Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66903

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  , 
1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje procedury używane do badania i charakteryzowania enzymów związanych ze ścianą komórkową, głównie β-1,3-glukanazy i peroksydazy, w roślinach pszenicy. Ich poziom aktywności wzrasta podczas interakcji pszenica - RWA i bierze udział w odpowiedzi obronnej roślin poprzez wzmocnienie ścian komórkowych, co zniechęca mszyce do żerowania.

Streszczenie

Rośliny pszenicy zaatakowane przez rosyjskie mszyce pszeniczne (RWA) wywołują kaskadę reakcji obronnych, w tym reakcje nadwrażliwe (HR) i indukcję białek związanych z patogenezą (PR), takich jak β-1,3-glukanaza i peroksydaza (POD). Badanie to ma na celu scharakteryzowanie właściwości fizykochemicznych POD i β-1,3-glukanazy związanych ze ścianą komórkową oraz określenie ich synergizmu w modyfikacji ściany komórkowej podczas interakcji RWASA2-pszenica. Podatne odmiany Tugela, umiarkowanie odporne Tugela-Dn1 i odporne Tugela-Dn5 zostały wstępnie wykiełkowane i posadzone w warunkach szklarniowych, nawożone 14 dni po posadzeniu i nawadniane co 3 dni. Rośliny zostały porażone przez 20 partenogenetycznych osobników tego samego klonu RWASA2 w fazie 3 liści, a liście zebrano w ciągu 1 do 14 dni po inwazji. Międzykomórkowy płyn do płukania (IWF) ekstrahowano za pomocą filtracji próżniowej i przechowywano w temperaturze -20 °C. Resztki liści rozdrobniono na proszek i wykorzystano jako składniki ściany komórkowej. Aktywność i charakterystykę POD określono przy użyciu 5 mM substratu gwajakolu iH2O2, monitorując zmianę absorbancji przy 470 nm. Aktywność β-1,3-glukanazy, optymalne warunki pH i temperatury wykazano, mierząc całkowitą zawartość cukrów redukujących w hydrolizacie za pomocą odczynnika DNS przy użyciu substratów β-1,3-glukanu i β-1,3-1,4-glukanu, mierząc absorbancję przy 540 nm i stosując krzywą wzorcową glukozy. Optimum pH określono w zakresie od 4 do 9 °C, optimum temperaturowe od 25 do 50 °C, a stabilność termiczną w zakresie od 30 °C do 70 °C. Specyficzność substratu β-1,3-glukanazy określono w temperaturze 25 °C i 40 °C przy użyciu substratów z β-1,3-1,4-glukanu z twarogu i jęczmienia. Dodatkowo określono sposób działania β-1,3-glukanazy za pomocą laminaribiozy do laminaripentaozy. Wzorce produktów hydrolizy oligosacharydów analizowano jakościowo za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i analizowano ilościowo za pomocą HPLC. Metoda przedstawiona w tym badaniu demonstruje solidne podejście do poinekowania pszenicy RWA, ekstrakcji peroksydazy i β-1,3-glukanazy z obszaru ściany komórkowej oraz ich kompleksowej charakterystyki biochemicznej.

Wprowadzenie

Rosyjskie mszyce pszeniczne (RWA) atakują pszenicę i jęczmień, powodując znaczne straty w plonach lub obniżenie jakości ziarna. Pszenica reaguje na porażenie poprzez wywołanie kilku reakcji obronnych, w tym zwiększenia poziomu aktywności β-1,3-glukanazy i peroksydazy w odpornych odmianach, podczas gdy odmiany podatne zmniejszają aktywność tych enzymów we wczesnym okresie porażenia1,2,3,4. Kluczowe funkcje β-1,3-glukanazy i POD w roślinie pszenicy obejmowały regulację akumulacji kalozy w odmianie odpornej i wygaszanie reaktywnych form tlenu (ROS) w ścianie komórkowej i regionach apoplastycznych podczas inwazji RWA1,3,5,6,7. Mafa et al.6 wykazali, że istnieje silna korelacja między zwiększoną aktywnością POD a zwiększoną zawartością ligniny w odpornej odmianie pszenicy po inwazji RWASA2. Ponadto zwiększona zawartość ligniny wskazywała, że ściana komórkowa porażonej odmiany pszenicy odpornej została wzmocniona, co doprowadziło do zmniejszenia nawożenia RWA.

