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ludzkie PBMC to wszechstronne typy komórek używane w wielu testach; Jednak przepustowość izolacji jest często ograniczeniem w wielu laboratoriach, w tym w biobankach16. Wcześniej NSW Health Statewide Biobank wyizolował PBMC przy użyciu metody gradientu gęstości. Badano automatyzację metody separacji w gradionym gradieniu gęstości w celu zwiększenia zdolności przetwarzania, ale zidentyfikowano bariery we wdrożeniu, w tym (i) koszt w pełni zautomatyzowanej jednostki do obsługi cieczy z jednostką wirówkową, z dodatkowym wymogiem dotyczącym jednostki HEPA do produkcji sterylnego produktu, (ii) przeszkolony personel w zakresie programowania oraz (iii) czas wymagany do testowania protokołu. W związku z tym w niniejszym badaniu zbadano alternatywne metody i zidentyfikowano komercyjnie uzyskany zestaw PBMC dla ludzi, który można wykorzystać do ręcznego i automatycznego przetwarzania. Sterylność jest zapewniona, ponieważ sprzęt wymagany do przetwarzania mieści się w standardowej (długość 1,2 m) komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ten artykuł szczegółowo opisuje modyfikacje wprowadzone do zalecanego przez producenta protokołu14 w celu zwiększenia wydajności i obniżenia kosztów odczynników bez utraty jakości. Ponadto protokół producenta został rozszerzony o szczegółowe informacje na temat etapów pobierania próbek z biobanku do przyszłych badań, w tym krwi pełnej (krok 1.2), osocza (krok 2.2) i krwinek czerwonych (krok 2.5) z oryginalnej probówki krwi, a także zliczania komórek i krioprezerwacji.

W tym badaniu porównano trzy protokoły izolacji PBMC: separację gradientu gęstości, ręczną i automatyczną izolację opartą na kulkach. Wprowadzono modyfikacje w ręcznym protokole opartym na kulkach, w tym usunięto rozcieńczanie powłoki buffy przed izolacją PBMC oraz wyeliminowano wymóg przerwy w wirowaniu, umożliwiając badaczom przestrzeganie elastycznego, opłacalnego i wysokowydajnego protokołu izolacji PBMC. Najpierw wykorzystano osiem dopasowanych próbek krwi pełnej do wyizolowania PBMC w celu porównania separacji gradientu gęstości i ręcznej techniki opartej na kulkach. Co ważne, rozmieszczenie populacji komórek, żywotność komórek i odzysk PBMC nie różniły się istotnie między dwiema porównywanymi metodami, jak pokazano odpowiednio na rysunku 2A-F, rysunku 3A i rysunku uzupełniającym 1. W reprezentatywnych danych liczba komórek była wyższa w przypadku metody separacji w gradionym gradimencie gęstości przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego, ale nie w przypadku użycia analizatora komórek hematologicznych. Ustawienia typu komórek PBMC na liczniku komórek wykorzystywały zakres średnic komórek 8-50 μm, a zatem zliczenia będą obejmować PBMC, a także granulocyty (o średnicy około 12-15 μm) przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego17. Podczas gdy hematologiczny licznik komórek oferował wyższą swoistość niż metoda wykluczania błękitu trypanowego, niektóre obliczenia odzysku były wyższe niż 100%, co odzwierciedlało margines błędu instrumentu (patrz rysunek uzupełniający 1). Dlatego zaleca się, aby badacze stosowali kombinację technik liczenia komórek podczas porównywania wydajności z protokołów izolacji PBMC, ponieważ większość technik nie oferuje zarówno specyficznej, jak i bardzo czułej różnicowej liczby komórek. Ponadto nie przeprowadzono testów w celu porównania aktywności funkcjonalnej PBMC uzyskanych z którejkolwiek z technik, co stanowi ograniczenie naszej analizy.

Następnie porównano ręczne i automatyczne metody oparte na kulkach i nie stwierdzono istotnych różnic między wydajnością a żywotnością PBMC z 8 dopasowanych próbek (Rysunek 4A,B). Populacje komórek nie były porównywane indywidualnie, ponieważ w obu metodach zastosowano ten sam koktajl izolacji przeciwciał. Co ważne, czas pracy przy przetwarzaniu 8 próbek został skrócony z 43 minut do 22 minut przy użyciu protokołu automatycznego (rysunek 4C). Podczas gdy automatyzacja, zapobieganie wypaleniu zawodowemu techników i spójność przetwarzania próbek są zapewnione dzięki automatyzacji, koszt odczynników i materiałów eksploatacyjnych jest znacznie wyższy i jest 3-4 razy wyższy niż w przypadku metody ręcznej opartej na kulkach. Dzieje się tak po wprowadzeniu modyfikacji w protokole producenta w celu użycia 1 ml buffy coat (z pełnej objętości krwi 10 ml) zamiast zalecanego zakresu 2-5 ml (z pełnej objętości krwi 10 ml i / lub większej). Jeśli budżet jest ograniczeniem, wybór metody ręcznej może skrócić czas przetwarzania o ~25% przy jednoczesnym zachowaniu kosztów odczynników i materiałów eksploatacyjnych porównywalnych z kosztami metody separacji gęstości. Zaleca się przetwarzanie nie więcej niż 8 próbek na raz na technika, aby zapewnić odpowiednie rozłożenie próbek (~30 s/próbkę) w ciągu 5-minutowych okresów inkubacji (kroki 3.7, 3.11 i 3.14).

