Artykuł metodologiczny

Transfer mitochondrialny za pomocą nanorurek tunelowych między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a nabłonkiem barwnikowym siatkówki in vitro

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

4 października 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół obejmujący śledzenie mitochondriów, procedury bezpośredniej kohodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (ARPE19), a także metody obserwacji i statystycznej analizy tworzenia i transferu mitochondriów przez nanorurki tunelowe (TNT) w celu scharakteryzowania wymiany mitochondrialnej za pośrednictwem TNT między MSC a komórkami ARPE19.

Streszczenie

Transfer mitochondrialny jest normalnym zjawiskiem fizjologicznym, które występuje powszechnie wśród różnych typów komórek. W dotychczasowych badaniach najważniejszym szlakiem transportu mitochondrialnego są nanorurki tunelowe (TNT). Przeprowadzono wiele badań donoszących, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą przenosić mitochondria do innych komórek za pomocą TNT. Jednak niewiele badań wykazało zjawisko dwukierunkowego transferu mitochondrialnego. W tym miejscu nasz protokół opisuje eksperymentalne podejście do badania zjawiska transferu mitochondrialnego między MSCs a komórkami nabłonka barwnikowego siatkówki in vitro za pomocą dwóch metod śledzenia mitochondriów.

Przez 24 godziny hodowaliśmy MSCs transfekowane mito-GFP z komórkami ARPE19 transfekowanymi mito-RFP (linia komórkowa nabłonka barwnikowego siatkówki). Następnie wszystkie komórki wybarwiono falloidyną i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zaobserwowaliśmy mitochondria z zieloną fluorescencją w komórkach ARPE19 i mitochondria z czerwoną fluorescencją w MSCs, co wskazuje, że dwukierunkowy transfer mitochondrialny zachodzi między MSC a komórkami ARPE19. Zjawisko to sugeruje, że transport mitochondrialny jest normalnym zjawiskiem fizjologicznym, które zachodzi również między MSCs a komórkami ARPE19, a transfer mitochondrialny z MSCs do komórek ARPE19 zachodzi znacznie częściej niż odwrotnie. Nasze wyniki wskazują, że MSCs mogą przenosić mitochondria do nabłonka barwnikowego siatkówki i podobnie przewidują, że MSCs mogą w przyszłości realizować swój potencjał terapeutyczny poprzez transport mitochondrialny w nabłonku barwnikowym siatkówki. Ponadto transfer mitochondrialny z komórek ARPE19 do MSCs wymaga dalszych badań.

Wprowadzenie

Mitochondria służą jako podstawowe źródło energii dla większości typów komórek, przy czym dysfunkcja mitochondriów szczególnie wpływa na tkanki wymagające dużej energii, takie jak siatkówka1. Zmiany metaboliczne w siatkówce mogą wywołać kryzys bioenergetyczny, ostatecznie skutkujący śmiercią fotoreceptorów i/lub komórek RPE2. Terapie oparte na mezenchymalnych komórkach macierzystych (MSC) wykazały skuteczność w leczeniu zwyrodnienia oka, a jeden z precyzyjnych mechanizmów leżących u podstaw korzystnego wpływu MSCs na tkanki siatkówki można przypisać funkcjonalnemu transferowi mitochondrialne3,4,5,6. W 2004 roku Rustom i wsp. po raz pierwszy opisali zjawisko transferu mitochondrialnego poprzez nową interakcję międzykomórkową, ułatwioną przez tunelowanie nanorurek (TNT)7.

W kulturze 2D, tunelujące nanorurki (TNT) są identyfikowane przez ich cienkie (20-700 nm) wypukłości membranowe o długości od dziesiątek do setek nanometrów, które są zawieszone nad podłożem i mogą bezpośrednio ustanawiać połączenia między dwiema lub więcej komórkami homotypowymi i heterotypowymi. Struktury te są znacznie wzbogacone w F-aktynę i ułatwiają transport ładunku, takiego jak mitochondria, między komórkami. Dodatkowo, TNT posiadają otwory na obu końcach, umożliwiając ciągłość zawartości cytoplazmatycznej między połączonymi komórkami8.

Trudno jest wykryć transfer mitochondrialny za pośrednictwem TNT in vivo ze względu na gęsty układ komórek i wyzwania w śledzeniu mitochondriów. Eksperymenty in vitro, wykorzystujące techniki kohodowli komórkowej i śledzenia mitochondriów, pozwalają na obserwację powstawania TNT i transferu mitochondrialnego8,9. Zaobserwowaliśmy również zjawisko transferu mitochondrialnego za pośrednictwem TNT poprzez kokulturację MSC i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki in vitro10.

