Method Article

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/66922

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie naczyń włosowatych siatkówki jest klinicznym znakiem rozpoznawczym wczesnych stadiów retinopatii cukrzycowej (DR). Nasze ostatnie badania wykazały, że usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki wywołane cukrzycą odgrywa kluczową i wcześniej nierozpoznaną rolę przyczynową w zwyrodnieniu naczyń włosowatych siatkówki za pośrednictwem stanu zapalnego. Wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki wynika z nadekspresji oksydazy lizylowej, enzymu, który sieciuje i usztywnia macierz podśródbłonkową. Ponieważ oczekuje się, że zwalczanie DR na wczesnym etapie zapobiegnie lub spowolni postęp DR i związaną z tym utratę wzroku, macierz podśródbłonkowa i sztywność naczyń włosowatych stanowią istotne i nowe cele terapeutyczne dla wczesnego leczenia DR. Co więcej, bezpośredni pomiar sztywności naczyń włosowatych siatkówki może służyć jako kluczowy etap walidacji przedklinicznej dla opracowania nowych technik obrazowania do nieinwazyjnej oceny sztywności naczyń włosowatych siatkówki u zwierząt i ludzi. Mając to na uwadze, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół izolacji i pomiaru sztywności naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej przy użyciu mikroskopii sił atomowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naczynia włosowate siatkówki są niezbędne do utrzymania homeostazy siatkówki i funkcji wzrokowych. Rzeczywiście, ich zwyrodnienie we wczesnej cukrzycy jest silnie związane z rozwojem zagrażających wzrokowi powikłań retinopatii cukrzycowej (DR), choroby mikronaczyniowej, która dotyka prawie 40% wszystkich osób z cukrzycą1. Zapalenie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do zwyrodnienia naczyń włosowatych siatkówki w DR. Wcześniejsze badania wykazały ważną rolę nieprawidłowych sygnałów molekularnych i biochemicznych w zapaleniu naczyń siatkówki wywołanym cukrzycą2,3. Jednak ostatnie prace wprowadziły nowy paradygmat patogenezy DR, który identyfikuje usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako kluczowy, ale wcześniej nierozpoznany czynnik zapalenia i zwyrodnienia naczyń siatkówki4,5,6.

W szczególności, wywołany cukrzycą wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki jest spowodowany regulacją w górę enzymu sieciującego kolagen oksydazy lizylowej (LOX) w komórkach śródbłonka siatkówki (ECs), co usztywnia macierz podśródbłonkową (błonę podstawną)4,5,6. Usztywnienie macierzy z kolei usztywnia leżące nad siatkówką EC (ze względu na mechaniczną wzajemność), prowadząc w ten sposób do ogólnego wzrostu sztywności naczyń włosowatych siatkówki4. Co najważniejsze, samo to usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki wywołane cukrzycą może sprzyjać aktywacji EC siatkówki i śmierci EC za pośrednictwem stanu zapalnego. Ta mechaniczna regulacja wad EC siatkówki może być przypisana zmienionej mechanotransdukcji śródbłonka, procesowi, w którym sygnały mechaniczne są przekształcane w sygnały biochemiczne w celu wytworzenia odpowiedzi biologicznej7,8,9. Co ważne, zmienione sygnały mechaniczne EC i struktura macierzy podśródbłonkowej są również związane ze zwyrodnieniem naczyniówek związanym ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wczesnym wiekiem (AMD)10,11,12, co świadczy o szerszych implikacjach mechanobiologii naczyń w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Warto zauważyć, że usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki występuje we wczesnym stadium cukrzycy, co zbiega się z początkiem zapalenia siatkówki. W związku z tym wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki może służyć zarówno jako cel terapeutyczny, jak i wczesny marker diagnostyczny DR. W tym celu ważne jest uzyskanie wiarygodnych i bezpośrednich pomiarów sztywności naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonkowej. Można to osiągnąć za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM), który oferuje unikalną, czułą, dokładną i niezawodną technikę bezpośredniego pomiaru sztywności komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i tkanek13. AFM przykłada niewielką (nanoniutonową) siłę wgłębienia na próbkę, której sztywność określa stopień, w jakim wgłębienie AFM wygina się - im sztywniejsza próbka, tym bardziej wygina się wspornik i odwrotnie. Intensywnie używaliśmy AFM do pomiaru sztywności hodowanych komórek śródbłonka, matryc subśródbłonkowych i izolowanych naczyń włosowatych siatkówki myszy4,5,6,11,12. Te pomiary sztywności AFM pomogły zidentyfikować mechanobiologię śródbłonka jako kluczowy czynnik determinujący patogenezę DR i AMD. Aby poszerzyć zakres mechanobiologii w badaniach nad wzrokiem, poniżej przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący stosowania AFM do pomiarów sztywności izolowanych naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Użytkowania Zwierząt i Opieki (IACUC; numer protokołu ARC-2020-030) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (numer A3196-01 instytucji OLAW zapewniającej dobrostan zwierząt). Poniższy protokół został przeprowadzony przy użyciu naczyń włosowatych siatkówki wyizolowanych od dorosłych (20-tygodniowych) samców myszy C57BL / 6J o wadze ~ 25 g (myszy z cukrzycą) i ~ 32 g (myszy bez cukrzycy; Laboratorium Jacksona).

1. Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy do pomiaru sztywności AFM (Dni 1-4)

UWAGA: Ten protokół, opisany w niedawnym badaniu4, szczegółowo opisuje enukleację i łagodne unieruchomienie oka myszy, izolację siatkówki i trawienie trypsyny, a następnie montaż powstałego unaczynienia siatkówki na szkiełkach mikroskopowych do pomiaru sztywności AFM.

  1. Wyłuszczenie i łagodne utrwalenie (dzień 1)
    1. Po eutanazji myszy z ekspozycją na dwutlenek węgla, a następnie zwichnięciem szyjki macicy, włóż mikrokleszcze za gałkę oczną, przytrzymaj przyczep mięśniowy i ostrożnie wyciągnij oko, nie ściskając mikrokleszczyków zbyt mocno, co może spowodować przecięcie nerwu wzrokowego.
    2. Umieścić wyłuszczone oko w 5% (v/v) formalinie w PBS na 24 godziny w temperaturze 4 °C w celu łagodnego utrwalenia.
      UWAGA: Na podstawie doświadczenia4, niestałe lub łagodniej unieruchomione oczy dają kruche naczynia włosowate, które ulegają fragmentacji podczas przygotowywania próbki AFM i pomiaru sztywności.
  2. Izolacja siatkówki (dzień 2)
    1. Umieść nieruchome oko na kawałku woskowanego papieru pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie, za pomocą mikrokleszczyków, przytrzymaj resztki mięśnia i nerwu wzrokowego przyczepione na zewnątrz tylnego oka i ustaw oko tak, aby rogówka była skierowana w jedną stronę (Ryc. 1).
    2. Za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj nacięcie 1-2 mm z tyłu i równolegle do rąbka (połączenie rogówka-twardówka). Następnie, przytrzymując oko na miejscu za pomocą mikrokleszczyków, przyłóż siłę ostrza w dół i kontynuuj naciskanie, aż przedni segment oka zostanie całkowicie oddzielony od tylnego końca (Rysunek 1). Wyrzuć przedni odcinek i soczewkę. Nie piłuj tam iz powrotem, ponieważ może to spowodować uszkodzenie siatkówki.
    3. Przenieś tylny segment (twardówkę, naczyniówkę i siatkówkę) do 6 cm naczynia wypełnionego PBS (pH 7,4).
    4. Za pomocą mikroszpatułki i jednocześnie delikatnie przytrzymując nerw wzrokowy mikrokleszkami, zgarnij siatkówkę. Przechowywać siatkówkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej PBS w temperaturze 4 °C do momentu izolacji kapilarnej.
       
