Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7

DOI:

10.3791/66888

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  , 
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology, Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych DNA w komórkach MCF-7 za pomocą technologii ELISA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

zasada 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxo-dG) jest dominującą formą powszechnie obserwowanego uszkodzenia oksydacyjnego DNA. Upośledzenie DNA głęboko wpływa na ekspresję genów i służy jako kluczowy czynnik stymulujący zaburzenia neurodegeneracyjne, raka i starzenie się. W związku z tym precyzyjna kwantyfikacja 8-oxoG ma znaczenie kliniczne w badaniach nad metodologiami wykrywania uszkodzeń DNA. Jednak obecnie istniejące podejścia do wykrywania 8-oxoG stanowią wyzwanie pod względem wygody, celowości, przystępności cenowej i zwiększonej czułości. Zastosowaliśmy technikę testu immunoenzymatycznego sprzężonego z enzymem kanapkowym (ELISA), wysoce wydajną i szybką metodę kolorymetryczną, do wykrycia zmian w zawartości 8-okso-dG w próbkach komórek MCF-7 stymulowanych różnymi stężeniami nadtlenku wodoru (H2O2). Określiliśmy stężenieH2O2, które indukowało uszkodzenie oksydacyjne w komórkach MCF-7, wykrywając jego wartość IC 50 w komórkach MCF-7. Następnie potraktowaliśmy komórki MCF-7 0, 0,25 i 0,75 mM H2O2 przez 12 godzin i wyekstrahowaliśmy 8-oxo-dG z komórek. Na koniec próbki poddano testowi ELISA. Po wykonaniu szeregu etapów, w tym rozprowadzania płytki, mycia, inkubacji, opracowywania koloru, zakończenia reakcji i zbierania danych, z powodzeniem wykryliśmy zmiany w zawartości 8-okso-dG w komórkach MCF-7 indukowane przezH2O2. Dzięki takim wysiłkom dążymy do ustalenia metody oceny stopnia uszkodzeń oksydacyjnych DNA w próbkach komórkowych, a tym samym do przyspieszenia rozwoju bardziej celowych i wygodnych podejść do wykrywania uszkodzeń DNA. Przedsięwzięcie to może wnieść znaczący wkład w eksplorację analiz asocjacyjnych między uszkodzeniami oksydacyjnymi DNA a różnymi dziedzinami, w tym badaniami klinicznymi nad chorobami i wykrywaniem substancji toksycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie oksydacyjne DNA jest konsekwencją braku równowagi między generacją reaktywnych form tlenu (ROS) a komórkowym systemem obrony antyoksydacyjnej1. Polega przede wszystkim na utlenianiu zasad DNA, purynowych i pirymidynowych2,3. Ta oksydacyjna modyfikacja zasad DNA nie tylko zagraża integralności genomu, ale także obejmuje szeroki zakres problemów patologicznych, w tym raka, choroby neurodegeneracyjne i choroby sercowo-naczyniowe4,5. Baza guaninowa w DNA ma najniższy potencjał redukcyjny i jest najbardziej podatna na utlenianie6. Dlatego 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxo-dG) służy jako podstawowy marker do oceny stopnia uszkodzenia oksydacyjnego DNA7,8. Dokładna kwantyfikacja 8-oxo-dG stała się kluczową kwestią w odniesieniu do różnych aspektów występowania choroby, progresji i oceny wieloczynnikowego obciążenia oksydacyjnego9.