Większość grup badaczy ekstrahowała i badała apoplastyczną β-1,3-glukanazę i POD podczas interakcji pszenica/jęczmień-RWA; ponadto, większość tych badań twierdziła, że te enzymy wpływają na ścianę komórkową rośliny pszenicy zaatakowanej RWA bez pomiaru obecności enzymu w obszarze ściany komórkowej. Tylko w kilku badaniach wykorzystano techniki mikroskopowe, aby wykazać, że poziomy aktywności β-1,3-glukanazy były powiązane z regulacją kalozy7,8,9 lub wyekstrahowane główne składniki ściany komórkowej, aby wykazać korelację między aktywnością POD a modyfikacją ściany komórkowej w klasie resistant6,10. Brak sondowania związku β-1,3-glukanazy i POD ze ścianą komórkową wskazuje na potrzebę opracowania metod, które pozwolą naukowcom bezpośrednio mierzyć enzymy związane ze ścianą komórkową.

Obecna metoda proponuje, że konieczne jest usunięcie płynu apoplastycznego z tkanki liścia przed ekstrakcją enzymów związanych ze ścianą komórkową. Procedura ekstrakcji płynu apoplastycznego musi być wykonana dwukrotnie z tkanki liścia, która służy do ekstrakcji enzymów związanych ze ścianą komórkową. Proces ten zmniejsza zanieczyszczenie i pomylenie enzymów apoplastycznych z enzymami znajdującymi się w regionach ściany komórkowej. Tak więc w tym badaniu wyekstrahowaliśmy POD związany ze ścianą komórkową, β-1,3-glukanazę i β-glukanazę specyficzną dla MLG i przeprowadziliśmy ich charakterystykę biochemiczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone za zgodą i pozwoleniem Komisji Etyki Badań nad Środowiskiem i Bezpieczeństwem Biologicznym Uniwersytetu Wolnego Państwa (UFS-ESD2022/0131/22). Szczegóły dotyczące odczynników i wyposażenia są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Warunki wzrostu roślin

  1. Wykiełkuj 250 nasion każdej odmiany pszenicy, tj. podatnej Tugela, umiarkowanie odpornej Tugela-Dn1 i odpornej Tugela-Dn5, na oddzielnych szalkach Petriego.
  2. Dodać 5 ml wody destylowanej do każdej szalki Petriego, uszczelnić folią parafinową i inkubować w komorze kiełkowania ustawionej na 25 °C przez 2 dni.
  3. Przesadzaj kiełkujące nasiona każdej odmiany do 15 cm doniczek zawierających glebę 1:1 i mech torfowy (15 roślin w doniczce) w kontrolowanych warunkach szklarniowych.
  4. Ustaw reżimy temperatury na 18 °C i 24 °C odpowiednio w nocy i w dzień.
  5. Rośliny należy nawadniać co 3 dni wodą z kranu i dostarczać im 2 g/l nawozu 14 dni po wykiełkowaniu.
  6. Umieść rośliny w klatkach otoczonych siatkami i pozwól im urosnąć do trzeciego stadium liścia2,6 (z czterema powtórzeniami biologicznymi każdej odmiany).

2. Porażenie odmian pszenicy RWASA2

    Zainfekuj odmiany pszenicy Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 RWASA2 zgodnie z Jimoh et al.11 oraz Mohase and Taiwe12.
  2. Trzymaj rośliny w dwóch oddzielnych zestawach w klatkach; zainfekuj jeden zestaw z 20 partenogenetycznymi osobnikami tego samego klonu RWASA2 na roślinę w każdej doniczce w komorach wzrostowych pokrytych siatkami. Trzymaj kolejny zestaw roślin pszenicy w oddzielnym pomieszczeniu pod komorą wzrostu z czystymi siatkami i traktuj je jako kontrolę.
    UWAGA: Przechowuj oba zabiegi w oddzielnych pomieszczeniach i przykryj rośliny klatkami zamkniętymi w siatkach. Ponadto, w przypadku gdy w badaniu wykorzystuje się dwa różne biotypy RWA, rośliny porażone jednym biotypem RWA należy w miarę możliwości utrzymywać rośliny porażone drugim biotypem lub w oddzielnych pomieszczeniach pod komorami wzrostowymi pokrytymi siatkami, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia krzyżowego RWASA2.
  3. Do zbioru wybierz drugi i trzeci liść w dwóch różnych reżimach czasowych, krótkotrwałym okresie karmienia (1, 2 i 3 dni) i długotrwałym okresie karmienia (7 i 14 dni) i zawiń je w wilgotne ręczniki papierowe.
  4. Natychmiast przenieś zebrane liście do pudełka zawierającego lód, aby zmniejszyć metabolizm liści przed ekstrakcją międzykomórkowego płynu myjącego (IWF).