  3. Płukanki siatkówki
    1. Aby przepłukać jedną siatkówkę, napełnij sześć studzienek 12-dołkowej płytki 1 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O). Następnie, za pomocą odwróconej pipety Pasteura, przenieś siatkówkę z probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml do pierwszego dołka.
    2. Przepłukać siatkówkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Używając pipety P1000, ostrożnie odpipetuj wodę w górę iw dół przylegającą do siatkówki, wdmuchując wodę na siatkówkę, aby spowodować delikatne mieszanie.
    4. Używając pipety z odwróconym szkłem, przenieść siatkówkę do drugiego dołka i powtórzyć kroki 1.3.2 i 1.3.3 4 razy, przy czym każde płukanie odbywa się w świeżej studzience (zawierającejddH2O).
    5. Na koniec przenieś siatkówkę do szóstej studzienki i przepłucz ją przez noc (O/N) w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 100 obr./min, aby ułatwić oddzielenie neurogleju siatkówki od naczyń krwionośnych podczas trawienia trypsyny.
  4. Trawienie trypsyny siatkówki (dzień 3)
    1. Przygotować 10% (w/v) roztwór trypsyny, rozpuszczając trypsynę w proszku w stosunku 1:250 w buforze Tris (pH 8; 0,1 M). Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając stożkową rurkę, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków, co utrudnia potwierdzenie rozpuszczalności trypsyny.
    2. Równoważyć 10% roztwór trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Gdy trypsyna w proszku całkowicie się rozpuści, przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
    3. Na 12-dołkowej płytce dodaj 2 ml / dołek / siatkówkę przefiltrowanego 10% roztworu trypsyny. Dodaj trochę dodatkowego roztworu trypsyny do sąsiedniej studzienki (aby zrównoważyć szklane ścianki pipety do kolejnych kroków).
    4. Dodaj 3 ml ddH2O do trzech dołków 6-dołkowej płytki (te trzy dołki należy przeznaczyć na jedną siatkówkę).
    5. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml włóż końcówkę P200 przed dodaniem 4 ml przefiltrowanego 10% roztworu trypsyny. Przenieś tę stożkową rurkę do łaźni o temperaturze 37 °C, aby umożliwić namoczenie końcówki w trypsynie przez 2-3 minuty, ponieważ pomaga to zapobiec przywieraniu siatkówki do ścianek końcówki w późniejszych etapach.
    6. Po przepłukaniu siatkówki O/N (od kroku 1.3.5) użyj pipety P1000, aby ostrożnie odpipetować wodę w górę iw dół przylegającą do siatkówki, spryskując siatkówkę wodą, aby spowodować delikatne poruszenie.
    7. Za pomocą pipety z odwróconego szkła przenieś przepłukaną siatkówkę do studzienki zawierającej trypsynę na płytce 12-dołkowej (od kroku 1.4.3). Upewnij się, że siatkówka jest przenoszona z minimalną ilością resztkowego ddH2O, aby nie rozcieńczyć znacząco roztworu trypsyny. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    8. Wyśrodkowawszy nasączoną trypsyną końcówkę P200 (z kroku 1.4.5) na obszarze nerwu wzrokowego, delikatnie pipetuj całą sieć naczyniową w górę iw dół, aby oddzielić tkankę nienaczyniową14.
    9. Używając pipety z odwróconego szkła wstępnie przepłukanej trypsyną (poprzez pipetowanie trypsyny 5 razy w górę iw dół), przenieś naczynia krwionośne siatkówki do pierwszego dołka zawierającego ddH2O-O na płytce 6-dołkowej (od kroku 1.4.4).
    10. Zakręć płytką i odpipetuj naczynia krwionośne w górę iw dół za pomocą szklanej pipety płukanej trypsyną w kształcie odwróconej trypsyny, aby usunąć wszelkie resztki tkanki nienaczyniowej.
    11. Za pomocą szklanej pipety przenieść układ naczyniowy siatkówki do drugiego dołka zawierającego ddH2O na płytce 6-dołkowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zamontowania na szkiełku w celu pomiaru sztywności AFM.
      UWAGA: Uwodnione unaczynienie siatkówki (w PBS) jest strukturalnie nienaruszone w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Jednak rutynowe pomiary sztywności powinny być wykonywane ze świeżo odizolowanych kapilarn.
  5. Montaż układu naczyniowego siatkówki do pomiaru sztywności AFM (dzień 4)
    1. Za pomocą odwróconej szklanej pipety płukanej trypsyną przenieś układ naczyniowy siatkówki do trzeciego dołka zawierającego ddH2O z płytki 6-dołkowej, aby usunąć resztki roztworu trypsyny.
    2. Dokładnie wyczyść (przy użyciu ddH2O i tkanki wycieraczki) naładowane szkiełko mikroskopowe o naładowanej powierzchni, które będzie używane do montażu sieci naczyniowej do pomiaru sztywności AFM.
      UWAGA: Naładowana powierzchnia szkiełka zapewnia silne wiązanie sieci naczyniowej podczas pomiaru AFM.
    3. Oznacz szkiełko i narysuj 4-5 cm okrągły obszar wokół środka za pomocą hydrofobowego pisaka, aby uniknąć rozlania wody podczas kolejnych kroków.
    4. Za pomocą odwróconej szklanej pipety płukanej trypsyną ostrożnie przenieś układ naczyniowy siatkówki do środka zaznaczonego obszaru.
    5. Za pomocą pipety P200 ostrożnie usuń jak najwięcej nadmiaru wody z jednej krawędzi, nie zasysając przypadkowo naczynia krwionośnego do końcówki.
    6. Umieść szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego (kaptur BSL-2) blisko przedniej strony (przefiltrowana siatka) i pozwól, aby resztki wody odparowały.
    7. Gdy układ naczyniowy jest prawie suchy, pod mikroskopem z kontrastem fazowym (4-krotne powiększenie), ostrożnie nawodnij naczynia, powoli dodając ddH2O za pomocą pipety P200 po jednej stronie zaznaczonego obszaru. Dodanie ddH2O bezpośrednio na naczynia krwionośne powoduje ich oderwanie.
    8. Wykonaj obrazy z kontrastem fazowym uwodnionego naczynia krwionośnego w powiększeniach 4x i 20x, aby upewnić się, że ma dobrą integralność strukturalną i jest odpowiednio rozłożona (nie składa się na siebie) i przymocowana do szkiełka podstawowego, co jest podstawowym kryterium wiarygodnego pomiaru sztywności AFM.