Tradycyjne metody wykrywania 8-oxo-dG, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD), spektrometria mas i pokrewne techniki z łącznikami, wykazują wysoką czułość i specyficzność10,11,12. Jednak techniki te często wiążą się ze złożonymi wymaganiami operacyjnymi i wysokimi kosztami, co utrudnia ich szerokie zastosowanie i praktyczność w wysokoprzepustowej analizie próbek. Wraz z ciągłym postępem nauki i technologii pojawiło się wiele nowych, wydajnych i dokładnych metod. Zastosowanie tych nowych technologii umożliwia nam dokładniejsze ilościowe określenie poziomu 8-oxo-dG i zapewnia bardziej zaawansowane narzędzia do dogłębnego badania związku między stresem oksydacyjnym a chorobami. Na przykład naukowcy zastosowali technologię nanoporów do ilościowego wykrywania i sekwencjonowania DNA13, identyfikowania typów uszkodzeń DNA za pomocą strategii sekwencjonowania kodu jednym kliknięciem14, opracowywania metod sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i tworzenia bioczujników opartych na 8-oxoG poprzez integrację biotyny-streptawidyny z ELISA15. Wśród nich test ELISA, ze swoimi uznanymi zaletami pod względem swoistości, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i kosztów, jest jednym z idealnych rozwiązań do wykrywania 8-oxo-dG. Dlatego tak ważne jest opracowanie wysokoprzepustowej, wysoce czułej, wygodnej i szybkiej metody wykrywania 8-oxo-dG.

Technika testu immunoenzymatycznego (ELISA), opracowana w 1971 roku16, szybko się rozwinęła w ciągu ostatnich 50 lat i stała się obecnie jedną z najczęściej stosowanych metod wykrywania w dziedzinie biologii i medycyny17,18,19. Technologia ELISA charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością, krótkim czasem reakcji i jest łatwa w użyciu, co czyni ją powszechnie uznawanym wyborem do badań próbek na dużą skalę i analizy o wysokiej przepustowości20. W rezultacie, test ELISA jest szeroko stosowany do ilościowej lub półilościowej analizy związków, białek, przeciwciał lub cząsteczek w komórkach21,22,23. Na przykład został wykorzystany do wykrywania biomarkerów związanych z różnymi chorobami, pozostałościami leków i biomolekułami24. Testy ELISA można podzielić na cztery główne typy w oparciu o projekt eksperymentalny i zasady25. Metody te obejmują bezpośredni test ELISA, pośredni test ELISA, test ELISA typu sandwich oraz konkurencyjny test ELISA26,27. Spośród nich do badania w tym artykule wybrano test ELISA, który wykorzystuje dwa specyficzne przeciwciała, jedno do wychwytywania cząsteczki docelowej, a drugie do wykrywania. Zasada eksperymentalna testu ELISA typu sandwich jest następująca: Po pierwsze, specyficzne przeciwciało jest unieruchamiane w studzienkach mikropłytki w celu wychwycenia interesującego analitu. Po dodaniu wzorca lub próbki docelowy analit wiąże się z unieruchomionym przeciwciałem. Następnie dodaje się znakowane przeciwciało, które rozpoznaje inny epitop na antygenie, tworząc strukturę kanapkową. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał dodaje się substrat. Pod katalitycznym działaniem przeciwciała wtórnego zachodzi reakcja barwna, a intensywność koloru jest dodatnio skorelowana ze stężeniem docelowego analitu w próbce. Na koniec zmierzono gęstość optyczną (OD) w celu określenia stężenia próbki. Test Sandwich ELISA ma zalety zwiększonej czułości i swoistości dla próbek docelowych, dzięki czemu nadaje się do wykrywania niskich stężeń docelowych analitów i próbek złożonych28. Dodatkowo uzyskane wyniki można określić ilościowo w celu dalszej analizy. Czynniki te sprawiają, że test ELISA typu sandwich jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania zarówno w badaniach naukowych, jak i laboratoriach klinicznych29.

