Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66910

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół ex vivo izolowanego działania na szczurzym sercu, aby przetestować strategie zachowania serca dawcy. W artykule opisano protokół stosowania w statycznym przechowywaniu serc dawców gryzoni w chłodniach; Jednak protokół może być również stosowany w przypadku serc dawców uzyskanych po dawstwie po śmierci krążeniowej i śmierci mózgu.

Streszczenie

Optymalizacja rozwiązań do konserwacji serca dawcy odegrała kluczową rolę w zmniejszeniu uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych w sercach dawców podczas pobierania narządów, transportu i przeszczepów. Wcześniejsze prace z naszego laboratorium wykazały, że dodanie trójazotanu glicerolu i erytropoetyny do roztworów konserwujących serce dawcy może znacznie poprawić regenerację funkcji serca po długotrwałym przechowywaniu w chłodni i po śmierci krążeniowej serca. Ten protokół suplementacji został wdrożony do użytku klinicznego na oddziałach transplantacyjnych w Australii, Belgii i Wielkiej Brytanii. W tym miejscu przedstawiamy protokół testowania strategii suplementacji przy użyciu izolowanego ex vivo obwodu perfuzji pracującego serca szczura (IWRH). Korzystając z tej metodologii, strategie suplementacji mogą być testowane w kontekście długotrwałego przechowywania statycznego w niskiej temperaturze, dawstwa po śmierci mózgu i dawstwa po śmierci krążeniowej w celu zachowania serca dawcy. Odzyskanie funkcji serca, mierzone przepływem aortalnym, przepływem wieńcowym, rzutem serca, ciśnieniem tętna i częstością akcji serca, można wykorzystać do określenia, czy określona strategia zachowania może zminimalizować uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne serca dawcy.

Wprowadzenie

Na sukces przeszczepu serca może mieć duży wpływ metoda konserwacji serca dawcy. Serca dawców są poddawane unieruchomieniom niedokrwiennym podczas procesu pobierania, transportu i przeszczepiania narządów. Stopień uszkodzenia niedokrwiennego narządu dawcy można złagodzić, wybierając odpowiednią strategię zachowania serca dawcy. Przechowywanie statyczne w chłodni (CSS) pozostaje najbardziej wykonalną i powszechną metodą konserwacji serca dawcy; jednak CSS niekoniecznie musi być najlepszą opcją dla wszystkich ścieżek dawstwa serca. Na przykład serca pozyskane za pośrednictwem szlaku dawstwa po śmierci krążeniowej (DCD) są utrzymywane i oceniane pod kątem żywotności za pomocą normotermicznej perfuzji maszynowej, podczas gdy serca pozyskane za pośrednictwem ścieżki dawstwa po śmierci mózgu (DBD) mogą być konserwowane za pomocą CSS lub hipotermicznej perfuzji maszynowej. Innym ważnym wyznacznikiem zastosowanej strategii konserwacji jest ilość ciepłego niedokrwienia (w przypadku DCD) lub zimnego niedokrwienia (w przypadku DBD), na które narażone jest serce podczas pobierania i transportu narządów.

Wiele ośrodków stosuje dodatkowe farmakologiczne uzupełnienie roztworu do konserwacji serca w celu zwiększenia tolerancji niedokrwiennej i poprawy funkcji serca po przeszczepie. Badania na gryzoniach przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że suplementacja kardioplegii erytropoetyną i trójazotanem glicerolu była w stanie znacznie poprawić regenerację funkcji serca po długotrwałym przechowywaniu serca dawcy w chłodni1,2. Badania te następnie przeszły do badań nad zachowaniem serca dawcy na świniach i dostarczyły podstaw przedklinicznych, które doprowadziły do włączenia erytropoetyny i trójazotanu glicerolu do roztworu kardioplegii serc pobranych za pośrednictwem szlaku DCD z wykorzystaniem normotermicznej perfuzji maszynowej3,4,5. Obecnie suplementacja erytropoetyną i trójazotanem glicerolu jest również stosowana w australijskich oddziałach transplantacyjnych do klinicznych pobrań serca DBD z udziałem CSS. Ogólnym celem opisanego poniżej protokołu perfuzji izolowanego pracującego serca szczura (IWRH) jest przetestowanie strategii zachowania serca dawcy w warunkach laboratoryjnych i przetestowanie ich skuteczności w zachowaniu funkcji serca dawcy po reperfuzji. Opisany izolowany protokół pracy serca szczura jest stosowany od ponad dwóch dekad w naszym laboratorium i okazał się niezwykle przydatny w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych suplementów i/lub strategii, które mogą poprawić zachowanie serca dawcy2,7,8,9.

