Artykuł metodologiczny

Hellgrammite jako niekonwencjonalny biomonitor do oceny wód powierzchniowych i zdrowia środowiska

718 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66911

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  , 
1Posgrado en Hidrociencias, Colegio de Postgraduados, 2Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio de Evaluación de la Salud de los Ecosistemas Acuáticos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 3Instituto Politécnico Nacional, Coordinación Politécnica para la Sustentabilidad

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie biomarkerów do wczesnego wykrywania szkodliwych skutków w ekosystemach wodnych. Biomarkery są ściśle związane z cechami wartowniczymi, a ich zmiany pomagają w wykrywaniu uszkodzeń wczesnego ostrzegania.

Streszczenie

Larwy dobsonfów z rodzaju Corydalus, powszechnie znane jako Hellgrammites, charakteryzują się znaczącymi rozmiarami, szerokim zakresem występowania i długim okresem niedojrzałości, który może trwać do jednego roku. Hellgrammity są wyraźnie znane z tego, że wykazują wrażliwość na zanieczyszczenia i wpływ na strukturę siedlisk. Biorąc pod uwagę te unikalne cechy, wykorzystanie larw Corydalus texanus jest wysoce odpowiednie jako wiarygodne środki biomonitoringu do oceny integralności ekologicznej ekosystemów wodnych. Protokół ten ma na celu dostarczenie niezbędnych narzędzi do oceny C. texanus i wykazanie ich skuteczności poprzez studium przypadku. Wyniki badań mają praktyczne implikacje, wskazując, że larwy C. texanus wykazują wczesne reakcje ostrzegawcze na zanieczyszczenia górnicze, bioakumulację dużych ilości metali ciężkich, takich jak Zn, Fe i Al. Obecność lub brak populacji C. texanus może służyć jako pomocny wskaźnik do identyfikacji potencjalnych problemów związanych ze zdrowiem ekosystemu. Niekonwencjonalne podejście zaowocowało wczesnymi ostrzeżeniami o zanieczyszczeniu w zakładach górniczych, co uwypukliło potrzebę podjęcia w odpowiednim czasie działań w celu ochrony środowiska. Biorąc pod uwagę ich unikalne cechy, stosowanie larw C. texanus jest wysoce sugerowane jako wiarygodnego niekonwencjonalnego bioindykatora.

Wprowadzenie

Hellgramites to larwy owadów z rzędu Megaloptera (Latreille, 1802), zwane dobsonflies lub fishfly w stadium dorosłym. Niska różnorodność, ale powszechność charakteryzuje tę grupę larw owadów drapieżnych z ekosystemów wodnych1. Gatunki Hellgramitów występują w dobrze zdefiniowanych regionach biogeograficznych; W związku z tym stosunkowo łatwo jest zidentyfikować gatunki bez dużej wiedzy taksonomicznej. Warto zauważyć, że larwy Corydalidae posiadają najbardziej znane gatunki z rzędu Megaloptera (20-90 mm długości ciała)2, co sprawia, że hellgramit jest widoczny gołym okiem.

Hellgrammity odgrywają kluczową rolę w ekosystemach wodnych jako drapieżniki, z potężną obecnością dzięki dużym gryzakom, które wskazują na ich imponujący drapieżny kształt. Grzbietowo-brzusznie spłaszczone ciało łączy się również z 7-8 parami skrzeli włókien wzdłuż ciała, a torebka głowa z sześcioma łodygami na bok sprawia, że hellgrammity są fascynującymi organizmami dla entomologów i fanów3. Dorosłe osobniki Corydalidae zaskakują i tworzą wrażenie na ludziach ze względu na swój wyraźny rozmiar; Są one jednak całkowicie nieszkodliwe. Warto zauważyć, że hellgrammity mają zdolność do przetrwania w środowisku wodnym w stadium larwalnym przez znaczny czas.

Fenotypowe cechy hellgrammitów dają szczególną szansę na podkreślenie ich roli w ekosystemach wodnych; niemniej jednak ich potencjał wskaźnikowy jest najbardziej pożądaną cechą dla ekologów wodnych. Ogromna wiedza na temat ich potencjału bioindykacyjnego jest podkreślana w ekosystemach wodnych, ponieważ ich występowanie wiąże się z dobrymi warunkami zdrowotnymi w ich siedliskach ze względu na ich nietolerancję na zanieczyszczenia organiczne w wodach powierzchniowych4,5,6,7,8.

Większość megalopterów Corydalidae żyje w szybko płynących wodach jako bystrza i podłoża zdominowane przez bruk i kamyki, ale hellgrammity występują również w strumieniach o niskim nachyleniu z zaczepami i podłożami piaskowymi, a także w siedliskach lentycznych, takich jak jeziora3,9,10. Ich szeroki zakres występowania odzwierciedla krytyczne cechy czołowego drapieżnika i ich zdolność do kolonizacji kilku siedlisk, do czego dążą ich skuteczne strategie historii życia11. Hellgramici łączyli swoje cechy z dynamiką ekosystemów wodnych; tak więc strategie takie jak adaptacja do oddychania powietrznego przez przetchlinki (oprócz ich brzusznych kępek skrzeli tchawicy) są właściwe dla strategii Corydalidae10.