Zarówno w przypadku metod ręcznych, jak i automatycznych opartych na kulkach, usunięcie powłoki kożuchowej jest krytycznym krokiem w celu zapewnienia optymalnej izolacji PBMC. Ważne jest, aby pamiętać, że w tym protokole stosuje się kożuch, a nie krew pełną, ponieważ objętość odczynników jest oparta na objętościach materiału wyjściowego10. Skuteczne usunięcie całej objętości kożucha może być technicznie trudne. Początkowo ta metoda szczegółowo opisywała usuwanie 0,5 ml kożucha kożuchowego, jednak została zwiększona do 1 ml, aby poprawić regenerację. Aby zapewnić odpowiednią i konsekwentną regenerację kożuchwy, szczegółowe opisanie tego procesu jest ważne w dokumentacji protokołu i szkoleniu. Zaleca się obracanie końcówki pipety podczas zasysania kożucha kożbowego, uważając, aby nie zassać zbyt wielu erytrocytów z warstwy poniżej (krok 2.3). Ważne jest, aby nie nasycać koktajlu przeciwciał, który wiąże niechciane komórki (tj. granulocyty i czerwone krwinki), co może mieć wpływ na wydajność i czystość10. Aby zminimalizować ilość krwinek czerwonych zebranych podczas ekstrakcji kożuchowca, końcówka pipety powinna znajdować się pomiędzy warstwą plazmy i kożuchowca. Objętość kożucha można zwiększyć z 1 ml; Należy jednak zachować ostrożność w sposób opisany powyżej, aby zapewnić, że nie więcej niż 10% zebranej objętości zawiera erytrocyty. Alternatywnie, do konsekwentnego zbierania kożuchów buffy można użyć automatycznego urządzenia do obsługi płynów18. Jednak dedykowane godziny wymagane do kalibracji i rozwiązywania problemów z protokołami przyrządów do obsługi cieczy, zwłaszcza biorąc pod uwagę koszty, mogą być niewykonalne dla większości laboratoriów.

Przejście i zastosowanie protokołu opartego na koralikach automatyzacji było niezbędne, biorąc pod uwagę cel NSW Health Statewide Biobank, jakim jest przetworzenie 23 000 PBMC w ciągu najbliższych 3 lat. W tym przypadku wykazano, że PBMC można izolować z probówek ACD do 9 dni od pobrania ze średnią żywotnością >70%. Podczas gdy plony były optymalne 24 godziny po pobraniu, przetwarzanie w tym czasie nie zawsze jest wykonalne, ponieważ może być konieczne przetransportowanie próbek. Wykazano, że PBMC wyizolowane metodą ręczną lub automatyczną opartą na kulkach mogą dawać wydajność >3 x 105 komórek/ml krwi pełnej po wyizolowaniu w ciągu 4 dni od pobrania i >1 x 105 komórek/ml krwi pełnej po wyizolowaniu w ciągu 10 dni od pobrania. Niskie liczby próbek pobranych w ciągu 5 dni są odnotowywane jako ograniczenie tej analizy. Co więcej, dane nie zostały rozdzielone na podstawie wieku, płci i historii klinicznej uczestników, ponieważ informacje te nie zostały udostępnione. Chociaż potrzebna jest analiza porównawcza w celu zbadania skutków opóźnień w czasie przetwarzania dla obu metod, wcześniej donoszono, że opóźnienia w izolacji PBMC przy użyciu metody gradientu gęstości obniżają jakość komórek i znacznie zwiększają zanieczyszczenie RBC 19,20. Ponadto proporcje granulocytów zwiększają się, jeśli przetwarzanie jest opóźnione, a zatem próbki w podobnym "wieku" powinny być grupowane do dalszych analiz 20,21,22. Warto zauważyć, że eksperyment ten przeprowadzono przy użyciu antykoagulacji krwi z kwaśną dekstrozą cytrynową (tj. Cytrynianem trisodowym, kwasem cytrynowym i dekstrozą); jednak wydajność i/lub proporcja typów komórek może się różnić, jeśli stosuje się inne antykoagulanty23; w związku z tym zaleca się, aby badacze wybrali odpowiedni antykoagulant w oparciu o zamierzone dalsze analizy PBMC.