To badanie miało na celu ilościowe wykrycie 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 w celu określenia stopnia uszkodzenia oksydacyjnego DNA w komórkach. Badanie to składa się z dwóch głównych części: skonstruowania modelu uszkodzenia oksydacyjnego DNA komórki MCF-7 oraz wykrycia 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA. Po pierwsze, komórki MCF-7 hodowano in vitro i traktowano różnymi stężeniamiH2O2przez różny czas. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu CCK-8 w celu określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50)H2O2w komórkach MCF-7. Na podstawie wartości IC50 wybrano odpowiedni czas zabieguH2O2i stężenie indukcyjne. Aby wyekstrahować próbki komórek MCF-7 uszkodzonych przez utlenianie, uzyskano próbki komórek i supernatanty i dodano je do dołków połączonych enzymatycznie wcześniej pokrytych przeciwciałami 8-oxo-dG. 8-oxo-dG obecny w próbce zwiąże się z przeciwciałami związanymi z nośnikiem w fazie stałej. Następnie dodano przeciwciała 8-oxo-dG znakowane peroksydazą chrzanową. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w stałej temperaturze, aby zapewnić całkowite związanie próbki i przeciwciała. Niezwiązany enzym usunięto przez mycie, a następnie dodano substrat kolorymetryczny, który uzyskał niebieski kolor. Pod działaniem kwasu roztwór zmienił kolor na żółty. Ostatecznie wartość OD próbek studzienki reakcyjnej zmierzono przy 450 nm, a stężenie 8-oxo-dG w próbce było proporcjonalne do wartości OD. Generując krzywą wzorcową, można obliczyć stężenie 8-oxo-dG w próbce.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowamodelu oksydacyjnego uszkodzenia DNA indukowanego przezH2O2 w komórkach MCF-7