Wiele poprzednich badań zaobserwowało jedynie jednokierunkowy transfer mitochondriów z MSC do innych komórek3,4,5,6. Wcześniej próbowaliśmy również przeanalizować dwukierunkowy transfer mitochondrialny przy użyciu dwóch rodzajów komórek oznaczonych odpowiednio zielonym mito-trackerem i czerwonym mito-trackerem, ale przesłuch barwników zakłócał wyniki eksperymentalne. Aby dokładniej zbadać dwukierunkowy transfer mitochondriów, tutaj skonstruowaliśmy dwie linie komórkowe o różnej fluorescencji mitochondrialnej przy użyciu techniki transfekcji lentiwirusowej, a następnie obserwowaliśmy i analizowaliśmy zjawiska powstawania TNT i dwukierunkowego transferu mitochondriów przez bezpośrednią kohodowlę in vitro.

W skrócie, krok po kroku opisany jest tutaj praktyczny protokół, jak śledzić mitochondria, współhodować MSCs z komórkami ARPE19 oraz analizować tworzenie TNT i transfer mitochondriów. Wyniki tego eksperymentu wykazały dwukierunkowy transfer mitochondrialny za pośrednictwem TNT, który nie tylko dowiódł, że transport mitochondrialny jest powszechnym zjawiskiem fizjologicznym, ale także wykazał potencjalną zdolność terapeutyczną MSCs na komórkach siatkówki.

Protokół

1. Generowanie linii komórkowych MSC-mito-GFP i ARPE19-mito-RFP

  1. Hodowla komórkowa
    UWAGA: Tylko MSC są tutaj używane jako przykład.
    1. Hodować ludzkie MSCs na 6-dołkowej płytce w pożywce hMSC z 1% penicyliną i streptomycyną (patrz tabela materiałów), aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. W zależności od gęstości wzrostu komórek zmieniaj pożywkę raz na 2-3 dni.
      1. Usunąć oryginalną pożywkę i raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) (patrz Tabela Materiałów). Dodać 1 ml mieszaniny trypsyna-EDTA-DPBS (0,05% Trypsyna-EDTA: 0,25% Trypsyna-EDTA rozcieńczona DPBS w stosunku 1:5; patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 3-4 minuty (w zależności od komórek) w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Obserwuj trawienie komórek pod mikroskopem i przerwij trawienie, jeśli większość komórek jest zaokrąglona i oderwana.
      2. Delikatnie postukaj w płytkę 6-dołkową, aby oderwać komórki przylegające do powierzchni, a następnie dodaj 1 ml świeżej, kompletnej pożywki, aby zakończyć trawienie.
      3. Delikatnie zawiesić wszystkie komórki za pomocą pistoletu do pipet, a następnie przenieść wszystkie zebrane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      4. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g przez 5 minut.
      5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 1 ml świeżej pożywki. Weź 10 μl zawiesiny komórek do zliczania komórek.
      6. Osiemnaście do 24 godzin przed transfekcją lentiwirusa, wysiewaj komórki MSC o gęstości 1 × 105 komórek na basenie na płytkach 6-dołkowych, upewniając się, że gęstość komórek w momencie transfekcji wynosi około 50%.
  2. Transfekcja lentiwirusa
    UWAGA: Wszystkie operacje związane z transfekcją lentiwirusową muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Następnego dnia zastąpić początkową pożywkę 2 ml świeżej pożywki i dodać 25 μl zawiesiny lentiwirusa (5,00 E + 08 TU/ml) z adiuwantami, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Pakowanie lentiwirusa zostało wykonane przy użyciu plazmidu Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (patrz tabela materiałów i rysunek uzupełniający S1) przez firmę.
    2. Po 6 godzinach inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą wirusa 2 ml świeżej pożywki. Kontynuuj inkubację i zmieniaj podłoże raz dziennie.
      UWAGA: Znaczącą ekspresję fluorescencji mitochondrialnej obserwuje się w MSCs 48 godzin po transfekcji, z dalszym wzmocnieniem widocznym w punkcie czasowym 72 godzin.
    3. Badanie przesiewowe pomyślnie transfekowanych komórek poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej puromycyną (1 μg/ml) 2 dni po transfekcji. Równocześnie, dodać równoważne stężenie puromycyny do mezenchymalnych komórek macierzystych pozbawionych transfekcji wirusowej jako kontrolę.
      UWAGA: Wektor wirusa mito-GFP został zaprojektowany tak, aby zawierał gen oporności na puromycynę.
    4. Zmieniaj pożywkę codziennie, wprowadzając puromycynę (1 μg/ml). Zatrzymaj dodatek puromycyny po prawie całkowitej śmierci komórki w grupie kontrolnej.
      UWAGA: Pożywka nie zawiera tego stężenia puromycyny. Dodanie puromycyny jest wymagane tylko wtedy, gdy pożywka jest dodawana do płytki 6-dołkowej.
    5. Kontynuuj hodowlę bez puromycyny, aż komórki zostaną pasażowane i zamrożone. Nazwij ten typ komórki jako MSC-mito-GFP.
      UWAGA: Komórki ARPE19 pochodziły z Banku Komórek ATCC i były hodowane w DMEM/F12 zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny (patrz Tabela materiałów), a metody ich trawienia i pasażu są takie same jak w przypadku MSC. Plazmid Mito-RFP został zmodyfikowany z Mito-GFP przez firmę. Na koniec nazwaliśmy pomyślnie transfekowane komórki jako ARPE19-mito-RFP.