Protokół

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Australia). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Instytutu Badań Medycznych Garvan (Sydney, Australia).

1. Przygotowanie buforu Krebs-Henseleit (KH)

  1. Przygotować 2 l 20-krotnego roztworu podstawowego buforu KH zawierającego 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Rozdzielić porcję do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przed eksperymentem przygotuj dwie 2-litrowe kolby Erlenmyera zawierające 1x bufor KH zawierający 1900 ml wody dejonizowanej, 100 ml 20x buforu podstawowego KH, 4,20 g NaHCO3 (25 mM) i 3,96 g glukozy (11 mM).
    1. Umieścić kolby buforowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i sgazować roztwór karbogenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla, natężenie przepływu ustawione na 2 l/min) przez kamienie napowietrzające (wsuwany filtr wlotowy) przez 5 minut, a następnie dodać 2,8 ml 1 M CaCl2 (1,4 mM). Kontynuować bulgotanie roztworu przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem doświadczenia. Użycie kamienia napowietrzającego pomaga w równomiernym napowietrzeniu bufora.
    2. Umieść niewielką objętość (~50 ml) buforu w okrągłym metalowym naczyniu w temperaturze -20 °C, aby ostygł i utworzył warstwę mrożonego buforu.

2. Przygotowanie obwodu perfuzji

  1. Upewnij się, że wszystkie rurki i szklane naczynia są czyste i nie ma widocznych narośli/zanieczyszczeń.
  2. Ustaw wysokości szklanych komór tak, aby odpowiadały wymaganym ciśnieniom perfuzji w oparciu o 1 cm H2O odpowiadające 1,36 mmHg: Langendorff - serce 100 cm (około 75 mmHg), obciążenie wstępne robocze bok do serca 15 cm (około 11 mmHg), komora od serca do obciążenia następczego 100 cm (około 75 mmHg).
  3. Rozpocznij cyrkulację gorącej wody wokół obwodu co najmniej 10 minut przed perfuzją serca.
  4. Umieść filtry z mikrofibry (1,2 μm) w uchwytach filtrów i mocno je zabezpiecz.
  5. Zalać obwód buforem KH, upewniając się, że całe powietrze zostało usunięte, i użyj rurki kontrolującej przepływ clamp, aby wyregulować przepływ po stronie Langendorffa (Rysunek 1A, B) do ~ 50 ml / min. Wolniejszy przepływ pozwala na łatwą kaniulację aorty i zapobiega przemieszczeniu się serca przed wiązaniem. Umieść termometr w obwodzie za pomocą złącza rurki w kształcie litery T, aby monitorować temperaturę bufora na poziomie ~37 °C.

3. Konfiguracja oprogramowania Lab Chart (analiza danych)

  1. Upewnij się, że Powerlab (system akwizycji danych) i przepływomierz są włączone i podłączone do komputera przed otwarciem oprogramowania do analizy danych.
  2. Otwórz nowy plik.
  3. Skonfiguruj zbieranie danych, wybierając menu rozwijane Ustawienia i wybierając Ustawienia kanału. Wybierz ciśnienie w aorcie, przepływ w aorcie i tętno (Rysunek 2A).
  4. Skonfiguruj każdy kanał z ustawieniami pokazanymi w Rysunek 2B.

4. Przygotowanie zwierzęcia do izolacji serca szczura

UWAGA: Metodologia izolacji i perfuzji serca szczura dla serc bez DBD i DCD do przechowywania statycznego w zimnej temperaturze jest opisana poniżej. Metody instrumentacji serca do obwodu perfuzyjnego są stosunkowo podobne, niezależnie od zastosowanej metody dawstwa. Różnice w protokole dawstwa serca szczura DBD i DCD występują przede wszystkim od momentu zastosowania znieczulenia zwierzęcia do momentu wycięcia serca od zwierzęcia.