  1. Odzyskiwanie komórek MCF-7
    1. Szybko przenieś probówkę kriogeniczną do hodowli komórkowych, która zawiera 3,5 x 106 komórek MCF-7 i jest przechowywana w lodówce o temperaturze -80°C, do pojemnika piankowego zawierającego ciekły azot. Wyjmij probówkę za pomocą kleszczy i umieść ją w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C na około 1 minutę w celu rozmrożenia zakonserwowanych komórek.
      UWAGA: Podczas procesu rozmrażania w łaźni wodnej należy co jakiś czas potrząsać komórkami, aby zapewnić równomierne ogrzewanie kriowialu.
    2. Umieścić kriowial w wirówce i odwirowywać w temperaturze pokojowej przy 150 x g przez 5 minut.
    3. Za pomocą pipety usunąć supernatant z probówki do przechowywania kriogenicznego i dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Dobrze wymieszać i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 mm, uzupełnić dodatkowe 7 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
    4. Wstrząsnąć naczyniem hodowlanym na krzyż, aby zapewnić równomierne wymieszanie, i przeprowadzić hodowlę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana składa się z pożywki hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną i streptomycyną.
  2. Ocena żywotności komórek
    1. Wybierz komórki MCF-7 w logarytmicznej fazie wzrostu o dobrym statusie komórkowym do eksperymentu. Podczas logarytmicznej fazy wzrostu komórki zazwyczaj wykazują krótszy cykl podziału i wysoką częstotliwość podziałów komórkowych.
      1. Obserwuj morfologię i tempo wzrostu komórek MCF za pomocą mikroskopu elektronowego. Kiedy komórki mają jednolitą i gęsto upakowaną morfologię jednowarstwową, a proliferacja komórek jest oczywista, można stwierdzić, że komórki są zasadniczo w logarytmicznej fazie wzrostu.
    2. Mycie komórek: Za pomocą pipety usuń pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego, dodaj 1 ml buforu PBS, aby umyć komórki, a następnie wyrzuć PBS.
    3. Odwarstwienie komórek: Dodaj 1 ml trypsyny, aby umyć komórki, odczekaj około 1 minuty, aż trypsyna całkowicie oderwie komórki od naczynia hodowlanego. Delikatnie postukaj w naczynie hodowlane; Obserwacja ruchu komórek
      w arkuszach wskazuje na dokładne oderwanie komórki.
    4. Zakończenie odrywania komórek i zliczania komórek: Dodać 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby zakończyć odłączanie, delikatnie pipetować komórki i określać stężenie zawiesiny komórek za pomocą urządzenia do liczenia komórek.
      UWAGA: Upewnij się, że zawiesina komórek jest jednorodna przed liczeniem, delikatnie pipetując w górę iw dół.
    5. Wysiew komórek: Dostosuj rozcieńczoną zawiesinę komórek, aby uzyskać gęstość komórek 5 000 komórek na 100 μl. Zaszczepij zawiesinę komórek do 21 dołków 96-dołkowej płytki za pomocą pistoletu do pipet, dozując 100 μl do każdej studzienki. Dodać 100 μl buforu PBS do otaczających studzienek z nasionami, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu pożywki hodowlanej.
    6. Przygotowanie pożywki zawierającejH2O2: Wybierz 9 dołków na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i przypisz etykiety na podstawie gradientu stężeńH2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Dodać 720 μl kompletnej pożywki do studzienek oznaczonych jako 2,0 mM i 1,5 mM i dodać 360 μl kompletnej pożywki do pozostałych studzienek.
      1. Za pomocą pipety dozować 1,63 μl i 1,22 μl odczynnika 3% H2O2 do studzienek oznaczonych odpowiednio jako 2,0 mM i 1,5 mM. Dokładnie wymieszaj roztwór. Za pomocą pipety przenieść 360 μl 2,0 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 1,0 mM i wymieszać; następnie przenieść 360 μl 1,0 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,5 mM i wymieszać; i na koniec przenieś 360 μL 0,5 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,25 mM. Odpipetować 360 μl 1,5 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,75 mM w celu rozcieńczenia i osiągnięcia pożądanego stężenia. (Rysunek 1).
        UWAGA: Upewnij się, że roztwór podstawowyH2O2w pipecie został całkowicie przeniesiony do studzienek, aby uniknąć pozostałości roztworu. Zapewnić dokładne wymieszanie roztworów przed przystąpieniem do rozcieńczania.
    7. Inkubacja: Po około 24 godzinach wysiewu komórek za pomocą pipety usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 96-dołkowej, gdy komórki przylgną do powierzchni. Zgodnie z gradientem stężeń dodać odpowiednie podłoże zawierające H2O2 do każdej studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 12 godzin.
    8. Dodanie odczynnika CCK-8: Po wyznaczonym 12-godzinnym okresie poddawania działaniu substancji należy użyć pipety do usunięcia pożywki hodowlanej z płytki 96-dołkowej, dodać 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej i 10 μl odczynnika CCK-8 do każdego dołka i dołączyć trzy ślepe studzienki kontrolne. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godz
      UWAGA: Podczas procesu dodawania próbek należy unikać tworzenia się pęcherzyków, aby zapobiec zakłóceniom w odczycie wartości OD.
    9. Pomiar absorbancji: Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora, zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i zapisać wyniki.
    10. Zgodnie ze wzorem obliczeniowym IC50,
      wskaźnik inhibicji (%) = (OD grupy eksperymentalnej leku-średnia OD otworu kontrolnego leku)/ (średnia OD otworu kontrolnego komórki-średnia OD otworu kontrolnego leku) x 100%
      Obliczyć wyniki jako procent absorbancji w kulturach kontrolnych.
    11. Zaimportuj przetworzone dane eksperymentalne do oprogramowania do analizy statystycznej, wybierz typ analizy Regresja nieliniowa, skonstruuj czteroparametrowy model logistyczny i przejdź do kliknięcia przycisku Dopasuj krzywą, aby dopasować krzywą. Po zakończeniu procesu dopasowania oprogramowanie automatycznie obliczy wartość IC50.
  3. Eksperyment z utlenianiem komórek MCF-7 indukowany przezH2O2
    1. Pobierz komórki MCF-7 w logarytmicznej fazie wzrostu z dobrym statusem komórek do eksperymentów.
    2. Umyj, wykonaj odłączanie komórek, zakończ odłączanie i policz komórki (szczegółowe metody znajdują się w kroku 1.2).
    3. Wysiew komórek: Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 1 x 106 komórek na naczynie, z 4 ml zawiesiny na naczynie o średnicy 6 cm.
    4. Oznacz dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 5 ml jako 0.25 mM i 0.75 mM 3% H2O2 . Dodać 4 ml kompletnej pożywki do każdej probówki, a następnie dodać odpowiednio 1,13 μl i 3,40 μl 3% H2O2 . Delikatnie potrząśnij probówkami, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Zastąp pożywkę hodowlaną w trzech szalkach kompletną pożywką zawierającąH2O2o stężeniach 0, 0,25 i 0,75 mM.
    5. Inkubuj kultury: Włóż naczynia do inkubatora na 12 godzin.