2. Bezpośrednia kokultura komórek MSC i ARPE19

UWAGA: W tym systemie kohodowli, komórki MSC-mito-GFP będą służyć jako komórki dawcy, podczas gdy komórki ARPE19-mito-RFP będą funkcjonować jako komórki biorcze. Aby odróżnić komórki dawcy od biorcy, prześledziliśmy komórki biorców.

  1. Oznacz komórki ARPE19-mito-RFP za pomocą CellTrace Violet (patrz tabela materiałów) w błonie cytoplazmatycznej.
    UWAGA: Wzbudzenie i emisja barwnika CellTrace violet wynoszą odpowiednio 405 nm i 450 nm.
    1. Przygotować roztwór podstawowy CellTrace Violet (patrz tabela materiałów), dodając 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki z odczynnikiem CellTrace Violet i dobrze mieszając bezpośrednio przed użyciem.
    2. Wyhoduj komórki ARPE19-mito-RFP do pożądanej gęstości 80%-90%.
    3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy CellTrace Violet we wstępnie podgrzanym (37 °C) DPBS do pożądanego stężenia roboczego (1:1 000). To jest rozwiązanie załadowcze.
      UWAGA: Rozcieńczenie CellTrace Violet musi być przeprowadzone za pomocą DPBS i nie może być zastąpione pożywką hodowlaną, ponieważ doprowadzi to do bardzo słabych wyników barwienia.
    4. Usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją 1 ml roztworu ładującego. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli pozwalają na to warunki, barwienie można zaobserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym po 5 minutach. Barwienie można zakończyć, gdy tylko zostaną osiągnięte pożądane rezultaty, ponieważ niektóre komórki mogą nie być w stanie tolerować długotrwałej ekspozycji na DPBS.
    5. Usuń roztwór nasycający, umyj komórki 2x DPBS i zastąp 2 ml świeżej kompletnej pożywki. Inkubować komórki przez co najmniej 10 minut po barwieniu, aby umożliwić CellTrace Violet hydrolizę octanu.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby komórki powróciły do optymalnego stanu i aby uniknąć ingerencji w kolejne eksperymenty.
  2. Przygotuj 24-dołkową płytkę, dodając 50 μl DPBS do każdej studzienki. Następnie włóż szkło nakrywkowe (o określonej średnicy 15 mm) (patrz Tabela materiałów) do płytki i pozwól mu osiąść przez 1 minutę. Wyjmij DPBS z dołków, wykorzystując podciśnienie, aby upewnić się, że szkiełko pokrywy znajduje się blisko dna naczynia.
  3. Trypsynizować MSCs dawcy i biorców komórek ARPE19 zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
  4. Zliczanie komórek
    1. Umieścić 10 μl zawiesiny komórek na płytce do liczenia w celu wyliczenia.
      UWAGA: Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża, można je 10-krotnie rozcieńczyć pożywką, a następnie postępować jak powyżej.
    2. Wysiewać 10 000 MSCs i 10 000 komórek ARPE19 w 500 μl pożywki na dołek 24-dołkowej płytki. Dobrze wymieszaj komórki przed dodaniem ich do płytki 24-dołkowej. Zobacz obliczenia pokazane poniżej, biorąc pod uwagę liczbę MSC A/ml i liczbę komórek ARPE19 B/mL.
      UWAGA: W przypadku 4 dołków wymagane jest 40 000 MSCs i 40 000 komórek ARPE19 w 2 ml pożywki.
      Objętość zawiesiny MSC (C) zawierającej 40 000 MSCs = 40 000/A μL
      Objętość zawiesiny ARPE19 (D) zawierającej 40 000 MSCs = 40 000/B μL
      Uzupełnić objętość do 2 ml za pomocą 2 - (C + D) ml pożywki.
  5. Obserwuj komórki pod mikroskopem, potrząsaj płytką, aż komórki zostaną równomiernie rozłożone, a następnie inkubuj je w kulturze przez 24 godziny.