  1. Zważ zwierzę, upewniając się, że jego waga wynosi >330 g. Idealny zakres wagowy dla samców szczurów to 330-420 g.
  2. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Zapewnij odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego w oparciu o brak odruchu pedałowania (odruch szczypania palców) i odruchu mrugania oczami.
  3. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, zabezpieczając kończyny taśmą. Podawaj zwierzęciu tlen przez stożek nosowy.
  4. Miej metalowy pojemnik buforowy KH i mały metalowy pojemnik z lodem w stacji prosektoryjnej. Namocz gazę o wymiarach 7,5 cm x 7,5 cm w buforze KH i umieść ją na pojemniku z lodem.
  5. Po potwierdzeniu odpowiedniej płaszczyzny znieczulenia chirurgicznego, należy ogolić skórę w miejscu nacięcia chirurgicznego i oczyścić skórę środkami aseptycznymi, takimi jak betadyna lub 70% alkohol. Wykonaj boczne nacięcie w poprzek brzucha (laparotomia) i przesuń żołądek i jelita na bok, aby umożliwić dostęp do lewej żyły nerkowej. Wstrzyknąć 1500 j.m. heparyny i uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Odczekaj 1-2 minuty, aby heparyna zaczęła krążyć, zanim będziesz kontynuować pobieranie serca.
  6. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę piersiową po obu stronach i przecinając przeponę. Ostrożnie przytrzymaj i podnieś blok płuco-serce, przecinając wzdłuż aorty zstępującej, upewniając się, że łuk aorty pozostaje nienaruszony. Pozwoli to na zachowanie wystarczającej długości aorty do kaniulacji.
  7. Szczur jest poddawany eutanazji poprzez usunięcie serca i płuc pod narkozą. Zanurz blok płuco-serce w błocie pośniegowym buforowym KH, aby umożliwić zatrzymanie serca.

5. Kaniulacja serca do izolowanego działającego obwodu perfuzji serca

  1. Przenieś blok płuco-serce na gazę na lodzie. Wypreparuj nadmiar tłuszczu wokół aorty, przytnij aortę, aby pozostawić 3-5 mm długości do kaniulacji i wykonaj małe nacięcie ~1-2 mm w tętnicy płucnej. Umożliwi to drogę dla ścieków wieńcowych.
  2. Umieść przycięty blok płuco-serce (jeszcze na lodzie) bezpośrednio pod kaniulami. Wyreguluj przepływ od strony Langendorffa za pomocą rurki kontrolującej przepływ clamp, aby ułatwić kaniulację aorty. Ostrożnie nałóż aortę na lewą kaniulę, przytrzymaj ją czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0.
  3. Zwiększ przepływ z perfuzji Langendorffa, całkowicie otwierając zacisk rurki sterującej przepływem. Otwórz zacisk obciążenia następczego. Upewnij się, że z komory Langendorffa jest ciągły przepływ. Rozpocznij monitorowanie aktywności serca za pomocą oprogramowania.
    UWAGA: jeśli wartość przepływu w aorty na wyświetlaczu przepływomierza wynosi <10 ml/min, upewnij się, że arteriotomia płucna ma wystarczający rozmiar. Niski ślad/wartość przepływu w aortze może również wskazywać, że kaniula aorty została wprowadzona zbyt daleko.
  4. Wyreguluj blok płuco-serce tak, aby przednia powierzchnia płuc była skierowana w stronę operatora. Zawiąż lewy płat płuca jedwabnym szwem 2-0 i odetnij nadmiar lewej tkanki płucnej. Zawiąż pozostałe płaty płuc jednym ruchem jedwabnym szwem 2-0 i przetnij tkankę. Obróć serce tak, aby związane płuca były skierowane do tyłu.
  5. Za pomocą małych nożyczek Vannas odetnij 2-3 mm krawędź uszka lewego przedsionka, upewniając się, że uzyskano mały otwór w przedsionkach. Ostrożnie kaniuluj lewy uszek przedsionkowy do lewej kaniuli, przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0. Rysunek 3A pokazuje rozmieszczenie obu kaniul.
  6. Wyreguluj płaszcz wodny komory serca tak, aby serce znajdowało się pośrodku komory.
  7. Otwórz przetwornik ciśnienia na powietrze i wyzeruj przetwornik ciśnienia w oprogramowaniu, wybierając menu rozwijane Ciśnienie aorty > Bridge Amp > Zero. Kliknij przycisk OK.
  8. Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 10 minut. Upewnij się, że przepływ w aortze Langendoffa wynosi 10-20 ml/min (idealnie 20 ml/min).
  9. Przed przełączeniem trybu pracy należy upewnić się, że kamień napowietrzający (wsuwany filtr wlotowy) ze zbiornika buforowego Langendorff KH jest umieszczony w roboczym zbiorniku buforowym KH.
  10. Przełącz serce w tryb pracy, zamykając duży zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej i otwierając przepływ prowadzący do uszka lewego przedsionka. Otwórz kran trójdrożny prowadzący od działającego perfuzatu. Przenieść wspólny przewód powrotny (zabierając bufor KH z powrotem do zbiornika) ze zbiornika Langendorff do zbiornika roboczego.
  11. Płuczkę serca w trybie roboczym przez 15 minut. Wartości przepływu w aortze muszą wynosić >30 ml/min pod koniec 15-minutowej perfuzji. Gdy serce się ustabilizuje, zacznij rejestrować dane w oprogramowaniu do analizy danych.
  12. Zmierz ścieki wieńcowe (przepływ wieńcowy) po 1 min, 5 minutach, 10 minutach i 15 minutach
    UWAGA: Wartości przepływu wieńcowego powinny wynosić od 10 do 20 ml/min. Przepływ wieńcowy większy niż 22 ml / min na ogół wskazuje na nieszczelność pochodzącą z niezawiązanego naczynia płucnego. Tętno powinno wynosić od 200 do 300 uderzeń na minutę. Ścieki wieńcowe można pobrać do dalszej analizy markerów uszkodzenia tkanek (np. troponiny-I, uwalniania dehydrogenazy mleczanowej).