Hellgrammites zamieszkują określone ekosystemy i wykazują szybkie reakcje na odchylenia od ustalonych wzorców, służąc tym samym jako system wczesnego ostrzegania7. Reakcje tych dzikich organizmów fauny i flory mogą być wykorzystane jako cenne narzędzie do oceny wpływu zanieczyszczenia na ekosystemy wodne, szczególnie w przypadku mieszanin zanieczyszczeń niebędących przedmiotem zwalczania. Stwierdzono pewne szkodliwe skutki dla organizmów żywych w ekosystemach ze względu na indywidualną toksyczność chemikaliów, ale należy określić wpływ mieszanin zanieczyszczeń. Wczesne reakcje ostrzegawcze ze strony hellgrammitów mogą umożliwić zidentyfikowanie szkodliwych skutków poprzez odniesienie do wpływu mieszaniny zanieczyszczeń lub nawet wtedy, gdy indywidualne skutki zanieczyszczeń rozpoznają stężenie bez obserwowalnego skutku (NOEC)12.

Kilka organizmów modelowych zostało wykorzystanych do eksperymentalnych testów ostrych i przewlekłych; jednak są one hodowane i utrzymywane w kontrolowanych warunkach13. Kontrolowane warunki sprawiają, że nie są one w stanie zidentyfikować niedocelowych skutków kilku zanieczyszczeń, na które są narażone. NOEC jest również często rozpoznawany ze względu na złożoność mieszaniny zanieczyszczeń. Z tego powodu w ostatnich dziesięcioleciach rozpoznano niemodelowe gatunki rodzime o skutkach niedocelowych w systemach przesiewowych, które są niezbędne do prowadzenia badań ekotoksykologicznych14. W związku z tym wydaje się, że piekielnice są w stanie ocenić szkodliwe skutki zanieczyszczenia w ekosystemach wodnych. Cechy takie jak między innymi biologia, genetyka i fizjologia sprawiają, że organizmy niemodelowe nadają się do oceny wpływu w ekosystemach14.

Ten protokół ma na celu stworzenie nowatorskiego narzędzia do biomonitoringu przy użyciu organizmu niebędącego modelem, który może wykrywać sygnały wczesnego ostrzegania w odpowiedzi na mieszaniny zanieczyszczeń niebędących celem. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, cechy wykazywane przez larwy modelowego gatunku, C. texanus, zostały kompleksowo rozważone i włączone do analizy15.

Protokół

figure-protocol-1
Rysunek 1: Szybki przewodnik krok po kroku, jak używać niekonwencjonalnego biomonitora Corydalus texanus do wdrożenia w ekosystemach wodnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Praca w terenie

  1. Zidentyfikuj miejsca badań znajdujące się przed i za źródłem zanieczyszczeń, w których rozpoznaje się podejrzewane lub ewidentne oddziaływanie (tj. emisje punktowe lub rozproszone).
    UWAGA: Niniejszy protokół obejmował 15 stanowisk badawczych w czterech głównych rzekach: 1) Rzeka Extoraz (stanowiska PB, EZ, RQ, BC); 2) Rzeka Escanela-Jalpan (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Rzeka Ayutla (AY); oraz 4) Rzeka Santa María (SM, AT).
  2. Wyszukaj i zlokalizuj co najmniej jeden ośrodek referencyjny (miejsce o niewielkim wpływie lub bez wpływu) i zdefiniuj je jako ośrodek badawczy.
    UWAGA: Dla obecnych ośrodków badawczych BC, ES, SM, AY i AT zostały uznane za ośrodki referencyjne.
  3. Rozpoznaj pewne atrybuty siedlisk, które zwiększają prawdopodobieństwo znalezienia osobników C. texanus. Należą do nich podłoże żwirowe, siedliska skaliste o bardziej stromych nachyleniach, przepływy o dużej prędkości, dobrze natlenione wody, duża gęstość koron drzew oraz siedliska na wyżynach i nizinach.
  4. Ogrodz 100-metrowy odcinek strumienia, aby zidentyfikować odpowiednie siedliska do biomonitoringu16.
  5. Wejdź do strumienia, aby pobrać próbki.
  6. Pobrać próbki od co najmniej sześciu osobników C. texanus w siedliskach takich jak bystrza, kamyki, czyste wody i zanieczyszczenia za pomocą siatki o rozmiarze oczek 500 μm.
  7. Usuń kamienie w kierunku przepływu wody i przenieś larwy do siatki.
  8. Trzymaj siatkę z pobranymi larwami i przenieś je do wyznaczonych butelek w celu tymczasowego utrzymania. Z siatką należy obchodzić się ostrożnie i zgiąć krawędzie do wewnątrz, aby zapobiec utracie larw.
  9. Zmierzyć szerokość głowy larw, od których pobiera się próbki, za pomocą suwmiarki w celu identyfikacji stadium IX–XI (w zakresie od 6 mm do 10 mm).
  10. Oczyść larwy, zanurzając je w butelce zawierającej wodę ze strumienia na 30 minut.
  11. Umieść próbki w plastikowych butelkach z wyraźnym oznakowaniem, a następnie poddaj je eutanazji przez zanurzenie w ciekłym azocie (-75 °C) w zbiorniku kriogenicznym.
  12. Próbki należy bezpiecznie transportować i przechowywać w temperaturze -45 °C w ultrazamrażarce w laboratorium.
  13. Za pomocą butelki polietylenowej pobrać próbkę wody strumieniowej o objętości 200 ml, dodać 1 ml kwasu azotowego i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C w celu późniejszego ilościowego oznaczenia metali ciężkich w laboratorium.