3. Pośrednia kohodowla komórek MSC i ARPE19 w systemie transwell

  1. Przeprowadzić hodowlę komórkową, znakowanie, trawienie i liczenie zgodnie z opisem w krokach od 2.1 do 2.4.1.
  2. Wysiewaj 20 000 komórek ARPE19 w 1 ml pożywki na dołek 24-dołkowej płytki.
    UWAGA: W tym eksperymencie użyliśmy komórek ARPE19 bez znakowanych mitochondriów.
  3. Umieść wkładkę w dołku, w którym komórka została zasiana.
  4. Wysiać 10 000 MSCs w 100 μl podłoża w górnej komorze komórkowej na dołek.
  5. Powtórz krok 2.5.

4. Barwienie cytoszkieletu

UWAGA: Chroń przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.

  1. Usuń pożywkę z płytek 24-dołkowych. Umyj wszystkie komórki raz 500 μl/studzienkę 4% poliformaldehydu (PFA), dodaj 500 μl świeżego 4% PFA i utrwal próbki przez 20 min.
    UWAGA: Wstawki systemu transwell są odrzucane.
    UWAGA: Ponieważ nanorurki są bardzo delikatne, umyliśmy komórki bezpośrednio 4% PFA zamiast DPBS, aby zmaksymalizować retencję nienaruszonych nanorurek.
  2. Usunąć utrwalacz i myć próbki przez 3 x 10 minut za pomocą DPBS.
  3. Dodać 500 μl/basenik roztworu blokującego składającego się z 0,5% Triton X-100 (patrz tabela materiałów) i 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć roztwór blokujący i przemywać próbki DPBS przez 3 x 10 minut.
  5. Przygotowanie roztworu barwiącego falloidynę (patrz Tabela materiałów)
    UWAGA: Wzbudzenie i emisja falloidyny wynoszą odpowiednio 650 nm i 668 nm.
    1. Przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając zawartość fiolki w 150 μl bezwodnego DMSO, aby uzyskać 400-krotny roztwór podstawowy.
    2. Przygotuj roztwór barwiący, rozcieńczając 400-krotny roztwór do przechowywania do 1x za pomocą DPBS. To jest roztwór barwiący falloidynę.
  6. Do każdej studzienki dodać 200 μl roztworu barwiącego falloidynę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Odzyskać roztwór barwiący i przemyć próbkę 3 x 10 minut za pomocą DPBS.
    UWAGA: Podczas mycia komórek DPBS lepiej będzie pozostawić płytkę na shakerze.
  8. Wyjmij szklankę nakrywkową za pomocą igły strzykawkowej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    UWAGA: Optymalny stan to taki, w którym na szkle nakrywkowym nie widać widocznej cieczy, ale nie jest ona również sucha.
  9. Nałóż niewielką ilość podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na szkiełko podstawowe i ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełku, aby upewnić się, że podłoże równomiernie pokrywa całą powierzchnię. Uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci.
    UWAGA: Odczekaj kilka minut, aby lakier do paznokci wyschł.
  10. Natychmiast uchwyć obraz konfokalny lub przenieś go do pudełka na plastry i przechowuj w temperaturze 4 °C przez krótki czas.
    UWAGA: Idealny czas przechowywania to 2 tygodnie. Jeśli ten czas zostanie przekroczony, efekt obrazowania może ulec pogorszeniu.

5. Obrazowanie konfokalne

UWAGA: Obrazowanie konfokalne jest wykonywane zgodnie z instrukcją obsługi i może się różnić w zależności od mikroskopu. Tutaj podajemy tylko niektóre z kluczowych kroków.

