Artykuł metodologiczny

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66899

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Streszczenie

Nadzór środowiskowy jest uznawany za ważne narzędzie do oceny zdrowia publicznego w erze postpandemicznej. Woda, a w szczególności ścieki, stała się źródłem z wyboru do pobierania próbek obciążeń patogenami w środowisku. Ścieki z otwartych kanalizacji i komunalnych oczyszczalni ścieków są rezerwuarem zarówno patogenów, jak i genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) i często mają kontakt z ludźmi. Chociaż istnieje wiele metod śledzenia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w wodzie, wyizolowanie dobrej jakości DNA z wysoką wydajnością z niejednorodnych próbek pozostaje wyzwaniem. Aby to skompensować, często konieczne jest stosowanie dużych ilości próbek, co stwarza praktyczne ograniczenia. Ponadto DNA środowiskowe jest często fragmentaryzowane, a źródłem AMR (plazmidy, fagi, liniowe DNA) jest DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Jednak niewiele procesów ekstrakcji koncentrowało się na metodach wysokowydajnej ekstrakcji liniowego i niskocząsteczkowego DNA. W tym artykule przedstawiono prostą metodę wysokowydajnej liniowej ekstrakcji DNA z małych objętości ścieków przy użyciu właściwości strącania glikolu polietylenowego (PEG). Badanie to przemawia za zwiększeniem ogólnej wydajności DNA z próbek wody pobranych do analiz metagenomicznych poprzez wzbogacenie proporcji liniowego DNA. Ponadto ulepszenie DNA o niskiej masie cząsteczkowej pozwala przezwyciężyć obecny problem niedostatecznego próbkowania środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe ze względu na skupienie się na DNA o wysokiej masie cząsteczkowej i wewnątrzkomórkowym. Oczekuje się, że metoda ta będzie szczególnie przydatna, gdy istnieje zewnątrzkomórkowe DNA, ale w niskich stężeniach, na przykład w przypadku ścieków z oczyszczalni ścieków. Powinno to również usprawnić pobieranie próbek środowiskowych fragmentów genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, które rozprzestrzeniają się w drodze horyzontalnego transferu genów.

Wprowadzenie

SARS-CoV-2 i jego następstwa podkreśliły znaczenie nadzoru środowiskowego w monitorowaniu i przewidywaniu ognisk chorób zakaźnych1,2. Podczas gdy pandemie wirusowe są oczywiste, wzrost oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) jest często opisywany jako podstępna pandemia, która stanowi główny problem zdrowia publicznego na całym świecie3,4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania skoordynowanych strategii, aby zrozumieć ewolucję i rozprzestrzenianie się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Zbiorniki wodne, a także ścieki, mogą służyć jako zbiorniki zarówno dla patogenów, jak i AMR5,6,7,8. Wspólne źródła wody są zatem silnym źródłem przenoszenia chorób wśród ludzi, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), gdzie zła higiena i przeludnienie idą w parze9,10,11. Testowanie źródeł wody jest od dawna stosowane do oceny stanu zdrowia społeczności12,13,14. Ostatnio ścieki z miejskich oczyszczalni ścieków okazały się dobrym wskaźnikiem zaawansowania przypadków COVID w klinice1,2,15,16,17,18.

W porównaniu z monitorowaniem konkretnych chorób, wykrywanie i śledzenie AMR w środowisku stanowi bardziej złożony problem. Duża liczba stosowanych antybiotyków, zróżnicowane geny oporności, różne lokalne naciski selekcyjne i horyzontalny transfer genów między bakteriami utrudniają ocenę rzeczywistego obciążenia opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, a po dokonaniu oceny skorelowanie go z obserwacjami klinicznymi19,20,21,22. W rezultacie, podczas gdy skoordynowany nadzór nad klinicznym opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe jest prowadzony przez kilka organizacji na całym świecie3,23,24, monitorowanie środowiskowego AMR jest wciąż w powijakach, przejrzane w19,25,26.

W ostatnich latach zgłoszono różne metody śledzenia środowiskowego AMR5,27, sprawdzone w28,29. Punktem wyjścia dla większości z nich jest ekstrakcja dobrej jakości DNA z heterogenicznych próbek środowiskowych, co samo w sobie jest wyzwaniem. Ponadto DNA środowiskowe jest zazwyczaj fragmentowane z powodu ekspozycji na wrogie otoczenie. Fragmentaryczne zewnątrzkomórkowe DNA od dawna jest uznawane za ważny rezerwuar genów oporności na środki odporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (recenzja w30,31,32), z dodatkowym potencjałem do wchodzenia i opuszczania bakterii poprzez horyzontalny transfer genów. Dlatego ważne jest, aby każdy protokół, który ma na celu pomiar obciążenia opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe w środowisku, jak najlepiej pobierał próbki DNA o liniowej i niskiej masie cząsteczkowej. Co zaskakujące, niewiele uwagi poświęcono opracowaniu metod specyficznych dla wysokowydajnej ekstrakcji liniowego i niskocząsteczkowego DNA: niniejsza praca koncentruje się na wypełnieniu tej luki.