2. Uzyskiwanie macierzy podśródbłonkowej z hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (REC) (Dni 1-17)

UWAGA: Ten protokół, zaadaptowany z Beacham et al.15 i opisane w ostatnich badaniach4,5,6, opisuje hodowlę REC na zmodyfikowanych szklanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie decelularyzację w celu uzyskania matrycy podśródbłonkowej do późniejszego pomiaru sztywności AFM.

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych ze szkła pokrytego żelatyną i posiewanie komórkowe (Dzień 1)
    UWAGA: Wykonaj powlekanie żelatyną i kolejne etapy płukania PBS++ w okapie do hodowli tkankowej przed przejściem do okapu do oparów chemicznych w celu przeprowadzenia kolejnych etapów obróbki aldehydem glutarowym i etanoloaminą.
    1. Umieścić jedno autoklawowane okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na zagłębienie sterylnej płytki 24-dołkowej i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej, sterylnej 0,2% (w/v) żelatyny (rozcieńczonej w PBS zawierającej wapń i magnez; PBS++) do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Odessać roztwór żelatyny, raz przepłukać szkiełka nakrywkowe sterylnym PBS++ i usieciować pokrytą żelatynę, dodając 500 μl 1% (v/v) aldehydu glutarowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zebrać i odpowiednio zutylizować (zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi) roztwór aldehydu glutarowego przed płukaniem szkiełek nakrywkowych PBS++ przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min w RT. Powtórz ten etap płukania 5 razy. Podczas pierwszych trzech płukań należy podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej pęsety, aby umożliwić dokładne wypłukanie aldehydu glutarowego. Każda pozostała ilość może zmniejszyć żywotność komórek.
    4. Dodać 800 μl 1 M etanoloaminy do usieciowanego żelatyny szkiełka nakrywkowego na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby ugasić wszelkie pozostałe ślady aldehydu glutarowego w studzience.
    5. Zebrać i odpowiednio zutylizować (zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi) roztwór etanoloaminy i płukać szkiełka nakrywkowe 5 razy PBS++ przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej przy 100 obr./min w RT. Podczas pierwszych trzech płukań należy podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej pęsety, aby umożliwić dokładne wypłukanie etanoloaminy. Każda pozostała ilość może zmniejszyć żywotność komórek.
    6. Usieciowane szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe do powlekania komórkowego.
      UWAGA: Chociaż rutynowo platerujemy komórki natychmiast po przygotowaniu szkiełek nakrywkowych, warto porównać posiewanie komórek na usieciowanych żelatynowych szkiełkach nakrywkowych przechowywanych w PBS++ w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.
    7. W sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej płytki komórek mikronaczyniowego śródbłonka siatkówki (REC) w 500 μl pożywki/basenie o gęstości, która osiąga 100% zbieżność w ciągu 24 godzin, co potwierdzono mikroskopią z kontrastem fazowym.
      UWAGA: Osiągnięcie konfluencji w ciągu 24 godzin jest ważne, ponieważ wynikający z tego spoczynek REC zwiększy zdolność komórek do wydzielania macierzy (patrz następny krok). Z naszego doświadczenia z ludzkimi REC wynika, że gęstość posiewu 4 x 104 komórek/cm2 jest wystarczająca do osiągnięcia konfluencji w ciągu 24 godzin. Ponieważ jednak rozmiar REC różni się w zależności od gatunku (np. REC myszy jest znacznie mniejszy), może być konieczna optymalizacja początkowej gęstości posiewu.
  2. Wytwarzanie macierzy podśródbłonkowej przez hodowlę REC (dzień 2-16)
    1. Po tym, jak komórki osiągną konfluencję (~24 h), zastąp pożywkę żywą świeżą pożywką uzupełnioną sterylnie przefiltrowanym kwasem askorbinowym (końcowe stężenie 200 μg/ml).
      UWAGA: Wszelkie leczenie REC czynnikami ryzyka choroby (np. Wysoki poziom glukozy, zaawansowane produkty końcowe glikacji itp.) lub środkami farmakologicznymi można rozpocząć już teraz, wraz z leczeniem kwasem askorbinowym.
    2. Zmieniaj pożywkę hodowlaną uzupełnioną kwasem askorbinowym co drugi dzień przez 15 dni.
      UWAGA: Kwas askorbinowy jest niestabilny w roztworze. Przygotuj świeży 100-krotny roztwór podstawowy co drugi dzień do średniej suplementacji.
  3. Decelularyzacja kultur REC w celu uzyskania macierzy podśródbłonkowej (dzień 16)
    1. Po 15 dniach leczenia kwasem askorbinowym usuń pożywkę i przepłucz komórki PBS bez wapnia/magnezu.
    2. Decelularyzacja kultur REC poprzez dodanie 250 μl / na studzienkę ciepłego buforu decelularyzacyjnego (20 mM wodorotlenku amonu i 0,5% Triton X-100 w PBS) przez ~ 2-3 min. Potwierdź usunięcie komórek pod mikroskopem z kontrastem fazowym (10-krotne powiększenie).
    3. Delikatnie usuń bufor decelularyzacyjny, nie naruszając macierzy podśródbłonkowej wydzielanej przez REC i dodaj 0,5 ml PBS do każdej studzienki.
      UWAGA: Aby upewnić się, że macierz podśródbłonkowa nie odczepia się podczas tego i kolejnych etapów płukania, należy wykonywać delikatne płukanie tylko pipetą P1000. Nie wykonuj zasysania próżniowego.
    4. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez noc w celu ustabilizowania matrycy wydzielanej przez REC.
  4. Leczenie DNazy macierzy podśródbłonkowej w celu usunięcia resztek komórkowych (Dzień 17)
    1. Przepłukać macierz podśródbłonkową z kroku 2.3.4 za pomocą 800 μl PBS/studzienkę.
    2. Delikatnie usunąć PBS i inkubować matrycę z 200 μl DNazy I wolnej od RNaz (30 K jednostek) w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady resztek komórkowych. Sprawdź skuteczność leczenia DNazą, uważnie szukając resztek komórkowych pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
    3. Delikatnie usunąć roztwór DNazy I i dwukrotnie przepłukać macierz podśródbłonkową 800 μl PBS/studzienkę.
    4. Sprawdź, czy włóknista matryca podśródbłonkowa w makroskali jest widoczna pod mikroskopem z kontrastem fazowym (powiększenie 10x). Wizualizacja drobniejszych włókien macierzy w nanoskali wymaga skanowania topograficznego AFM lub obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości białek macierzy znakowanych immunologicznie przy 100-krotnym powiększeniu.
    5. Natychmiast użyj świeżej (nieutrwalonej) matrycy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności AFM.
    6. Po pomiarze AFM utrwalić próbki matrycy za pomocą 1% (v/v) paraformaldehydu (15 min w temperaturze pokojowej) i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu immunoznakowania przeciwciałami przeciwko białkom macierzy podśródbłonkowej i/lub enzymom sieciującym.