  1. Uruchom mikroskop konfokalny i otwórz cztery kanały laserowe (405, 488, 561, 640) zgodnie z instrukcją obsługi.
  2. Uzyskaj dostęp do oprogramowania na komputerze i wykonaj wstępne parametryzacje oprogramowania.
    1. Dodaj kanały fluorescencyjne CF-405, CF-488, CF-561 i CF-640 w panelu Zarządzanie procesem.
    2. Dostosuj czas ekspozycji każdego kanału fluorescencji do 200 ms i ustaw intensywność wzmocnienia na 2 w panelu sterowania aparatu.
    3. Ustaw sumator laser/LED na wartość 80.
  3. Manipuluj zewnętrznym panelem sterowania mikroskopu, aby ustawić soczewkę obiektywu na powiększenie 20x i upewnij się, że soczewka jest ustawiona na najniższe ustawienie.
  4. Ustaw suwak w odwróconej orientacji na stole nośnym.
  5. Aktywuj laser 405 nm i manipuluj ostrością za pomocą zgrubnych i precyzyjnych spiral ogniskowania. Obserwuj próbkę pod okularem, aż pojawią się niebieskie komórki fluorescencyjne.
  6. Wybierz opcję Live Imaging (Obrazowanie na żywo) w interfejsie oprogramowania komputera, przełącz się na kanał CF-405 i ponownie wyreguluj helisę precyzyjnej ostrości, aż na ekranie komputera pojawi się wyraźny obraz komórek wykazujących niebieską fluorescencję.
  7. Ustaw soczewkę obiektywu na 40-krotne powiększenie i przejdź do kanału CF-640, a następnie ostrożnie dostosuj ostrość, aż widoczna będzie wyraźna struktura mikrofilamentu komórkowego.
  8. Utrzymanie stałej ogniskowej, sekwencyjne przechodzenie do kanałów CF-405, CF-488 i CF-561 oraz modyfikowanie parametrów optymalnego czasu ekspozycji, intensywności wzmocnienia i sumatora laser/LED do obrazowania w każdym kanale, jeśli to konieczne.
  9. Aktywuj funkcję Z, Image Stack i zdefiniuj punkt początkowy i końcowy osi Z, manipulując ogniskową, aby uchwycić obraz z głębią za pomocą osi Z.
  10. Kliknij przycisk Start w panelu Zarządzanie procesami, aby zrobić zdjęcie.
  11. Wybierz losowo 10 pól widoku dla każdego slice.
    UWAGA: Żadne dwa pola widzenia nie powinny się na siebie nakładać.
  12. Aktywuj funkcję poklatkową, określając całkowity czas trwania obrazowania wynoszący 24 godziny i interwał zdjęć wynoszący 5 minut po zidentyfikowaniu żądanego pola widzenia.
    UWAGA: Aby uchwycić sekwencję poklatkową, konieczne jest zaszczepienie komórek w naczyniu ze szklanym dnem i umieszczenie ich w wentylowanym pudełku zawierającym 5% gazu CO2 .
  13. Zapisz i wyeksportuj wszystkie obrazy.
    UWAGA: Aby wzmocnić kontrolę TNT i transferu mitochondrialnego, zastosowano obrazowanie w super rozdzielczości. Obrazowanie w superrozdzielczości przeprowadzono przy użyciu skomercjalizowanej karty HIS-SIM, określanej jako HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) dostarczonej przez firmę. Obrazy zostały uzyskane przy użyciu obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 100x/1,5 NA.

6. Analiza danych

  1. Do analizy statystycznej każdego obrazu określ ilościowo całkowitą liczbę komórek, liczbę nanorurek, liczbę fioletowych komórek ARPE19-mito-RFE, liczbę fioletowych komórek dodatnich wykazujących zieloną fluorescencję (reprezentującą liczbę komórek ARPE19 z transferem mitochondrialnym z MSC) oraz liczbę komórek fioletowo-ujemnych wykazujących czerwoną fluorescencję (reprezentującą liczbę komórek MSC z transferem mitochondrialnym z komórek ARPE19).
    1. Aby określić ilościowo powstawanie TNT, oblicz stosunek liczby nanorurek międzykomórkowych do całkowitej liczby komórek.
    2. Obliczyć szybkość transferu mitochondrialnego jako stosunek liczby komórek fioletowo-dodatnich wykazujących zieloną fluorescencję do całkowitej liczby komórek fioletowo-dodatnich (reprezentujących transfer mitochondrialny z MSCs do komórek ARPE19) lub stosunek liczby komórek fioletowo-ujemnych wykazujących czerwoną fluorescencję do całkowitej liczby komórek fioletowo-ujemnych (reprezentujących transfer mitochondrialny z komórek ARPE19 do MSCs).