Powszechną i prostą metodą wytrącania DNA jest połączenie glikolu polietylenowego (PEG) i soli, takich jak chlorek sodu (NaCl)33. PEG jest makromolekularnym środkiem tłumiącym używanym do osiągania specyficznego dla wielkości wytrącania fragmentów DNA34,35. Im niższe stężenie PEG, tym większa masa cząsteczkowa DNA, które można skutecznie wytrącić. W wielu badaniach wykorzystano PEG podczas ekstrakcji środowiskowej DNA i RNA1,2 (podsumowane w Tabeli 117,33,36,37,38,39) albo w ostatnim kroku 33,36,37lub do koncentracji dużych próbek wody w celu ekstrakcji cząstek wirusa, jak w przypadku SARS-CoV-215,40. W obecnej pracy stwierdzono, że stężenia PEG stosowane wcześniej do ekstrakcji środowiskowego DNA (w dużej mierze determinowane przez protokoły nadzoru wirusów) nie wychwytują liniowego DNA o niskiej masie cząsteczkowej. W związku z tym tracą one możliwość pobierania próbek krótkich fragmentów DNA i nie nadają się do dokładnej oceny zawartości oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W badaniu wykorzystano właściwości glikolu polietylenowego i chlorku sodu, aby skutecznie wytrącić liniowe fragmenty DNA o niskiej masie cząsteczkowej z wysoką wydajnością, która może w przyszłości doprowadzić do opracowania opłacalnej metody ekstrakcji DNA. Metodę tę można wykorzystać do wzbogacenia proporcji rozdrobnionego i drobnocząsteczkowego DNA ze złożonych próbek naturalnych, uzyskując w ten sposób dokładniejszy obraz środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przy niewielkim udoskonaleniu technika ta nadaje się do łatwego i taniego zastosowania przez lokalne korporacje komunalne i inne organy rządowe do wykorzystania jako narzędzie nadzoru przy minimalnym przeszkoleniu technicznym.

Protokół

1. Pobieranie próbek ścieków

  1. Zanurz zlewkę polipropylenową o pojemności 500 ml w otwartym zbiorniku odpływowym lub oczyszczalni ścieków (STP) i zbierz ~300 ml próbki ścieków.
  2. Przenieś ~250 ml próbki do 250 ml autoklawowanej butelki polipropylenowej.
  3. Zakręć nakrętkę butelki i zamknij ją plastikową folią. Trzymaj butelkę pionowo w zamkniętej torbie.
  4. Próbkę należy transportować w pozycji pionowej w zamkniętym pojemniku w temperaturze otoczenia.
  5. Inaktywować próbkę na gorąco w temperaturze 70 °C w piecu z gorącym powietrzem przez 4 godziny przed przetworzeniem jej do ekstrakcji DNA.