3. Pomiar sztywności AFM

UWAGA: Ten protokół, zaadaptowany ze standardowej instrukcji obsługi AFM i opisany w ostatnich badaniach4,5, szczegółowo opisuje pozyskiwanie i analizę danych dotyczących sztywności naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonkowej za pomocą AFM i oprogramowania do analizy danych. Chociaż kroki opisane poniżej są oparte na konkretnym modelu AFM (patrz tabela materiałów), podstawowe zasady mają ogólne zastosowanie do wszystkich modeli AFM.

  1. Wybór sondy wspornikowej
    UWAGA: Miękkie próbki biologiczne wymagają miękkich wsporników, które mogą zginać się po wgłębieniu próbki, podczas gdy wymiary sondy są dobrane tak, aby pasowały do wymiarów próbki.
    1. Do pomiaru sztywności naczyń siatkówki myszy o średnicy 5-8 μm należy użyć sondy wspornikowej o promieniu 1 μm ze stałą sprężystości (k) 0,2-0,3 N/m. Do pomiaru sztywności matrycy podśródbłonkowej złożonej z włókien w skali nano należy użyć sondy wspornikowej o promieniu 70 nm ze stałą sprężystości (k) 0,06-0,1 N/m.
  2. Montaż wspornikowy
    1. Na komputerze AFM otwórz oprogramowanie sterujące jednostką AFM i kamerą podłączoną do mikroskopu z kontrastem fazowym, który służy do wizualizacji wspornika i próbki.
    2. Zamocuj uchwyt wspornika na stojaku do wymiany wsporników i zamontuj wybrany wspornik na uchwycie za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich pod stereoskopem, nie uszkadzając fizycznie wspornika. Dokręć na uchwycie, aby zabezpieczyć wspornik.
    3. Umieść i zablokuj uchwyt wspornika na głowicy AFM, która spoczywa na stojaku.
    4. Korzystając z funkcji silnika krokowego w oprogramowaniu AFM, wycofaj głowicę AFM do najwyższego punktu i ustaw tę pozycję jako punkt zerowy w oprogramowaniu. Ten krok zapobiega przypadkowemu uderzeniu wspornika AFM w stolik na próbkę podczas montażu głowicy AFM (następny krok).
    5. Ostrożnie podnieś głowicę AFM ze stojaka i zamontuj ją na stoliku na próbki AFM, umieszczając nogi w odpowiednich szczelinach.
  3. Osiowanie laserowe
    UWAGA: Początkowe wyrównanie lasera odbywa się bez żadnej próbki (tj. w trybie powietrznym), ponieważ zapewnia bardziej precyzyjne wyrównanie wiązki laserowej na końcówce wspornika (zapobiegając załamaniu lasera w cieczy). Ponieważ jednak próbki biologiczne są zanurzane w ośrodku, który ma inny współczynnik załamania światła niż powietrze, ważne jest, aby przed pomiarem sztywności ponownie ustawić laser w ośrodku.
    1. Aby wyrównać laser w powietrzu, umieść głowicę AFM na stoliku na próbkę i użyj obiektywu 10x i dołączonej kamery, aby wyświetlić wspornik na monitorze w trybie na żywo. Laser na podczerwień jest niewidoczny przed wzrokiem użytkownika, ale jest widoczny za pomocą kamery CCD.
    2. Wybierz funkcję Spektroskopia sił w trybie kontaktowym w oprogramowaniu i otwórz okno zatytułowane Wyrównanie laserowe.
    3. Za pomocą dwóch oznaczonych laserem po bokach na głowicy AFM, skoncentruj wiązkę lasera na wsporniku tak, aby wartość SUM w oknie wyrównania lasera była najwyższa. Aby to osiągnąć, ustaw ostrość laser na środku wspornika lub wokół niego.
    4. Za pomocą regulacyjnych detektora wyreguluj fotodetektor tak, aby plamka lasera znajdowała się pośrodku okna wyrównania lasera.
    5. Za pomocą regulacyjnej lusterka wyreguluj lustro tak, aby upewnić się, że wartość SUMA jest najwyższa możliwa.
      UWAGA: Wysoka wartość SUM zapewnia czułą i dokładną ocenę sztywności próbki. W związku z tym należy wykonać zarówno etapy wyrównania lasera, jak i regulacji lustra, aby uzyskać najwyższą wartość SUM.
    6. Następnie, w celu wyrównania laserowego w cieczy, dodaj żądaną pożywkę hodowlaną do naczynia i mocno zamontuj ją na stoliku, aby zapobiec wibracjom lub dryfowaniu, które tworzą artefakty pomiarowe podczas wgłębiania próbki.
    7. Patrząc na obraz z kamery na żywo skupiony na wsporniku, opuść go do cieczy za pomocą funkcji silnika krokowego.
    8. Powtórz kroki 3.3.4 i 3.3.5, aby upewnić się, że wartość SUMA pozostaje najwyższa, a plamka lasera znajduje się w środku okna wyrównania lasera.
  4. Kalibracja stałej sprężystości wspornikowej
    UWAGA: Chociaż sondy wspornikowe są dostarczane ze skalibrowaną przez producenta stałą sprężystości (k), dobrą praktyką jest niezależna weryfikacja jej wartości (w cieczy) przed rozpoczęciem pomiaru. Użyj czystej szklanej powierzchni, która minimalizuje interakcje między sondą wspornikową a szklaną powierzchnią.
    1. Siła zadana przyłożona przez wspornik ustawia maksymalne odchylenie lasera od wspornika, które jest dozwolone dla wgłębienia siły. Ustaw go początkowo na 1,5 V. Jeśli wspornik nie zbliży się do tej zadanej siły wartości zadanej, zwiększaj ją stopniowo, aż wgnieci próbkę i wygeneruje krzywą wgłębienia siły.
    2. Długość Z oznacza maksymalną odległość, na jaką z-piezo wycofuje się po osiągnięciu przez wspornik wartości zadanej podczas wgłębienia próbki. Długość Z powinna być co najmniej wystarczająca, aby zapewnić czyste oddzielenie sondy wspornikowej od próbki. Aby skalibrować stałą sprężystości na powierzchni szklanej, ustaw długość Z na 1 μm.
    3. Prędkość Z odnosi się do prędkości, z jaką z-piezo przesuwa wspornik pionowo w dół w kierunku próbki podczas wgłębiania siły. Powinien być zoptymalizowany, ponieważ bardzo niska prędkość uchwyci przede wszystkim lepkie zachowanie próbki, podczas gdy bardzo wysoka prędkość uchwyci przede wszystkim zachowanie sprężyste. Oczekuje się, że optymalna prędkość pozwoli uchwycić prawdziwą lepkosprężystą naturę próbek biologicznych. Ustaw prędkość Z na 2 μm/s dla lepkosprężystych próbek biologicznych.
