Ten artykuł opisuje identyfikację komórek piropotycznych za pomocą cytometrii przepływowej po podwójnym barwieniu przeciwciałami przeciwko N-końcowemu fragmentowi kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodkowi propidyny (PI).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Piroptoza to rodzaj zapalny programowanej śmierci komórki, głównie spowodowany tworzeniem porów błony komórkowej przez N-koniec generowany z rozszczepionych białek z rodziny Gasdermin (GSDM). Badanie GSDM-NT przyczepionego do błony metodą Western Blot jest najczęściej stosowaną metodą oceny piroptozy. Jednak za pomocą tej metody trudno jest odróżnić komórki z piroptozą od innych form śmierci komórki. W tym badaniu komórki DF-1 zakażone wirusem zakaźnej choroby kaletki maziowej (IBDV) wykorzystano jako model do ilościowego określenia proporcji komórek poddawanych piroptozie za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując specyficzne przeciwciała przeciwko N-końcowemu fragmentowi barwienia kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodku propidyny (PI). Komórki chGSDME-NT-dodatnie były łatwo wykrywalne za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał anty-chGSDME-NT znakowanych Alexa Fluor 647. Co więcej, odsetek podwójnie dodatnich komórek chGSDME-NT / PI w komórkach zakażonych IBDV (około 33%) był znacznie większy niż w kontrolach zakażonych pozorami (P < 0,001). Wyniki te wskazują, że badanie chGSDME-NT związanego z błoną za pomocą cytometrii przepływowej jest skutecznym podejściem do określania komórek piroptotycznych wśród komórek przechodzących śmierć komórkową.
Wprowadzenie
Piroptoza to zapalny rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, który zależy głównie od tworzenia porów błony plazmatycznej przez Gasdermin (GSDM) D u ssaków1,2,3. Ze względu na genetyczny niedobór GSDMD u kurcząt4,5, mechanizm piroptozy u kurcząt pozostaje nieuchwytny. Rodzina Gasdermin obejmuje konserwatywne białka, w tym GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME i DFNB593,6. Badania wykazały, że GSDME od ryb teleost i kaczek jest rozszczepiany przez kaspazę-1/3/7 lub kaspazę-3/7 w celu wywołania pyroptotycznej śmierci komórki7,8. Jednak rola piroptozy za pośrednictwem GSDME w odpowiedzi gospodarza na infekcje chorobotwórcze u kurcząt pozostaje niewyjaśniona.
Zakaźna choroba kaletki maziowej (IBD) to ostra, wysoce zaraźliwa i immunosupresyjna choroba drobiu wywoływana przez IBDV9. IBDV, bezotoczkowy dwusegmentowy wirus dwuniciowego (ds) RNA, należy do rodzaju Avibirnavirus z rodziny Birnaviridae10. Wcześniejsze badania przeprowadzone przez innych i nasze laboratorium wykazały, że zakażenie IBDV indukuje śmierć komórek gospodarza różnymi szlakami11,12,13,14. Wcześniejsze odkrycia wykazały, że zakażenie IBDV wyzwala uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH), wskaźnika śmierci komórek litycznych6,15, co sugeruje, że zakażenie IBDV indukuje śmierć komórek litycznych w komórkach gospodarza. Ponadto dane pokazują, że komórki zakażone IBDV wykazują cechy morfologiczne pyroptotycznej śmierci komórki, w tym pęcznienie komórek z dużymi pęcherzykami wydmuchiwanymi z błony plazmatycznej i dodatnie barwienie jodku propidyny (PI), co sugeruje, że zakażenie IBDV indukuje piroptozę w komórkach.