2. Przygotowanie próbek komórkowych i przygotowanie odczynników ELISA

  1. Pobieranie próbek ekstraktów komórkowych
    1. Pobieranie próbek: Odrzuć supernatant hodowli komórkowej MCF-7, przepłucz, wykonaj odłączanie komórek, zakończ odłączanie i zbieraj komórki. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Wirowanie: Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby zebrać osad komórkowy. Dodaj 200 μl PBS, aby ponownie zawiesić każdą próbkę komórkową i rozbić komórki poprzez powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania. Odwirować lizat komórkowy przy stężeniu 1 500 x g przez 10 minut i za pomocą pipety zebrać supernatant do analizy.
      UWAGA: Gdy ilość komórek jest niska, zmniejsz objętość PBS używanej do ponownego wymieszania. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeżeli natychmiastowa analiza nie jest możliwa. W przypadku długotrwałego przechowywania należy podzielić próbki na porcje w oparciu o ilości jednorazowego użytku i przechowywać je w temperaturze -80 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotowanie odczynników ELISA
    1. Rozmrażanie odczynników: Pozwól, aby odczynniki ELISA, w tym folie uszczelniające, wstępnie powlekane płytki, wzorce, rozcieńczalnik do próbek, przeciwciało wykrywające-HRP, substrat chromogenowy, roztwór zatrzymujący, skoncentrowany bufor do przemywania (20x) i próbki testowe osiągnęły temperaturę pokojową (18-25 °C) przez 20 minut przed rozpoczęciem testu. Otwórz czytnik ELISA na 15 minut przed użyciem.
    2. Przygotowanie buforu do płukania: Obliczyć wymaganą objętość rozcieńczonego buforu do płukania, a następnie rozcieńczyć 20x skoncentrowany bufor do płukania wodą destylowaną lub dejonizowaną do 1x roztworu roboczego. Niewykorzystany skoncentrowany bufor do płukania należy włożyć z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Bufor do mycia powinien być przygotowany świeży przed użyciem. Jeśli kryształy są obecne w skoncentrowanym buforze do płukania przechowywanym w lodówce, pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową i delikatnie potrząśnij, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą przed użyciem.
    3. Przygotowanie wzorca
      1. Przygotować roztwory robocze próbek wzorcowych o stężeniach odpowiednio 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 ng/ml. Aby zapewnić dokładność wyników eksperymentalnych, przed użyciem należy ostrożnie wymieszać próbki wzorcowe w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas procesu rozpuszczania.