    4. Wysokość obiektu w zakresie Z wskazuje przybliżoną odległość od próbki, w której spoczywa z-piezoelektryczne po zmierzeniu krzywej siły i przed przemieszczeniem się w inne miejsce na próbce. Wysokość docelowa zakresu Z powinna być większa niż wysokość przykładowych obiektów. Ustaw wysokość celu w zakresie Z na 7,5 μm.
    5. Korzystając z funkcji silnika krokowego, przyłóż wspornik dość blisko powierzchni próbki (sądząc po ostrości na obrazie kontrastu fazowego przy 10-krotnym powiększeniu) przed wybraniem funkcji Approach w oknie spektroskopii sił w trybie kontaktowym, aby obniżyć wspornik w mniejszych krokach co 15 μm.
    6. Kliknij przycisk Acquire, aby przechwycić krzywą siły.
    7. Wybierz krzywą siły, otwórz ją w oknie menedżera kalibracji i wybierz Tryb oparty na kontakcie w sekcji metody.
    8. Korzystając z funkcji Wybierz-dopasowanie zakresu, wybierz krzywą wycofania wspornika dla dopasowania krzywej liniowej. Następnie zaznacz pole wyboru Czułość, aby przekonwertować jednostkę siły z V na N.
    9. Podnieś wspornik o 100-200 μm w cieczy i wybierz funkcję szumu termicznego. Ponownie, korzystając z opcji Wybierz zakres dopasowania, dopasuj krzywą dzwonową szumu termicznego do krzywej Lorentza. Po dopasowaniu krzywej zaznacz pole Stała sprężystości (k). Upewnij się, że stała sprężystości (k) jest zbliżona do wartości producenta i zanotuj ją na przyszłość. Po kalibracji jednostka wartości zadanej zmieni się z mV na nN.
      UWAGA: Szum termiczny to naturalna częstotliwość wspornika w określonej temperaturze. Korekcja szumu termicznego jest wymagana do dokładnego pomiaru stałej sprężystości.
  5. Akwizycja krzywych siła-odległość
    1. Umieść próbkę montowaną na szkiełku podstawowym (naczynia siatkówki lub macierz podśródbłonkową) na stoliku AFM i wybierz spektroskopię sił w trybie kontaktowym w sekcji eksperymentu oprogramowania.
    2. Ustaw siłę zadaną na 0,5 nN i kliknij przycisk Approach, który jest znacznie wyższy niż ugięcie termiczne zarówno sond wspornikowych SAA-SPH 1 μm, jak i PFQNM-LC-A 70 nm, zapewniając płynne zbliżanie się wspornika do próbki.
    3. Po wykryciu powierzchni przez wspornik i powrocie do spoczynkowej wysokości docelowej należy ustawić wartość zadaną na 0,2 nN dla sztywniejszej sondy wspornikowej SAA-SPH 1 μm lub 0,1 nN dla bardziej miękkiej sondy wspornikowej PFQNM-LC-A 70 nm. Ta regulacja wartości zadanej zapewnia, że zarówno sztywne, jak i miękkie wsporniki łatwo się wyginają podczas wgłębiania próbki (patrz rozdział 3.1).
    4. Ustaw długość Z na ~2.5 μm, aby zapewnić czyste oddzielenie sondy wspornikowej od próbek biologicznych podczas wciągania (patrz krok 3.4.2) i prędkość Z na 2 μm/s (patrz krok 3.4.3).
    5. Używając stolika na stoliku AFM, ostrożnie umieść sondę wspornikową w żądanym miejscu na próbce.
      UWAGA: Ponieważ kapilary nie zawsze rozkładają się płasko na szkiełku, można bezpiecznie wycofać wspornik o kolejne 10-20 μm z jego docelowej wysokości spoczynkowej przed przesunięciem stolika.
    6. Kliknij przycisk Podejście, aby najpierw zbliżyć wspornik do próbki, a następnie kliknij przycisk Uzyskaj, aby przechwycić krzywe siły dla żądanych lokalizacji. Zapisz wszystkie krzywe sił do analizy.
  6. analiza danych
    1. Otwórz krzywą siły w oprogramowaniu do przetwarzania danych.
    2. Wybierz krzywą siły cofania do analizy danych (podobnie jak w kroku 3.4.8).
    3. Korzystając z funkcji Wygładzanie danych, wygładź krzywą siły za pomocą filtra Gaussa, aby usunąć niepożądane szumy z pozyskanych danych.
    4. Korzystając z funkcji odejmowania linii bazowej, dostosuj wartość nachylenia i wielkość (bezkontaktowej) części linii bazowej krzywej siły do zera.
    5. Kliknij funkcję Punkt kontaktowy, aby automatycznie przesunąć punkt styku krzywej siły do współrzędnych (0,0) na osiach X i Y.
    6. Korzystając z funkcji pionowego położenia końcówki, oblicz rzeczywiste położenie pionowe wspornika na osi Y, korygując wszelkie wgłębienia próbki.
    7. Na przetworzonej krzywej siły zastosuj funkcję dopasowania sprężystości, wybierając najpierw kształt i promień końcówki (na podstawie wybranej sondy wspornikowej), a następnie dopasowując krzywą siły przy użyciu modelu Hertza/Sneddona.
      1. Jeśli wgłębienie matrycy przez sondę o promieniu 70 nm przekracza 70 nm, co zwykle ma miejsce, wybierz kształt końcówki paraboloidalnej. W przypadku pomiaru sztywności kapilarnej wgłębienie próbki za pomocą sondy o promieniu 1 μm nigdy nie przekracza 1 μm, dlatego należy wybrać kształt końcówki kuli. Ponadto, jeśli punkt styku dopasowanej krzywej nie pokrywa się z punktem styku rzeczywistej krzywej cofania, należy zaznaczyć pole wyboru Krzywa przesunięcia.
    8. Zanotuj i zapisz wartość modułu (sztywności) Younga.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naczynia włosowate siatkówki myszy
Pomiar sztywności AFM izolowanych naczyń włosowatych siatkówki obejmuje etapy obchodzenia się z próbką, które mogą potencjalnie uszkodzić ich integralność mechanostrukturalną. Aby temu zapobiec, a tym samym zapewnić wykonalność, wiarygodność i odtwarzalność pomiarów AFM, wyłuszczone oczy są utrwalane w 5% formalinie przez noc w temperaturze 4 °C przed izolacją naczynia. Ten łagodny protokół utrwalania ze zmniejszonym stężeniem formaliny, niską temperaturą utrwalania, ograniczonym czasem utrwalania i brakiem nakłucia rogówki został opracowany w celu zminimalizowania wszelkich potencjalnych artefaktów sieciowania/usztywniania spowodowanych utrwaleniem chemicznym. Jak pokazano w Rysunek 2B,C, ta stosunkowo łagodna fiksacja zapewnia, że izolowane unaczynienie siatkówki jest strukturalnie wytrzymałe i wystarczająco trwałe do pomiaru AFM. Natomiast naczynia siatkówkowe odizolowane od oczu nieunieruchomionych (metodą hipotoniczną)4 lub krótko utkwione oczy (przez 8 godzin) ulegają fragmentacji lub zapadają się, co czyni je nieodpowiednimi do pomiaru AFM (Rysunek 2B).