2. Sekcja pobranych larw i separacja tkanek

  1. Umieść plastikową tackę do wycinków na lodzie i poczekaj, aż osiągnie 4 °C, używając termometru, aby sprawdzić.
  2. Weź próbki z ultrazamrażarki i umieść je na tacy do sekcji, aby rozpocząć sekcję.
  3. Wybierz tkanki docelowe: mięśnie, gałęzie, cewę nerwową i egzoszkielet.
  4. Użyj noża ceramicznego, aby zdjąć głowę i ostrożnie oddzielić tkanki. Otwórz korpus wzdłużnie i usuń skrzela z każdej strony.
  5. Oddziel egzoszkielety za pomocą mniejszego noża ceramicznego i oczyść nadmiar tkanki. Umieść egzoszkielety w piekarniku i susz je w temperaturze 80 °C przez 48 godzin.
  6. Po upływie tego czasu przechowuj suche egzoszkielety do dalszej analizy.
  7. Utrzymuj czyszczenie tkanek miękkich w niskich temperaturach w celu dalszej analizy za pomocą mikrotestów.
  8. Użyj małego noża ceramicznego, aby wydobyć miękkie tkanki z tłuszczu. Oddzielić i połączyć każdą tkankę docelową od osób z tego samego punktu pobierania próbek.
  9. Przechowuj każdy typ tkanki w mikroprobówce o pojemności 2 ml, utrzymując niską temperaturę przez cały proces.
  10. Aby przygotować każdą tkankę docelową, należy zważyć 100 mg tkanki i dodać 1 ml roztworu PBS o pH 7,4. Użyj jednoręcznego tearora tkankowego, aby homogenizować każdą tkankę. Zazwyczaj tkanki miękkie wymagają trzech cykli po 10 s każdy.
  11. Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do mikroprobówki o pojemności 1 ml.
  12. Wykonaj testy mikromarkerów.

3. Kwantyfikacja metali ciężkich

  1. Zważyć 250 mg wysuszonych egzoszkieletów z co najmniej sześciu próbek w określonym stadium rozwoju za pomocą wagi analitycznej.
  2. Zmiel egzoszkielety w szklanym moździerzu, aż staną się drobno sproszkowane. Dodać 250 ml ultraczystego kwasu azotowego do naczyń reakcyjnych w proszku.
  3. Aby roztrawić próbki, przenieś je do kuchenki mikrofalowej do mineralizacji w temperaturze 180 °C przez 30-45 min.
    UWAGA: Użyj odpowiedniego pojemnika nadającego się do kuchenki mikrofalowej marki kuchenki mikrofalowej, aby bezpiecznie i skutecznie podgrzewać próbki. Czas trawienia próbek tkanek różni się w zależności od marki kuchenki mikrofalowej i wynosi 30-45 minut. Niektóre marki oferują ustandaryzowane metody.
  4. Przeprowadzić roztwarzanie mikrofalowe dla próbek wody zgodnie z metodą EPA3015A, używając 45 ml próbki wody i dodając 5 ml kwasu azotowego.
  5. Pomiar metali ciężkich i metaloidów w strawionych próbkach (wodzie i tkankach) za pomocą optycznej spektroskopii emisyjnej ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES), w tym Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba i As.
    UWAGA: Użyj argonu klasy 5 i roztworów wzorcowych każdego metalu i metaloidu, aby skonstruować krzywą kalibracyjną.