2. Ekstrakcja DNA z próbek ścieków

  1. Po schłodzeniu próbki ścieków należy rozdmuchiwać próbki z maksymalną prędkością i pozostawić zanieczyszczenia/szlam do opadnięcia.
  2. Zdekantować 27,5 ml ścieków do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i dodać do nich 13,5 g PEG-8000 (stężenie końcowe 30%) i 3 g NaCl (stężenie końcowe 1,2 M) i dobrze wymieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Inkubować próbkę przez noc (~16-18 h) w temperaturze 4 °C.
  4. Odwirować próbkę o sile 15 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: PEG-8000 przy 30% jest bardzo lepki, a osad może zostać przemieszczony podczas wyrzucania supernatantu. Supernatant należy dekantować powoli i ostrożnie, aby upewnić się, że osad nie zostanie utracony. Kroki od 2.6 do 2.23 są wykonywane przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA z gleby zgodnie z instrukcją zestawu z kilkoma modyfikacjami.
  6. Rozpuścić osad w 800 μl roztworu do lizy z zestawu i dodać roztwór do wymieszanej probówki z kulkami cyrkonowymi.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania większych objętości należy zebrać granulki z żądanej liczby probówek. Na przykład, jeśli przetwarzasz 160 ml próbki; będą cztery probówki o pojemności 50 ml zawierające ścieki z PEG i NaCl. Po odwirowaniu wszystkich czterech probówek w temperaturze 15 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut, odrzucić supernatant ze wszystkich czterech probówek. Dodaj 200 μl roztworu CD1 do każdego, ponownie zawiesić granulki i zebrać je razem w jednej probówce z kulkami.
  7. Przymocuj rurkę koralików poziomo na wirze. Obracaj rurkę z maksymalną prędkością przez 20-30 min.
    UWAGA: Przedłużone wirowanie zapewnia całkowitą lizę i homogenizację próbek, co poprawia wydajność DNA.
  8. Wirować probówki o pojemności 8 000 x g przez 15 sekund, aby osadzać kulki na dnie, usunąć spienianie i całkowicie przenieść supernatant z probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Niektóre koraliki mogą również zostać przeniesione na tym etapie.
  9. Odwirować stężenie sklaratu 15 000 x g przez 1 minutę.
  10. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Supernatant może nadal zawierać pewne zawieszone cząstki.
  11. Dodać 200 μl roztworu strącającego i wirować z maksymalną prędkością przez 5 s. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min.
    UWAGA: Inkubacja w temperaturze 4 °C zwiększa efektywność wytrącania białek i szczątków komórkowych, podczas gdy DNA pozostaje w roztworze. Możliwe jest wstrzymanie protokołu na tym etapie na okres do 2 godzin bez znaczącego spadku wydajności i jakości wyekstrahowanego DNA.
  12. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT). Unikać osadu i przenieść klarowny supernatant do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  13. Dodać 600 μl buforu wiążącego na 700 μl supernatantu i wirować z maksymalną prędkością przez 5 s.
  14. Załadować 700 μl lizatu na kolumnę wirową krzemionki, inkubować przez 2 minuty i odwirować przy 15 000 x g przez 1 min.
    UWAGA: Inkubacja lizatu na kolumnie krzemionkowej zwiększa wiązanie DNA z kolumną, co skutkuje lepszą wydajnością DNA.
  15. Odrzucić przepływ i powtarzać krok 2.14, aż cały lizat przejdzie przez kolumnę wirową.
  16. Ostrożnie umieść kolumnę wirującą w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Upewnij się, że żaden przepływ nie został rozpryskiwany na kolumnę wirującą.
  17. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny wirowej i odwirować kolumnę wirową przy 15 000 x g przez 1 min.
  18. Odrzucić przepływowy płyn i umieścić kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  19. Dodać 500 μl buforu do płukania etanolem do kolumny wirowej. Wirować przy 15 000 x g przez 1 min.
  20. Wyrzuć przepływowy płyn i umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  21. Wirować przy 16 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia resztek etanolu. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce o pojemności 1.5 ml.
  22. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (wstępnie podgrzanego do 55 °C) do środka białej membrany filtracyjnej i inkubować przez 5 min.
    UWAGA: Podgrzany bufor elucyjny, wraz z inkubacją na błonie, zwiększa skuteczność elucji DNA, zwłaszcza DNA o dużej masie cząsteczkowej.
  23. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić kolumnę wirową.
  24. Do eluowanego DNA dodać 10 μl 3 M NaCl (1/10 objętości eluatu DNA) i 250 μl schłodzonego absolutnego etanolu (2,5 objętości eluatu DNA). Odwróć, aby dobrze wymieszać i odwiruj zawartość przy 8 000 x g przez 15 s.
  25. Inkubować mieszaninę DNA i etanolu w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Inkubację mieszaniny DNA-etanol można zwiększyć do 16 godzin bez znaczącego spadku wydajności lub jakości wyekstrahowanego DNA.
  26. Odwirować w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  27. Do granulatu dodać 500 μl schłodzonego 70% etanolu.
  28. Odwirować w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  29. Odwróć i delikatnie postukaj tubką w bibułkę, aby usunąć resztki etanolu poprzez działanie kapilarne.
  30. Całkowicie wysuszyć osad DNA, trzymając probówki otwarte na bloku grzewczym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż cały etanol odparuje.
  31. Ponownie zawiesić osad DNA w 30-50 μl autoklawowanej podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
  32. Wiruj DNA przy 8,000 x g przez 15 s.
  33. Wybierz aplikację dsDNA w ustawieniach Kwasy nukleinowe w spektrofotometrze Nanodrop.
    1. Wyczyść cokół niestrzępiącą się bibułką i wodą. Użyj ddH2O, aby wyzerować instrument, a następnie załaduj 2 μl próbki DNA na cokół
      2. .
    2. Zmierzyć proporcje stężenia i absorbancji (A260/280 i A260/230) w celu określenia czystości.
  34. Przechowywać próbkę DNA w temperaturze -20 °C.

3. Wytrącanie liniowego DNA amplifikowanego reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) w celu sprawdzenia odzysku DNA w zakresie mas cząsteczkowych

  1. Wykorzystując genomowe DNA z E. coli MG155, amplifikuj fragmenty genów metodą PCR, aby wygenerować pulę liniowych fragmentów z następujących genów: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (patrz tabela 2 dla sekwencji starterów i warunków PCR).
  2. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i połącz produkty PCR razem.
  3. Podziel zebrane amplikony na probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml o równych objętościach - oznacz jedną probówkę jako "Wejściowe DNA".
  4. Dodać PEG i NaCl zgodnie z pożądanymi warunkami (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) do każdej z probówek z wyjątkiem tej oznaczonej jako "Wejściowe DNA" i uzupełnić końcową objętość do 1 ml.
  5. Inkubować probówki przez noc (~16-18 h) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przez resztę etapów do 3.16, "Wejściowe DNA" jest przechowywane w lodówce w niezmienionej postaci.
  6. Wirować probówki w mikrowirówce stołowej zgodnie z żądaną prędkością (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  7. Ostrożnie usunąć 900 μl supernatantu ze strony przeciwnej do osadu za pomocą mikropipety.
  8. Pierwsze mycie etanolem: Dodaj 900 μl schłodzonego 70% etanolu do granulatu i wymieszaj, delikatnie odwracając rurki.
  9. Obracać probówki z tą samą prędkością, co w kroku 3.6 (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Usunąć supernatant przez dekantację.
  11. Drugie płukanie etanolem: Do granulatu dodać 500 μl schłodzonego 70% etanolu.
  12. Wirować probówki z taką samą prędkością, jak w kroku 3.6 (15 000 x g lub 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  13. Odwróć i delikatnie postukaj tubką w bibułkę, aby usunąć resztki etanolu poprzez działanie kapilarne.
  14. Całkowicie wysuszyć osad DNA, trzymając probówki otwarte na bloku grzewczym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż cały etanol odparuje.
  15. Ponownie zawiesić osad w 20 μl autoklawowanej podwójnie destylowanej wody.
  16. Zmierzyć stężenie DNA wytrąconego w różnych warunkach i "wejściowego DNA" za pomocą spektrofotometru Nanodrop lub fluorometru.
  17. Załaduj wytrącone DNA na 1% żel agarozowy w celu wizualizacji DNA.