Wyniki

Schematyczny rysunek przedstawiający bezpośrednią kokulturę mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz komórek ARPE19 ukazano na Rysunku 1. Komórki MSC, zmodyfikowane w celu ekspresji mito-GFP jako komórki dawcy, oraz komórki ARPE19-mito-RFP z fioletowo znakowanymi błonami cytoplazmatycznymi jako komórki biorcy, były hodowane razem w stosunku 1:1. Po 24-godzinnym okresie kokultury komórki barwiono falloidyną i analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Powstałe populacje komórek obejmowały komórki MSC-mito-GFP, komórki ARPE19-mito-RFP, komórki ARPE19-mito-RFP zawierające mito-GFP oraz komórki MSC-mito-GFP zawierające mito-RFP. Co istotne, obecność mito-GFP w komórkach ARPE19 oraz mito-RFP w komórkach MSC sugerowała dwukierunkowy transfer mitochondriów.

Szczegółowe informacje na temat tworzenia się TNT przedstawiono na Ryc. 2. Struktury te mogą tworzyć połączenia międzykomórkowe między komórkami tego samego typu (Ryc. 2A-C), a także między komórkami różnych typów (Ryc. 2D). Nanorurki tunelowe (TNT) służą jako kanały łączące sąsiednie komórki, wykazując charakterystyczną strukturę błonową bogatą w F-aktynę z otwartymi końcami, co umożliwia ciągłość cytoplazmatyczną oraz transport mitochondriów. Obrazowanie w osi Z wykazuje, że TNT nie są silnie zakotwiczone w macierzy zewnątrzkomórkowej, lecz zawieszone w medium hodowlanym, co odróżnia je od konwencjonalnych wypustek komórkowych. Transfer mitochondriów jest widoczny na Ryc. 3, gdzie fioletowe komórki ARPE19 wykazują rozproszoną, zieloną fluorescencję kropkową, wskazującą na mitochondria pochodzące z MSC (Ryc. 3A). Komórki MSC ujemne pod względem fioletowego barwnika, zawierające czerwoną fluorescencję kropkową, reprezentują transfer mitochondriów z komórek ARPE19 (Ryc. 3B). Ryc. 4 przedstawia tworzenie się TNT oraz transfer mitochondriów w obrazowaniu superrozdzielczym, co pozwala na dostrzeżenie większej liczby szczegółów transferu mitochondriów poprzez TNT. Film 1 przedstawia dynamikę transportu mitochondriów przez TNT.

Aby dalej wykazać, że warunkiem koniecznym dla transferu mitochondriów jest kontakt fizyczny, taki jak TNT, a nie sekrecja i pobieranie mitochondriów, zastosowano wcześniej opisaną metodę kokultury10. Jak pokazano na Rysunku 5A, komórki MSC i ARPE19 wysiano odpowiednio do górnej i dolnej komory płytki transwell. Były one oddzielone filtrem o porach 0,4 µm, który blokował bezpośredni kontakt między komórkami MSC a ARPE19, ale umożliwiał przenikanie mitochondriów. Po 24 h kokultury poddano analizie komórki ARPE19 w dolnej komorze i zaobserwowano niewielką ilość mito-GFP pochodzącą z komórek MSC z górnej komory (Rysunek 5B). Wyniki te sugerują, że transfer mitochondriów wymaga bezpośredniego kontaktu między komórkami MSC a ARPE19.

Ostatecznie przeprowadzono ilościowe oznaczenie tworzenia się TNT oraz transferu mitochondriów, a odpowiadające im wyniki przedstawiono na Rysunku 6. Komórki MSC wykazały znacznie większą zdolność do przekazywania mitochondriów niż komórki ARPE19 (p = 0.0286). Wyniki te wskazują, że MSC posiadają zdolność do transferu mitochondriów do komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.