6. Podawanie kardioplegii w celu zimnego statycznego przechowywania serca

  1. Napełnij komorę kardioplegii (umieszczoną na wysokości 60 cm, aby uzyskać ciśnienie perfuzyjne około 40 mmHg) 50 ml wyznaczonego roztworu konserwującego serce (z suplementacją lub bez).
  2. Opuść płaszcz wodny i zamknij kran trójdrożny po stronie trybu pracy.
  3. Zatrzymaj przepływ w kierunku lewej kaniuli przedsionkowej, zamykając zacisk.
  4. Otwórz przepływ do kaniuli aortalnej.
  5. Zamknąć zacisk od strony Langendoffa i na obciążeniu następczym.
  6. Otwórz zacisk z linii kardioplegii i wypłucz 15 ml kardioplegii z przewodu ciśnieniowego. Zamknij kran na przewodzie ciśnieniowym.
  7. Pozwól, aby serce zostało przepłukane kardioplegią przez kaniulę aortalną i zbierz ścieki wieńcowe. Uruchom kardioplegię przez 3 minuty i zapisz objętość podanej kardioplegii.
  8. Zatrzymaj rejestrowanie danych w oprogramowaniu i zapisz plik.
  9. Po 3 minutach zamknij zacisk kardioplegii i mały niebieski zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej.
  10. Umieść zacisk buldoga na kaniuli aortalnej i drugi zacisk buldoga na lewej kaniuli. Odłącz blok kaniuli serca od obwodu i umieść go w zlewce zawierającej kardioplegię w pojemniku na lód (Rysunek 3B, C).
  11. Przechowuj serce w lodówce przez 6 godzin (lub żądany czas przechowywania w chłodni).

7. Reperfuzja serca po przechowywaniu w niskiej temperaturze

  1. Przygotować bufor KH zgodnie z punktem 1.
  2. Zalać obwód perfuzyjny zgodnie z sekcją 2.
  3. Otwórz zapisany plik z perfuzji linii bazowej.
  4. Ostrożnie wyjmij blok kaniuli serca z pojemnika na lód i przymocuj go do obwodu perfuzyjnego. Przed ponownym podłączeniem kaniuli aortalnej użyj strzykawki 18 G wypełnionej buforem KH, aby usunąć powietrze z kaniuli. Najpierw podłącz kaniulę aortalną, otwórz rurkę clamp po stronie Langendorffa i upewnij się, że rurka obciążenia wtórnego clamp jest otwarty.
  5. Podłącz ponownie lewą kaniulę przedsionkową, upewniając się, że powietrze zostało usunięte z kaniuli przed podłączeniem do obwodu perfuzyjnego. Trzymaj stronę roboczą clamp zamknięty, aż nadejdzie czas przełączenia z Langendorff w tryb pracy.
  6. Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 15 minut. Upewnij się, że rejestracja danych rozpoczęła się na początku reperfuzji Langendorffa.
  7. Przed przełączeniem w tryb pracy należy umieścić oba bulgoczące kamienie w buforze KH, otworzyć 3-kierunkowy kran po stronie roboczej i przenieść wspólny przewód powrotny do zbiornika roboczego.
  8. Zamknij biały zacisk Langendorffa, otwórz biały zacisk po stronie roboczej i wykonuj płuczkę serca przez 30 minut. Zmierz i zbierz ścieki wieńcowe w wyznaczonych punktach czasowych do dalszej analizy (np. markery uszkodzenia serca). Upewnij się, że zatrzymałeś i ponownie uruchomiłeś nagrywanie oprogramowania, aby rozpocząć nowy segment (lub alternatywnie dodać komentarz).
  9. Po około 15 minutach reperfuzji w trybie pracy zamknij kran trójdrożny.
  10. Pod koniec reperfuzji zapisz plik danych, zatrzymaj przepływ przez obwód i odłącz blok serca. Pobrać próbki z lewej komory do przetwarzania histologicznego i/lub zamrozić je na zatrzask do przyszłych badań (np. ekstrakcji białka do badań western blot).
  11. Wyjmij filtry z uchwytów filtrów, opróżnij bufor z obwodu i dwukrotnie przepłucz 5 l wody destylowanej.
    UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, pomaga podgrzać wodę destylowaną w dużym pojemniku w łaźni wodnej.

8. Analiza funkcjonalnego odzyskiwania

  1. Otwórz plik LabChart.
  2. Podświetl region, w którym trwa co najmniej 30 sekund nagrywania, a następnie kliknij polecenie > Dodaj zaznaczenie danych LUB Wielokrotne dodawanie do danych. Spowoduje to dodanie żądanych parametrów do pliku DataPad w oprogramowaniu.
  3. Wybierz menu rozwijane Okno > DataPad.
  4. Zaznacz i skopiuj wartości odzyskiwania z DataPad do arkusza kalkulacyjnego w celu funkcjonalnej analizy odzyskiwania. Oblicz odzysk funkcjonalny jako procent odpowiedniej wartości bazowej1,6,7.

Wyniki

Wyniki podstawowej perfuzji określą, czy początkowy eksperyment (wstępne przechowywanie) zakończył się sukcesem. Przepływ aorty wyświetlany w trybie Langendorffa powinien wynosić od 14 do 22 ml/min. Przepływ Langendorffa jest wyświetlany na przepływomierzu jako wartość ujemna ze względu na wsteczną perfuzję aorty. Przykład akceptowalnego śladu Langendorffa jest pokazany w Rysunek 4A.

Po przełączeniu w tryb pracy, przepływ w aortze powinien wynosić co najmniej 30 ml/min, gdy serce się uspokoi. To normalne, że przepływ początkowo wzrasta do około 50 ml / min, a następnie zmniejsza się do około 25 ml / min, zanim wzrośnie z powrotem do stabilnego podstawowego przepływu aorty. Gdy parametry wyjściowe są zadowalające (AF > 30 ml/min, CF 10-20 ml/min, HR 200-300 uderzeń na minutę), serce może być przechowywane. Przykład dobrego śladu linii bazowej jest pokazany w Rysunek 4B.

W zależności od testowanego roztworu konserwującego, niektóre serca nie przyniosą dobrej regeneracji po długotrwałym przechowywaniu w chłodnym miejscu, mimo że mają doskonały punkt odniesienia. Przykład śladu wskazującego na słabą regenerację w trybie pracy jest pokazany w Rysunek 4C.

Końcowe funkcjonalne odzyskanie dla przepływu aortalnego może być obliczone na podstawie końcowego odczytu przepływu w aorcie jako procent wartości wyjściowej. Na przykład, jeśli wyjściowe migotanie przedsionków serca wynosiło 40 ml/min, a migotanie przedsionków na końcu reperfuzji po przechowywaniu statycznym w niskiej temperaturze wynosiło 20 ml/min, powrót do migotania przedsionków dla tego serca wynosił 50%. Przykład takiej reprezentacji danych jest pokazany w Rysunek 5.

figure-results-1
Rysunek 1: Działający obwód perfuzji serca. (A) Zdjęcie izolowanego działającego obwodu perfuzji serca szczura. Czerwone pole wskazuje, gdzie znajduje się izolowane serce. (B) Schemat izolowanego roboczego obwodu perfuzji serca wskazujący kierunek przepływu buforu KH przez obwód dla perfuzji Langendorffa (linia przerywana) i trybu pracy (linia ciągła). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja oprogramowania LabChart. (a) Konfiguracja ustawień kanałów dla ciśnienia w aorcie, przepływu aorty i tętna. (B) Przykład szablonu LabChart z trzema kanałami. W oknach po prawej stronie wyświetlane są poszczególne skonfigurowane kanały. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kaniulacja i kardioplegia. (A) Kaniulacja serca przed umieszczeniem w komorze płaszcza wodnego. Lewa kaniula jest wprowadzana do aorty, a prawa kaniula jest wprowadzana do lewej komory przez wyrostek lewego przedsionka. Naczynia płucne zostały związane, a tkanka płucna wycięta. (B) Po podaniu kardioplegii serce umieszcza się w zlewce zawierającej roztwór kardioplegii. Kaniule zostały zaciśnięte za pomocą klipsów typu bulldog przed odłączeniem od zestawu. (C) Przykład serc umieszczonych w pojemniku na lód w celu długotrwałego przechowywania w chłodni. Tutaj przechowywano dwa serca do reperfuzji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykłady śladów LabChart. Ślady ciśnienia (czerwony wykres), przepływu w aorty (niebieski wykres) i tętna (zielony wykres) dla serca z (A) dobrym śladem Langendorffa, (B) dobrą regeneracją podczas reperfuzji w trybie pracy, (C) słabą regeneracją podczas reperfuzji w trybie pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne wykresy dla powrotu do sprawności. (A) przepływ aortalny, (B) przepływ wieńcowy, (C) rzut serca i (D) tętno. Ten rysunek został ponownie wykorzystany za zgodą Gao et al.8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę wrażliwy charakter podstawowej funkcji serca, należy zachować ostrożność, aby utrzymać zestaw do perfuzji w czystości i z kompatybilnymi komponentami. Na przykład należy użyć odpowiedniej rurki PVC. Niektóre materiały rurek, takie jak silikon, mogą przyczyniać się do zmniejszenia przepływu i kurczliwości aorty, co może być spowodowane utratą tlenu przez rurkę. Chociaż na rynku dostępne są izolowane działające obwody perfuzji serca szczura, większość z nich jest używana głównie do perfuzji Langendorffa. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary funkcjonalne można uzyskać w modelu perfuzji Langendoffa poprzez wprowadzenie cewnika balonowego do lewej komory w celu uzyskania pomiarów ciśnienia rozkurczowego lewej komory (LVDP). Jednak możliwość pomiaru surowego przepływu aorty i pojemności minutowej serca w systemie perfuzyjnym Langendoffa nie jest możliwa. Główną zaletą protokołu IWRH jest możliwość uzyskania pomiarów funkcjonalnych przepływu z aorty i rzutu serca bez konieczności dodatkowych interwencji serca (tj. cewnika balonowego). Istnieją komercyjne opcje działającego systemu perfuzji serca szczura i chociaż można je dostosować do indywidualnych wymagań badania, systemy te mogą być kosztowne.

W protokole znajdują się krytyczne kroki mające na celu zapewnienie optymalnej wyjściowej funkcji serca gryzonia podczas perfuzji. Przygotowanie roztworów buforowych KHB nie powinno być starsze niż 4 tygodnie. Podczas zalewania obwód perfuzyjny musi być wolny od pęcherzyków powietrza. Należy zachować ostrożność podczas kaniulacji uszka lewego przedsionka. Nadmierne obchodzenie się z tkanką może zwiększyć ryzyko rozdarcia, a także może przyczynić się do funkcjonalnej drażliwości serca.

Jakość działania obwodu perfuzyjnego IWRH można ogólnie określić na podstawie odczytów wyjściowych uzyskanych w sercach (AF > 30 ml / min, CF ~ 20 ml / min). Dalsze badania kontroli jakości w modelu CSS można przeprowadzić poprzez zatrzymanie i przechowywanie serca w roztworze konserwującym Celsior uzupełnionym 1 μmol/l zoniporide plus 0,1 mg/ml triazotanu glicerolu. Serca zatrzymane preparatem Celsior uzupełnione trójazotanem glicerolu i zoniporydem gwarantują natychmiastowy powrót do reperfuzji Langendorffa i ostateczny powrót funkcjonalny na poziomie 40-60% po 6 godzinach przechowywania w chłodni. W razie wątpliwości, czy platforma działa dobrze, ta suplementacja kontroli jakości jest przydatna do przetestowania.

Metody wykorzystania serc gryzoni pozyskanych w drodze dawstwa po śmierci krążeniowej zostały opisane wcześniej10,11. Krótko mówiąc, szczury są znieczulane, tętnica szyjna jest kaniulowana i uzyskuje się odczyty ciśnienia. Heparyna (500 j.m.) jest wstrzykiwana przez kaniulę tętnicy szyjnej. Tchawica jest podwiązana, aby zainicjować odłączenie aparatury podtrzymującej życie. Po osiągnięciu wymaganego czasu ciepłego niedokrwienia serce można wyciąć i wprowadzić do obwodu perfuzyjnego. W celu podania roztworu konserwującego do serca DCD, 60 ml roztworu konserwującego przepłukuje się przez aortę (~20 ml / min) przez przewód ciśnieniowy w obwodzie. Naczynia płucne są wiązane, płuca są preparowane, wprowadzana jest lewa kaniula, a następnie 40 ml roztworu konserwującego jest przepłukiwane przez przewód ciśnieniowy. Serce jest następnie perfundowane zgodnie z powyższym protokołem. Odzyskiwanie funkcjonalne jest traktowane jako surowa wartość hemodynamiki funkcjonalnej, a analiza statystyczna jest przeprowadzana poprzez porównanie wartości z tymi sercami, które były operowane pozorami (jednak bez DCD przepłukanego na platformie).

Metody wykorzystania serc gryzoni pozyskanych po śmierci mózgu zostały już wcześniej opisane12. Krótko mówiąc, zwierzęta są znieczulane, intubowane i wentylowane, z monitorowaniem hemodynamicznym zgodnie z protokołem gryzoni DCD. W czaszce skroniowo-ciemieniowej wykonuje się otwór na zadzior, a cewnik do embolektomii 3F umieszcza się podtwardówkowo. Fałszywe kontrolki mają otwory na zadziory, ale nie wprowadzają cewnika. Balon jest napełniany 0,3 ml wody przez 2 minuty i utrzymywany napompowany przez 1 godzinę. Po 1 godzinie obserwacji hemodynamicznej serca są eksplantowane i umieszczane na izolowanym działającym obwodzie perfuzji serca, rejestrowane są pomiary podstawowe, podawana jest kardioplegia, a serca są przechowywane w zimnym miejscu, jak opisano powyżej.

Głównym ograniczeniem korzystania z obwodu perfuzyjnego IWRH jest brak możliwości użycia buforu perfuzyjnego opartego na krwi do krążenia w systemie. Niemożliwe byłoby pozyskanie wystarczającej ilości krwi gryzoni, aby dodać ją do perfuzatu; Dlatego perfuzja krwi nie jest możliwa. Alternatywne modele, takie jak heterotopowy przeszczep serca u gryzoni lub badania ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach, prawdopodobnie będą musiały zostać przeprowadzone w celu zbadania wpływu perfuzji krwi. Jednak te alternatywne metody wymagają specjalistycznej wiedzy w zakresie umiejętności mikrochirurgicznych i/lub dużych placówek chirurgicznych zwierząt oraz doświadczonych anestezjologów, perfuzjonistów i kardiochirurgów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Opisane tutaj badania zostały sfinansowane z grantów przyznanych P.S Macdonaldowi przez National Health and Medical Research Council Australia, St Vincent's Clinic Foundation oraz NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml bezbarwna probówka Eppendorffa, 1000 w opakowaniuBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 ml centów/probówki (S) Rękaw/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BPADInstrumentsMLT1199Data Acquisition
Bridge AmpADInstrumentsFE221Akwizycja danych
Carbogen 555G2BOCBOC002
Termometr Checktemp1Hanna InstrumentsHI98509Zacisk do budowy przyponu
1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Zacisk do budowy przyponu
z trzpieniem przedłużającym Med.Thomas Scientific8847T08Zacisk do budowy wiertni
z trzpieniem przedłużającym Sm.Thomas Scientific8847T02Klipsy do budowy platformy
, naczynie, 60 g Spójne ciśnieniowoScientific14121Sprzęt chirurgiczny
Zamknięte złączeThomas Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 wstępnie przycięty 45 cm pudełko z 24specjalistycznymi artykułami medycznymiS195Chirurgiczne materiały eksploatacyjne
Wykonany na zamówienie odgazowywacz z płaszczem 250 mlNiestandardowe dmuchane szkło Pty LtdN/ARig Construction
Custom Made 750 mL ReservoirCustom Blown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
D-(+)-Glukoza Bezwodna SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgAby wykonać dwukanałową konsolę bufora Krebs
ADInstrumentsTS402Akwizycja danych
Kolby Erlenmyera 2 L 
Filtr Mikrofibra typ GF/C włókno szklane 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Kleszcze, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Sprzęt chirurgiczny Zaciski
czterema bolcami z długim ramieniem 9 mm x 115 mm do trzymania przedmiotów o średnicy 2-70 mm. Powlekany winylemMet-App Australia Pty Ltd1352
Cyrkulator grzejnika budowlanego. Cyfrowe sterowanie półprzewodnikowe. (1020 watów/240 woltów)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Heparyna 5000 U/5 mL pudełko 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Ketamina 100 mg/50 mlProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Znieczulający
siarczan magnezu siedmiowodny AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gDo produkcji krebs
Buffer męski/żeński adapter zawiasowyThomas Scientific8847V08Konstrukcja platformy
Masterflex L/S Łatwa w ładowaniu głowica do rur precyzyjnych, PPS, wirnikCRSJohn Morris1015164Rig Construction
Nożyczki Metzenbaum, zakrzywione 11,5 cmCoherent ScientificWPI-501748Sprzęt chirurgiczny
Nożyczki Metzenbaum, 14,5 cm prosteCoherent ScientificWPI-501252Sprzęt montażowy do sprzętu chirurgicznego
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414montażowe do głowic pomp
Łącznik otwartyThomas Scientific8847E05Budowa platformy
ParaformadehydeSigma-AldrichP6148-500GPrzetwarzanie próbek
Chlorek potasu (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals 26764.26Do produkcji jednozasadowego fosforanu potasu buforu Krebsa
 Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gAby wykonać Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2-kanałowy rejestrator + oprogramowanie LabchartADInstrumentsML826Sprzęt komputerowy i oprogramowanie
Precyzyjny czujnik przepływu XN Inline, 3,2 mm (1/8") ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNSkalpel do budowy platform
z rękojeścią jednorazowy #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Uszczelka silikonowa do Swinnex 47 mm 5 / PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Silikonowy O-ring 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Pojedynczy zacisk biuretyThomas Scientific8847T32Konstrukcja platformy
Wsuwany wlot filtra Wielkość porów 10 i mikro; m (bubbler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Łącznik obrotowyThomas Scientific8847E35Konstrukcja wiertni
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gDo produkcji Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Construction
strzykawki 1 mL pudełko/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
zaciski bolcowe o średnicy 9 mm x długim ramieniu 125 mm i podwójnej do trzymania 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356rurowego do budowy platform
TS410ADInstrumentsTS410Rurka do akwizycji danych
PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50ft Rolka 15,24 m, przezroczysta, bez ftalanów DEHP, klasa spożywcza spełnia REACThermo FisherNAL 8701-0600Budowa platformy
Rurka PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD 50 stóp Rolka 15,24 m, przezroczysta, bez ftalanów DEHP, dopuszczona do kontaktu z żywnością REACThermo FisherNAL 8701-0900Rurka do budowy wiertni
PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD 100ft RolkaThermo FisherNAL 8701-4120Nożyczki do budowy platform
Vannas, 8,5 cm, proste, ostrza 7 mmSpójne naukoweWPI-500-086Sprzęt
chirurgicznyŁaźnia wodna 30 litrów z tacą podwieszanąThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
Zestaw przetworników/ z Trzy Moduł przepływomierza

Bibliografia

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
  4. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
  6. Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
  7. Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
  8. Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
  9. Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
  10. Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
  11. Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
  12. Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uszkodzenie reperfuzyjnepowr t funkcji sercastatyczne przechowywanie w niskiej temperaturzeperfuzja Langendorffaroztw r kardioplegicznypomiar przep ywu w aorcieobw d perfuzyjny serca

Powiązane artykuły