Wyniki

Opracowanie protokołu wysokowydajnej ekstrakcji DNA z próbek ścieków
Do ekstrakcji wysokiej jakości DNA i RNA z próbek wody zastosowano zmodyfikowaną wersję wcześniej opracowanych protokołów17. Próbki pobrano z otwartych kanałów ściekowych oraz z oczyszczalni ścieków w regionie Delhi-NCR w północnych Indiach. Po wstępnym przetwarzaniu z użyciem PEG i NaCl (Rysunek 1), próbki poddano ekstrakcji przy użyciu zestawów do izolacji DNA z gleby oraz wody. We wszystkich przypadkach zaobserwowano wyraźny prążek wysokocząsteczkowy, odpowiadający prawdopodobnie wewnątrzkomórkowemu DNA bakteryjnemu, oraz rozmycie w tle, co jest typowe dla próbek środowiskowych37, (Rysunek 2).

Brak wydajnej ekstrakcji DNA z odcieku z oczyszczalni ścieków (STP)
Mimo że z otwartych kanałów i dopływów do STP uzyskano zadowalającą wydajność całkowitego DNA (Tabela 3), nie udało się uzyskać żadnego DNA z końcowego oczyszczonego odcieku; problemy z niską wydajnością zostały opisane również w poprzednich pracach41 (Rycina 3). Po procesach oczyszczania, które obejmują chlorowanie ścieków, a w niektórych przypadkach zarówno naświetlanie UV, jak i ultrafiltrację42, spodziewa się niskiego obciążenia mikrobiologicznego, a wszelkie pozostałości DNA (składające się z DNA zewnątrzkomórkowego i pofragmentowanego) ulegają rozcieńczeniu. Początkowe niskie stężenie PEG użyte do zagęszczania próbek i precypitacji kwasów nukleinowych mogło potencjalnie wykluczyć DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Innymi słowy, pofragmentowane DNA mogło zostać utracone na początkowym etapie zagęszczania.

Zwiększenie stężeń PEG i NaCl prowadzi do wytrącenia DNA o niższej masie cząsteczkowej
Aby sprawdzić, czy zwiększenie stężenia PEG pomaga w wzbogaceniu frakcji DNA o niższej masie cząsteczkowej, przygotowano laboratoryjny standard fragmentów PCR o różnych długościach, tworząc zakres liniowych fragmentów DNA (Rysunek 4). Standard poddano czterem różnym warunkom wytrącania: 9% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (kombinacja pierwotna), 9% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (podniesienie tylko stężenia soli), 30% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (podniesienie tylko stężenia PEG) oraz 30% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (podniesienie stężenia soli i PEG). Warunki wybrano w oparciu o standardowy protokół stosowany w nadzorze nad SARS-CoV-217 oraz warunki opisane w badaniu nad modułowymi metodami ekstrakcji DNA z próbek środowiskowych33. Zastosowano dwie różne prędkości wirowania – 15 000 × g oraz 20 000 × g – w oparciu o wpływ różnych prędkości na sedymentację DNA43. Po zwiększeniu stężeń PEG i NaCl odpowiednio do 30% i 1,2 M, całkowity odzysk DNA wzrósł o około 70%, a fragmenty DNA o wielkości nawet 150 par zasad (bp) zostały skutecznie wytrącone (Rysunek 5). Różnica w prędkości wirowania nie miała dużego wpływu na wydajność (Rysunek 6A), co może wynikać z zastosowanego długiego czasu wirowania. Ponieważ całkowity odzysk DNA był niższy w pierwotnej kombinacji PEG/NaCl, możliwe było, że prążki o niższej masie cząsteczkowej, mimo obecności, znajdowały się w stężeniu poniżej granicy detekcji. Aby to sprawdzić, zwiększono ilość DNA wprowadzanego do procesu wytrącania, a na żel agarozowy w celu wizualizacji naniesiono nadmiar DNA odpowiadający każdej próbie (1,5 mg). Tylko w przypadku próby z 30% PEG uzyskano dobry odzysk prążka o najniższej masie cząsteczkowej, tj. 150 bp (Rysunek 6B).