3. Ekstrakcja międzykomórkowego płynu płuczącego (IWF) z apoplastu

  1. Zebrane liście około trzech odmian pszenicy pokrój na 7 cm kawałki.
  2. Opłucz kawałki liści dwukrotnie w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia cytozolowe z odciętych końcówek6,13.
  3. Włóż kawałki liści do grubościennej szklanej rurki i zanurz próbki w buforze ekstrakcyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Zastosuj infiltrację próżniową przez 5 minut za pomocą pompy strumieniowej, aby zaimpregnować liście buforem ekstrakcyjnym.
  5. Następnie wyjmij kawałki liści ze szklanej rurki i osusz je ręcznikiem papierowym.
  6. Włożyć wysuszone kawałki liści pionowo do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych wyposażonych w perforowane dyski i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Za pomocą pipety o pojemności 100 μl zebrać supernatant do wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Powtórz całą procedurę ekstrakcji z tym samym materiałem liściowym.
  9. Zebrać zebrany supernatant połączyć i przechowywać w temperaturze -20°C.
    UWAGA: Podwielokrotności supernatantu są traktowane jako źródło zawartości apoplastu lub IWF. IWF nie był używany w obecnym badaniu, ale ważne było, aby usunąć go z tkanek liści, zanim wyekstrahujemy β-1,3-glukanazę i peroksydazę (POD) związaną ze ścianą komórkową.

4. Ekstrakcja β-1,3-glukanazy i POD związanych ze ścianą komórkową

UWAGA: Resztki liści pozostawione po ekstrakcji IWF zostały użyte do ekstrakcji całkowitego białka ściany komórkowej.

  1. Zmiażdż resztki liści na drobny proszek z ciekłym azotem za pomocą moździerza i tłuczka.
  2. Przenieść około 200 mg sproszkowanej tkanki liścia do moździerza zawierającego 4 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM fosforanu sodu z 1% (w/v) poliwinylopolipirolidonem (PVPP); pH 5,0), a następnie zmielić tłuczkiem na gładką pastę, którą następnie przenosi się do probówek do mikrowirówek.
  3. Inkubować mieszaninę w probówkach do mikrowirówek przez 3 minuty na lodzie, a następnie odwirowywać przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zebrać supernatant (całkowite ekstrakty białkowe) w probówkach do mikrowirówek (podwielokrotności 2 ml) i użyć go jako źródła β-1,3-glukanazy i POD przez całe badanie.

5. Określenie wzorca białka

  1. Określić całkowite stężenie białka w ekstraktach zgodnie z metodą Bradforda14.
  2. Przygotować roztwory albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniach 0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/ml i 1,0 mg/ml rozpuszczone w 50 mM buforze fosforanu sodu w celu wytworzenia wzorca białkowego.
  3. Przygotować wzorzec, dodając 10 μl każdego roztworu BSA do 96-dołkowej mikropłytki ze 190 μl (0,25% v/v) odczynnika Bradforda (patrz Tabela materiałów).
  4. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 20 minut i mierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika mikropłytek, a następnie wykorzystywać wartości absorbancji do przygotowania krzywej wzorcowej do ilościowego określania stężenia białka.
  5. Ilościowe określenie stężenia białka
    1. Dodać 10 μl wyekstrahowanego enzymu (krok 4) do 96-dołkowej mikropłytki ze 190 μl (0,25% v/v) odczynnika Bradforda w trzech powtórzeniach.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 20 minut.
    3. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru z czytnikiem mikropłytek i wykorzystać wartości absorbancji do określenia stężenia białka przy użyciu BSA jako wzorca białka (przygotowanego w kroku 5.4).

6. Przygotuj wzorzec glukozy dla aktywności β-1,3-glukanazy

  1. Przygotować roztwory wzorcowe o stężeniach od 0,00 mg/ml do 1,0 mg/ml (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/ml) z glukozą rozpuszczoną w wodzie destylowanej.
  2. Dodać 300 μl każdego roztworu glukozy i 600 μl odczynnika kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w stosunku 1:2 do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować reakcje w temperaturze 100 °C przez 5 minut (patrz Tabela materiałów dla odczynników DNS) (Miller i wsp.15).
  3. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przed pomiarem absorbancji przy długości fali 540 nm za pomocą spektrofotometru.
  4. Średnie wartości absorbancji wykorzystać do opracowania krzywej wzorcowej do oznaczania aktywności enzymu β-1,3-glukanazy.