4. Mikrotesty do oceny stresu oksydacyjnego i biomarkerów

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Wymieszaj 6 g NaH2PO4 z 1000 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 50 mM monozasadowego buforu fosforanowego. Przechowywać w kolbie w temperaturze 2-8 °C przez czas nieokreślony.
    2. Aby uzyskać 8,1% SDS, rozpuść 450 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS) w 5 ml ultraczystej wody. Przygotuj się tuż przed użyciem.
    3. Rozcieńczyć 2 ml kwasu trichloroetanowego (TCA) w 8 ml ultraczystej wody (w razie potrzeby przygotować świeży odczynnik).
    4. Rozpuścić 100 mg tetrabutyloamonu (TBA) w 10 ml ultraczystej wody (w razie potrzeby przygotować świeży odczynnik).
    5. Aby uzyskać 50 mM PBS pH 7,8, rozpuść 97 mg Na2HPO4 i 59 mg NaH2PO4 w 10 ml ultraczystej wody. Następnie dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH, aby zwiększyć lub HCl, aby zmniejszyć.
    6. Przygotować roztwór katalazy bydlęcej o stężeniu 200 μg/ml, rozpuszczając 8 mg w 40 μl ultraczystej wody (w razie potrzeby przygotować świeży odczynnik).
    7. Aby przygotować 50 mM TRIS/5 mM roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), dodaj 6,05 g tris (hydroksymetylo)aminometanu (TRIS) i 0,073 g EDTA do 45 ml ultraczystej wody. Za pomocą HCl należy dostosować pH do 7,6 i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    8. Dla 0,1 M zredukowanego glutationu (GSH) (dla 45 zduplikowanych próbek) odważyć 0,0184 g GSH i rozpuścić go w 600 μl 10 mM HCl.
    9. Aby przygotować 10 mM HCl, dodaj 0,5 μl stężonego HCl do 599,5 μl ultraczystej wody.
    10. Dodaj 28,5 μl reduktazy glutationowej do 1,4 ml 0,1 M TRIS/HCl 0,5 mM EDTA pH 8,0.
    11. Zmieszaj 1,211 g TRIS i 0,0146 g EDTA z 90 ml ultraczystej wody, aby przygotować 0,1 M TRIS/HCl i 0,5 mM roztworu EDTA o pH 8,0. Dodaj HCl, aby w razie potrzeby dostosować pH. Roztwór można przechowywać w nieskończoność w temperaturze 2-8 °C.
    12. Odważyć 0,075 g NADPH i dodać do 2,25 ml 1% NaHCO3 1 mM EDTA.
    13. Wymieszaj 1 g NaHCO3 i 0,0282 g EDTA w 100 ml ultraczystej wody, aby przygotować 1% roztwór NaHCO3 i 1 mM EDTA. Przechowywać roztwór w temperaturze 4-8 °C przez nieokreślony czas.
    14. Zmieszaj 2 μl wodoronadtlenku t-butylu z 2 ml ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7 mM. Wymieszać bezpośrednio przed użyciem.
    15. Zmieszaj 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 1 ml ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 μg/μl.
  2. Substancje reaktywne kwasu tiobarbiturowego (TBARS) (peroksydacja lipidów, LPO)17
    1. Dodać 5 μl supernatantu tkankowego do mikroprobówki o pojemności 1 ml. Dodać 45 μl z 50 mM PBS (świeży i podstawowy roztwór).
    2. Dodaj 12,5 μl 8,1% SDS (świeżo przygotowanego). Dodać 93,5 μl 20% TCA pH 3,5 (świeżo przygotowanego).
    3. Dodaj 93,5 μl 1% TBA (świeżo przygotowanego). Uzupełnij objętość, dodając 50,5 μl ultraczystej wody. Zamknij pokrywę probówki i wiruj ją przez 30 sekund.
    4. Nakłuć pokrywkę mikroprobówki igłą i inkubować we wrzącej wodzie przez 10 minut.
    5. Schłodzić probówkę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odwirować ją przy 1000 x g przez 10 minut.
    6. Dodać 150 μl supernatantu do studzienki w 96-dołkowej mikropłytce i zmierzyć absorbancję przy 530 nm za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.
    7. Aby określić ilościowo nadtlenki lipidów, należy utworzyć 8-punktową krzywą kalibracyjną TBARS (0-160 μM) przy użyciu dialdehydu malonowego bis (octanu dimetylu), jak opisano w tabeli 1. Dostosuj krzywą dialdehydu malonowego (MDA) do typu tkanki lub podejrzewanego poziomu uszkodzenia.
    8. Wyraź wyniki jako białko nmol MDA eq·mg−1.
  3. Test mikroenzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej (SOD)18
    1. Użyj płytki 96-dołkowej. Dodać 147 μl 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 do dwóch studzienek jako ślepe próby. Dodać 144 μl 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 do innych studzienek przez duplikat.
    2. Pobrać 3 μl z supernatantu i dodać je do studzienek na próbki. Delikatnie wymieszaj kilkakrotnie zawartość na talerzu.
    3. Dodaj 3 μl 10 mM kwasu pirogalowego do każdego dołka w ciągu 30 sekund. Natychmiast delikatnie wymieszaj.
    4. Zmierzyć absorbancję przy T0 (czas = 0 s) i T10 (czas = 10 s), przy 420 nm i temperaturze 25 °C.
    5. Oznaczyć SOD, obliczając procentową inhibicję pirogalolu w próbce, stosując następujące równanie:
      figure-protocol-2
      Gdzie
      x% = procent utlenienia pirogalolu przez SOD w próbce; Dlatego utlenianie pirogalolu jest równe 100 - x%
      UWAGA: Obliczanie aktywności SOD przy założeniu, że 1 j.m. to objętość, która hamuje 50% utleniania pirogalolu, jak opisano poniżej:
      figure-protocol-3
      Gdzie
      y = objętość próbki w mililitrze (hamuje 50% pirogalonu)
      50% = procent inhibicji pirogalolu równa się 1U SOD
      0,003 = objętość próbki w mililitrach
      100 - x% = procentowe zahamowanie pirogalolu przez próbkę
    6. Na koniec określ aktywność SOD za pomocą równania:
      figure-protocol-4
      SOD = aktywność SOD w jednostkach międzynarodowych na mikrogram białka
      Y = objętość próbki, która hamuje 50% pirogalolu
      100 = współczynnik konwersji z decylitra na mililitr.
      białko = stężenie białka uzyskane z oceny ilościowej Bradforda jest wyrażone w mikrogramach na mililitr; Konieczne jest podzielenie przez 10, aby przeliczyć na gramy na decylitr
  4. Test mikroenzymu antyoksydacyjnego katalazy (CAT)19,20
    1. Użyj 96-dołkowej mikropłytki. Dodać 20 μl supernatantu próbki do studzienek (przez duplikat).
    2. Dodać 20 μl świeżej katalazy (200 μg/ml) do studzienek jako standard (przez duplikat). Dodać 100 μl 50 mM PBS o pH 7,8 do próbki i ślepej próby.
    3. Dodaj 100 μl 90 mM (30%)H2O2do studzienek, aby rozpocząć reakcję. Po dodaniuH2O2odczytywać absorbancję co 15 s przez 2,5 min przy 240 nm.
    4. Oblicz aktywność za pomocą równania:
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
  5. Test enzymatyczny peroksydazy glutationowej (GPx)21
    1. Użyj 96-dołkowej mikropłytki.
    2. Zmieszać 240 μl 0,1 M roztworu GSH, 1 200 μl 10 U/ml roztworu GSH-Rd i 1 200 μL 4 mM NADPH. Utrzymuj roztwór na lodzie.
    3. Dodać do studzienek 100 μl 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7,6. Dodać ponownie 1 μl próbki sklarowanej nad osadem. Postukaj w mikropłytkę i delikatnie wymieszaj.
    4. Dodać 50 μl roztworu mieszającego (krok 4.5.2) i delikatnie wymieszać.
    5. Dodać 20 μl roztworu wodorotlenku t-butylu o stężeniu 7 mM do studzienek, aby rozpocząć reakcję (rozpoczęcie reakcji w 16 zduplikowanych próbkach zajmuje około 15 s). Szybko wymieszaj mikropłytkę.
    6. Monitorować absorbancję co 1 minutę przez 5 minut w temperaturze 25 °C przy długości fali 340 nm.
    7. Oblicz aktywność GPx za pomocą równania:
      figure-protocol-10
      Gdzie
      GPx = aktywność w milimolach na minutę na mikrogram białka
      ΔAbs340/min= średnia absorbancja w delta
      103 = konwersja molowa na milimolowa
  6. mg prot = stężenie białka z oznaczenia Bradforda wyrażone w mikrogramach na mikrolitr
    1. Kwantyfikacja białek za pomocą analizy Bradforda22
    2. Wykonać krzywą wzorcową z roztworów albuminy surowicy bydlęcej (BSA), zebranej z roztworu podstawowego 1 μg/μl, jak pokazano w tabeli 2.
    3. Użyj 96-dołkowej mikropłytki. Dodać 190 μl odczynnika Bradforda do próbki i studzienek wzorcowych.
    4. Dodać 10 μl BSA do standardowych studzienek przez duplikat. Dodać 10 μl supernatantu do studzienek na próbki.
    5. Delikatnie wymieszać końcówką pipety.
    6. Odczyt absorbancji przy długości fali 595 nm. Określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej.