Wytrącanie kolistego DNA (bakteryjnego DNA genomicznego i plazmidowego) nie wykazuje tej samej tendencji
Do wytrącania przy różnych stężeniach PEG i NaCl wykorzystano DNA genomiczne szczepu E. coli MG155 oraz plazmid (pRSV, ~4 kb). W przeciwieństwie do DNA liniowego, podniesienie poziomów PEG i NaCl nie miało istotnego wpływu (Rycina 7), co sugeruje, że wydajność odzysku kolistego i wysokocząsteczkowego DNA (typowego dla DNA wewnątrzkomórkowego) nie zmienia się wraz ze wzrostem stężenia PEG. Stoi to w sprzeczności z wcześniejszymi obserwacjami dotyczącymi wytrącania białek44, gdzie rozpuszczalność gwałtownie spadała wraz ze wzrostem stężenia PEG. Biorąc pod uwagę, że PEG działa jako czynnik zagęszczający (crowding agent), wysunięto hipotezę, że powierzchnia makrocząsteczki dostępna do oddziaływań odgrywa istotną rolę w jego skuteczności jako czynnika wytrącającego. W przypadku DNA liniowego można przypuszczać, że wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki zwiększa się również powierzchnia dostępna do oddziaływań. W przypadku DNA kolistego możliwe jest, że niskie stężenia PEG są już wystarczające do nasycenia cząsteczki, a dalsze zwiększanie stężenia może nie prowadzić do zwiększenia efektywnej powierzchni oddziaływań.

Niska wydajność izolacji DNA z wody ściekowej w przypadku pominięcia wstępnego przetwarzania poprzez precypitację z PEG i NaCl
Aby sprawdzić, czy wstępne przetwarzanie wody ściekowej jest kluczowe dla ekstrakcji DNA, 20 mL inaktywowanych termicznie (70 °C, 4 h) ścieków wzbogacono 10 mg wcześniej przygotowanego standardu liniowego i inkubowano przez noc w 4 °C (a) bez PEG + NaCl, (b) z 9% PEG + 0,3 M NaCl (oryginalna kombinacja) oraz (c) z 20% PEG + 1,2 M NaCl (zwiększona ilość PEG i soli). Próbki zostały następnie poddane ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do gleby, zgodnie z opisem w protokole. Stwierdzono, że wydajność ekstrahowanego DNA wzrasta o 60% przy wstępnym przetwarzaniu próbek ścieków z 9% PEG + 0,3 M NaCl w porównaniu do braku etapu wstępnego przetwarzania (Rycina 8), co wskazuje, że wstępna precypitacja z PEG i NaCl jest niezbędna do uzyskania wysokiej wydajności DNA z próbek ścieków. Warto również zauważyć, że choć całkowita wydajność DNA, w tym wysokocząsteczkowego DNA genomicznego (gDNA), jest niższa przy zastosowaniu wysokich stężeń PEG i soli do precypitacji, to wzbogacona zostaje frakcja DNA o niższej masie cząsteczkowej (Rycina 8). Spadek całkowitej wydajności przy zwiększeniu stężenia PEG i soli można przypisać wysokiej lepkości PEG, co może prowadzić do utraty osadu DNA podczas usuwania naddatku. Potwierdza to zasadność proponowanej etapowej metody ekstrakcji DNA (Rycina 9), w której w pierwszej kolejności można ekstrahować wysokocząsteczkowe DNA, stosując precypitację z niskim stężeniem PEG i NaCl, a otrzymany naddatek można poddać kolejnej rundzie wstępnego przetwarzania ze zwiększoną ilością PEG i NaCl, aby efektywnie wyekstrahować niskocząsteczkowe DNA, które nie uległo precypitacji w pierwszym etapie.