7. Oznaczanie testu aktywności β-1,3-glukanazy

UWAGA: Aktywność enzymu związanego ze ścianą komórkową β-1,3-glukanazy ekstrahowanej z Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 została określona przez ilość uwolnionych całkowitych cukrów redukujących uwolnionych w wyniku hydrolizy 0,5% (w/v) mieszanych substratów β-1,3-1,4-glukanu (MLG) i 0,4% (w/v) β-1,3-glukanu przy użyciu zmodyfikowanej metody, jak opisano przez Millera i wsp.15. Probówki z porcjami białka należy zawsze trzymać na lodzie. Jeśli próbki zostały zamrożone, rozmrozić je na lodzie i przystąpić do rozmrożenia natychmiast po rozmrożeniu.

  1. Dodać 200 μl ekstraktu enzymatycznego (utrzymywać stężenie białka między 20 μg/ml a 90 μg/ml we wszystkich reakcjach, chyba że zaznaczono inaczej) i 300 μl substratu rozpuszczonego w 50 mM buforze cytrynianu sodu (pH 5,0) do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Przeprowadź równoległą ślepą próbę bez ekstraktu enzymatycznego dla wszystkich substratów (pierwsza ślepa próba), a ślepa próba enzymatyczna składa się z ekstraktu enzymatycznego bez substratu (druga ślepa próba). Zarówno substrat, jak i ekstrakt enzymatyczny zastąpiono buforem odpowiednio w pierwszej i drugiej czerni.
  2. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i zakończyć reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 100 °C przez 5 minut, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zmieszać 300 μl supernatantu z 600 μl odczynnikiem DNS (w stosunku 1:2) do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
  4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 540 nm za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Jeśli stężenie cukrów redukujących ogółem w mieszaninie jest wysokie, spowoduje to powstanie ciemnobrązowego roztworu, który jest trudny do odczytania za pomocą spektrofotometru. W związku z tym konieczne jest dalsze rozcieńczanie próbek przed odczytaniem absorbancji.
  5. Użyj krzywej wzorcowej glukozy opracowanej w kroku 6.4 powyżej, aby określić aktywność enzymu w jednostkach SI krzywej wzorcowej.
  6. Aby przeliczyć aktywność na określoną aktywność, która jest wyrażona w μmol glukozy/h/mg białka, użyj poniższego równania:
    Aktywność właściwa = [(aktywność enzymu/180.16)*1000]/czas/stężenie białka
    UWAGA: Przelicz aktywność enzymu w mg / ml na g / ml; 180.16 g/mol to masa cząsteczkowa glukozy, 1000 to czynnik, który przekształca M w mikromole, czas to okres reakcji, a stężenie ekstraktu białkowego jest reprezentowane w mg/ml. Jedną jednostkę aktywności β-1,3-glukanazy definiuje się jako 1 μmol glukozy uwolnionej z substratu w ciągu 1 godzinnego okresu reakcji.

8. Określanie aktywności peroksydazy (POD)

UWAGA: Aktywność peroksydazy związanej ze ścianą komórkową odmian pszenicy Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 została określona poprzez ilościowe określenie tworzenia tetra-gwajakolu wytwarzanego w jednostce czasu z guaiacol16.

  1. Dodać 30 μl ekstraktu enzymatycznego, 30 μl 1% (v/v)H2O2 i 970 μl 5 mM gwajakolu do kuwet w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Wykonaj ślepą próbę bez ekstraktu enzymatycznego (pierwsza ślepa próba) i kolejną ślepą próbę dla próbek enzymów bez substratu (druga ślepa próba). Próbki enzymu lub substratu zastąpiono 50 mM buforem fosforanu sodu odpowiednio w pierwszej i drugiej ślepej próbie.
  2. Użyj trybu kinetycznego spektrofotometru do monitorowania zmiany absorbancji przy 470 nm.
  3. Określ nachylenie, w którym wykres był liniowy i użyj go jako wartości absorbancji.
  4. Oblicz średnią absorbancję i wykorzystaj ją do obliczenia aktywności POD.
  5. Obliczyć aktywność peroksydazy za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji gwajakolu (26,6 mM-1 cm-1) i wyrazić aktywność w μmol tetra-gwajakolu/min/mg białka.
  6. Oblicz aktywność POD za pomocą równania używanego przez Mafa et al.6:
    AKTYWNOŚĆ STRĄKÓW = [(ΔABS × DF) ÷ Stężenie białka] × 26,6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    UWAGA: Gdzie ΔABS = średnia absorbancja; DF = współczynnik rozcieńczenia; 26,6 mM-1 cm-1 = współczynnik ekstynkcji gwajakolu.