Schemat procesu transferu mitochondriów, współhodowla MSC-mito-GFP i ARPE19-mito-RFP, interakcja komórek.
Rycina 1: Schematyczna prezentacja współhodowli MSC i komórek ARPE19. Komórki MSC wykazujące ekspresję mito-GFP oraz komórki ARPE19-mito-RFP znakowane barwnikiem CellTrace Violet są współhodowane przez 24 h w stosunku 1:1. Mito-GFP w komórkach violet+ oznacza transfer mitochondriów z MSC do komórek ARPE19, natomiast Mito-RFP w komórkach violet- oznacza transfer mitochondriów z komórek ARPE19 do MSC. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; MSC = mezenchymalne komórki macierzyste. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej mitochondriów komórkowych, znakowanych mito-GFP i mito-RFP, w przekrojach 3D.
Rycina 2: Tworzenie TNT pomiędzy komórkami MSC a komórkami ARPE19. Białe groty strzałek wskazują tworzenie TNT, zielone groty strzałek wskazują mitochondria z mito-GFP, a czerwone groty strzałek wskazują mitochondria z mito-RFP. (A,B) Tworzenie TNT pomiędzy komórkami ARPE19. (C) Tworzenie TNT pomiędzy komórkami MSC. (D) Tworzenie TNT pomiędzy komórkami MSC a komórkami ARPE19. Obrazowanie w osi Z pokazujące TNT zawieszone w pożywce hodowlanej. Paski skali = 25 µm. Skróty: MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; TNTs = nanotubule tunelowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna Mito-GFP, Mito-RFP, barwników fioletowych i faloidyny w strukturach komórkowych, panel A-B.
Rycina 3Transfer mitochondriów z MSC do komórek ARPE19. (A) białe przerywane okręgi wskazują transfer mitochondriów (mito-GFP) z MSC do komórek ARPE19, a (B) żółte przerywane koło wskazuje transfer mitochondriów (mito-RFP) z komórek ARPE19 do MSC. Paski skali = 20 µmSkróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia konfokalna z MSC-GFP i ARPE19-RFP pokazująca struktury komórkowe, markery fluorescencyjne.
Rycina 4: Formowanie TNT i transfer mitochondriów pomiędzy komórkami MSC a komórkami ARPE19 w mikroskopii super-rozdzielczej. (A i B) Transport mitochondriów z MSC do komórek ARPE19. (C) Szczegół obrazu TNT w obrazowaniu super-rozdzielczym. (D) Zielone mitochondria z MSC obecne w komórkach ARPE19 w obrazowaniu super-rozdzielczym. Pasek skali = 5 µm. Skróty: MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; TNTs = nanorurki tunelowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kokultury komórek MSC-mito-GFP, mikroskopia fluorescencyjna dla badania interakcji komórkowych, barwienie faloidyną.
Rysunek 5: Niemal niewykrywalny transfer mitochondriów w pośredniej kokulturze w systemie transwell komórek MSC i ARPE19. (A) Schematyczny widok kokultury komórek MSC i ARPE19 w systemie transwell. (B) Reprezentatywne obrazy komórek ARPE19 na dnie płytki transwell po 24 h pośredniej kokultury z komórkami MSC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe obrazujące tworzenie TNT i transfer mitochondrialny; komunikacja komórkowa; analiza danych ilościowych.
Rycina 6: Ilościowa ocena tworzenia TNT i transferu mitochondrialnego. (A) Tworzenie TNT, (B) transfer mitochondrialny. Skróty: M = MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; A = komórki ARPE19; TNTs = nanotubule tunelowe; M-A = tworzenie TNT pomiędzy MSCs a komórkami ARPE19; M-M = tworzenie TNT pomiędzy MSCs; A-A = tworzenie TNT pomiędzy komórkami ARPE19. n = 4, średnia ± SD, test U Manna-Whitneya, *p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek dodatkowy S1: Mapowanie plazmidu pCT-Mito-copGFP. Zakupiono Mito-GFP (CYTO102-PA-1). Marker Mitochondria Cyto-Tracer, pCT-Mito-GFP (CMV), łączy się z copGFP poprzez znacznik Cox8, co prowadzi do znakowania mitochondriów białkiem copGFP. Fuzja ta jest sterowana przez promotor CMV, co umożliwia silną ekspresję w liniach komórkowych takich jak HeLa, HEK293 i HT1080. Mito-RFP powstało z modyfikacji mito-GFP poprzez zastąpienie GFP białkiem RFP; zawiera ono gen oporności na puromycynę. Pakowanie tego plazmidu do lentiwirusów jest realizowane przez wyspecjalizowane firmy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo 1: Transport mitochondrialny za pośrednictwem TNT między komórkami MSC a komórkami ARPE19. TNT powstają w wyniku dwukierunkowego ruchu komórek MSC i ARPE19, co ułatwia transfer mitochondriów z komórek MSC do komórek ARPE19. Skróty: MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; TNTs = nanotubule tunelowe. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Liczne badania wykazały, że zjawisko transferu mitochondrialnego za pośrednictwem TNT jest powszechnym procesem fizjologicznym w różnych typach komórek tkankowych 10,11,12,13. Funkcjonalne dawstwo mitochondriów z MSCs do komórek z dysfunkcją mitochondriów wykazuje duży potencjał terapeutyczny 3,14,15,16,17,18.