Wyniki

Wyniki badania pokazują, że metale ciężkie, w szczególności Aluminium (Al), Żelazo (Fe) i (Zn), mają szkodliwy wpływ na środowisko, czego dowodem jest Rysunek 2. Wykrycie wysokiego poziomu metali ciężkich zarówno w próbkach tkanek, jak i wody pobranych ze wszystkich miejsc doprowadziło do niekorzystnego wyniku. Wykryto wartości odstające, ze współczynnikiem bioakumulacji (BAF) wynoszącym 600, szczególnie na obszarach intensywnie wydobywających, takich jak rzeka Extoraz (miejsca PB, EP, RQ i BC pokazane w Rysunek 3). Co ciekawe, w niektórych miejscach badań, w których stężenie w wodzie było nienormalnie wysokie (PB), nie było możliwe znalezienie próbek C. texanus. Oznacza to, że próg bioakumulacji został prawdopodobnie przekroczony.

figure-results-1
Rysunek 2: Wykres pudełkowy czynnika bioakumulacji (BAF) oceniany u osób Corydalus texanus pobranych w 15 miejscach badań. Współczynnik bioakumulacji (BAF) obliczono dla metali Al, Fe i Zn na podstawie analizy próbek wody i egzoszkieletów osobników C. texanus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponieważ SGBR jest chronionym obszarem naturalnym, ważne jest, aby upewnić się, że nie zajdą żadne zmiany środowiskowe, które mogłyby wpłynąć na organizm wskaźnikowy. Zaobserwowano jednak gradienty w odpowiedziach biomarkerów stresu oksydacyjnego (Ryc. 3). Zgodnie z oceną, miejscami o najniższych poziomach uszkodzenia błony komórkowej, o czym świadczą poziomy LPO, były EN, SM i CN. Te same miejsca wykazywały niski poziom aktywności SOD, który służy jako główny enzym w obronie organizmu przed stresem oksydacyjnym. Sugeruje to, że w tych lokalizacjach występuje minimalny stres oksydacyjny, a zatem można rozważyć interwencje, które nie wpływają na organizmy wskaźnikowe. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowano, że aktywność GPx jest znacznie niższa w różnych miejscach, a mianowicie EP, RQ, BC i ES, gdzie odnotowano wysokie poziomy LPO. Obserwacja ta sugeruje, że organizm reaguje na stresujące warunki spowodowane głównie przez górnictwo. Po ocenie markerów wczesnego ostrzegania w tym konkretnym organizmie odkryto, że niektóre miejsca mają niski i wysoki poziom wpływu. Odkrycia te skutecznie pokazują użyteczność wykorzystania tego gatunku jako niekonwencjonalnego strażnika.

figure-results-2
Rysunek 3: Wykres pudełkowy ocenianych odpowiedzi biomarkerów u próbek Corydalus texanus w 15 miejscach pobierania próbek w trzech głównych rzekach wpływających do dorzecza w Meksyku (Rezerwat Biosfery Sierra Gorda) podczas pory suchej i mokrej. Odpowiedzi mierzono za pomocą trzech biomarkerów: (A) poziom peroksydacji lipidów (LPO) odzwierciedlający wczesne uszkodzenie komórek, (B) odpowiedź przeciwutleniająca dysmutazy ponadtlenkowej obrony komórkowej pierwszej linii (SOD) oraz (C) odpowiedź przeciwutleniająca obrony komórkowej przez peroksydazę glutationową (GPx). Czerwone strzałki wskazują na brak osobników biomonitorujących lub bardzo ograniczoną liczbę okazów, co wystąpiło tylko raz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
rura200 μM MDA bis (μL)Woda ultraczysta (μL)Stężenie MDA bis (μM)
1010000
cyfra arabskaRozdział 12,5Klasa 987,5Rozdział 2.5
3259755
45095010
510090020
6200800Rozdział 40
7400600Rozdział 80
8800200160

Tabela 1: Stężenie MDA potrzebne do skonstruowania krzywej stężenia MDA.

