Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66899

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Streszczenie

Nadzór środowiskowy jest uznawany za ważne narzędzie do oceny zdrowia publicznego w erze postpandemicznej. Woda, a w szczególności ścieki, stała się źródłem z wyboru do pobierania próbek obciążeń patogenami w środowisku. Ścieki z otwartych kanalizacji i komunalnych oczyszczalni ścieków są rezerwuarem zarówno patogenów, jak i genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) i często mają kontakt z ludźmi. Chociaż istnieje wiele metod śledzenia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w wodzie, wyizolowanie dobrej jakości DNA z wysoką wydajnością z niejednorodnych próbek pozostaje wyzwaniem. Aby to skompensować, często konieczne jest stosowanie dużych ilości próbek, co stwarza praktyczne ograniczenia. Ponadto DNA środowiskowe jest często fragmentaryzowane, a źródłem AMR (plazmidy, fagi, liniowe DNA) jest DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Jednak niewiele procesów ekstrakcji koncentrowało się na metodach wysokowydajnej ekstrakcji liniowego i niskocząsteczkowego DNA. W tym artykule przedstawiono prostą metodę wysokowydajnej liniowej ekstrakcji DNA z małych objętości ścieków przy użyciu właściwości strącania glikolu polietylenowego (PEG). Badanie to przemawia za zwiększeniem ogólnej wydajności DNA z próbek wody pobranych do analiz metagenomicznych poprzez wzbogacenie proporcji liniowego DNA. Ponadto ulepszenie DNA o niskiej masie cząsteczkowej pozwala przezwyciężyć obecny problem niedostatecznego próbkowania środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe ze względu na skupienie się na DNA o wysokiej masie cząsteczkowej i wewnątrzkomórkowym. Oczekuje się, że metoda ta będzie szczególnie przydatna, gdy istnieje zewnątrzkomórkowe DNA, ale w niskich stężeniach, na przykład w przypadku ścieków z oczyszczalni ścieków. Powinno to również usprawnić pobieranie próbek środowiskowych fragmentów genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, które rozprzestrzeniają się w drodze horyzontalnego transferu genów.

Wprowadzenie

SARS-CoV-2 i jego następstwa podkreśliły znaczenie nadzoru środowiskowego w monitorowaniu i przewidywaniu ognisk chorób zakaźnych1,2. Podczas gdy pandemie wirusowe są oczywiste, wzrost oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) jest często opisywany jako podstępna pandemia, która stanowi główny problem zdrowia publicznego na całym świecie3,4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania skoordynowanych strategii, aby zrozumieć ewolucję i rozprzestrzenianie się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Zbiorniki wodne, a także ścieki, mogą służyć jako zbiorniki zarówno dla patogenów, jak i AMR5,6,7,8. Wspólne źródła wody są zatem silnym źródłem przenoszenia chorób wśród ludzi, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), gdzie zła higiena i przeludnienie idą w parze9,10,11. Testowanie źródeł wody jest od dawna stosowane do oceny stanu zdrowia społeczności12,13,14. Ostatnio ścieki z miejskich oczyszczalni ścieków okazały się dobrym wskaźnikiem zaawansowania przypadków COVID w klinice1,2,15,16,17,18.

W porównaniu z monitorowaniem konkretnych chorób, wykrywanie i śledzenie AMR w środowisku stanowi bardziej złożony problem. Duża liczba stosowanych antybiotyków, zróżnicowane geny oporności, różne lokalne naciski selekcyjne i horyzontalny transfer genów między bakteriami utrudniają ocenę rzeczywistego obciążenia opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, a po dokonaniu oceny skorelowanie go z obserwacjami klinicznymi19,20,21,22. W rezultacie, podczas gdy skoordynowany nadzór nad klinicznym opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe jest prowadzony przez kilka organizacji na całym świecie3,23,24, monitorowanie środowiskowego AMR jest wciąż w powijakach, przejrzane w19,25,26.

W ostatnich latach zgłoszono różne metody śledzenia środowiskowego AMR5,27, sprawdzone w28,29. Punktem wyjścia dla większości z nich jest ekstrakcja dobrej jakości DNA z heterogenicznych próbek środowiskowych, co samo w sobie jest wyzwaniem. Ponadto DNA środowiskowe jest zazwyczaj fragmentowane z powodu ekspozycji na wrogie otoczenie. Fragmentaryczne zewnątrzkomórkowe DNA od dawna jest uznawane za ważny rezerwuar genów oporności na środki odporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (recenzja w30,31,32), z dodatkowym potencjałem do wchodzenia i opuszczania bakterii poprzez horyzontalny transfer genów. Dlatego ważne jest, aby każdy protokół, który ma na celu pomiar obciążenia opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe w środowisku, jak najlepiej pobierał próbki DNA o liniowej i niskiej masie cząsteczkowej. Co zaskakujące, niewiele uwagi poświęcono opracowaniu metod specyficznych dla wysokowydajnej ekstrakcji liniowego i niskocząsteczkowego DNA: niniejsza praca koncentruje się na wypełnieniu tej luki.