Biorąc pod uwagę, że tworzenie porów błonowych w komórkach piroptotycznych przez N-końcowy fragment rozszczepionego GSDM (GSDM-NT) jest cechą charakterystyczną piroptozy, teoretycznie, komórki piropotyczne mogłyby być wykryte za pomocą cytometrii przepływowej, badając GSDM-NT na błonie komórkowej za pomocą specyficznych przeciwciał. W ptasich komórkach piroptotycznych N-końcowy fragment Gasderminy E kurczaka (chGSDME-NT) tworzy pory błonowe, umożliwiając jodkowi propidyny (PI) przejście i wiązanie DNA. W ten sposób proporcję komórek piroptotycznych można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej, odróżniając w ten sposób piroptozę od innych form śmierci komórki, takich jak apoptoza i martwica. Nie opisano jednak metody badania komórek piroptotycznych za pomocą cytometrii przepływowej. W tym badaniu komórki DF-1 zostały zakażone IBDV i przeprowadzono cytometrię przepływową w celu zbadania komórek piroskoptotycznych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (McAb) przeciwko fragmentowi chGSDME-NT (związanego z błoną) i barwieniu PI. Co zaskakujące, komórki piropotyczne zostały skutecznie wykryte za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto można określić ilościowo proporcję komórek piroptotycznych. Odkrycia te stanowią potężny i skuteczny sposób określania piroptozy.
Ten artykuł opisuje metodę badania pirotoksyny w komórkach zakażonych IBDV za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwienia anty-chGSDME-NT McAb i PI. Metodę tę można również rozszerzyć na inne komórki zakażone patogenami i zastosować do badania różnych typów komórek z piroptozą, odróżniając je od innych form śmierci komórki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie komórek próbki
- Hodowla komórek DF-1 (nieśmiertelne fibroblasty zarodków kurzych) na płytkach sześciodołkowych (5 x 10,5 komórek na studzienkę) ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 38 °C.
- Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę do hodowli komórek zawierającą surowicę, przemyj komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy do każdej studzienki.
- Dodaj roztwór wirusa IBDV (zawierający obliczony MOI) do każdej studzienki i ustaw fałszywą kontrolę infekcji, dodając objętość DMEM równą objętości roztworu wirusa.
- Po 1 godzinie adsorpcji wirusa należy wyrzucić pożywkę hodowlaną, trzykrotnie przemyć komórki PBS, dodać 2 ml DMEM uzupełnionego 2% FBS do każdej studzienki i kontynuować hodowle komórkowe przez 24 godziny.
- 24 godziny po zakażeniu IBDV należy przeprowadzić leczenie trypsyną (500 μl na dołek) przez 1 minutę, a następnie zneutralizować za pomocą DMEM uzupełnionego 10% FBS (2 ml na dołek). Następnie komórki muszą zostać pobrane w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych do cytometrii przepływowej.
- Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS i delikatnie wirować probówki przez 3 s.
- Odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 1.6 (400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C).
- Powtórz płukanie komórek zgodnie z opisem w kroku 1.7 i kroku 1.8.
- Wykonaj liczenie komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu barwiącego cytometrię przepływową (tak, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 x 107 komórek/ml). Delikatnie wymieszaj zawiesiny.
2. Barwienie komórek w cytometrii przepływowej
- Dodać 100 μl zawiesin jednokomórkowych z kroku 1.10 do 5 ml okrągłodennych probówek z polistyrenu (12 mm × 75 mm). Przygotuj makiety komórek zakażonych i zakażonych IBDV do barwienia przeciwciałami anty-chGSDME-NT/CT i użyj normalnej mysiej IgG jako kontroli izotypu. W międzyczasie przygotuj ślepą próbę kontrolną i pojedyncze barwione probówki z komórkami zakażonymi IBDV.
- Dodaj 1 μg znakowanego Alexa Fluor 647 anty-chGSDME-NT McAb, anty-chGSDME-CT McAb lub normalnej mysiej IgG (jako kontroli izotypu) odpowiednio do probówek zakażonych IBDV i pozorowanych kontrolnych. Następnie delikatnie wiruj rurki przez 3 s.
- Inkubować wybarwione komórki w temperaturze 2-8 °C lub na lodzie przez 30 minut w ciemności. Delikatnie wiruj rurki co 10 minut.
- Przemyć komórki 1 ml buforu barwiącego do cytometrii przepływowej przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Powtórzyć płukanie komórek zgodnie z opisem w kroku 2.4.