3. Eksperyment ELISA

  1. Powlekanie płytek: Zaprojektuj z wyprzedzeniem całkowitą liczbę dołków dla wzorców, próbek i ślepej próby/kontroli i wyjmij wymagane paski płyty. Dodać 50 μl wzorcowego roztworu roboczego i próbki detekcyjne o różnych stężeniach do dołków reakcyjnych. Wykonaj wzorce w trzech egzemplarzach i powstrzymaj się od dodawania jakichkolwiek próbek do studzienek ślepych/kontrolnych25.
    UWAGA: Etapy eksperymentalne testu ELISA są pokazane schematycznie w Rysunek 2. Jeżeli stężenie próbki przekracza zakres wykrywania, przed pobraniem próbki należy ją rozcieńczyć rozcieńczalnikiem. Podczas dodawania próbek dodaj je na dno płytki, unikając dotykania ścianek studzienki, delikatnie potrząśnij, aby wymieszać i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Aby zapewnić dokładność eksperymentu, każde dodawanie próbki powinno zostać zakończone w ciągu 10 minut.
  2. Inkubacja: Z wyjątkiem studzienek ślepych, do każdej studzienki reakcyjnej dodać 100 μl przeciwciała detekcyjnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), uszczelnić studzienki uszczelką płytkową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w inkubatorze o stałej temperaturze.
  3. Mycie: Wylać płyn, strząsnąć płyn z dołków płytkowych, osuszyć na bibułę chłonną, dodać 350 μl buforu do każdej studzienki reakcyjnej, odstawić na 1-2 minuty, a następnie wyrzucić bufor do płukania. Powtórz proces prania 5x.
    UWAGA: Dokładne mycie ma kluczowe znaczenie, ponieważ bezpośrednio wpływa na dokładność wyników eksperymentów. Upewnij się, że bufor do mycia jest całkowicie strząśnięty po każdym praniu. Po umyciu ostrożnie zetrzyj wszelkie pozostałości na dnie płytki, aby uniknąć wpływu na pomiar absorbancji.
  4. Reakcja barwna: Dodać 50 μl substratu A i 50 μl substratu B do każdej studzienki reakcyjnej, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 min.
    UWAGA: Po dodaniu odczynnika barwiącego należy niezwłocznie obserwować zmianę koloru w studzienkach reakcyjnych. Jeśli kolor jest zbyt ciemny, dodaj roztwór zatrzymujący, aby wcześniej zakończyć reakcję.
  5. Zakończyć reakcję i zmierzyć absorbancję: Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdego dołka reakcyjnego i natychmiast zmierzyć wartość OD przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika ELISA (w ciągu 15 minut).
  6. Analiza danych: Zaimportuj przetworzone dane eksperymentalne do oprogramowania do analizy statystycznej, wybierz typ analizy Regresja liniowa. Skonstruuj krzywą kalibracyjną, wykreślając stężenie wzorców na osi X w stosunku do wartości gęstości optycznej (OD) na osi Y. Wykorzystać ustaloną krzywą kalibracyjną, aby ustalić stężenie 8-oxo-dG obecnego w próbkach. Skonstruuj model matematyczny Logistic i przejdź do kliknięcia przycisku Dopasuj krzywą, aby dopasować krzywą. Po zakończeniu procesu dopasowania oprogramowanie automatycznie oblicza krzywą standardową i wartość P.
    UWAGA: Krzywa standardowa nie może być ponownie użyta i musi być wyznaczana na nowo dla każdego eksperymentu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 3, oś X oznacza stężenieH2O2 zastosowane do komórek MCF-7, podczas gdy oś Y wskazuje żywotność komórki. Leczenie 0,75 mM przez 12 godzin zmniejszyło żywotność komórek MCF-7 do 67%. Równocześnie ze wzrostem stężenia nastąpił znaczny spadek żywotności komórek MCF-7, szczególnie przy stężeniu 1,5 mM, gdzie żywotność spadła poniżej 3% (tab. 1). Wyniki eksperymentalne sugerowały IC50 na poziomie 0,7655 mM dla komórek MCF-7.

W tej serii eksperymentów zastosowaliśmy ulepszoną technikę ELISA do ilościowego oznaczania poziomów 8-oxo-dG. Dzięki analizie danych równanie regresji krzywej standardowej jest następujące:

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Jak pokazano na Rysunek 4A, krzywa kalibracyjna wykazała wysoką liniowość (R²=0,978), a Rysunek 4B pokazuje, że relacje między zmierzonymi stężeniami 8-oxo-dG w próbkach a odpowiadającymi im dodanymi ilościami były silnie skorelowane, co wskazuje na dobrą precyzję (współczynnik zmienności wynosił mniej niż 5%). Ponadto spójność uzyskanych wyników w wielu powtórzeniach wskazuje na wiarygodność i odtwarzalność metody eksperymentalnej.