9. Charakterystyka POD

UWAGA: Testy charakterystyki POD zostały przeprowadzone przy użyciu 3 dni po infestacji (dpi) ekstraktów enzymatycznych Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 zgodnie z podobnymi metodami opisanymi w kroku 8, z niewielkimi zmianami w reakcyjnych i temperaturach. Próbki enzymów były zawsze trzymane na lodzie podczas przeprowadzania eksperymentów. Uruchom reakcje w poczwórnych duplikatach z równoległą reakcją ślepą.

  1. Aby uzyskać optymalne testy pH, wykonaj następujące czynności.
    1. Rozpuścić substrat gwajakolu w 50 mM (cytrynian sodu, pH 4 i 5), fosforan sodu (pH 6 i 7) i Tris-HCl (pH 8 i 9) (patrz tabela materiałów).
    2. Przeprowadzić reakcje w temperaturze 25 °C zgodnie z opisem w kroku 8.
  2. Aby uzyskać optymalne testy temperatury, wykonaj następujące czynności.
    1. Przeprowadzić reakcje odpowiednio w temperaturze 25 °C, 30 °C, 40 °C i 50 °C.
    2. Użyć substratu gwajakolu rozpuszczonego w buforze o pH 5 (optymalnym pH) i przeprowadzić reakcje zgodnie z opisem w kroku 8.
  3. W przypadku testów termostabilności należy wykonać następujące czynności.
    1. Przed rozpoczęciem reakcji inkubować enzym w temperaturze 37 °C, 50 °C i 70 °C przez 30 minut.
    2. Przeprowadzić reakcje zgodnie z metodami opisanymi w kroku 8, używając 50 mM buforu cytrynianu sodu (pH 5) i w temperaturze 40 °C (optymalna temperatura).

10. Charakterystyka β-1,3-glukanazy

UWAGA: Przeprowadź testy charakterystyki zgodnie z metodą opisaną w kroku 7, używając ekstraktów enzymatycznych o wartości 3 dpi, z pewnymi modyfikacjami reakcyjnych i temperatur. Przeprowadzaj reakcje w czworakach, z równoległą reakcją ślepej próby dla każdego substratu.

  1. Aby uzyskać optymalne testy pH, należy postępować w następujący sposób:
    1. Rozpuścić substraty MLG i β-1,3-glukanu w 50 mM (cytrynian sodu o pH 4 i 5), fosforan sodu (pH 6 i 7) i Tris-HCl (pH 8 i 9).
    2. Uruchom reakcję zgodnie z opisem w kroku 7.
  2. Aby uzyskać optymalne testy temperatury, należy postępować w następujący sposób:
    1. Przeprowadzić reakcje odpowiednio w temperaturze 25 °C, 30 °C, 40 °C i 50 °C.
    2. Użyć substratów MLG i β-1,3-glukanu rozpuszczonych w 50 mM buforze cytrynianu sodu (pH 5) o optymalnym pH (uzyskanym w kroku 10.1) i przeprowadzić reakcje zgodnie z opisem w kroku 7.
  3. W przypadku testów termostabilności należy postępować w następujący sposób:
    1. Przed rozpoczęciem reakcji inkubować enzym w temperaturze 37 °C, 50 °C i 70 °C przez 30 minut.
    2. Przeprowadzić reakcje przy użyciu substratów rozpuszczonych w 50 mM buforze cytrynianu sodu (pH 5) i inkubować w temperaturze 25 °C i 40 °C przez 24 godziny.

11. Ocena mechanizmu działania β-1,3-glukanazy na różnych podłożach glukana

UWAGA: Substraty glukanu zawierają tę samą resztę glukozy w swoim szkielecie, ale wiązania glikozydowe między jednostkami glukopiranozy są zróżnicowane i mogą przyjmować orientację α lub β17. Wiązania glikozydowe mogą tworzyć się między kilkoma atomami węgla cząsteczek glukozy, określając ich strukturę chemiczną, np. β-1,3-glukan, β-1,4-glukan i mieszany sprzężony β-1,3-1,4-glukan (MLG)18,19,20. Mechanizm działania β-1,3-glukanazy określono przy użyciu próbek Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn 5 z RWASA2 (źródła enzymów) oraz następujących substratów: β-1,3-glukanu (CM-curdlan), MLG (z jęczmienia) i β-1,4-glukanu (AZO-CM-celuloza). Mechanizm działania określa się w optymalnych warunkach testowych (25 °C i 40°C, pH 5,0), przy użyciu 0,1% (w/v) β-1,4-glukanu, 0,4% (w/v) β-1,3-glukanu lub 0,5% (w/v) substratów MLG.

  1. Rozpuścić substraty w 50 mM buforze cytrynianu sodu (pH 5).
  2. Dodać 200 μl ekstraktu enzymatycznego i 300 μl substratu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Inkubować reakcje w dwóch oddzielnych temperaturach, 25 °C i 40 °C przez 8 godzin.
  4. Zakończenie reakcji przez ogrzewanie w temperaturze 100 °C.
  5. Odwirować mieszaninę reakcyjną β-1,3-glukanu i MLG przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i postępować zgodnie z opisem w kroku 7.3.
  6. W przypadku β-1,4-glukanu, po zakończeniu reakcji w temperaturze 100 °C, rozcieńczyć mieszaninę 800 μl absolutnego alkoholu etylowego i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 10 000 x g.
  7. Przenieść supernatant do krzywych, zmierzyć absorbancję przy długości fali 590 nm za pomocą spektrofotometru i obliczyć aktywność β-1,3-glukanazy na β-1,4-glukan, stosując procedurę producenta (patrz tabela materiałów) i wyrazić aktywność w jednostkach/mg białka.

12. Określanie sposobu działania β-1,3-glukanazy

UWAGA: Sposób działania indukowanej β-1,3-glukanazy indukowanej przez RWASA2 Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 został oceniony za pomocą oligosacharydów laminaryny (LAM) o stopniu polimeryzacji (DP) między 5 a 2. Użyj zestawu do chromatografii cienkowarstwowej (TLC), chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) i peroksydazy glukozowej (GOPOD), aby określić DP wymagany dla β-1,3-glukanazy do hydrolizy substratu. TLC wykorzystano do analizy jakościowej, a LC-MS do analizy ilościowej, która określiła stężenie oligosacharydów w hydrolizacie po reakcji21.

  1. Przygotować reakcje sposobu działania β-1,3-glukanazy
    UWAGA: Przygotować skoncentrowany ekstrakt białkowy z zagęszczającym filtrem membranowym wirówki o mocy 10 kDa, a tym samym uzyskać skoncentrowane i nieskoncentrowane ekstrakty białkowe zainfekowane RWASA2 do eksperymentu.
    1. W celu zagęszczenia enzymów wyekstrahowanych z każdej odmiany, należy przenieść 5 ml ekstraktów do wirówki o mocy 10 kDa, zagęszczając filtry membranowe.
    2. Odwirować probówki filtracyjne z membraną zawierającą ekstrakt o sile 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Rozpuścić laminaripentaozę (LAM5), laminarytetrazę (LAM4), laminarytryozę (LAM3) i laminarybiozę (LAM2) (patrz tabela materiałów) w 50 mM cytrynianu sodu (pH 5) do uzyskania 10 mg/ml.
    4. Aby rozpocząć reakcję, dodaj 20 μl ekstraktu białkowego i 40 μl laminaripentaozy (LAM5), laminatorytetraozy (LAM4), laminatorytryozy (LAM3) i laminarybiozy (LAM2).
    5. Inkubować reakcję w temperaturze 40 °C przez 16 godzin, a zakończyć gotowaniem w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
  2. Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową (TLC)
    1. Pokrój 4 płytki krzemionkowe na 10 cm2 kawałki i narysuj jedną linię w poprzek powierzchni płytki, pozostawiając 1 cm odstępu od spodu jednej krawędzi.
    2. Zaznacz kropki nad linią i zaznacz je według różnych odmian i DP oligosacharydów taminaryny, w odległości 1 cm od siebie i. Weź 2 płytki krzemionkowe dla skoncentrowanego ekstraktu białkowego i pozostałe 2 dla nieskoncentrowanych ekstraktów.
    3. Dodać 3 μl mieszanin reakcyjnych 3 do 5 razy na odpowiednie zaznaczone miejsca na płytce krzemionkowej i pozostawić plamki na płytce do całkowitego wyschnięcia przed powtórzeniem procesu.
    4. Delikatnie umieścić płytki krzemionkowe w zbiorniku TLC zawierającym fazę ruchomą n-butanolu: kwas octowy: woda (2:1:1 v/v/v) stroną zawierającą plamki próbek na dnie.
    5. Pozwól, aby faza ruchoma przesunęła się od dołu do góry płytki.
      UWAGA: Ten krok może zająć około 2 godzin. Nie przesuwaj ani nie przeszkadzaj w zbiorniku, gdy sample się rozdzielają.
    6. Wyjmij płytki z fazy ruchomej i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
    7. Dodaj roztwór barwiący do małego pojemnika, delikatnie zanurz płytkę krzemionkową w roztworze barwiącym 0,3% (w/v) naftolu w 95% (v/v) etanolu przy użyciu 5% (v/v) kwasu siarkowego przez 5 s, usuń go, a następnie pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Na tym etapie włącz blok grzewczy/piekarnik i ustaw temperaturę na 100 °C.
    8. Umieść wysuszone płytki krzemionkowe na bloku grzewczym i podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez 7-10 minut lub do momentu pojawienia się niebiesko-fioletowych plam. Zrób zdjęcia płytek krzemionkowych pokazujących niebiesko-fioletowe plamy i udokumentuj je.
  3. Określić ilościowo stężenie hydrolizatów laminarynowo-oligosacharydowych
    UWAGA: Stężenie hydrolizatów MD zostanie określone ilościowo zarówno dla skoncentrowanych, jak i nieskoncentrowanych ekstraktów białkowych21.
    1. Dodać 20 μl każdej próbki do kolumny C18 (węglowodany 4,6 × 250 mm) i pozostawić do rozdzielenia z szybkością przepływu 500 μl/min przy użyciu gradientu wody (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B) od 100% B do 60% B przez 10 minut, a następnie etapy przywracania równowagi kolumny o łącznym czasie pracy wynoszącym 20 minut, aby umożliwić ponowne zrównoważenie kolumny.
    2. Zjonizować anality eluujące w ujemnym trybie elektrorozpylania w źródle jonów spektrometrii mas o temperaturze grzałki 400 °C w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika, gazu z nebulizatora 30 psi, gazu z grzejnika 30 psi i gazu kurtynowego 20 psi.
    3. Ustaw potencjał deklastrowania na 350 V.
    4. Analizuj eluujące anality na spektrometrze mas w trybie skanowania Q1 w zakresie od 150 Da do 1000 Da z czasem przebywania 3 s.
    5. Zapisz stężenia analitów w arkuszu kalkulacyjnym.
  4. Ilościowe określenie stężenia glukozy
    1. Przeanalizuj stężenie glukozy wytwarzane w wyniku hydrolizy laminaryny za pomocą odczynnika GOPOD zgodnie z instrukcjami producenta22,23.
    2. Zmierzyć absorbancję spektrofotometru przy długości fali 510 nm w trybie ustalonym.

13. Gromadzenie i analiza danych

  1. Losowo dobieraj wszystkie eksperymenty, aby uniknąć stronniczości podczas infestacji lub pobierania próbek i przeprowadzaj analizę w poczwórnych odstępach.
  2. O ile nie stwierdzono inaczej, należy użyć średnich odchylenia standardowego ± celu przedstawienia wartości na wykresach i tabelach wygenerowanych na podstawie zebranych danych doświadczalnych.
  3. Użyj programu Microsoft Excel, aby przeanalizować wszystkie dane i wygenerować wykresy.
  4. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą kompatybilnego oprogramowania.
    UWAGA: Wykonaj Wieloczynnikową Analizę Wariancji (ANOVA), aby sprawdzić istotność między zabiegami i LSD Fishera, aby przetestować grupy jednorodne przy wartości alfa 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cztery powtórzenia biologiczne odmian pszenicy (Tugela, Tugela-Dn1 oraz Tugela-Dn5) zainfekowano RWASA2 w stadium wzrostu trzech liści. Po infekcji liście zbierano w 1., 2., 3., 7. i 14. dpi. Próby kontrolne nie były infekowane RWASA2, aby wyniki eksperymentu były porównywalne z roślinami pszenicy niepoddanymi stresowi. Eksperymenty przeprowadzono w czterech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako wartości średnie.

Stężenia białek w ekstraktach z roślin zainfekowanych RWAS...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pszenica i jęczmień to rośliny zbożowe często atakowane przez gatunki mszyc, w tym mszyce pszeniczne (Diuraphis noxia)7,24. Odporne rośliny pszenicy indukują regulację w górę aktywności POD i β-1,3-glukanazy jako reakcje obronne przez cały okres porażenia w celu modyfikacji ściany komórkowej poprzez regulację akumulacji kalozy i ligniny 6,25,26,27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że w związku z tą pracą nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

M. Mafa otrzymał dofinansowanie od NRF-Thuthuka (Numer referencyjny: TTK2204102938). S.N. Zondo otrzymał stypendium podyplomowe National Research Foundation na swój tytuł magistra. Autorzy są wdzięczni Radzie Badań Rolniczych - Instytut Małego Ziarna (ARC-SG) za udostępnienie nasion użytych w tym badaniu. Wszelkie opinie, ustalenia i zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów), w związku z czym fundatorzy nie ponoszą żadnej odpowiedzialności w tym zakresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 kDa Wirówka z membraną zagęszczającąSigma-AldrichR1NB84206Wyłącznie do celów badawczych. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych. Do zagęszczania i oczyszczania roztworów biologicznych.
2 g LaminaribiozaMegazyme (Wicklow, Irlandia)O-LAM2Laminarbioza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Irlandia)O-LAM3Laminarytrioza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.
3,5 Kwas dinitrosalicylowySigma-AldrichD0550Stosowany w kolorymetrycznym oznaczaniu cukrów redukujących
4 g Laminartetraozy Megazyme (Wicklow, Irlandia)O-LAM4Laminarytetraoza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Irlandia)O-LAM5Laminarinatoza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, biochemicznych testach enzymatycznych i analizach diagnostycznych in vitro.
95% Absolutny etanolSigma-Aldrich107017Absolut etanolu do analizy
Kwas octowySigma-AldrichB00063Kwas Acetc lodowaty 100% do analizy (zawiera kwas octowy)
Azo-CM-CelulozaMegazyme (Wicklow, Irlandia)S-ACMCPolisacharyd jest barwiony Remazolbrilliant Blue R w ilości ok. jednej cząsteczki barwnika na 20 reszt cukru.
Beta glukan (jęczmień) Megazyme (Wicklow, Irlandia)G6513Sproszkowane podłoże, słabo rozpuszczalne w wodzie. Służy do oznaczania aktywności β-1,3-glukanazy.
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, Republika Południowej Afryki500-0006Barwnik do oznaczania kolorymetrycznego, koncentrat, do stosowania z zestawami do oznaczania białek Bio-Rad I i II 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Gibco Europe810-1018Wyłącznie do użytku laboratoryjnego
Kwas cytrynianowySigma-AldrichC0759Wyłącznie do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Irlandia)P-CMCURSproszkowany substrat do oznaczania aktywności β-1,3-glukanazy. Nierozpuszczalny w wodzie.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270Tylko do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Wskaźnik utleniania. Służy do oznaczania aktywności peroksydazy.
Nadtlenek wodoruBDH Laboratory Supplies, Anglia10366Silny środek utleniający.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonia)NIPodłoże do sadzonek na bazie mchu torfowego.
Nawóz wielonawożeniowy (5.2.4 (43))Nawóz wielopaszowyClassicB1908248Rozpuszczalny w wodzie nawóz dla młodych rozwijających się roślin i siewek o wysokim zapotrzebowaniu na fosfor (P) w celu zapewnienia optymalnego rozwoju korzeni.
NaftolMerck, NiemcyN2780Ulega uwodornieniu w obecności katalizatora.
PhenolSigma-Aldrich33517Wrażliwy na światło. Dla R& D tylko używać. Nie do celów związanych z narkotykami, gospodarstwem domowym ani innymi. Dostępna karta charakterystyki
Czterowodny winian potasowo-sodowy (sól Rochelle)Sigma-AldrichS2377stosowany do przygotowania roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego stosowanego do oznaczania cukru redukującego.
Płytka krzemionkowa (TLC Żel krzemionkowy 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAMatryca z żelu krzemionkowego, ze wskaźnikiem fluorescencyjnym 254 nm
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045Do R& D tylko używać. Nie do celów związanych z narkotykami, gospodarstwem domowym ani innymi.
Pirosiarczyn soduSigma-Aldrich31448Dodawany jako przeciwutleniacz podczas przygotowywania roztworów kwasu 3,5-dinitrosalicylowego.
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigma-AldrichS9390Stosowany jako roztwór buforowy w badaniach biologicznych w celu utrzymania stałego pH.
Fosforan sodu jednozasadowy siedmiowodnySigma-Aldrich71500Związek nieorganiczny, który jest rozpuszczalny w wodzie. Stosowany jako odczynnik przy opracowywaniu zapraw na bazie krzemianów.
Oprogramowanie do analizy statystycznejTIBCO Statisticawersja 13.1
Kwas siarkowyMerck, Darmstadt, Niemcy30743Kwas siarkowy 95-97% do analizy Hg, odczynnik ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Środek buforujący w mieszaninach inkubacyjnych.  Jest również stosowany jako składnik buforu lizy i TE (Tris-EDTA). Wyłącznie do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.
UV– Spektrofotometr światła widzialnegoGENESYS 120 
  NI = nie zidentyfikowano.

Bibliografia

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Beta-1aktywność peroksydazyrosyjska mszyca pszenicybiałka związane z patogenezącharakterystyka enzymatycznacienkowarstwowa chromatografiaswoistość substratowa glukanazyinterakcje między rośliną a szkodnikiem
Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.