- Zawiesić osad w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
- Wybarwić komórki grupy zakażonej IBDV i grupy pozorowanej zakażonej, a także probówek barwionych pojedynczym PI 10 μg/ml PI przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 400 μl buforu barwiącego cytometrię przepływową do testu cytometrii przepływowej.
3. Przeprowadzanie testu cytometrii przepływowej
- Włącz cytometr przepływowy, aby zainicjować instrument i uruchomić oprogramowanie.
- Rozpocznij od uruchomienia ślepej rurki kontrolnej, a następnie pojedynczych barwionych probówek, aby wyregulować parametry napięcia i kompensacji cytometru przepływowego. Wykorzystaj kanały fluorescencyjne FL3 i FL4, które emitują światło o długości fali 635 nm, do wykrywania odpowiednio fluoroforów PI i Alexa Fluor 647.
- Po skonfigurowaniu wszystkich parametrów uruchom sekwencyjnie wszystkie próbki.
4. Analiza danych cytometrii przepływowej
- Przeanalizuj barwienie Alexa Fluor 647 każdej próbki na histogramie kanału FL4.
- Aby ocenić proporcję podwójnie dodatnich komórek w każdej próbce, użyj czterokwadrantowego wykresu punktowego FL3 / FL4.
- Ustaw progi dodatnie na podstawie podwójnie barwionych próbek kontrolnych IgG/PI w ramach kontroli izotypu, zapewniając, że odsetek komórek podwójnie dodatnich pozostaje poniżej 1%. Takie podejście ułatwia pomiar proporcji podwójnie dodatnich komórek we wszystkich próbkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
chGSDME-NT na błonie komórkowej komórek DF-1 zainfekowanych IBDV można było łatwo wykryć za pomocą cytometrii przepływowej
Jedną z najważniejszych cech komórek pyroptotycznych jest tworzenie porów błonowych przez fragmenty GSDM-NT powstające w wyniku rozszczepienia gazderminy. W związku z tym komórki pyroptotyczne mogłyby teoretycznie zostać wykryte za pomocą cytometrii przepływowej poprzez badanie obecności GSDM-NT na błonach komórkowych przy użyciu specyfic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano skuteczną metodę badania piroptozy za pomocą cytometrii przepływowej, uzyskaną poprzez podwójne barwienie zakażonych komórek za pomocą anty-chGSDME-NT McAb i PI znakowanych Alexa Fluor 647. Podejście to można również zastosować do różnych typów komórek w celu odróżnienia piroptozy od innych typów śmierci komórki, takich jak apoptoza i martwica.
Piroptoza, zapalny rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, zależny głównie od indukowanego przez Gasdermin (GSDM) tworzen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dr. Jue Liu za jego życzliwą pomoc. Badanie to było wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (nr 2022YFD1800300), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32130105) oraz Funduszu Celowego na rzecz Systemu Badań nad Nowoczesnymi Technologiami Agro-Przemysłowymi (nr 2022YFD1800300), Narodowego Funduszu Nauk Przyrodniczych Chin (nr . CARS-40), Chiny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5 ml okrągłodenna probówka z polistyrenu (12 i 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych | Zestawy | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chiny) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chiny) | EU0227 | |
| Oprogramowanie CellQuest | Inkubator BD Biosciences | ||
| CO2 | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Wirówka do zamrażania kriogenicznego | Eppendorf | 5810R | |
| Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Bufor do barwienia cytometrii przepływowej | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometr | Qiu-jing Odczynnik biochemiczny i Instrument Company (Szanghaj, Chiny) | Szczep | |
| IBDV Lx | Szczep IBDV Lx został uprzejmie dostarczony przez dr Jue Liu, Pekińską Akademię Rolnictwa i Leśnictwa w Pekinie, Chiny | ||
| M& C Technologia genowa | CC017 | ||
| Jodek propidyny (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsyna-EDTA, 0,25% | M& C Technologia genowa | CC008 | |
| Oscylator wirowy | MIULAB | MIX-28+ |
Bibliografia
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9(2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526(2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724(2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