Tutaj, aby przedstawić dwukierunkowy transfer mitochondrialny za pośrednictwem TNT między MSC a komórkami ARPE19, skonstruowaliśmy linie komórkowe MSC-mito-GFP i ARPE19-mito-RFP. Następnie oba rodzaje komórek hodowano wspólnie przez 24 godziny, a pod koniec kohodowli przeprowadzono barwienie cytoszkieletu. Za pomocą obrazowania konfokalnego obserwowaliśmy i liczyliśmy powstawanie TNT i szybkość transferu mitochondriów. Na wyniki tych obserwacji mogą mieć wpływ takie czynniki, jak proporcja współhodowanych komórek i gęstość komórek. Podczas kohodowli konieczne jest dokładne wymieszanie dwóch typów komórek i utrzymanie ich w stanie jednokomórkowym, aby zminimalizować tworzenie kolonii komórkowych przez komórki homotypowe, zmniejszając w ten sposób występowanie transferu mitochondrialnego między dwoma typami komórek.

Analiza cytometrii przepływowej może być podobnie stosowana do analizy szybkości transferu mitochondriów, a ta metoda jest prostsza niż statystyki po obrazowaniu. Jednak szybkość transferu mitochondrialnego obliczona przy użyciu tej metody będzie nieco niższa niż wartość rzeczywista, ponieważ niewielkie ilości transferu mitochondrialnego mogą nie zostać zarejestrowane. W tym protokole liczenie wyników obrazowania musi być wykonywane bardzo ostrożnie, aby uniknąć pominięć lub nieprawidłowego zliczania fałszywych sygnałów fluorescencyjnych.

Badanie dwukierunkowego transferu mitochondrialnego poprzez konstruowanie dwóch linii komórkowych z fluorescencją mitochondrialną jest innowacją tego protokołu. Metoda pozwala uniknąć interferencji barwników fluorescencyjnych i sprawia, że wyniki eksperymentów są bardziej wiarygodne. Transfer mitochondriów z komórek siatkówki do MSCs zasługuje na dalsze badania, na przykład w celu zbadania zmian w proporcji mitochondriów przenoszonych w obu kierunkach w warunkach stresowych.

Stosując się do procedur eksperymentalnych opisanych w tym protokole, byliśmy w stanie ustalić, że MSCs mogą przenosić mitochondria do komórek nabłonka barwnikowego siatkówki przez tunelujące nanorurki. Zjawisko to może służyć jako wiarygodny mechanizm leżący u podstaw korzystnego wpływu MSCs na tkanki siatkówki, pomagając w ten sposób w wyjaśnieniu terapii regeneracyjnych tkanek oka opartych na MSCs.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd za obrazowanie za pomocą komercyjnego mikroskopu super-resolution (HIS-SIM), akwizycję danych, rekonstrukcję obrazu SR, analizę i dyskusję. Praca ta jest częściowo wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82125007,92368206) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (Z200014).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056
4% paraformaldehydSolarbioP1110
Płytka 6-dołkowaNEST703001
15 ml probówka wirówkowaBD Falcon352097
24-dołkowa NEST702001
Komórki ARPE19ATCCCRL-2302Linie komórkowe
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BeyotimeST025
CellTrace fioletowyInvitrogenC34557
Szkiełko okładkoweNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Bydło płodowe Surowica (FBS)VivaCellC04002-500
Odczynnik FluorSaveMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003Linie komórkowe
ncMissionPokazaneNaRP02010
Pióro StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Plazmid; Od  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
TranswellCorning3470
Pipeta Axygen TF-1000-R-S Phalloidin Invitrogen A22287 Triton X-100 Solarbio T8200 Płytka

Bibliografia

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwukierunkowy transfer mitochondri wledzenie mitochondri wmikroskopia konfokalnakokultura kom rekznakowanie Mito GFPznakowanie Mito RFP
Transfer mitochondrialny za pomocą nanorurek tunelowych między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a nabłonkiem barwnikowym siatkówki in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.