Podsumowując, dane eksperymentalne wskazują, że nasza zoptymalizowana metoda ELISA jest w stanie skutecznie wykrywać wahania poziomów 8-oxo-dG w dobrze kontrolowanych warunkach. Ma to istotne implikacje dla przyszłych zastosowań tej techniki w szerszym zakresie typów próbek do monitorowania uszkodzeń DNA spowodowanych stresem oksydacyjnym. Pomimo pewnych ograniczeń, perspektywy zastosowania metody wydają się obiecujące po optymalizacji warunków eksperymentalnych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie rozcieńczeńH2O2. Schemat ideowy przedstawia metodę przygotowania rozcieńczeń nadtlenku wodoru (H2O2), polegającą na skrupulatnym łączeniu roztworów i precyzyjnym przenoszeniu różnych stężeńH2O2do probówek oznaczonych odpowiednio jako 1,0 mM, 0,5 mM i 0,25 mM. Docelowe stężenie uzyskuje się poprzez przeniesienie 1,5 mM H2O2 do probówki oznaczonej jako 0,75 mM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania antygenów. Ta schematyczna ilustracja przedstawia sekwencyjne etapy testu immunoenzymatycznego (ELISA) do wykrywania antygenu: dodanie próbki i przygotowanie ślepej próby; inkubacja antygenu znakowanego HRP; mycie i przygotowanie talerza; dodawanie i inkubacja substratu; zakończenie reakcji i pomiar gęstości optycznej (OD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3:H2O2 hamował proliferację komórek MCF-7. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu CCK-8 poddanego działaniu różnych stężeńH2O2(0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 lub 2,0 mM) przez 12 godzin, a dla wskazanego stanu obliczono IC 50. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza ilościowa 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 po leczeniu H2O2. (A) Krzywa wzorcowa ELISA dla 8-oxo-dG. Przedstawia zależność między znanymi stężeniami 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 ng/ml) a ich odpowiednimi wartościami absorbancji. Równanie regresji krzywej standardowej to Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R2=0,978). (B) stężenie 8-okso-dG w komórkach MCF-7 poddanych działaniuH2O2. Wykres przedstawia poziomy 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 poddanych różnym stężeniomH2O2(0, 0,25 i 0,75 mM). Każdy punkt danych reprezentuje średnią ± SE (błąd standardowy) z trzech niezależnych eksperymentów (n=3), ilustrując wpływ stresu oksydacyjnego na uszkodzenie DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. TGL
parametr
StężenieH2O2, mM00,250,50,751cyfra arabska
Żywotność komórek MCF-7, %10082,881,3761,07Pytanie 13,4Z drugiej strony, 77

Tabela 1: Żywotność komórek MCF-7 traktowanychH2O2.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój metod ELISA ma ogromne znaczenie zarówno dla istniejących, jak i nowych metodologii wykrywania uszkodzeń DNA. W porównaniu z tradycyjnymi technikami HPLC i spektrometrii mas, podejście to jest nie tylko przyjazne dla użytkownika, ale także wykazuje wysoką czułość i spełnia wymagania wysokoprzepustowych badań przesiewowych30. Umożliwia to monitorowanie 8-oxo-dG w badaniach przesiewowych chorób na dużą skalę, ułatwiając głębsze zrozumienie korelacji między tym biomarkerem a różnymi chorobami.

Podczas procedur doświadczalnych niezbędnych jest kilka krytycznych etapów w celu zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności wyników. Początkowo eksperyment biegle ocenił wrażliwość komórek MCF-7 naH2O2, z wartością IC 50 wynoszącą 0,7655 mM po 12 godzinach, podkreślając poziom tolerancji komórek MCF-7. Wynik ten ma ogromne znaczenie naukowe dla zrozumienia antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych komórek MCF-7 i ich przetrwania w stresie oksydacyjnym, zapewniając jednocześnie ważny wskaźnik referencyjny dla przyszłych badań przesiewowych leków przeciwutleniających lub powiązanych mechanizmów leczenia31. Ponadto selekcja i parowanie przeciwciał 8-oxo-dG ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania testu ELISA i bezpośrednio wpływa na swoistość i czułość systemu wykrywania ELISA. Ponadto optymalizacja strategii wzmacniania sygnału i etapów przetwarzania próbki to ważne czynniki wpływające na dokładność detekcji. Odkryliśmy, że zastosowanie stabilnego systemu reakcji substratowej może zmniejszyć błędy tła i zwiększyć zakres czułości wykrywania.

Podczas procesu eksperymentalnego mogą wystąpić problemy techniczne, takie jak niestabilne przeciwciała, fluktuacje sygnału i reaktywność krzyżowa reagentów. Aby rozwiązać te problemy, przyjęliśmy bardziej stabilny protokół eksperymentalny, który obejmował zastosowanie stabilnych rozpuszczalników przeciwciał w celu poprawy stabilności przeciwciał oraz optymalizacji i dostosowania warunków eksperymentalnych. Dodatkowo, aby rozwiązać problem błędu spowodowanego fluktuacjami sygnału, ustandaryzowaliśmy eksperyment przy użyciu standardowych próbek 8-oxo-dG, aby zapewnić spójność wyników.