Powszechną i prostą metodą wytrącania DNA jest połączenie glikolu polietylenowego (PEG) i soli, takich jak chlorek sodu (NaCl)33. PEG jest makromolekularnym środkiem tłumiącym używanym do osiągania specyficznego dla wielkości wytrącania fragmentów DNA34,35. Im niższe stężenie PEG, tym większa masa cząsteczkowa DNA, które można skutecznie wytrącić. W wielu badaniach wykorzystano PEG podczas ekstrakcji środowiskowej DNA i RNA1,2 (podsumowane w Tabeli 117,33,36,37,38,39) albo w ostatnim kroku 33,36,37lub do koncentracji dużych próbek wody w celu ekstrakcji cząstek wirusa, jak w przypadku SARS-CoV-215,40. W obecnej pracy stwierdzono, że stężenia PEG stosowane wcześniej do ekstrakcji środowiskowego DNA (w dużej mierze determinowane przez protokoły nadzoru wirusów) nie wychwytują liniowego DNA o niskiej masie cząsteczkowej. W związku z tym tracą one możliwość pobierania próbek krótkich fragmentów DNA i nie nadają się do dokładnej oceny zawartości oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W badaniu wykorzystano właściwości glikolu polietylenowego i chlorku sodu, aby skutecznie wytrącić liniowe fragmenty DNA o niskiej masie cząsteczkowej z wysoką wydajnością, która może w przyszłości doprowadzić do opracowania opłacalnej metody ekstrakcji DNA. Metodę tę można wykorzystać do wzbogacenia proporcji rozdrobnionego i drobnocząsteczkowego DNA ze złożonych próbek naturalnych, uzyskując w ten sposób dokładniejszy obraz środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przy niewielkim udoskonaleniu technika ta nadaje się do łatwego i taniego zastosowania przez lokalne korporacje komunalne i inne organy rządowe do wykorzystania jako narzędzie nadzoru przy minimalnym przeszkoleniu technicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek ścieków

  1. Zanurz zlewkę polipropylenową o pojemności 500 ml w otwartym zbiorniku odpływowym lub oczyszczalni ścieków (STP) i zbierz ~300 ml próbki ścieków.
  2. Przenieś ~250 ml próbki do 250 ml autoklawowanej butelki polipropylenowej.
  3. Zakręć nakrętkę butelki i zamknij ją plastikową folią. Trzymaj butelkę pionowo w zamkniętej torbie.
  4. Próbkę należy transportować w pozycji pionowej w zamkniętym pojemniku w temperaturze otoczenia.
  5. Inaktywować próbkę na gorąco w temperaturze 70 °C w piecu z gorącym powietrzem przez 4 godziny przed przetworzeniem jej do ekstrakcji DNA.