Macierz podśródbłonkowa siatkówki
Sztywność naczyń krwionośnych odzwierciedla połączoną sztywność komórek naczyniowych i błony podstawnej (macierzy podśródbłonkowej)4. Ponieważ komórki przystosowują się do sztywności macierzy, przechodząc podobną zmianę własnej sztywności, proces określany jako wzajemność mechaniczna9, sztywność macierzy podśródbłonkowej, staje się ważnym wyznacznikiem ogólnej sztywności naczyń krwionośnych. Do pomiaru sztywności matrycy ważne jest uzyskanie jednorodnie gęstej matrycy podśródbłonkowej. W przypadku ludzkich siatkówkowych EC hodowanych w pożywce hodowlanej uzupełnionej kwasem askorbinowym zwykle zajmuje to 10-15 dni (Rysunek 3A)4,5,6. Ta różnica w okresie hodowli może wynikać z różnic między partiami w dostępnych na rynku pierwotnych EC siatkówki. Co więcej, ogólnie stwierdzamy, że komercyjnie dostępne EC siatkówki myszy C57BL / 6 osadzają gęstszą matrycę w porównaniu z pierwotną hodowlą EC siatkówki ludzkiej, co wskazuje na różnice specyficzne dla gatunku. Jak pokazano na rysunku Rysunek 3A, obrazy kontrastu fazowego pokazują tylko ogólny widok matrycy w skali makro. Jednak drobniejsza struktura fibrylarna w skali nano i mikro staje się widoczna w konfokalnych obrazach fluorescencyjnych o wysokiej rozdzielczości matrycy znakowanej immunologicznie przeciwciałami przeciwko białkom strukturalnym macierzy kolagenowi IV i fibronektynie (Figura 3B). Należy zauważyć, że te białka macierzy dostarczają również pouczających wskazówek komórkom śródbłonka poprzez wiązanie się ze specyficznymi receptorami integryny9.

pomiar sztywności AFM
Wybór odpowiedniej sztywności wspornika (stała sprężystości, k) i wymiaru sondy ma zasadnicze znaczenie dla wiarygodnych i czułych pomiarów. Parametry te należy dobrać tak, aby odpowiadały sztywności i wymiarom próbki biologicznej. Po zamontowaniu wybranego wspornika na AFM, wiązka lasera w podczerwieni musi być skupiona na końcówce wspornika, a odbita plamka lasera musi być wyśrodkowana na fotodetektorze. To laserowe osiowanie zapewnia precyzyjne i czułe wykrywanie ugięcia wspornika, a co za tym idzie, pomiar sztywności. Pomiar sztywności AFM rozpoczyna się od przesunięcia wspornika z-piezoelektrycznego pionowo w dół w kierunku próbki. W tym momencie nie występuje ugięcie wspornika, co powoduje powstanie płaskiej linii bazowej krzywej podejścia (Rysunek 4A). Gdy sonda wspornikowa styka się z próbką i wcina się w nią, wspornik wygina się, powodując odchylenie lasera na fotodetektorze, co jest zobrazowane przez pionowe odchylenie krzywej podejścia. Po przyłożeniu do próbki zadanej siły wgniecenia (siły wartości zadanej), wspornik cofa się do pozycji wyjściowej (wysokość docelowa Z) z dala od próbki. Odchylona krzywa retrakcji jest następnie dopasowywana do modelu Hertza/Sneddona w celu obliczenia modułu Younga (sztywności) próbki.

Z reprezentatywnego pomiaru wcięcia siły pokazanego na Rysunek 4, jest jasne, że krzywe podejścia i retrakcji uzyskane z kapilary siatkówki odizolowanej od myszy z cukrzycą (Rysunek 4B) są znacznie bardziej strome niż te uzyskane od myszy bez cukrzycy (Rysunek 4A). Bardziej strome nachylenie krzywych wgłębienia siły wskazuje na większe ugięcie wspornika spowodowane wyższą odpornością próbki na wgniecenie siły, co odzwierciedla wyższą sztywność próbki13. Rzeczywiście, późniejsza analiza danych dotyczących krzywych wgłębień wielu sił wykazała, że naczynia włosowate siatkówki myszy stają się znacznie sztywniejsze w cukrzycy4. Należy również zauważyć, że kontakt między sondą wspornikową a próbkami biologicznymi często powoduje niespecyficzną przyczepność powierzchni, co prowadzi do ujemnego ugięcia wspornika podczas cofania, co widać po przedłużeniu krzywej retrakcji poza linię bazową (Rysunek 4B). Co więcej, próbki biologiczne, takie jak komórki, macierz i naczynia krwionośne, są z natury lepkosprężyste, a zatem mogą ulegać trwałemu odkształceniu i / lub zmianie pozornej sztywności po wciśnięciu siły. Jeśli tak, znajdzie to odzwierciedlenie w niewspółosiowości krzywych zbliżania i cofania (histereza). Rzeczywiście, porównanie Rysunek 4A i Rysunek 4B potwierdza oczekiwany trend, w którym wgłębienie siły w bardziej miękkich naczyniach włosowatych u myszy bez cukrzycy powoduje większą histerezę niż obserwowane u ich sztywniejszych odpowiedników. Jak wcześniej informowaliśmy5,6, sztywność (moduł Younga) macierzy podśródbłonkowych uzyskanych z hodowli EC siatkówki jest również obliczana w wyżej wymieniony sposób.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja nacięcia wykonanego na oku myszy w celu izolacji siatkówki. Za pomocą pęsety do przytrzymania nerwu wzrokowego używa się skalpela do wykonania pełnego nacięcia za rąbkiem, aby oddzielić siatkówkę myszy od soczewki i przedniej komory. Fioletowa przerywana linia pokazuje położenie pionowego nacięcia. Schemat ten został narysowany przy użyciu naukowego oprogramowania do tworzenia obrazów i ilustracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja protokołu izolacji nienaruszonych naczyń siatkówki myszy do pomiaru AFM. (A) Obraz stereoskopowy pokazuje nienaruszoną siatkówkę wyizolowaną z łagodnie unieruchomionego oka myszy przed etapami izolacji kapilarnej. Pasek skali: 2 mm. (B) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego przy 4-krotnym powiększeniu pokazują naczynia siatkówki myszy uzyskane przy użyciu różnych metod izolacji. Porównując integralność strukturalną i trwałość izolowanych naczyń, stwierdzono, że trawienie trypsyną siatkówki z wyłuszczonych oczu utrwalonych w 5% formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C (czerwona ramka) daje najbardziej odpowiednie unaczynienie siatkówki do pomiaru sztywności AFM. Naczynia siatkówki wyizolowane tą metodą wykazywały wyraźną sieć naczyniową, która rozprzestrzeniała się równomiernie wzdłuż powierzchni szkła. Podziałka: 500 μm. (C) Widok w dużym powiększeniu (20x) nienaruszonej sieci naczyń włosowatych siatkówki, podobny do pokazanego w (B), potwierdza wysoką integralność strukturalną naczyń włosowatych uzyskaną z łagodnie unieruchomionych oczu. Podziałka: 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Matryce bezkomórkowe uzyskane z pierwotnych hodowli REC ludzi i myszy. (A) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego przy 20-krotnym powiększeniu, przedstawiające agregaty macierzy śródbłonkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych po decelularyzacji 10-dniowych (10 d) lub 15-dniowych (15 d) hodowli ludzkich lub mysich REC. Pasek skali: 100 μm. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencji konfokalnej o dużym powiększeniu (100x) matryc zdecelularyzowanych uzyskane z 15-dniowych ludzkich hodowli REC i znakowane przeciwciałami antykolagenowymi IV i antyfibronektynowymi ujawniają gęsty nanofibrylarny kolagen IV i matryca fibronektynowa. Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Krzywe odległości siły z pomiaru sztywności AFM naczyń włosowatych siatkówki myszy. Wykresy liniowe wskazują reprezentatywną krzywą podejścia (jasny kolor) i retrakcji (ciemny kolor) z pojedynczego pomiaru wgłębienia siły w jednym miejscu naczynia włosowatego siatkówki myszy wyizolowanej od (A) myszy bez cukrzycy lub (B) z cukrzycą. Krzywe siły uzyskane za pomocą półkulistej sondy wspornikowej SAA-SPH o promieniu 1 μm przedstawiają zależność między odległością wspornika-próbki (kontrolowaną przez z-piezo) a przyłożoną siłą pionową, która powoduje ugięcie wspornika. (A) Żółta strzałka wskazuje podejście wspornikowe napędzane przez z-piezo, w kierunku próbki, biała strzałka wskazuje punkt kontaktu, w którym sonda wspornikowa styka się z próbką, a zielona strzałka wskazuje ugięcie wspornika do zadanej (szczytowej) siły wgniecenia (*). (B) Zarówno krzywe zbliżania, jak i retrakcji uzyskane z naczynia włosowatego siatkówki wyizolowanego od myszy z cukrzycą wykazują znacznie bardziej strome nachylenie niż te z ich niecukrzycowych odpowiedników (pokazanych w A), co wskazuje na wyższą sztywność naczyń włosowatych u myszy z cukrzycą. Grot strzałki wskazuje spadek krzywej wciągania poniżej linii podstawowej, który odzwierciedla ujemne ugięcie sondy wspornikowej spowodowane przyleganiem między sondą a próbką podczas wgłębienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM jest szeroko stosowany do pomiaru związanych z chorobą zmian w sztywności większych naczyń, takich jak aorta i tętnice16. Odkrycia te pomogły ustalić rolę mechanobiologii śródbłonka w powikłaniach sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca17. Opierając się na tych odkryciach, zaczęliśmy badać wcześniej nierozpoznaną rolę mechanobiologii śródbłonka w rozwoju zmian mikronaczyniowych siatkówki we wczesnym DR. Sukces w tym dążeniu zależy jednak od dokładnego pomiaru wywołanych cukrzycą zmian w sztywności naczyń włosowatych siatkówki. Ostatnie badania wykazały, że podobnie jak w przypadku dużych naczyń krwionośnych, sztywność naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonka wydzielanej przez EC siatkówki można również bezpośrednio, dokładnie i niezawodnie zmierzyć za pomocą AFM 4,5,6.