Jeśli chodzi o ograniczenia metody eksperymentalnej, chociaż ELISA zapewnia podejście wysokoprzepustowe, może być nadal ograniczony przez specyficzne pokrycie przeciwciałami i nieuniknioną reaktywność krzyżową substratu32. W związku z tym w przypadku próbek złożonych mogą być wymagane dodatkowe etapy oczyszczania lub przetwarzania wstępnego. Co więcej, wykrycie próbek o niższych stężeniach może wymagać dalszej optymalizacji aktywności przeciwciał, aby spełnić wymagania badawcze.

Podsumowując, metoda wykrywania ELISA dla 8-oxo-dG ma ważne implikacje dla konkretnych obszarów badawczych. Ma potencjalną wartość aplikacyjną w monitorowaniu środowiska, ocenie ryzyka chorób i wczesnej diagnostyce oraz zapewnia nowe podejście do wykrywania 8-oxo-dG w rolnictwie, bezpieczeństwie żywności i badaniach przesiewowych leków33. Na przykład w biomonitoringu środowiska wykrywanie stresu związanego z uszkodzeniem oksydacyjnym DNA wywołanego przez toksyny środowiskowe w organizmach może pomóc w identyfikacji potencjalnych zagrożeń w odpowiednim czasie34. Oczekuje się, że w przyszłości, wraz z dalszą optymalizacją technologii wykrywania i jej zastosowaniem w wielu dyscyplinach, metoda ta będzie odgrywać bardziej krytyczną rolę w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Innowacyjny Zespół Badawczy ds. Nauki i Technologii Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (2021), Program Centrum Badań nad Technologią Inżynieryjną Jiangsu Vocational College (2023), Kluczowy Program Technologiczny Projektów Technologicznych Ludności Suzhou (SKY2021029), Otwarty Projekt Biobanku Zasobów Klinicznych Jiangsu (TC2021B009), Projekt Państwowego Kluczowego Laboratorium Medycyny Radiacyjnej i Ochrony, Uniwersytet Soochow (GZK12023013), programy Wyższej Szkoły Zdrowia Zawodowego w Suzhou (SZWZYTD202201) oraz projekt Qing-Lan w prowincji Jiangsu w Chinach (2021, 2022).

Materiały

2

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTA(1x)Gibco25200-072
Zestaw do liczenia komórek-8Dojindo
Inkubator
ST30-3302
GraphPad Prism X9Oprogramowanie GraphPad Oprogramowanieanalizy statystycznej
wirówka szybkoobrotowaTermo  9AQ2861
Ludzki zestaw ELISA 8-oxo-dGPipety ZcibioZC-55410
L-1000XLS+Rainin17014382
L-20XLS+Zbiornik
Rainin MvecryogeYDS-175-216
MCF-7 CELLBNCCBNCC100137
Mikropłytkowy fotometr Multiskan FCThermo1410101
PBS SolarbioP1020
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100XBeyotimeC0222
Trójokularowy mikroskop żywych komórekMotic1.1001E+12
Zamrażarka ultraniskotemperaturowaHaireV118574
Płytka do liczenia komórek CK04 CO Thermo 51032872 DMEM basic(1X)Gibco C11995500BT FBS PAN do Pipety ciekłego azotu 17014392

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
  4. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  5. Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
  6. Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
  7. Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
  8. Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401(2022).
  9. Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
  10. He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
  11. Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
  12. Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
  13. An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
  14. Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
  15. Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
  16. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  17. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  18. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).
  19. Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
  20. Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).
  21. Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
  22. Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
  23. Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
  24. Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
  26. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  27. Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
  28. Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
  29. Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).
  30. Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
  31. Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
  32. Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
  33. Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312(2023).
  34. Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie 8 Oxo dGtraktowanie nadtlenkiem wodorudetekcja uszkodze DNAtest ywotno ci kom rekmarker stresu oksydacyjnegosandwich ELISAmarker uszkodze DNA

Powiązane artykuły