2. Ekstrakcja DNA z próbek ścieków

  1. Po schłodzeniu próbki ścieków należy rozdmuchiwać próbki z maksymalną prędkością i pozostawić zanieczyszczenia/szlam do opadnięcia.
  2. Zdekantować 27,5 ml ścieków do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i dodać do nich 13,5 g PEG-8000 (stężenie końcowe 30%) i 3 g NaCl (stężenie końcowe 1,2 M) i dobrze wymieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Inkubować próbkę przez noc (~16-18 h) w temperaturze 4 °C.
  4. Odwirować próbkę o sile 15 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: PEG-8000 przy 30% jest bardzo lepki, a osad może zostać przemieszczony podczas wyrzucania supernatantu. Supernatant należy dekantować powoli i ostrożnie, aby upewnić się, że osad nie zostanie utracony. Kroki od 2.6 do 2.23 są wykonywane przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA z gleby zgodnie z instrukcją zestawu z kilkoma modyfikacjami.
  6. Rozpuścić osad w 800 μl roztworu do lizy z zestawu i dodać roztwór do wymieszanej probówki z kulkami cyrkonowymi.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania większych objętości należy zebrać granulki z żądanej liczby probówek. Na przykład, jeśli przetwarzasz 160 ml próbki; będą cztery probówki o pojemności 50 ml zawierające ścieki z PEG i NaCl. Po odwirowaniu wszystkich czterech probówek w temperaturze 15 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut, odrzucić supernatant ze wszystkich czterech probówek. Dodaj 200 μl roztworu CD1 do każdego, ponownie zawiesić granulki i zebrać je razem w jednej probówce z kulkami.
  7. Przymocuj rurkę koralików poziomo na wirze. Obracaj rurkę z maksymalną prędkością przez 20-30 min.
    UWAGA: Przedłużone wirowanie zapewnia całkowitą lizę i homogenizację próbek, co poprawia wydajność DNA.
  8. Wirować probówki o pojemności 8 000 x g przez 15 sekund, aby osadzać kulki na dnie, usunąć spienianie i całkowicie przenieść supernatant z probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Niektóre koraliki mogą również zostać przeniesione na tym etapie.
  9. Odwirować stężenie sklaratu 15 000 x g przez 1 minutę.
  10. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Supernatant może nadal zawierać pewne zawieszone cząstki.
  11. Dodać 200 μl roztworu strącającego i wirować z maksymalną prędkością przez 5 s. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min.
    UWAGA: Inkubacja w temperaturze 4 °C zwiększa efektywność wytrącania białek i szczątków komórkowych, podczas gdy DNA pozostaje w roztworze. Możliwe jest wstrzymanie protokołu na tym etapie na okres do 2 godzin bez znaczącego spadku wydajności i jakości wyekstrahowanego DNA.
  12. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT). Unikać osadu i przenieść klarowny supernatant do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  13. Dodać 600 μl buforu wiążącego na 700 μl supernatantu i wirować z maksymalną prędkością przez 5 s.
  14. Załadować 700 μl lizatu na kolumnę wirową krzemionki, inkubować przez 2 minuty i odwirować przy 15 000 x g przez 1 min.
    UWAGA: Inkubacja lizatu na kolumnie krzemionkowej zwiększa wiązanie DNA z kolumną, co skutkuje lepszą wydajnością DNA.
  15. Odrzucić przepływ i powtarzać krok 2.14, aż cały lizat przejdzie przez kolumnę wirową.
  16. Ostrożnie umieść kolumnę wirującą w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Upewnij się, że żaden przepływ nie został rozpryskiwany na kolumnę wirującą.
  17. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny wirowej i odwirować kolumnę wirową przy 15 000 x g przez 1 min.
  18. Odrzucić przepływowy płyn i umieścić kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  19. Dodać 500 μl buforu do płukania etanolem do kolumny wirowej. Wirować przy 15 000 x g przez 1 min.
  20. Wyrzuć przepływowy płyn i umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  21. Wirować przy 16 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia resztek etanolu. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce o pojemności 1.5 ml.
  22. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (wstępnie podgrzanego do 55 °C) do środka białej membrany filtracyjnej i inkubować przez 5 min.
    UWAGA: Podgrzany bufor elucyjny, wraz z inkubacją na błonie, zwiększa skuteczność elucji DNA, zwłaszcza DNA o dużej masie cząsteczkowej.
  23. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić kolumnę wirową.
  24. Do eluowanego DNA dodać 10 μl 3 M NaCl (1/10 objętości eluatu DNA) i 250 μl schłodzonego absolutnego etanolu (2,5 objętości eluatu DNA). Odwróć, aby dobrze wymieszać i odwiruj zawartość przy 8 000 x g przez 15 s.
  25. Inkubować mieszaninę DNA i etanolu w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Inkubację mieszaniny DNA-etanol można zwiększyć do 16 godzin bez znaczącego spadku wydajności lub jakości wyekstrahowanego DNA.
  26. Odwirować w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  27. Do granulatu dodać 500 μl schłodzonego 70% etanolu.
  28. Odwirować w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  29. Odwróć i delikatnie postukaj tubką w bibułkę, aby usunąć resztki etanolu poprzez działanie kapilarne.
  30. Całkowicie wysuszyć osad DNA, trzymając probówki otwarte na bloku grzewczym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż cały etanol odparuje.
  31. Ponownie zawiesić osad DNA w 30-50 μl autoklawowanej podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
  32. Wiruj DNA przy 8,000 x g przez 15 s.
  33. Wybierz aplikację dsDNA w ustawieniach Kwasy nukleinowe w spektrofotometrze Nanodrop.
    1. Wyczyść cokół niestrzępiącą się bibułką i wodą. Użyj ddH2O, aby wyzerować instrument, a następnie załaduj 2 μl próbki DNA na cokół
      2. .
    2. Zmierzyć proporcje stężenia i absorbancji (A260/280 i A260/230) w celu określenia czystości.
  34. Przechowywać próbkę DNA w temperaturze -20 °C.