Podsumowując, protokół izolacji PBMC za pomocą kulek magnetycznych, który można dostosować do przepływów pracy o wysokiej przepustowości, został szczegółowo opisany, aby spełnić wymagania dotyczące skalowania bez uszczerbku dla żywotności komórek. Zarówno metody ręczne, jak i automatyczne można zoptymalizować w celu uzyskania określonych stężeń komórek poprzez zmianę objętości początkowej i ponownie zawieszonej. Stanowy Biobank NSW Health przeszedł od ekstrakcji ~60 PBMC miesięcznie przy użyciu tradycyjnej techniki separacji gradientu gęstości do ~300 PBMC miesięcznie przy użyciu tej kompatybilnej z automatyzacją metody opartej na koralikach. Kolejnym celem autorów jest wykorzystanie zautomatyzowanej platformy do przetwarzania do 1200 PBMC miesięcznie i dalsze porównywanie PBMC wyizolowanych zarówno za pomocą technik opartych na kulkach magnetycznych (ręcznych i automatycznych), jak i technik gradientu gęstości, aby pomóc w wdrożeniu tej techniki w innych laboratoriach, ze szczególnym uwzględnieniem biobanków.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Stanowy Biobank Zdrowia Nowej Południowej Walii dziękuje za wsparcie ze strony NSW Health Pathology, Biura ds. Zdrowia i Badań Medycznych NSW oraz Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney. Ponadto autorzy wyrażają wdzięczność Omico i innym badaniom naukowym wspieranym przez NSW Health Statewide Biobank za udzielenie pozwolenia na publikację danych wygenerowanych we własnym zakresie i wykorzystanie niewykorzystanych próbek do celów badawczych. Autorzy dziękują profesor Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, University of Sydney) za krytyczne przywództwo i dyskusje. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka do kriokonserwacji komórek CS10, 100 ml (CRYOSTOR)StemCellTM Technologies07930
Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy IIThermo ScientififcTM51033311
CoolCell 1 mL FXBioToolsBCS-407PJest to używany pojemnik do zamrażania z kontrolną szybkością.
Woda destylowana Bacto Laboratories561832
Analizator hematologiczny DxH 500 Beckman Coulter Life SciencesB40601Określany jako zewnętrzny automatyczny licznik komórek.
EasyEightsTM EasySepTM MagnesStemCellTM Technologies18103
EasySepTM Zestaw do bezpośredniej izolacji człowieka PBMCStemCellTM Technologie19654Zestaw zawiera rurkę z kulkami magnetycznymi i rurkę do mieszania koktajli
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-Aldrich Pty LtdE6758-500GInstrukcje przygotowania 0,1 M roztworu EDTA z soli EDTA znajdują się w pliku uzupełniającym 2.
LymphoprepTM Gradient gęstości MediumStemCellTM Technologies7851
Wirówka Megafuge ST4 PlusThermo ScientififcTMTHR75009903
Elektroda pH-metru Orion Star A211Thermo ScientififcTMSTARA2110
Orion&handel; ROSS Ultra&handel; Szklana trioda i handel; Elektrody kombinowane pH/ATCThermo ScientififcTM8302BNURCA
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), roztwór, 1X, 500mlLife Technologies Australia Pty Ltd10010023
PrismGraphPad
RoboSepTM Buffer 1XStemCellTM Technologies20104Oprogramowanie używane do analiza statystyczna.
RoboSepTM-SStemCellTM Technologies21000W pełni zautomatyzowany separator komórek.
RoboSep&handel; Końcówki filtrująceProbówki StemCellTM Technologies20125
SepMateTM-50 (IVD) StemCellTM Technologies85460IVD - Diagnostyka in vitro. Znany również jako probówki SepMateTM-50
Vi-CELL XR Cell AnlayzerBeckman Coulter Life SciencesWewnętrzny automatyczny licznik komórek. Instrument przestarzały i niedostępny w sprzedaży (stan na 31 grudnia 2022 r.). Alternatywnym instrumentem jest analizator żywotności komórek ViCell BLU (nr produktu C19196).
Zestaw odczynników Vi-CELL XR Quad Pack BeckmanCoulter Nauki Przyrodnicze383722

Bibliografia

  1. Alexovic, M., et al. Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications. Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).
  2. Zhang, M., Huang, B. The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).
  3. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).
  4. Kleeberger, C. A., et al. Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).
  5. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  6. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).
  7. Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).
  8. Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells. Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).
  9. Coppola, L., et al. Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation. J Transl Med. 17 (1), 371(2019).
  10. Stemcell Technologies. Vol. 27156. STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).
  11. Hornschuh, M., et al. Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes. Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).
  12. Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour. F1000Res. 6, 2045(2017).
  13. Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage. Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).
  14. Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies. , Available from: https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html (2022).
  15. Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter. , Available from: https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf (2017).
  16. Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).
  17. Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. Histology, white blood cell. StatPearls Publishing. , (2024).
  18. Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study. Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).
  19. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  20. Yi, P. C., et al. Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays. J Immunol Methods. 519, 113514(2023).
  21. Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function. J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).
  22. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society. Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).
  23. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja PBMCwarstwa buffy coatwysokoprzepustowy schemat pracywirowanie w gradiencie g sto ciautomatyczny licznik kom rekywotno kom rekpopulacja monocyt w i limfocyt wmetoda kulek magnetycznych
Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.