Podejście to polega na izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy od łagodnie unieruchomionych oczu za pomocą trawienia trypsyną. Z doświadczenia wynika, że ten łagodny etap stabilizacji jest konieczny, ponieważ naczynia włosowate odizolowane od nieruchomych oczu (metodą hipotoniczną) są kruche i ulegają fragmentacji, co czyni je nieodpowiednimi do pomiaru sztywności AFM4. I odwrotnie, silniejsze utrwalenie i wynikająca z tego potrzeba intensywnego trawienia trypsyny, która została opisana w innym protokole trawienia trypsyny siatkówki18, może również zagrozić integralności strukturalnej naczyń włosowatych, co ocenia się na podstawie przerwania połączeń ścisłych. W związku z tym łagodne utrwalanie kapilar i delikatne trawienie trypsyny stosowane tutaj pomagają zmniejszyć artefakty sztywności wynikające z nadmiernego sieciowania wywołanego formaliną i zapewniają integralność strukturalną naczyń włosowatych w celu wiarygodnego pomiaru sztywności AFM.

Jako alternatywne podejście, niedawne badanie wykazało pomiar sztywności AFM naczyń włosowatych siatkówki z lekko zamocowanych płaskich mocowań siatkówki19. Wykonując wgłębienia siły AFM na naczyniach włosowatych siatkówki w nienaruszonej siatkówce, podejście to umożliwia pomiar sztywności in situ . Jednak te pomiary sztywności kapilarnej prawdopodobnie obejmują sztywność wewnętrznej membrany ograniczającej. Co więcej, podejście to ogranicza się do pomiaru tylko powierzchownych naczyń włosowatych, które są dostępne na płaskim montażu siatkówki, pomijając głębiej położony splot kapilarny, który jest specyficznie dotknięty we wczesnym DR20. Problemy te można rozwiązać za pomocą tego podejścia, które usuwa naczynia w sposób czysty (pozbawiony resztkowej tkanki siatkówki) ze wszystkich warstw siatkówki. Obecnie optymalizujemy ten protokół, aby wyizolować naczynia naczyniówkowe z modeli zwierzęcych wczesnego AMD. To powiedziawszy, zdajemy sobie sprawę, że łagodne utrwalanie formaliny zastosowane w protokole może powodować artefakt usztywniający związany z sieciowaniem w pomiarach AFM. W związku z tym rozsądne byłoby interpretowanie wartości sztywności naczyń krwionośnych uzyskanych przy użyciu tego podejścia bardziej w kategoriach względnych zmian sztywności (między różnymi grupami eksperymentalnymi), a nie sztywności bezwzględnej.

W przeciwieństwie do naczyń włosowatych siatkówki, które wymagają łagodnego unieruchomienia, macierz podśródbłonkowa uzyskana z hodowli EC siatkówki może być oceniana bez żadnych modyfikacji. Wynika to w dużej mierze z odporności zdeponowanej matrycy, która wynika z połączenia kilku czynników, w tym dodania kwasu askorbinowego do pożywki hodowlanej (co zwiększa syntezę kolagenu15), chemicznej modyfikacji szklanych szkiełek nakrywkowych, która zapobiega odklejaniu się matrycy podczas decelularyzacji oraz wydłużonego czasu trwania hodowli (10-15 dni). Co ważne, wykazaliśmy, że wywołany hiperglikemią wzrost sztywności macierzy podśródbłonkowej in vitro jest zgodny z wywołanym cukrzycą wzrostem sztywności naczyń włosowatych siatkówki obserwowanym in vivo4. Nie jest to zaskakujące, ponieważ oczekuje się, że wzrost sztywności matrycy zwiększy sztywność EC leżących nad siatkówką (ze względu na wzajemność mechaniczną), które razem zwiększają ogólną sztywność kapilarną. Rzeczywiście, niedawno wykazaliśmy, że EC siatkówki stają się sztywniejsze, gdy rosną w warunkach cukrzycowych4, prawdopodobnie poprzez wzrost napięcia cytoszkieletu aktyny zależnego od Rho / ROCK21. Odkrycia te sugerują również, że usztywnienie naczyniówki EC obserwowane w modelu małpy rezusów wczesnego AMD odzwierciedla zwiększoną sztywność macierzy podśródbłonka naczyniówki i nienaruszonych naczyń12, co jest testowane w trwających badaniach. Ogólnie rzecz biorąc, fakt, że zmiany sztywności w nieutrwalonej macierzy podśródbłonkowej siatkówki i EC odzwierciedlają trend obserwowany w łagodnie utrwalonych nienaruszonych naczyniach siatkówki, świadczy o słuszności podejścia łagodnego unieruchomienia.