Schemat ekstrakcji DNA ze ścieków: sterylizacja, inkubacja z PEG/NaCl, wirowanie, wyniki elektroforezy.
Rysunek 1: Obróbka wstępna próbek ścieków. Schemat przedstawiający przebieg prac od pobrania próbek po ekstrakcję DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki elektroforezy żelowej; ekstrakcja DNA z miejsc ściekowych przy użyciu zestawów do gleby i wody; schemat, wykres.
Rycina 2: Typowy profil żelowy DNA wyekstrahowanego z próbek ścieków. Objętość 50-100 mL (zgodnie z oznaczeniem na rycinie) ścieków pobranych z różnych miejsc poddano inaktywacji termicznej poprzez inkubację w 70 °C przez 4 h. Następnie inkubowano je z 9% PEG i 0,3 M NaCl przez noc w 4 °C, a następnie poddano ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do gleby lub wody. Około 150 ng wyekstrahowanego całkowitego DNA naniesiono na 1% żel agarozowy wraz z markerem 1 kilo-pair (kb) i poddano elektroforezie (90 V, 30 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Tabela po prawej stronie szczegółowo opisuje źródła pobrania próbek, objętość przetworzonych ścieków oraz zestaw użyty do ekstrakcji DNA dla każdej ścieżki. (STP: Oczyszczalnia ścieków; UVR: Promieniowanie ultrafioletowe) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy dla zestawów do ekstrakcji DNA z gleby, wody i bakterii, drabinka, dopływ i odpływ z STP.
Rycina 3: Próbki odpływu z STP wykazują niską wydajność całkowitego DNA. Objętość 40 mL ścieków pobranych z dopływu i odpływu STP poddano inaktywacji termicznej poprzez inkubację w 70 °C przez 4 h. Następnie inkubowano je z 9% PEG i 0.3 M NaCl przez noc w 4 °C, a następnie poddano ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do gleby, wody lub zestawu do ekstrakcji bakteryjnego DNA genomicznego. Około 150 ng wyekstrahowanego całkowitego DNA naniesiono na 1% żel agarozowy wraz z markerem 1 kb i poddano elektroforezie (90 V, 30 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Stężenie wyekstrahowanego DNA w próbkach odpływu wynosiło poniżej 1 ng/mL ścieków, w związku z czym nie można go było zwizualizować. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy żelowej; prążki DNA dla fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16s rRNA, marR; drabinka wielkości.
Rysunek 4: Generowanie liniowego standardu wielkości DNA w celu przetestowania skuteczności wytrącania DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Pięć fragmentów DNA o różnych wielkościach zostało wygenerowanych poprzez amplifikację PCR z wykorzystaniem DNA genomowego E. coli (MG1655) jako matrycy oraz starterów i warunków opisanych w Tabeli 2. Oczyszczone DNA (~1 µg) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR naniesiono na 1% żel agarozy wraz z markerem 1 kb i poddano elektroforezie (90 V, 40 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Ścieżki są opisane nazwami genów, z których amplifikowano fragment, oraz oczekiwaną wielkością amplikonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Elektroforeza żelowa wykazująca rozdział DNA; drabinka, warunki PEG, NaCl; analiza prążków.
Rycina 5: DNA o niskiej masie cząsteczkowej jest skutecznie odzyskiwane tylko przy najwyższym (30%) stężeniu PEG. DNA wejściowe (3.34 µg) z wcześniej przygotowanego standardu wielkości zostało poddane działaniu różnych kombinacji PEG i NaCl, zgodnie z oznaczeniami na rycinie, a następnie wyekstrahowane zgodnie z opisem w protokole. Zastosowano prędkość wirowania 15,000 x g. W przypadku próbki Input (ścieżka 3) oraz 1.2 M NaCl + 30% PEG (ścieżka 7) na żel nałożono 0.8 µg DNA. W pozostałych przypadkach, ze względu na niską całkowitą wydajność, nałożono całkowitą ilość DNA wyekstrahowanego w 16 µL; jako marker wielkości nałożono drabinkę 1 kb na 1% żel agarozowy i przeprowadzono elektroforezę (80 V, 45 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Biała ramka wyróżnia najniższy prążek o wielkości 150 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy wykazujące rozdzielenie DNA przy różnych stężeniach PEG i NaCl.
Rysunek 6: Odzysk DNA o niskiej masie cząsteczkowej zależy od wysokiego stężenia PEG, a nie od wysokiego stężenia soli. (A) DNA wejściowe (14 µg) ze standardu wielkości poddano działaniu różnych kombinacji PEG i NaCl, zgodnie z oznaczeniami na rysunku, a następnie wyekstrahowano metodą precypitacji etanolem, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole. Prędkość wirowania wynosiła 15 000 x g oraz 20 000 x g, jak wskazano na rysunku. Całkowitą ilość DNA wejściowego i wyekstrahowanego DNA, wraz z markerem 1 kb, naniesiono na żel agarozowy 1% i poddano elektroforezie (90 V, 30 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. (B) DNA wejściowe (15,67 µg) z wcześniej przygotowanego standardu wielkości poddano działaniu różnych kombinacji PEG i NaCl, zgodnie z oznaczeniami na rysunku, a następnie wyekstrahowano zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole. Zastosowana prędkość wirowania wynosiła 15 000 x g. Do każdej studni naniesiono 1,5 µg wyekstrahowanego DNA, a jako marker wielkości naniesiono marker 1 kb na żel agarozowy 1% i poddano elektroforezie (80 V, 45 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Biała ramka wyróżnia najniższy prążek o wielkości 150 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat elektroforezy, rozdział plazmidowego DNA, gDNA E. coli, warianty PEG-NaCl, marker drabinkowy.
Rycina 7: Odzysk DNA genomicznego i DNA plazmidowego nie jest znacząco wpływany przez zwiększenie stężenia PEG i NaCl. DNA wejściowe (9 µg; 4,5 µg plazmidu i 4,5 µg DNA genomicznego) poddano działaniu różnych kombinacji PEG i NaCl, zgodnie z oznaczeniami na rycinie, a następnie wyekstrahowano zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole. Zastosowana prędkość wirowania wynosiła 15,000 x g. Całkowitą ilość DNA wejściowego i DNA wyekstrahowanego, wraz z markerem 1 kb, naniesiono na 1% żel agarozowy i poddano elektroforezie (90 V, 45 min). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Białe ramki wskazują DNA genomiczne i DNA plazmidowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy w żelu; rozdział DNA z gradientem PEG i NaCl; dołączona drabinka molekularna.
Rycina 8: Wytrącanie wstępne z użyciem PEG i NaCl jest kluczowe dla wysokowydajnej ekstrakcji DNA z wód ściekowych. Ścieki inaktywowane termicznie (70 °C, 4 h) (20 mL) wzbogacono 10 mg wcześniej przygotowanego standardu liniowego i inkubowano przez noc w 4 °C bez dodatku PEG i NaCl lub z różnymi stężeniami PEG i NaCl, zgodnie z oznaczeniami na rycinie. Następnie przeprowadzono ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu do gleby. Na żel agarozowy 1% naniesiono DNA wejściowe (4 µg) użyte do wzbogacania (ścieżka 1) oraz DNA wyekstrahowane (4 µg) po etapie wstępnego przetwarzania 9% PEG + 0.3 M NaCl (ścieżka 3). W pozostałych warunkach na żel naniesiono całą ilość wyekstrahowanego DNA ze względu na niską wydajność. Jako marker wielkości naniesiono również drabinkę 1 kb. Żel poddano elektroforezie (70 V, 2 h). DNA wizualizowano w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu barwnika SYBR SAFE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat ekstrakcji DNA; próbka ścieków, PEG-8000, NaCl, wirowanie, metoda fenolowo-chloroformowa.
Rycina 9: Proponowana etapowa metoda ekstrakcji DNA ze ścieków w celu wzbogacenia frakcji DNA o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej. Schemat blokowy przedstawiający dwuetapową metodę ekstrakcji DNA ze ścieków z początkowym etapem wstępnego przetwarzania z użyciem niskich stężeń PEG i NaCl. Nadosad z pierwszego etapu jest poddawany kolejnej rundzie wytrącania w ramach wstępnego przetwarzania ze zwiększoną ilością PEG i NaCl, aby efektywnie ekstrahować z ścieków zarówno DNA o wysokiej, jak i niskiej masie cząsteczkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1. Poprzednie zastosowanie PEG i NaCl w badaniach nad ekstrakcją DNA z próbek środowiskowych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2. Sekwencje starterów i warunki PCR do generowania standardów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3. Wydajność i jakość DNA uzyskanego z próbek ścieków w okresie dwóch miesięcy w 2023 roku. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe jest obecnie jednym z 10 największych zagrożeń dla zdrowia, wymienionych przez WHO, a nadzór środowiskowy nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe jest uznawany za ważne narzędzie na całym świecie. Jak wspomniano we wprowadzeniu, obszerny zapis środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe obejmuje DNA o niskiej masie cząsteczkowej, fragmentaryczne i zewnątrzkomórkowe. Opisany tutaj protokół wstępnego przetwarzania wykorzystujący wysokie stężenie PEG w połączeniu z solą (30% PEG i 1,2 M NaCl) osiąga ten wynik poprzez wzbogacenie proporcji DNA o niskiej masie cząsteczkowej bez wpływu na ekstrakcję frakcji o wyższej masie cząsteczkowej (głównie genomowego i plazmidowego DNA). Jest to przeciwieństwo wcześniejszych metod zagęszczania wykorzystujących protokoły o niższym PEG i bezpośrednie zestawy (bez wstępnego przetwarzania), które są kłopotliwe ze względu na konieczność przetwarzania dużych ilości. Wstępne przetwarzanie z niższymi stężeniami PEG było nieefektywne w odzyskiwaniu DNA o niskiej masie cząsteczkowej ("niskie" odnosi się tutaj do prążków DNA poniżej 600 pz). Gdy podczas wstępnego przetwarzania nie stosuje się PEG, ekstrakcja DNA jest słaba, co powoduje, że odzyskiwane jest tylko 10% wejściowego DNA, w przeciwieństwie do 70%, gdy stosuje się PEG i NaCl (ryc. 8). Oprócz dodania PEG i NaCl, kolejnym ważnym krokiem jest usunięcie pozostałości etanolu po ekstrakcji DNA z zestawu, aby uzyskać czyste DNA do dalszego przetwarzania. Ważne jest, aby określić początkową objętość wody potrzebną do uzyskania całkowitej ilości co najmniej ~ 300 ng do 5 mg DNA w objętości 30-50 ml po elucji. W przeciwieństwie do 1 l lub więcej wody, która jest zwykle przetwarzana do ekstrakcji DNA ze ścieków27,41, stwierdzono, że przy proponowanym tutaj etapie wstępnego przetwarzania, zaledwie 27,5-40 ml wystarczy, aby uzyskać wysokiej jakości DNA do dalszego przetwarzania. Ścieki zawierają również cząstki stałe i materię organiczną, która może zawierać zaadsorbowane komórki bakteryjne i zewnątrzkomórkowe DNA. W związku z tym desorpcja komórek i DNA, której towarzyszy liza komórek, jest ważnym krokiem w kierunku zwiększenia wydajności DNA. Wysokie stężenia PEG sprawiają, że próbka jest lepka i może utrudniać etapy lizy i desorpcji ekstrakcji DNA, jak wspomniano wcześniej. Aby tego uniknąć, zaproponowano stopniową metodę ekstrakcji DNA, jak przedstawiono na schemacie blokowym (ryc. 9). Metoda ta będzie pomocna w ekstrakcji zarówno wewnątrzkomórkowego DNA o dużej masie cząsteczkowej (ryc. 7), jak i zewnątrzkomórkowego DNA o niskiej masie cząsteczkowej fragmentowanego i kolistego.