Rozdział pkt. Rozdział
Stężenie (μg/μL)Roztwór podstawowy (μl)Woda ultraczysta (μL)
0050
0,15Rozdział 45
0,210Rozdział 40
0,420Rozdział 30
0,8Rozdział 4010
1500

Tabela 2: Stężenie BSA dla krzywej kwantyfikacji białka.

Dyskusja

Chociaż zastosowanie C. texanus jest optymalne do oceny, konieczne jest rozważenie kilku aspektów jego stosowania i zbierania. Wybrane miejsca badań okazują się wyzwaniem ze względu na kilka czynników, takich jak niekorzystne warunki pogodowe, niedostępność geograficzna, wysoki poziom suszy czy niewystarczające protokoły bezpieczeństwa w wybranych regionach. Stwierdzone ograniczenia i ograniczenia mogą często stanowić wyzwanie podczas prowadzenia prac terenowych. Podczas oceny konkretnych regionów, szczególnie tych w strumieniach tropikalnych, uzyskanie próbek może być trudne. Chociaż w tym celu przestrzegano wytycznych Barbour23 , mogą istnieć przeszkody w dostosowaniu protokołów w niektórych ekosystemach ze względu na ich szczególne cechy. Jak wspomniano wcześniej, pobieranie próbek w tropikalnych środowiskach lotycznych wiąże się z różnymi wyzwaniami wynikającymi z czynników regionalnych i lokalnych. Czynniki te obejmują wysoki poziom niejednorodności środowiska, podłoża o dużej zmienności, zlewnię, szerokość, głębokość, przepływ, roślinność nadbrzeżną oraz szeroki zakres warunków fizykochemicznych24. W związku z tym uzyskanie jednolitej wielkości próbek może okazać się wyzwaniem, ponieważ w naturalny sposób wpływa na nie określony zakres czynników, szczególnie w odpowiedzi na zmiany sezonowe. W związku z tym standaryzacja ich wielkości może być złożonym przedsięwzięciem. Po pomyślnym zakończeniu prac terenowych przeprowadzane są kolejne procedury laboratoryjne, co pozwala na dalszą analizę.

Przeprowadzenie oceny wczesnego ostrzegania w odniesieniu do C. texanus wykazało jej przydatność w odzwierciedlaniu skutków w kontekście ekosystemów wodnych. W związku z tym identyfikacja makrobezkręgowców wodnych jako wiarygodnych wskaźników wpływu człowieka okazała się praktycznym podejściem25,26. Obecne badania wykazały, że C. texanus służy jako wysoce skuteczny, nietradycyjny model do szybkiej oceny warunków środowiskowych. W przypadku obecnego badania wykazano, że C. texanus wykazywał zmienność w reakcjach na zanieczyszczenie metalami ciężkimi pochodzącymi z górnictwa. Dodatkowe efekty zmian w siedlisku pozwalają na rozpoznanie wysokiego stopnia wrażliwości u C. texanus. Chociaż na tym obszarze istniały dowody na działalność górniczą, tradycyjne wskaźniki zanieczyszczenia, takie jak indeks różnorodności obliczony w Rico-Sanchez i wsp.27, nie uwzględniały wpływu zanieczyszczenia metalami ciężkimi w głównych strefach lub miejscach ochrony. Zmiany zaobserwowano jednak na obszarach takich jak BC czy SM, które znajdują się w strefach centralnych. Chociaż naturalne obszary chronione są skuteczne pod względem ochrony, odkrycia dotyczące C. texanus wskazują, że wczesne sygnały ostrzegawcze o szkodach pojawiają się już niezauważone. Włączenie fauny niekonwencjonalnej i rodzimej do protokołów badawczych i przyszłych regulacji w ich krajach, szczególnie w regionach tropikalnych, gdzie ekosystemy rzeczne znacznie różnią się od ekosystemów na obszarach o klimacie umiarkowanym28. Zastosowanie niekonwencjonalnego biomonitora, takiego jak C. texanus, może przyczynić się do poprawy dokładności i trafności wyników badań oraz do zwiększenia wysiłków na rzecz ochrony tych ważnych gatunków i ich siedlisk.

Stosowanie Corydalus sp. wykazało również wysoką wrażliwość na różnorodne skutki działalności człowieka (tj. skutki rolnicze, takie jak zmiana użytkowania gruntów i stosowanie agrochemikaliów), co zaobserwowano w rzece Filobobos (miejsce w kierunku dorzecza Zatoki Meksykańskiej)7. Badanie, o którym mowa, podkreśla istotną rolę wapnia w wywoływaniu stresu u Corydalus sp. ze względu na zwiększony wzrost poziomu LPO pod nienormalnie utwardzonymi wodami w rzece Filobobos. Odkrycia te, wraz z obecnymi, dowiodły przydatności rodzaju Corydalus w ocenie ekosystemów wodnych na międzyzwrotnikowych szerokościach geograficznych. Jednak przed oceną konkretnego ekosystemu wodnego konieczne jest posiadanie wcześniejszej wiedzy na temat badanego obszaru. Przeprowadzając wnikliwą analizę, należy określić optymalne lokalizacje badawcze, aby zgromadzić jak najobszerniejsze i najbardziej kompletne dane.