3. Wytrącanie liniowego DNA amplifikowanego reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) w celu sprawdzenia odzysku DNA w zakresie mas cząsteczkowych

  1. Wykorzystując genomowe DNA z E. coli MG155, amplifikuj fragmenty genów metodą PCR, aby wygenerować pulę liniowych fragmentów z następujących genów: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (patrz tabela 2 dla sekwencji starterów i warunków PCR).
  2. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i połącz produkty PCR razem.
  3. Podziel zebrane amplikony na probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml o równych objętościach - oznacz jedną probówkę jako "Wejściowe DNA".
  4. Dodać PEG i NaCl zgodnie z pożądanymi warunkami (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) do każdej z probówek z wyjątkiem tej oznaczonej jako "Wejściowe DNA" i uzupełnić końcową objętość do 1 ml.
  5. Inkubować probówki przez noc (~16-18 h) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przez resztę etapów do 3.16, "Wejściowe DNA" jest przechowywane w lodówce w niezmienionej postaci.
  6. Wirować probówki w mikrowirówce stołowej zgodnie z żądaną prędkością (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  7. Ostrożnie usunąć 900 μl supernatantu ze strony przeciwnej do osadu za pomocą mikropipety.
  8. Pierwsze mycie etanolem: Dodaj 900 μl schłodzonego 70% etanolu do granulatu i wymieszaj, delikatnie odwracając rurki.
  9. Obracać probówki z tą samą prędkością, co w kroku 3.6 (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Usunąć supernatant przez dekantację.
  11. Drugie płukanie etanolem: Do granulatu dodać 500 μl schłodzonego 70% etanolu.
  12. Wirować probówki z taką samą prędkością, jak w kroku 3.6 (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  13. Odwróć i delikatnie postukaj tubką w bibułkę, aby usunąć resztki etanolu poprzez działanie kapilarne.
  14. Całkowicie wysuszyć osad DNA, trzymając probówki otwarte na bloku grzewczym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż cały etanol odparuje.
  15. Ponownie zawiesić osad w 20 μl autoklawowanej podwójnie destylowanej wody.
  16. Zmierzyć stężenie DNA wytrąconego w różnych warunkach i "wejściowego DNA" za pomocą spektrofotometru Nanodrop lub fluorometru.
  17. Załaduj wytrącone DNA na 1% żel agarozowy w celu wizualizacji DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowanie protokołu wysokowydajnej ekstrakcji DNA z próbek ścieków
Do ekstrakcji wysokiej jakości DNA i RNA z próbek wody zastosowano zmodyfikowaną wersję wcześniej opracowanych protokołów17. Próbki pobrano z otwartych kanałów ściekowych oraz z oczyszczalni ścieków w regionie Delhi-NCR w północnych Indiach. Po wstępnym przetwarzaniu z użyciem PEG i NaCl (Rysunek 1), próbki poddano ekstrakcji przy użyciu zestawów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe jest obecnie jednym z 10 największych zagrożeń dla zdrowia, wymienionych przez WHO, a nadzór środowiskowy nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe jest uznawany za ważne narzędzie na całym świecie. Jak wspomniano we wprowadzeniu, obszerny zapis środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe obejmuje DNA o niskiej masie cząsteczkowej, fragmentaryczne i zewnątrzkomórkowe. Opisany tutaj protokół wstępnego przetwarzania wykorzystujący wysokie stężenie PEG w połączen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Fundacji Rockefellera (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) jako część zespołu APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Wyrażamy również uznanie dla pomocy finansowej udzielonej przez Axis Bank we wspieraniu tych badań oraz Trivedi School of Biosciences na Uniwersytecie Ashoka w zakresie sprzętu i innego wsparcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrowirówka 24-miejscowaEppendorf Wirówka 5425 REP5406000046
Absolutny etanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Absolut etanolu do analizy)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Wirówka stołowa z chłodzeniemWirówka Eppendorf 5920 REP5948000131
System obrazowania ChemiDocZestaw BioRad12003153
DNeasy PowerSoil ProQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTP (dNTP Mix 10 mM każdy, 0,2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
Polimeraza DNA DreamTaq, 5 U/&mikro; L + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR probówki 0,2 mlTarsons510051
Woda klasy biologii molekularnej do PCRHiMediaML065-1,5ML
NanoDrop OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo Scientific 13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Zestaw do czyszczenia żeluQiagen28506
Fluorometr Qubit 4 (z WiFi)ThermofisherQ33238
Probówki do testów kubitowychThermofisherQ32856
Zestaw odczynników Qubitt do ds DNA, szeroki zakresThermo ScientificQ32853 (500 testów)
Chlorek soduHiMediaTC046M-500G
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNATermocykler InvitrogenS33102
T100BioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-dołkowy system PCR)Applied Biosystems4484073
Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNAPromegaA1125

Bibliografia

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ekstrakcja DNA ze ściekówgeny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowenadzór środowiskowywytrącanie glikolem polietylenowymhoryzontalny transfer genówanaliza metagenomicznaoczyszczanie DNAzewnątrzkomórkowe DNAspektrofotometria Nanodrop
Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.