Jednym z obecnych ograniczeń tego protokołu pod względem kosztów jest ciągłe przetwarzanie wzbogaconego DNA o niskiej masie cząsteczkowej za pomocą zestawu w celu poprawy jakości. To ograniczenie można potencjalnie ominąć za pomocą innych metod oczyszczania DNA, takich jak ekstrakcja fenolowo-chloroformowa. Innym praktycznym ograniczeniem jest radzenie sobie z wysokimi stężeniami PEG, ponieważ granulat może zostać utracony z powodu wysokiej lepkości roztworu. Obecnie przeprowadza się wstępne przetwarzanie przy użyciu PEG i NaCl, po którym następuje zmodyfikowana wersja istniejącego protokołu zestawu, tj. zestaw jest nadal używany do końcowego oczyszczania DNA. Oczyszczanie DNA bez użycia zestawów, które daje wysoką wydajność DNA, ale o niskiej czystości (nie zgłoszonej tutaj), jest optymalizowane w celu poprawy jakości wyekstrahowanego DNA. Ze względu na lepki charakter roztworów PEG, należy dążyć do uzyskania optymalnego stężenia PEG, które może dać pełny zakres rozmiarów DNA, a jednocześnie być wygodnie obsługiwanym. Obniżenie stężenia do 20% (ryc. 6B) pozwoliło uzyskać wynik pośredni w stosunku do wydajności ekstrakcji niskiego (9%) i wysokiego (30%) PEG; Być może warto podjąć działania następcze w przyszłych pracach.