Efektywność pracy laboratoryjnej jest w dużym stopniu uzależniona od zastosowania odpowiednich technik pobierania. Pobieranie większych próbek może okazać się korzystne podczas przeprowadzania sekcji ze względu na zwiększoną ilość tkanek miękkich i egzoszkieletu dostępnych do analizy. Należy jednak pamiętać, że wahania sezonowe mogą wpływać na akumulację tkanki tłuszczowej, co utrudnia oddzielenie tkanek miękkich i egzoszkieletów podczas badań czasowych. W takich przypadkach wskazane może być skupienie się na skrzelach i dostępnych mięśniach każdej osoby. Pozyskanie znacznej liczby osób może stanowić krytyczne wyzwanie. Ze względu na wcześniej wymienione różnice, uzyskanie wystarczającej ilości tkanki do oceny zawartości metali ciężkich i odpowiedzi biomarkerów może być trudniejsze. Niniejsze badanie pokazało przykład tego przypadku, ponieważ nie było możliwe oszacowanie katalazy w próbkach z SGBR. Przed obecnym protokołem ocena katalazy wymagała dużej ilości tkanki; Niemniej jednak obecna propozycja oznaczania katalazy oferuje minimalną ilość tkanek do ich oceny.

Obecny wniosek w sprawie protokołu stwarza odpowiednią szansę na dokonanie wykonalnego przybliżenia integralności ekologicznej przy użyciu piekielników pospolitych w ekosystemach wodnych. Dostarcza kluczowych informacji do identyfikacji punktowych zanieczyszczeń lub pośrednich szkodliwych skutków wpływu człowieka, umożliwiając uzyskanie odpowiednich informacji zainteresowanym stronom, ekologom i naukowcom zajmującym się wodą. Chociaż koszt obecnego protokołu został znacznie obniżony, nadal pozostaje stosunkowo drogi ze względu na konieczność użycia kilku odczynników i użycie specjalistycznego sprzętu. Ponadto wymóg specjalistycznego sprzętu ogranicza liczbę miejsc, w których można wykonać pełny test.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych konfliktów interesów występujących w ich pracy.

Podziękowania

Autorzy chcieliby wyrazić szczerą wdzięczność CONAHCyT za udzielenie grantu FONINS P 1931, który znacznie ułatwił ich wysiłki badawcze. Chcieliby również podziękować Secretaría de Investigación y Posgrado przy Instituto Politécnico Nacional za nieocenione wsparcie udzielone w ramach grantu na projekt SIP (20200577). Ponadto pierwszy autor pragnie podziękować hojnemu stypendium podyplomowemu przyznanemu przez CONAHCyT, które umożliwiło zespołowi przeprowadzenie wycieczek terenowych i zebranie niezbędnych danych. Na koniec autorzy pragną wyrazić wdzięczność za nieocenioną pomoc Maríi Teresy Garcíi Camacho w laboratorium, bez której ten projekt nie byłby możliwy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Waga analityczna 220 gOhausPR224/ETa waga jest przydatna do ważenia tkanki pobranej z próbek.
SpodniobutyLaCrosse700152MZalecamy używanie woderów do pobierania próbek. Alternatywnie możesz również użyć butów z gumowymi butami biodrowymi do pobierania próbek.
Deska do krojeniaTrueTRUE915121Zaleca się stosowanie białych i plastikowych desek.
KleszczeDR Instruments112Zaleca się stosowanie 12 kleszczyków do pul wykonanych ze stali nierdzewnej.
System spektroskopii emisyjnej ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjniePerkin Elmer7300 DVUrządzenie do ilościowego oznaczania metali ciężkich za pomocą spektroskopii.
Siatka do kopaniaLaMotte0021-PAlternatywna metoda wykonania siatki do kopania polega na ręcznym wykonaniu jej przy użyciu siatki o grubości 500 mikrometrów.
Ciekły azot NANA NA Statyczny
pojemnik kriogeniczny Dewara z ciekłym azotemBestEquipDF0504Zaleca się stosowanie aluminiowego zbiornika z kanistrami.
Zestaw moździerza i tłuczkaCole-ParmerEW-63100-54Jest to porcelanowy moździerz i tłuczek służący do rozdrabniania suchych chusteczek.
Multiwave GO PlusAnton PaarC93IP001EN-EMultiwave to przydatne narzędzie do trawienia wielu próbek.
Piec do suszeniaFisher scientific506GPiec inkubacyjny, znany również jako piec do suchych chusteczek, jest niezbędny do suszenia tkanek w temperaturach co najmniej 80 stopni C.
Precyzyjny skalpelXcelite firmy Weller037103-48768Zaleca się stosowanie skalpela wykonanego z aluminium.
Homogenizator tkankowy (tearer)KoproK110000Zaleca się stosowanie rozdzieracza do tkanek z podstawą. Niektóre firmy oferują zrywarki ultradźwiękowe, które mogą być optymalnym wyborem.
Zamrażarka skrzyniowa o bardzo niskiej temperaturzeREVCOCA89200-384Wiele firm oferuje zamrażarki, ale zaleca się wybór takiej, której temperatura przechowywania wynosi co najmniej -40 stopni C.
Plastikowe butelki z szerokimi otworamiUnited Scientific81900Zdecydowanie zaleca się używanie butelek polipropylenowych z szerokimi nakrętkami i otworami.