Bezpośredni pomiar sztywności naczyń włosowatych siatkówki na podstawie zwierzęcych modeli DR nie tylko pomaga w ustaleniu mechanobiologii śródbłonka jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu DR, ale także stanowi mocne uzasadnienie do opracowania nowych czułych technik obrazowania do nieinwazyjnej oceny sztywności naczyń włosowatych siatkówki u pacjentów z DR w przyszłości. Takie nieinwazyjne techniki mogą potencjalnie wykryć subtelne zmiany w przepływie krwi, które mogą wynikać ze sztywnienia naczyń włosowatych, podobnie jak zmiany prędkości fali tętna tętniczego, które są powszechnie wykrywane w chorobach sercowo-naczyniowych wywołanych cukrzycą. Pomiary sztywności AFM naczyń włosowatych siatkówki wyizolowanych z pośmiertnych oczu ludzkich od dawców chorych na cukrzycę dostarczą ważnego dowodu słuszności koncepcji w tym zakresie. Biorąc poduwagę, że sztywność naczyń włosowatych siatkówki wzrasta na wczesnym etapie w mysim modelu cukrzycy typu 1 typu 4 (streptozotocyna), udane zastosowanie AFM w walidacji metod obrazowania mierzących sztywność może prowadzić do identyfikacji sztywności naczyń włosowatych siatkówki jako klinicznego biomarkera wczesnej patogenezy DR.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (dla K.G.), Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (dla K.G.), The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant od W.M. Keck Foundation (dla Doheny Eye Institute) oraz Ursula Mandel Fellowship i UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (dla I.S.T.). Praca ta była również wspierana przez nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness, Inc. dla Wydziału Okulistyki UCLA. Za treść tego artykułu wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
izolacja naczyń włosowatych siatkówki
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy PVDFMerck MilliporeSLGVM33RSLow Protein Binding Durapore
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia % magnezuCorning20-031-CVStężenie końcowe 1X, pH 7,4
Płytka 12-dołkowaFalcon Corning353043
15 ml probówka wirówkowaCorning430791Bez rnazy-dnaz, niepirogenne
20 ml Strzykawka Luer-Lok TIPBD302830
5 3/4 cala Jednorazowa pipeta ze szkła borokrzemianowego/niesterylna pipeta PasteuraFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Naczynie do hodowli tkankowychFalcon Corning353002
6-dołkowa płytkaFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mLPen Laboratorium Urządzeń Naukowych9804-02
Uchwyt ostrzaX-ACTO
#10Bard-Parker371110
Wosk dentystycznyMikroskopia elektronowa Nauki50-949-027
Mikroskop preparacyjnyAm-scope
Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%miliporów SigmaHT501128-4LStężenie końcowe 5% (v/v)
Kimwipes - chusteczka do wycieraniaKimtech Science34133
MikroszpatułkaFine Science Tools10089-11
Wytrząsarka orbitalnaLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Stal nierdzewna 115mm  PęsetaTed Pella, Inc.5667
Mikroskop z kontrastem fazowymNikon TS2
Purifier Logic+ Klasa II, Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabconco
Safe-Lock 2 mlEppendorf22363352
StereoskopAmScopeSM-3 Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem 3,5X-90X
Szkiełko mikroskopowe Superfrost Plus - Biała zakładka - Wstępnie oczyszczone - 25x75x1,0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, 0,1 M roztwór, pH 7,4 - Klasa biologicznaVWRE553-500MLpH 8 do roztworu trypsyny
Trypsyna 1:250 w proszku Klasa kultur tkankowychVWRVWRV0458-25G10 % (w/v) roztwór trypsyny
Woda Biologia molekularna KlasaCorning46-000-CM
Matryca podśródbłonkowa
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS z wapniem i magnezemThermo Fisher Scientific14040-117pH 7,4
Wodorotlenek amonuSigma-Aldrich338818
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4034
Kolagen IV przeciwciałoNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
EtanoloaminaSigma-Aldrich398136
Przeciwciało fibronektynySigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
Szkiełka nakrywkowe szklane (12mm)Fisher12-541-000
Aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences16220
Ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 mediumCorning15-100-CV
Mysie komórki śródbłonka siatkówki (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Naukowy  BP151-100
TrypsynaGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Pomiar
1 i mikro; m SondaBrukerSAA-SPH-1UMPółkulista sonda o wysokości 19 mikronów z promieniem końcowym 1
mikron, stała sprężystości 0,25 N / m
Sonda LC 70 nmBrukerPFQNM-LC-V2Półkulista sonda o wysokości 19 mikronów i promieniu końcowym 70 nm,
  Stała sprężystości 0,1N/m
  kameraRodzina XCAMToupcam1080P
HDMI Desktop do uruchamiania kameryAsusAsus desktopIntel i5-6600 CPU , 8 GB RAM
Uchwyt na naczynie do szkiełka nakrywkowegoCellvisD29-14-1.5-N29mm szklane dno z
  Mikrostudzienka 14 mm
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience zamontowany na mikroskopie optycznym do czułego pomiaru właściwości mechanostrukturalnych (sztywności i topografii) miękkich próbek biologicznych
Mikrskop z kontrastem fazowymZeissAxiovert 200z obiektywem 10X
Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Probówki wirówkowe 302380001 Mikroskop sił atomowych Mikroskop odwrócony

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).">Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
  2. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).">Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).
  3. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).">Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  4. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).">Chandrakumar, S., et al. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).
  5. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).">Chandrakumar, S., et al. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).
  6. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).">Yang, X., et al. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).
  7. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).">Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).
  8. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).">Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).
  9. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).">Ghosh, K., Ingber, D. E. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).
  10. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).">Yang, X., et al. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).
  11. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).">Cabrera, A. P., et al. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).
  12. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).">Cabrera, A. P., et al. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).
  13. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).">Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).
  14. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).">Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).
  15. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).">Beacham, D. A., et al. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).
  16. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).">Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).
  17. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).">Huynh, J., et al. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).
  18. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).">Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).
  19. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).">Chaqour, B., et al. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).
  20. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).">Ashraf, M., et al. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).
  21. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).">Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal CapillariesSubendothelial MatrixAtomic Force MicroscopyCapillary StiffnessDiabetic RetinopathyVascular StiffnessRetinal Vessel IsolationPhase Contrast MicroscopyDecellularization BufferCollagen Four Matrix

Related Articles