PEG jest rutynowo stosowany podczas różnych etapów ekstrakcji DNA z próbek środowiskowych. Jednak stosowanie PEG nie zostało ustandaryzowane do ekstrakcji DNA w kontekście nadzoru nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Nadzór nad ściekami polega na wykrywaniu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w wielu różnych niszach, w tym w STP (dopływ i ścieki) oraz otwartych i zamkniętych odpływach 8,27. Podczas gdy informacje na temat oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w dopływie dostarczają kluczowych informacji na temat oporności krążącej w społeczności, obecność genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w ściekach jest równie ważna dla pomiaru i potencjalnego przewidywania pojawienia się ognisk oporności. Próbki ścieków mają zazwyczaj niskie obciążenie mikrobiologiczne, ponieważ większość komórek jest zabijana podczas procesu oczyszczania, co skutkuje bardzo niską wydajnością komórkowego DNA. Jednak ścieki zawierają zewnątrzkomórkowe, swobodnie pływające DNA, składające się zarówno z genomowego DNA o dużej masie cząsteczkowej, jak i plazmidu o niskiej masie cząsteczkowej, fagimidów i fragmentarycznego DNA. Geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe obecne w DNA o niskiej masie cząsteczkowej (zarówno fragmentarycznej, jak i plazmidowej/fagowej) mogą zostać przeniesione do pozostałych żywych komórek w ściekach, prowadząc do rozprzestrzeniania się oporności 30,41,45. Dlatego ważne jest, aby wykrywać zewnątrzkomórkowe DNA o niskiej masie cząsteczkowej w ściekach. Inne metody stosowane do ekstrakcji DNA ze ścieków podczas oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe zazwyczaj nie zapewniają wstępnego wzbogacenia DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Takie podejście do ekstrakcji DNA ze ścieków może być wykorzystane do dostarczenia informacji o kompleksowym rezystomie środowiska.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Fundacji Rockefellera (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) jako część zespołu APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Wyrażamy również uznanie dla pomocy finansowej udzielonej przez Axis Bank we wspieraniu tych badań oraz Trivedi School of Biosciences na Uniwersytecie Ashoka w zakresie sprzętu i innego wsparcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrowirówka 24-miejscowaEppendorf Wirówka 5425 REP5406000046
Absolutny etanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Absolut etanolu do analizy)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Wirówka stołowa z chłodzeniemWirówka Eppendorf 5920 REP5948000131
System obrazowania ChemiDocZestaw BioRad12003153
DNeasy PowerSoil ProQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTP (dNTP Mix 10 mM każdy, 0,2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
Polimeraza DNA DreamTaq, 5 U/&mikro; L + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR probówki 0,2 mlTarsons510051
Woda klasy biologii molekularnej do PCRHiMediaML065-1,5ML
NanoDrop OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo Scientific 13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Zestaw do czyszczenia żeluQiagen28506
Fluorometr Qubit 4 (z WiFi)ThermofisherQ33238
Probówki do testów kubitowychThermofisherQ32856
Zestaw odczynników Qubitt do ds DNA, szeroki zakresThermo ScientificQ32853 (500 testów)
Chlorek soduHiMediaTC046M-500G
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNATermocykler InvitrogenS33102
T100BioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-dołkowy system PCR)Applied Biosystems4484073
Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNAPromegaA1125

Bibliografia

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNA ze ciek wgeny oporno ci na rodki przeciwdrobnoustrojowenadz r rodowiskowywytr canie glikolem polietylenowymhoryzontalny transfer gen wanaliza metagenomicznaoczyszczanie DNAzewn trzkom rkowe DNAspektrofotometria Nanodrop
Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.