Bibliografia

  1. Rivera-Gasperín, S. L., Ardila-Camacho, A., Contreras-Ramos, A. Bionomics and ecological services of Megaloptera larvae (Dobsonflies, Fishflies, Alderflies). Insects. 10 (4), 86(2019).
  2. Cover, M. R., Seo, J. H., Resh, V. H. Life history, burrowing behavior, and distribution of Neohermes filicornis (Megaloptera: Corydalidae), a long-lived aquatic insect in intermittent streams. Western North Ame. Nat. 75 (4), 474(2016).
  3. Martins, C. C., Ardila-Camacho, A., Rivera-Gasperín, S. L., Oswald, J. D., Liu, X., Contreras-Ramos, A. A world checklist of extant and extinct species of Megaloptera (Insecta: Neuropterida). Euro J of Tax. 812 (1), 1-93 (2022).
  4. Knight, A. W., Siegfried, C. A. The distribution of Corydalus Cornutus (Linnaeus) and Nigronia Serricornis (Say) (Megaloptera: Corydalidae) in Michigan. The Great Lakes Entomol. 10 (2), 1(2017).
  5. Florida, S., Lindsay, H., Patel, M., Lindsay, P. Water quality of Quebrada Cuecha: effects of the effluent from the Monteverde cheese factory. , Available from: https://digitalcommons.usf.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1662&context=tropical_ecology (2018).
  6. Cao, C. -Q., Liu, Z., Chen, S. -Z., Tong, C. The swimming behavior of the aquatic larva of Neoneuromus ignobilis (Megaloptera: Corydalidae: Corydalinae). Acta Entomol Sin. 55 (1), 133-138 (2012).
  7. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E. Assessment of seasonal and spatial variations of biochemical markers in Corydalus sp. (Megaloptera: Corydalidae), a non-conventional biomonitor, in a mountain cloud forest in Mexico. Environ Sci Pollut Res Int. 27 (24), 30755-30766 (2020).
  8. Galindo-Pérez, E. J., et al. Cave macroinvertebrates as bioindicators of water quality. Water Sci Technol. 8 (5), 5-17 (2017).
  9. Dolin, P. S. The life history and ecology of Chauliodes Rastricornis Rambur and C. Pectinicornis. (Linnaeus)(Megaloptera: Corydalidae) in Greenbottom swamp, Cabell County, West Virginia. Marshall University. , Doctoral dissertation (1980).
  10. Cover, M. R., Resh, V. H. Global diversity of dobsonflies, fishflies, and alderflies (Megaloptera; Insecta) and spongillaflies, nevrorthids, and osmylids (Neuroptera; Insecta) in freshwater. Hydrobiologia. 595 (1), 409-417 (2008).
  11. Barba-Álvarez, R., De la Lanza-Espino, G., Contreras-Ramos, A., González-Mora, I. Aquatic insects indicators of water quality in Mexico: case studies, Copalita, Zimatán and Coyula rivers, Oaxaca. Mexican Biodiversity Magazine. 84 (1), 381-383 (2013).
  12. Beyer, J., et al. Environmental risk assessment of combined effects in aquatic ecotoxicology: A discussion paper. Mar Env Res. 96, 81-91 (2014).
  13. Tišler, T., Zagorc-Končan, J. Comparative assessment of toxicity of phenol, formaldehyde, and industrial wastewater to aquatic organisms. Water Air Soil Pollut. 97, 315-322 (1997).
  14. Larramendy, M. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-traditional Aquatic Models. Royal Society of Chemistry. , Cambridge. (2017).
  15. Contreras-Ramos, A., Rosas, M. V. Biodiversity of Megaloptera and Raphidioptera in Mexico. Biodiversity Supplement of Mexico. 85, 257-263 (2014).
  16. Villamarín, C., Rieradevall, M., Paul, M. J., Barbour, M. T., Prat, N. A tool to assess the ecological condition of tropical high Andean streams in Ecuador and Peru: The IMEERA index. Ecol Indic. 29, 79-92 (2013).
  17. Uchiyama, M., Mihara, M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 86 (1), 271-278 (1978).
  18. Marklund, S., Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47 (3), 469-474 (1974).
  19. Aebi, H. Catalase. Methods Enzymol. 105, 121-126 (1984).
  20. Li, Y., Schellhorn, H. E. Rapid kinetic microassay for catalase activity. J Biomol Tech. 18 (4), 185-187 (2007).
  21. Kumar, P., Maurya, P. K. L-Cysteine efflux in erythrocytes as a function of human age: Correlation with reduced glutathione and total anti-oxidant potential. Rejuvenation Res. 16 (3), 179-184 (2013).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Barbour, M. T., Stribling, J. B., Verdonschot, P. F. M. The multihabitat approach of USEPA's rapid bioassessment protocols: benthic macroinvertebrates. Limnetica. 25 (3), 839-850 (2006).
  24. Allan, J. D. Stream Ecology: Structure and Function of Running Waters. , Springer. Dordrecht. (2007).
  25. Barbour, M. T., Gerritsen, J., Snyder, B. D., Stribling, J. B. Rapid Bioassessment Protocols for Use in Streams and Wadeable Rivers: Periphyton, Benthic Macroinvertebrates and Fish. United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (1999).
  26. Wright, J. F., Armitage, P. D., Furse, M. T., Moss, D. The classification of sites on British rivers using macroinvertebrates. SIL Proceed, 1922-2010. 22 (3), 1939-1943 (1984).
  27. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E., Sundermann, A. Aquatic macroinvertebrate assemblages in rivers influenced by mining activities. Sci Rep. 12 (1), 3209(2022).
  28. Ramírez, A., Pringle, C. M., Wantzen, K. M. Tropical Stream Conservation. Tropical Stream Ecology. , Academic Press, Elsevier. (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biomonitor z larwy pstr gownicyocena w d powierzchniowychCorydalus texanusekosystemy wodnewra liwo na zanieczyszczeniabioakumulacja metali ci kichzanieczyszczenia g rniczeniekonwencjonalny bioindykatorwska nik stanu zdrowia ekosystemu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły