Hiperpolaryzowany rezonans magnetyczny i spektroskopia płuc 129xe u myszy wentylowanych mechanicznie

Podsumowanie

Hiperspolaryzowany ksenonowy rezonans magnetyczny może określić ilościowo regionalną mikrostrukturę płuc (wymiary przestrzeni powietrznej) i fizjologię (wentylacja i wymiana gazowa) w badaniach translacyjnych i opiece klinicznej. Chociaż jest to trudne, może dostarczyć porównywalnych informacji na temat płuc w badaniach przedklinicznych. Protokół ten opisuje infrastrukturę i procedury potrzebne do wykonywania rutynowego ksenonowego rezonansu magnetycznego płuc u myszy.

Streszczenie

Hiperpolaryzowany (HP) ksenon-129 (¹²⁹Xe) to wziewny środek kontrastowy do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) o unikalnych właściwościach spektralnych i fizycznych, które mogą być wykorzystane do ilościowego określenia fizjologii płuc, w tym wentylacji, ograniczonej dyfuzji (rozmiar pęcherzyka płucnego) i wymiany gazowej. U ludzi, jest on stosowany do oceny ciężkości choroby i progresji w różnych zaburzeniach płuc i jest zatwierdzony do użytku klinicznego w Stanach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii. Poza zastosowaniami klinicznymi, zdolność ¹²⁹Xe MRI do nieinwazyjnej oceny patofizjologii płuc i dostarczania informacji o rozdzielczości przestrzennej jest cenna dla badań przedklinicznych. Wśród modeli zwierzęcych myszy są najczęściej stosowane ze względu na dostępność genetycznie modyfikowanych modeli chorób. W tym przypadku ¹²⁹Xe MRI jest obiecujący jako minimalnie inwazyjna, wolna od promieniowania i czuła technika podłużnego monitorowania postępu choroby płuc i odpowiedzi na terapię (np. w odkrywaniu leków). Technika ta może zostać rozszerzona na zastosowania przedkliniczne poprzez włączenie aparatu do swobodnego oddychania wyzwalanego rezonansem magnetycznym lub respiratora mechanicznego do dostarczania gazu. W tym miejscu opisujemy kroki i udostępniamy listy kontrolne, aby zapewnić solidne gromadzenie i analizę danych, w tym tworzenie termicznie spolaryzowanego fantomu gazu ksenonowego do kontroli jakości, optymalizacji polaryzacji, obchodzenia się ze zwierzętami (uspokojenie, intubacja, wentylacja i opieka nad myszami) oraz protokołów wentylacji, ograniczonej dyfuzji i danych wymiany gazowej. Podczas gdy przedkliniczny rezonans magnetyczny ¹²⁹Xe może być stosowany w różnych modelach zwierzęcych (np. szczurach, świniach, owcach), protokół ten koncentruje się na myszach ze względu na wyzwania związane z ich małą anatomią, które są równoważone przez ich przystępność cenową i dostępność wielu modeli choroby.

Wprowadzenie

Mimo że schorzenia płuc pozostają główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie¹, w ostatniej dekadzie odnotowano znaczną poprawę wyników leczenia pacjentów. Poprawa ta wynika częściowo z dwóch czynników. Po pierwsze, w III fazie badań klinicznych priorytetem jako punkty końcowe są obecnie zmiany w funkcji płuc, a nie śmiertelność, co przyspiesza badania nad lekami^2,3,4,5. Po drugie, postępy w udoskonalaniu modeli zwierzęcych dostarczyły wiedzy na temat mechanizmów chorobowych i pomogły w opracowywaniu terapii^6,7. Modele mysie są często preferowane w badaniach translacyjnych, ponieważ oferują one podobieństwo fizjologiczne do ludzi, są przystępne cenowo i charakteryzują się szybkim rozwojem choroby. Inżynieria genetyczna rozszerzyła zakres i jakość dostępnych modeli, a International Mouse Strain Resource dysponuje obecnie ponad 32 0 szczepów myszy⁸, w porównaniu do zaledwie 4 218 szczepów szczurów (Rat Genome Database⁹). Modele te otworzyły nowe możliwości badania czynników mechanistycznych oraz odpowiedzi na terapię w szeregu chorób płuc, w tym w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (COPD)¹⁰, mukowiscydozie (CF)¹, włóknieniu płuc^12,13, nadciśnieniu płucnem^14,15 oraz astmie¹⁶.

Niestety, badania nad płucami myszy są ograniczone przez dostępne techniki ilościowego określania stopnia rozwoju choroby. Badania często opierają się na procedurach terminalnych, które 1) dostarczają informacji o całym płucach (testy biochemiczne) lub informacji zlokalizowanej (histologia) oraz 2) wymagają badań przekrojowych i dużych prób badawczych. W konsekwencji nie pozwalają one na uchwycenie dynamiki choroby w wymiarze przestrzennym ani czasowym. W przeciwieństwie do nich, nieinwazyjne obrazowanie trójwymiarowe umożliwia ocenę struktury, procesów molekularnych i funkcji płuc w czasie.

Strukturę płuc (np. nieprawidłowości dróg oddechowych i włóknienie śródmiąższowe) można zwizualizować za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) z ultra-krótkim czasem echa (UTE) oraz mikrotomografii komputerowej (µCT) o wysokiej rozdzielczości. Informacje funkcjonalne i mechanistyczne (np. wentylacja, perfuzja, metabolizm guza i procesy zapalne) można uzyskać dzięki zastosowaniu egzogennych środków kontrastowych (np. CT z wzmocnieniem ksenonem i UTE z wzmocnieniem tlenem) oraz jonizujących metod medycyny nuklearnej (tj. pozytonowej tomografii emisyjnej [PET] oraz jedno-fotonowej tomografii emisyjnej [SPECT]). Jednak obrazowanie funkcjonalne jest trudne ze względu na niewielki kontrast w stosunku do szumu (szczególnie w przypadku UTE z wzmocnieniem tlenem przy wysokich natężeniach pola magnetycznego stosowanych w MRI przedklinicznym, gdzie T₁ ulega wydłużeniu), dostępny bez zastosowania metod jonizujących z poziomach promieniowania wyższymi niż norma. Chociaż obrazowanie tymi metodami jest dobrze tolerowane w modelach zwierzęcych przy zastosowaniu konwencjonalnych dawek, skumulowane promieniowanie może zaburzać wyniki w badaniach nad immunologią, stanami zapalnymi i rakiem płuc¹⁷. Z kolei obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) hiperpolaryzowanym (HP) ksenonem-129 (¹²⁹Xe) dostarcza małoinwazyjnych, niepromieniujących i wysoce czułych informacji strukturalnych i funkcjonalnych. Mimo że technika ta była wykorzystywana w badaniach przedklinicznych do charakteryzacji stanów takich jak rozedma^18,19, włóknienie²⁰, rak płuc²¹, POChP² oraz popromienne uszkodzenie płuc²³ w jednym lub wielu punktach czasowych, wciąż pozostaje ona niedostatecznie wykorzystywana w warunkach przedklinicznych.

Aby umożliwić rutynowe badania prekliniczne MRI ¹²⁹Xe, wymagane jest spełnienie kilku warunków wstępnych, w tym uzyskanie instytucjonalnych zgód regulacyjnych, posiadanie urządzenia do hiperpolaryzacji, cewki radiowej (RF) dostrojonej do  ¹²⁹Xe oraz skanera z możliwością obrazowania wielu jąder. Chociaż zaawansowane zastosowania^{24,25,26,27,28,29,30,31,32,3} wymagają specyficznego dla producenta programowania impulsów, co wykracza poza zakres niniejszego protokołu, podstawowe zastosowania można zrealizować przy niewielkich modyfikacjach oprogramowania. Dlatego skupiamy się na kontroli jakości, zarządzaniu namagnesowaniem, gromadzeniu danych oraz procedurach obsługi zwierząt — w tym wentylacji mechanicznej — które są specyficzne dla  preklinicznego  MRI ¹²⁹Xe (Rysunek 1).

Do tej pory w obrazowaniu ¹²⁹Xe u małych zwierząt stosowano trzy bezpieczne dla MR metody podawania gazu, z których każda ma swoje zalety i wady: oddychanie swobodne, sterowane tłokiem oraz oparte na spadku ciśnienia. Oddychanie swobodne pozwala na spontaniczną inhalację bez ryzyka urazu związanego z intubacją lub tracheostomią, ale zużywa znacznie więcej gazu hiperpolaryzowanego (HP) i może wprowadzać artefakty ruchowe^34,35. Komercyjne urządzenia sterowane tłokiem są samokalibrujące i łatwe w obsłudze zaraz po wyjęciu z opakowania, lecz mogą być prohibitywnie drogie³⁶. Podejście oparte na spadku ciśnienia, zastosowane w niniejszej pracy, jest dobrze opisane w literaturze, modułowe, konfigurowalne i sterowane kodem open-source^37,38,39,40. Ponadto jest ono kosztowo efektywne, zazwyczaj kosztując mniej niż 10 tys. USD i wymagając kilku tygodni poświęconych na budowę. Respirator oparty na spadku ciśnienia podaje ¹²⁹Xe z worka z dawką znajdującego się w ciśnieniowym kanistrze, monitorując jednocześnie ciśnienie w drogach oddechowych intubowanej myszy.

Rycina 1Przegląd protokołu rutynowego pobierania ksenonu-129 (¹²⁹Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) z użyciem ksenonu (Xe) u myszy. (A) Kroki konfiguracji wstępnej. (Uwaga: programowanie skanera jest specyficzne dla każdego producenta i nie zostało opisane w niniejszym protokole). (B) Etapy gromadzenia codziennych danych dotyczących zapewnienia jakości (QA) oraz danych o zwierzętach. (C) Kroki prowadzące do pomyślnego zakończenia eksperymentu i analizy danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

W niniejszej pracy zbieramy i analizujemy trzy powszechne klasy danych MRI ¹²⁹Xe: wentylację, obrazowanie dyfuzyjne (rozmiar pęcherzyków i przestrzeni powietrznej) oraz wymianę gazową. Obrazy wentylacji przedstawiają rozkład wdychanego gazu ¹²⁹Xe. Obszary płuc z ograniczonym przepływem powietrza pojawiają się jako ciemne na obrazach gazu HP, a patologię ilościowo określa się poprzez objętość wadliwej wentylacji. U ludzi procent wad wentylacji (VDP) wykazuje wysoką powtarzalność^41,42 oraz wysoką czułość w wykrywaniu niedrożności dróg oddechowych w chorobach takich jak POChDP^43,4,45 i astma^46,47.

Ograniczoną dyfuzję atomów ¹²⁹Xe w przestrzeni powietrznej można zmierzyć za pomocą pozornego współczynnika dyfuzji (ADC), który służy jako wskaźnik wielkości przestrzeni powietrznej. ADC oblicza się poprzez pozyskanie obrazu bazowego (b₀) bez ważenia dyfuzyjnego oraz jednego lub więcej obrazów pozyskanych w obecności ważenia dyfuzyjnego indukowanego przez gradienty bipolarne (b_N). Podwyższony ADC odzwierciedla zwiększenie wielkości przestrzeni powietrznej wynikające z procesów starzenia lub przebudowy rozedmowej^18,48. Ponadto zastosowanie obrazów o wielu wartościach b (≥4) pozwala na obliczenie bardziej szczegółowych informacji morfometrycznych (np. średniej długości przerwy, MLI)^49,50.

Wymianę gazową można scharakteryzować poprzez 1) rozpuszczalność ¹²⁹Xe w tkance błony kapilarnej, osoczu i erytrocytach (RBCs) oraz 2) the >przesunięcie chemiczne w kierunku pola słabego o 20 ppm dla ¹²⁹Xe po rozpuszczeniu w tych przedziałach. Zarówno dane spektroskopowe, jak i obrazowe dostarczają informacji na temat chorób serca i płuc (np. nadciśnienia płucnego i niewydolności lewej komory serca^51,52,53). Podczas gdy wiele gatunków (ludzie, psy i szczury) wykazuje unikalne piki widmowe pochodzące z każdego przedziału, u myszy brakuje unikalnego sygnału z erytrocytów ze względu na różnice w oddziaływaniach w miejscu wiązania hemoglobiny z ksenonem. Zamiast tego wszystkie rozpuszczone komponenty u myszy łączą się w jeden sygnał.⁵⁴Można jednak zaobserwować wyraźny rezonans RBC u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję ludzkiej hemoglobiny, takich jak te wykorzystywane w modelach anemii sierpowatej⁵⁴Ogólnie rzecz biorąc, rozpuszczone ¹²⁹Spektroskopia i obrazowanie z wykorzystaniem ksenonu dostarczają unikalnych informacji na temat patofizjologii krążeniowo-oddechowej u myszy^55,56.

Przed przystąpieniem do realizacji niniejszego protokołu konieczna jest znajomość informacji wstępnych na temat skanera MRI, wentylacji mechanicznej oraz technik obchodzenia się z myszami, wymaganych w badaniach nad tymi zwierzętami. Przed rozpoczęciem badań na zwierzętach wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez lokalną Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC)⁵⁷. Ponieważ całkowity moment magnetyczny dostępny w płucach myszy jest z natury niski (np. objętość oddechowa ~250 µL), rozmiar voxela musi być 100 razy mniejszy niż u ludzi, aby uzyskać równoważną anatomicznie rozdzielczość. Częstotliwość oddychania myszy jest również niezwykle wysoka (>10 oddechów/minutę). W związku z tym procedury wstrzymywania oddechu pojedynczego, zazwyczaj stosowane w obrazowaniu ludzi, są niewykonalne. Zamiast tego, w obrębie każdego oddechu można zastosować jedynie kilka wzbudzeń RF, zatem obrazy ¹²⁹Xe muszą być kodowane w ciągu od kilkunastu do kilkuset oddechów. Może być wymagane programowanie impulsów, aby umożliwić zewnętrzne wyzwalanie akwizycji oraz prawidłowe zapętlenie warstw, kodowania fazowego i/lub obrazów ważonych dyfuzją, przy jednoczesnym zrównoważeniu stosunku sygnału do szumu (SNR), rozdzielczości i czasu skanowania. W tym przypadku respirator generuje impuls logiczny tranzystor-tranzystor (TTL) raz na oddech w celu wyzwolenia akwizycji danych (Rysunek 2).

Rycina 2Reprezentatywna wentylacja mechaniczna i czas akwizycji danych. (AWentylacja kontrolowana przez użytkownika może uruchamiać akwizycję danych w końcowej fazie wdechu, podczas wstrzymania oddechu lub w końcowej fazie wydechu.BW przypadku tej sekwencji 3D z wentylacją radialną użytkownik definiuje całkowitą liczbę nabytych projekcji oraz liczbę projekcji na jeden oddech.C) W przypadku obrazowania 2D z dyfuzyjnym ważeniem obrazu, selektywnego dla warstwy, użytkownik definiuje kolejność warstw, obrazów dla danej wartości b oraz kodowania fazy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby zapewnić niezawodną wentylację i podawanie  ¹²⁹Xe, wymagane są solidne procedury sedacji i intubacji. W każdym badaniu należy uwzględnić efekty wtórne każdego środka anestetycznego – w tym zmiany w wentylacji minutowej, częstości akcji serca (HR) oraz ciśnieniu krwi^{58,59,60,61,62,63,64,65,6}. Choć w przedklinicznym MRI z wykorzystaniem gazów HP stosowano różne środki uspokajające, my używamy mieszaniny ketaminy, ksylazyny i acepromazyny ze względu na jej dostępność, efektywność kosztową, niezawodność i czas działania^67,68. Po sedacji zwierzęta muszą zostać zaintubowane w celu zapewnienia skutecznej wentylacji mechanicznej. Intubacja myszy jest trudna ze względu na mały rozmiar ich anatomii, dlatego kluczowe jest gruntowne przeszkolenie w tej technice. Zachęcamy badaczy do zapoznania się z opublikowanymi protokołami wideo^69,70. Ponieważ większość komercyjnych kaniul do intubacji zawiera stal nierdzewną, przedstawiamy technikę wykonania bezymetalowych (tj. kompatybilnych z MRI i gazami HP), klinowatych kaniul, które można dostosować do średnicy dróg oddechowych, aby stworzyć szczelne zamknięcie ze ścianą tchawicy myszy.

Ponieważ obrazy ¹²⁹Xe są gromadzone przez wiele cykli oddechowych, ustawienia respiratora mają kluczowe znaczenie. Strategie wentylacji ochronnej muszą być starannie rozważone, aby zapobiec uszkodzeniu płuc^71,72,73,74. W szczególności stosowanie niskiej objętości oddechowej (TV), umiarkowanego dodatniego końca ciśnienia wydechowego (PEEP) oraz manewrów rekrutacji pęcherzyków płucnych (RMs) zmniejsza ryzyko uszkodzenia płuc indukowanego wentylacją u pacjentów ludzkich i w modelach zwierzęcych^{75,76,7,78,79,80,81}. W niniejszej pracy zalecamy prostą technikę, która jest zgodna z wentylacją mechaniczną ¹²⁹Xe z metodą spadku ciśnienia, jest bezpieczna i zapewnia wystarczający stosunek sygnału do szumu (SNR) obrazu ¹²⁹Xe. Konkretnie, PEEP stosujemy poprzez dodanie komercyjnego zaworu PEEP do linii wydechowej respiratora. Aby przeprowadzić RMs, linia wydechowa musi zostać zamknięta, tak aby zwierzę otrzymało wiele wdechów bez wydechów, aż do osiągnięcia docelowego ciśnienia i czasu trwania.

W całym tekście podajemy ogólne ustawienia wentylacji, jednak zaleca się zapoznanie z literaturą w celu dostosowania ich do konkretnych celów badania^82,83. Oprócz monitorowania szczytowego ciśnienia wdechowego podczas wentylacji mechanicznej, istotne jest monitorowanie temperatury zwierzęcia, co można przeprowadzić przy użyciu standardowych metod pomiaru temperatury u myszy. Choć nie jest to wymagane do obrazowania, monitorowanie częstotliwości akcji serca za pomocą elektrokardiogramu (EKG) może być korzystne; EKG może wskazać, czy zwierzę budzi się z sedacji, otrzymało przedawkowaną dawkę leku lub jest w stanie stresu, co pozwala badaczowi na interwencję.

Opisany protokół został opracowany w celu gromadzenia danych dotyczących 3D radialnej wentylacji ¹²⁹Xe⁶¹, danych 2D GRE z dyfuzyjnym ważeniem⁷⁶ oraz dynamicznych danych wymiany gazowej uzyskanych metodą spektroskopii impulsowej. Protokół ten ma na celu wypełnienie luki między badaniami przedklinicznymi na modelach małych zwierząt a potencjałem MRI ¹²⁹Xe w pogłębianiu naszej wiedzy na temat schorzeń płuc.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Wstępne przygotowanie miejsca

1. Utworzenie i przetestowanie fantomu gazowego z termicznie spolaryzowanym ¹²⁹Xe (Rysunek 3).
   1. Przygotować naczynie z borokrztanu (~60 mL), zawór tłokowy z przednim uszczelniającym pierścieniem O oraz szlifowany trzpień z borokrzanu, wszystkie przystosowane do pracy pod ciśnieniem do 150 psig. Upewnić się, że nie ma części magnetycznych. Przymocować złączkę ściskaniową do szklanego trzpienia. Dokręcić, aby uzyskać szczelność gazową.
   2. Podłączyć naczynie do pompy próżniowej i zbiornika z tlenem zgodnie z Rysunkiem 3A. Odessać powietrze z naczynia do ciśnienia absolutnego poniżej 10 mTorr.
   3. Napełnić naczynie tlenem do ciśnienia 1,5 atm, aby zredukować T₁ ¹²⁹Xe z > 30 min do ~2 s (przy natężeniu pola magnetycznego 7 T; dla skanera 9,4 T użyć tlenu pod ciśnieniem 1,6 atm). Uszczelnić naczynie.
      UWAGA: Dla wyższych natężeń pola wymagane będzie nieco wyższe ciśnienie parcjalne tlenu, aby osiągnąć T₁≤ 2 s⁸⁴.
   4. Napełnić nieprzepuszczalny dla gazów zbiornik 40 mL ksenonu wzbogaconego izotopowo (85% ¹²⁹Xe).
      UWAGA: Można również użyć ksenonu o naturalnym składzie izotopowym (26% ¹²⁹Xe), ale konieczne będzie zwiększenie liczby uśrednień sygnału, aby zniwelować około 3-krotny spadek SNR.
   5. Podłączyć naczynie do zbiornika z ¹²⁹Xe. Odessać powietrze z przewodów do ciśnienia absolutnego poniżej 10 mTorr.
   6. Napełnić laboratoryjny naczyniowy Dewar z ciekłym N₂ o otwartym wlewie do ~90%. Zanurzyć dno naczynia (~5 cm) w ciekłym azocie, aby skondensować O₂ i wytworzyć próżnię (Rysunek 3B). Podczas zanurzenia otworzyć zawór, aby ¹²⁹Xe ze zbiornika mógł wpłynąć do naczynia (Rysunek 3C).
   7. Zamknąć zawór tłokowy, powoli wyciągając trzpień, aż otwór wlotowy w tłoku znajdzie się za pierścieniem O. Natychmiast po przejściu otworu za pierścień O, dokręcić ręcznie, aby uszczelnić naczynie. Wyjąć naczynie z ciekłego azotu i pozwolić mu odtajać.
      UWAGA: Po odtajaniu ciśnienie w naczyniu wzrośnie do ~4,5 atm (2 atm O₂ + 2,5 atm ¹²⁹Xe).
   8. Zabezpieczyć szklane elementy (np. włożyć naczynie do wyłożonego pojemnika z rury z polichlorku winylu (PVC), Rysunek 3D).
      UWAGA: Przy odpowiedniej konserwacji fantom może utrzymywać ciśnienie przez dekadę lub dłużej.
   9. Zmierzyć T₁ fantomu (np. używając spektroskopowej sekwencji regeneracji wstecznej). Potwierdzić, że T₁ < 2 s dla skanerów 7 T. Monitorować sygnał i T₁ w czasie w celu zapewnienia kontroli jakości (QA).

Rysunek 3Tworzenie polaryzacji termicznej ¹²⁹phantom z gazem Xe, prowadzony zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w kroku 1.1. The O₂ i ¹²⁹Ciśnienia parcjalne Xe można zmieniać w celu dostosowania T₁ aby uzyskać odpowiednie ¹²⁹Xe T₁ czasy i natężenie sygnału przy danej natężeniu pola⁸⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przeprowadź zapewnienie jakości przy użyciu fantomu gazowego o polaryzacji termicznej (Tabela 1 i Rysunek 4).
   1. Umieść cewkę do ¹²⁹Xe w izocentrum magnesu i wycentruj fantom gazowy ¹²⁹Xe wewnątrz cewki. W pojedynczej sekwencji wzbudzenia i akwizycji ("single pulse"), ustaw częstotliwość roboczą tak, aby odpowiadała przybliżonej częstotliwości gazu ¹²⁹Xe w fantomie (~83,07 MHz przy 7T).
   2. Wycentruj częstotliwości akwizycji i wzbudzenia na częstotliwość Larmora ¹²⁹Xe i używaj tej częstotliwości dla wszystkich skanów ¹²⁹Xe służących do kalibracji fantomu i kontroli jakości. Parametry eksperymentalne dla wszystkich skanów QA znajdują się w Tabeli 1. Potwierdź wycentrowanie fantomu za pomocą lokalizatora fantomu (Rysunek 4A).
   3. Przeprowadź eksperyment nutacji w celu skalibrowania kąta odchylenia: Zakładając, że SNR jest wystarczający, użyj pojedynczych impulsów RF z odstępem czasu repetycji (TR) > 5 x T₁. Dla każdej akwizycji stopniowo zwiększaj moc RF, aż sygnał spadnie do zera i zacznie się odwracać. Standard zastosowany w tym przypadku to: liczba impulsów = 65; TR = 10 s; czas trwania impulsu = 125 µs; moc RF = 1-13,8 W, zwiększana o 0,2 W
   4. Wykonaj transformację Fouriera i ustaw fazę pierwszego widma (tj. widma pozyskanego przy najniższej mocy RF). Zastosuj tę samą fazę dla wszystkich widm. Przedstaw widma rzeczywiste jako funkcję mocy impulsu RF (Rysunek 4B).
   5. Moc, która powoduje zniknięcie piku (tj. minimalną wysokość piku), odpowiada kątowi odchylenia 180°. Uzyskaj kąt odchylenia 90˚, stosując tę samą moc przy połowie długości impulsu potrzebnej do uzyskania kąta 180˚. Jeśli oprogramowanie skanera na to pozwala, ustaw tę referencyjną moc i długość impulsu dla 90° do późniejszego skalowania kąta odchylenia.
   6. Użyj pojedynczego impulsu do shimowania poprzez minimalizację szerokości połówki maksymalnej (FWHM) widma ¹²⁹Xe (TR ~ 1 s). W razie potrzeby ponownie wycentruj częstotliwość po shimowaniu. Zapisz wartość szerokości połówki maksymalnej.
   7. Wykonaj skan QA ¹²⁹Xe (Tabela 1 i Rysunek 4C). Zapisz dane QA: SNR, średni sygnał z fantomu oraz odchylenie standardowe szumu.

Rysunek 4Kontrola jakości przed skanowaniem. (A) Lokalizator fantoma w płaszczyźnie koronarnej, wykonany w sekwencji GRE 2D o niskiej rozdzielczości, zapewnia wycentrowanie fantoma w magnesie. (B) Eksperyment nutacji w celu ustawienia kąta 90°˚ impuls wykazuje minimum (peak ujemny) w 180° tętno. (C) Po lokalizacji i kalibracji kąta odchylenia należy przeprowadzić akwizycję obrazu QA 2D GRE o wyższej rozdzielczości. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Skrócona nazwa protokołu	Opis sekwencji	TR (ms)	TE (ms)	Średnie / Powtórzenia	Kąt odchylenia (˚)	Rozmiar macierzy lub Npunkty	pole widzenia (mm2)	BW RF (kHz)	Grubość warstwy / plastra (mm)	Czas trwania skanowania
Pojedynczy impuls	Rejestracja impulsów	1000		1 / 1	60	2048		10		1 s
Lokalizator fantomowy	2D GRE	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 min
Kalibracja kąta odchylenia	Akwizycja impulsu	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7,5 min
129Kontrola jakości Xe	2D GRE (dwuwymiarowa sekwencja gradientowego echa)	5000	3.3	8 / 1	90	322	322	3	40	21 min

Tabela 1: Parametry sekwencji zapewnienia jakości kalibracji fantoma. TR = czas repetycji, TE = czas echa, N_punkty = liczba punktów, FOV = pole widzenia, BW = szerokość pasma. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. polaryzacja płaska (Rysunek 5A, B).
   1. Wybierz spolaryzowane ¹²⁹Objętość Xe i czas akumulacji: 40 ml w 15 min jest wartością optymalną dla tego protokołu (Rysunek 5) lecz można go łatwo dostosować do innych zastosowań i urządzeń.
   2. Zakładając znaną objętość martwą wewnątrz hiperpolaryzatora (np. V_{objętość martwa} = 80 ml), oblicz szybkość przepływu (F_Ksenon w SLM) dla dozowanej objętości V_pożądany, ¹²⁹frakcja gazu Xe f, oraz czas akumulacji t_akceleracja:
           (1)
      UWAGA: Choć dłuższy czas produkcji zazwyczaj pozwala uzyskać wyższą polaryzację, może on nie być praktyczny dla in vivo obrazowanie. Użyj odpowiedniego modelu dla hiperpolaryzatora^85,86,87,88 aby określić szybkość przepływu, która zrównoważy czas produkcji i polaryzację. W tym przypadku wykorzystano model J. W. Plummera i wsp.⁸⁹ (Rysunek 5A) został zastosowany. Ma to zastosowanie w przypadku polaryzatorów przepływu ciągłego i nie dotyczy hiperpolaryzatorów przepływu zatrzymanego⁹⁰.
   3. Spolaryzuj gaz zgodnie z tymi parametrami, zmierz polaryzację za pomocą urządzenia komercyjnego lub własnej konstrukcji i porównaj ją z przewidywaną polaryzacją dla QA.
   4. Zmierz stratę polaryzacji podczas transportu. Jeśli polaryzacja spadnie o wystarczająco dużą wartość (np. >10%), zbuduj magnetyczne etui transportowe, aby chronić polaryzację podczas transportu. Zobacz Plik uzupełniający 1Zarządzanie polaryzacją podczas transportu i Rysunek uzupełniający 1.

Rycina 5: Zarządzanie polaryzacją. (A) Polaryzacja oraz objętość produktu są funkcją czasu akumulacji i szybkości przepływu. Worek z 40 ml gazu zapewnia wysoką polaryzację początkową (~35%) przez 20 min. Choć użycie 1 l gazu może wydawać się korzystne, spowoduje ono niższą polaryzację początkową (~20%).B) Po około 15 minutach wentylacji, partia 1 litra HP ¹²⁹Ksenon uległby wyczerpaniu do <polaryzacja na poziomie 10% przy pozostałej objętości gazu wynoszącej 60 ml¹¹⁶W związku z tym, stosując kilka worków o pojemności 40 ml z ¹²⁹Ksenon utrzymuje wyższą średnią polaryzację dostarczoną. C) Miejsca, w których pole główne i pole osłonowe przecinają się (czerwone pole w pozycji (N,N,N)), mogą powodować szybką relaksację HP. ¹²⁹Charakterystyka pola rozproszonego magnesu pomaga w identyfikacji bezpiecznych stref, w których można umieścić zbiorniki z HP ¹²⁹Xe może zostać umieszczony bez szybkiej relaksacji (zielony obszar w pozycji (0,0,n)). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Plik uzupełniający 1: Zarządzanie polaryzacją podczas transportu. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

4. Pomiar T zależny od położenia₁ z HP ¹²⁹Ksenon w polu brzegowym (Rycina 5C).
   1. Należy wyznaczyć punkty odniesienia o znanych odległościach i pozycjach względem izocentrum magnesu w wymiarach X, Y i Z. Należy oznaczyć izocentrum oraz kolejne pozycje od n do N. Liczba badanych pozycji będzie zależeć od dostępnej przestrzeni.
   2. Zhiperpolaryzować niewielką objętość ¹²⁹Xe (~250 ml) i przenieś go do pomieszczenia sterowania MRI. Napełnij dużą strzykawkę (50-100 ml) za pomocą ¹²⁹Xe i umieść go w izocentrum magnesu (pozycja 1 w Rysunek 5C). Odtworzyć ok. 1˚ impuls o kącie odchylenia do pomiaru sygnału.
   3. Pozostaw strzykawkę w tej pozycji przez ok. 10 min, a następnie zarejestruj kolejne widmo. Powtarzaj pomiar sygnału co 10 min, aż sygnał spadnie o co najmniej 1 T.₁ (tj. sygnał spadł do poziomu ok. 1/3 wartości początkowej).
   4. Rozpocznij nowy T₁ eksperyment z nową strzykawką zawierającą ¹²⁹Xe poprzez powtórzenie kroku 1.4.2.
   5. Przenieś strzykawkę do nowej pozycji (np. pozycji n w Rycina 5C) i pozostawić w tym miejscu na 10 min. Zwrócić strzykawkę do izocentrum w celu pozyskania dodatkowych ~1˚ spektrum kąta odchylenia.
   6. Powtórz ten proces: przesuń strzykawkę do pozycji n, odczekaj 10 min, przywróć ją do izocentrum i ponownie zmierz sygnał, aż spadnie on o co najmniej 1 T₁.
   7. Powtórz kroki 1.4.4 - 1.4.6 dla pozostałych pozycji referencyjnych obejmujących kierunki X, Y i Z.
   8. Sygnał początkowy (S₀) ulegnie monoeksponencjalnemu rozpadowi w ciągu n Impulsy RF z θ kąt odchylenia. Dopasuj sygnał (S) jako funkcja czasu (t) w polu brzegowym, aby obliczyć T₁ na każdej pozycji:
           (2)
   9. Zidentyfikuj pozycję z wystarczającą ilością T₁ (>20 min) przez ¹²⁹Umiejscowienie zbiornika z ksenonem (Xe).
5. Tworzenie bezymentalnych kaniul intubacyjnych (Rysunek 6).
   1. Należy przygotować dwa żylne cewniki do stałego utrzymania wykonane z politetrafluoroetylenu (PTFE) złączy Luer. Igły należy wyrzucić do pojemnika na odpady ostre.
      ​UWAGA: Dla myszy >Dla zwierząt o masie 25 g należy stosować kaniule 18 G i 20 G. Dla mniejszych zwierząt należy stosować kaniule 20 G i 22 G.
   2. Odetnij złączki Luer z cewników. Wsuń mniejszy cewnik w górny koniec większego cewnika, aby utworzyć dłuższą kaniulę o bardziej ostrym zwężeniu. Otnij kompozytową kaniulę do długości ok. 4,6 cm, wykonując skośne cięcie końcówki. bez podstawy Luer (Rysunek 6A, B).
   3. Odetnij szerszy koniec 200 µL końcówkę pipety do długości ok. 2,6 cm (Rycina 6C).
   4. Pokryć wnętrze końcówki pipety ogólnym środkiem rozdzielczym do form. Użyć drugiej końcówki pipety włożonej do środka, aby cienko rozprowadzić środek rozdzielczy. Wypełnić końcówkę pipety acetoksyliczną wulkanizującą pastą silikonową (Rycina 6D, E).
   5. Zatkać kaniulę drutem 2 G, tak aby wystawał on z obu jej końców. Przewlecz kaniulę przez silikon znajdujący się w końcówce pipety. Wysuń rurkę około 7 mm poza koniec końcówki pipety (Rycina 6F, G).
   6. Nasunąć rurkę kaniuli na szerszą stronę końcówki pipety, przechodząc przez plastikowy męski konektor Luer, i skleić oba elementy za pomocą żywicy epoksydowej. Odciąć fragment rurki wystający poza konektor Luer (Rycina 6H).
   7. Należy odczekać do wyschnięcia żywicy epoksydowej (>24 h), a następnie ostrożnie wyjmij silikonową kaniulę intubacyjną z formy na końcówkę pipety. Wyjmij drut z kaniuli, upewniając się, że rurka nie została niedrożna (Rycina 6I).
   8. Aby wykonać uchwyt ułatwiający intubację, połącz rurkę (1/16" lub 1/8") do żeńskiego złącza Lutera. Po przygotowaniu do intubacji należy połączyć to żeńskie złącze Lutera z męską kaniulą intubacyjną Lutera. Element ten można łatwo odłączyć po intubacji (Rycina 6J).
   9. Dezynfekuj przed każdym użyciem u zwierząt: przemyj zewnętrzną stronę kaniuli 70% alkoholem. Przemyj drut 20 G środkiem dezynfekcyjnym, a następnie przećznij go przez kaniulę, aby zdezynfekować jej wnętrze i upewnić się, że nie występują żadne zatory.

Rysunek 6: Tworzenie obrazowania MRI oraz HP ¹²⁹Kaniule do intubacji myszy kompatybilne z Xe. Kanule te są wykonane z cewników żylnych, końcówek do pipet oraz silikonowego uszczelniacza, zgodnie z opisem w kroku 1.5. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

2. Codzienna zbiórka danych

UWAGA: Patrz Plik uzupełniający 2: Lista kontrolna QA skanowania przedklinicznego.

Plik uzupełniający 2: Lista kontrolna QA skanowania przedklinicznego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

1. Przeprowadź codzienną kontrolę jakości skanera i przygotuj respirator (Rycina 4).
   1. Używając fantomów, uruchom protokoły QA na skanerze (patrz Tabela 1 w celu uzyskania parametrów skanowania QA oraz Krok 1.2 w celu zapoznania się z etapami codziennej kontroli jakości).
   2. Zkalibruj respirator zgodnie z metodą J. Nouls et al.³⁸. Patrz Plik uzupełniający 3: Kalibracja respiratora, Rycina uzupełniająca 2 oraz Rycina uzupełniająca 3.
   3. Ustaw parametry respiratora do obrazowania w fazie końca wdechu (Tabela 2). Umieść legowisko dla zwierzęcia na podstawie skanera, a moduł podtrzymywania życia (tj. elementy respiratora mechanicznego) na stole obok skanera.
   4. Uruchom system ogrzewania zwierząt dedykowany dla danej lokalizacji. Ustaw grzałkę na 35.5 - 40 °C, włącz obieg powietrza i umieść wąż doprowadzający powietrze w odległości ok. 5" od miejsca, w którym spoczywać będzie głowa zwierzęcia, aby wstępnie ogrzać otwór skanera.

Parametr wentylacji	Zalecenia dla HP 129Xe MRI	Uwagi
Objętość oddechowa (TV)	8–10 mL/kg idealnej masy ciała	Umiarkowana TV; niska TV wymaga wyższej BR, co może powodować artefakty ruchowe na obrazach
Dodatnie ciśnienie końcowowydechowe (PEEP)	2–6 cmH2O
Częstotliwość oddechów (BR)	80–120 br/min
Manewry rekrutacyjne (RMs)	~35 cmH2O przez 6 s co 5 min
Czas trwania wentylacji; Pozycja	< 6 h; na plecach	Pozycja na plecach dla lepszej widoczności ruchu klatki piersiowej
Frakcja tlenu w mieszaninie wdechowej (FIO2)	0,3–0,5	Zapobieganie hipoksji u myszy w znieczuleniu
Stosunek czasu wdechu do wydechu (I:E)	1:2–1:4
Stosunek czasu wdechu do całkowitego czasu cyklu	0,2–0,4
Wentylacja minutowa	≥0,57 mL·g-1·min-1
Nasze standardy:
BR = 80 br/min, czas wdechu = 20 ms, FIO2 = 0,3
Obrazowanie w końcowej fazie wdechu: wstrzymanie oddechu = 20 ms, opóźnienie wyzwalacza = 20 ms po rozpoczęciu wdechu
Obrazowanie podczas wstrzymania oddechu: wstrzymanie oddechu = 250 ms, opóźnienie wyzwalacza = 250 ms po rozpoczęciu wdechu
Obrazowanie w końcowej fazie wydechu: wstrzymanie oddechu = 20 ms, opóźnienie wyzwalacza = 650 ms po rozpoczęciu wdechu

Tabela 2: Zalecane ustawienia respiratora dla ¹²⁹Obrazowanie ksenonem. Parametry można dostosować do konkretnych celów badania i warunków eksperymentalnych^{117,118,119,120,121,122,123,124}. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 3: Kalibracja respiratora. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

2. Podaj zwierzęciu środek uspokajający i przeprowadź intubację.
   1. Włącz inkubator do 27.7 °C i/lub elektryczną podkładkę grzewczą do 37.7 °CZważ i zapisz masę ciała zwierzęcia. Oblicz dawkę środka uspokajającego na podstawie masy ciała. Patrz Tabela 3 dla typowego schematu dawkowania.
   2. Wstrzyknąć środek uspokajający do jam brzusznej. Odnotować czas wstrzyknięcia i ustawić czasomierz do następnej dawki środka uspokajającego.
      UWAGA: Należy wykonać pozostałe kroki w sekcji 2 (Codzienne gromadzenie danych) tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować czas sedacji oraz ryzyko przedawkowania.
   3. Nanieść lubrykant do oczu na oczy zwierzęcia, a następnie umieść zwierzę w klatce na podkładce grzewczej lub w inkubatorze, aby zapobiec hipotermii.
   4. Potwierdź całkowite uśpienie zwierzęcia, wykonując test ucisku palca stopy 10–15 min po wstrzyknięciu środka usypiającego.⁶⁸Przeprowadzić intubację zgodnie z procedurami opisanymi przez Das i wsp.⁶⁹.
      UWAGA: Artykuł Das i wsp.⁶⁹ towarzyszy mu szczegółowa demonstracja wideo opisanej techniki. Kroki postępowania są następujące:
   5. Zawieś zwierzę w pozycji na plecach za zęby na skośnej desce. Użyj depresora do języka dla gryzoni, aby wysunąć język.
   6. Aby zapewnić widoczność strun głosowych, należy dostarczyć światło białe za pomocą kabla światłowodowego wprowadzonego do kaniuli intubacyjnej lub za pomocą silnego źródła światła umieszczonego na zewnątrz gardła. Kaniulę należy wprowadzić na głębokość mniejszą niż 5 mm poza struny głosowe.
   7. Należy upewnić się, że kaniula znajduje się w tchawicy, a nie w przełyku, podłączając ją do odcinka rurki zawierającego małą kroplę wody. Jeśli kropla wody porusza się w rytmie oddechów zwierzęcia, położenie kaniuli jest prawdopodobnie prawidłowe.

Odczynnik	Dawka	Ścieżka	Czas trwania	Komentarze
Substancje wziewne
Izofluran	Indukcja: 4%–5% Utrzymanie: 1%– 3% lub do uzyskania pożądanego efektu	Wziewny	Podczas przepływu ciągłego	• Wymaga użycia skalibrowanego parownika
Preparaty do iniekcji
Zalecane: ketamina + ksylazyna + acepromazyna	90 + 9 + 3 mg/kg	Doszytny	20–60 min	• Powoduje podatność na hipotermię
				• W przypadku wielokrotnego podawania dawek zaleca się przejście na mieszaninę ketaminy i ksylazyny, aby zapobiec przedawkowaniu.
				• Powoduje drżenie podczas ustępowania działania. W przypadku obrazowania należy ściśle przestrzegać harmonogramu dawkowania.
				• Może powodować bradykardię
Ketamina + ksylazyna	90 + 9 mg/kg	Dosadjeczniowo	20–40 min	• Patrz powyżej (Ketamina + ksylazyna + acepromazyna)
Pentobarbital	50–70 mg/kg	Dosyciewny	20–60 min	• Obniża częstość oddechów i ruchomość
				• Koszty mogą być zbyt wysokie.
				• Produkt klasy farmaceutycznej może być niedostępny
Zastrzeżenie: Są to wytyczne ogólne. Przed ich wdrożeniem należy skonsultować się z lekarzem weterynarii w celu uzyskania dalszych informacji.

Tabela 3: Typowy zestaw środków znieczulających dla myszy. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Wentyluj zwierzę (Tabela 2).
   1. Podłącz zwierzę do respiratora za pomocą konektora Luer na kaniuli intubacyjnej. Monitoruj ruchy przepony i szczytowe ciśnienie wdechowe (~10-12 cm H₂O dla objętości oddechowej 10 mL/kg masy ciała). Jeśli ciśnienie lub ruchy oddechowe są nieprawidłowe, ostrożnie skoryguj kąt ustawienia szyi i głębokość wprowadzenia kaniuli w razie potrzeby.
   2. Upewnij się, że kaniula intubacyjna jest szczelna, wykonując manewr rekrutacyjny: zablokuj wydech (np. palcem, zamykając port wydechowy), tak aby zwierzę wykonało kilka wdechów bez wydechów.
      UWAGA: Jeśli ciśnienie w drogach oddechowych osiągnie szczytowe ciśnienie wdechowe 35 cmH₂O w czasie ~6 s, uszczelnienie dróg oddechowych jest wystarczające. W przeciwnym razie zapoznaj się z sekcją rozwiązywania problemów.
   3. Przywróć normalny wydech. Wykonuj manewry rekrutacyjne pomiędzy skanami oraz co ~5 min poza czasem skanowania, aby utrzymać podatność płuc i zapobiec atelektozie. Podłącz zawór PEEP do linii wydechowej. Ustaw PEEP na 4 cmH₂O. Zaobserwuj wzrost szczytowego ciśnienia wdechowego o tę wartość.
   4. Po udanej intubacji zaplanuj i zainicjuj produkcję HP ¹²⁹Xe, dostosowując to do harmonogramu powtarzania dawek środka sedatywnego, aby zapobiec przebudzeniu się zwierzęcia podczas skanowania. Monitoruj temperaturę ciała przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Akwizycja danych: Pozyskanie obrazów wentylacyjnych.
   UWAGA: Kroki akwizycji danych  2.4, 2.5 oraz 2.6 mogą być wykonywane w dowolnej kolejności
   1. Ustaw respirator zgodnie z Tabelą 2 dla obrazowania w fazie końca wdechu.
   2. Wczytaj następujące protokoły ustawień: lokalizator protonowy zwierzęcia, pojedynczy impuls do centrowania częstotliwości gazu w płucach myszy oraz lokalizator ¹²⁹Xe zwierzęcia. Parametry skanowania znajdują się w Tabeli 4.
   3. Ustaw zwierzę w izocentrum i potwierdź za pomocą lokalizacji protonowej, że jama klatki piersiowej znajduje się w centrum pola widzenia. W przypadku użycia cewek jednoczęstotliwościowych zastąp cewkę protonową cewką RF dostrojoną do ¹²⁹Xe.
   4. Zarejestruj polaryzację ¹²⁹Xe i przetransportuj ją do skanera MRI. Patrz Plik uzupełniający 4: Lista kontrolna QA polaryzacji ksenonu.
   5. Umieść worek z ¹²⁹Xe w kanistrze respiratora i zamknij go. Podłącz kanister do linii respiratora i poczekaj, aż w kanistrze wytworzy się ciśnienie (3 - 6 psig).
   6. Rozpocznij mechaniczną wentylację ¹²⁹Xe. Przy każdej aktywacji wentylacji ¹²⁹Xe pozwól zwierzęciu wykonać ~5 oddechów przed rozpoczęciem skanu, aby wymienić funkcjonalną pojemność resztkową płuc.
      UWAGA: Pomiędzy skanami ¹²⁹Xe przełącz na mieszankę N₂/O₂, aby oszczędzać gaz hiperpolaryzowany.
   7. Używając pojedynczego impulsu, dostrój częstotliwość roboczą do częstotliwości rezonansowej gazowego ¹²⁹Xe in vivo (~83,07 MHz przy 7 T). Skopiuj częstotliwość do wszystkich kolejnych skanów ¹²⁹Xe w fazie gazowej. Wykonaj lokalizację ¹²⁹Xe, aby potwierdzić, że płuca znajdują się w izocentrum.
   8. Wczytaj i uruchom radialną sekwencję wentylacyjną ¹²⁹Xe. Monitoruj szczytowe ciśnienie wdechowe.
      UWAGA: Jeśli gaz ¹²⁹Xe skończy się przed zakończeniem protokołu, szczytowe ciśnienie wdechowe gwałtownie spadnie. Worek 40 mL ¹²⁹Xe może służyć do wentylacji myszy o masie 30 g przez ~24 min przy wentylacji 70% ¹²⁹Xe z częstotliwością 80 oddechów na minutę i objętością oddechową 10 mL/kg idealnej masy ciała.
   9. Po zakończeniu skanu przełącz wentylację na mieszankę N₂/O₂ i usuń pusty worek z ¹²⁹Xe.
   10. W przypadku obrazowania w fazie końca wydechu zmień czas wstrzymania oddechu oraz opóźnienie wyzwalacza zgodnie z Tabelą 2 i powtórz kroki 2.4.2 - 2.4.9.
   11. Wyeksportuj surowe dane ze skanera.

Skrócona nazwa protokołu	Opis sekwencji	Wyzwalacz	TR (ms)	TE (ms)	Powtórzenia	Kąt odchylenia (˚)	Rozmiar macierzy lub  Npts	pole widzenia (mm)2)	BW RF (kHz)	Grubość warstwy/plastra (mm)	Czas trwania skanowania
Pojedynczy impuls	Akwizycja impulsowa (faza gazowa)	Opcjonalnie	1000		1	60	2048		10		1 s
Lokalizator zwierząt	2D GRE	Tak	50	1.7	1	60	642	322	3	25	60 s
Wentylacja radialna	Radialny obrazowanie 3D z wieloma echami	Tak	20	Patrz opis	1	30	613	223	32.05	30	16 min
Jednopulsowa faza rozpuszczona	Akwizycja impulsowa (faza rozpuszczona)	Nie	80		1	90	512		10.35		80 ms
Dynamiczna spektroskopia fazy rozpuszczonej.	Nabywanie impulsowe (faza rozpuszczona)	Nie	50		1000	90	512		10.5		50 s
Obrazowanie z dyfuzyjnym ważeniem	2D GRE	Tak	12.2	8.1	4	45	642	322	3	1.5	18 min

Tabela 4: In vivo parametry sekwencji. Opisana wcześniej trójwymiarowa radialna sekwencja wentylacyjna z wieloma echami³⁹ pozyskuje obrazy dla 6 czasów echa. Wyniki przedstawiono dla obrazu z pierwszego echa (TE = 1,12 ms, Rycina 7). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 4: Lista kontrolna QA polaryzacji ksenonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

5. Akwizycja danych: Przeprowadzenie dynamicznej spektroskopii fazy rozpuszczonej.
   1. Ustawić respirator zgodnie z Table 2 dla obrazowania podczas wstrzymania oddechu. Ustawić BR na 10 breaths/min. Przygotować nową woreczkę z ¹²⁹Xe zgodnie z krokami 2.4.2 - 2.4.5.
   2. Rozpocząć mechaniczną wentylację ¹²⁹Xe. Wczytać i uruchomić pojedynczy impuls, aby dostosować częstotliwość roboczą do częstotliwości fazy rozpuszczonej (~83,084 MHz przy 7 T). Skopiować częstotliwość roboczą do dynamicznej spektroskopii fazy rozpuszczonej.
      UWAGA: W przypadku myszy z hemoglobiną typu dzikiego będzie to pojedynczy pik⁵⁴.
   3. Wczytać i uruchomić sekwencję dynamicznej spektroskopii wycentrowaną na częstotliwości fazy rozpuszczonej w płucach zwierzęcia. Po zakończeniu skanowania przełączyć wentylację na mieszaninę N₂/O₂ i usunąć pusty woreczek ¹²⁹Xe. Eksportować surowe dane ze skanera.
6. Akwizycja danych: Pozyskanie obrazów ważonych dyfuzyjnie.
   1. Ustawić respirator zgodnie z Table 2 dla obrazowania podczas wstrzymania oddechu. Przygotować nową woreczkę z ¹²⁹Xe zgodnie z krokami 2.4.2 - 2.4.7.
   2. Wczytać i uruchomić sekwencję ważoną dyfuzyjnie. Po zakończeniu skanowania przełączyć wentylację na mieszaninę N₂/O₂ i usunąć pusty woreczek ¹²⁹Xe. Eksportować surowe dane ze skanera.

3. Zakończenie eksperymentu

1. Wybudzenie zwierzęcia.
   1. Wyciągnij kaniulę intubacyjną bezpośrednio z pyska zwierzęcia. Jeśli zwierzę nie zacznie natychmiast oddychać samoistnie, zastosuj lekkie uciśnięcia klatki piersiowej. W razie dostępności podaj niewielki strumień tlenu medycznego w okolicy pyska zwierzęcia, aby wspomóc wybudzanie z sedacji.
   2. Gdy zwierzę zacznie oddychać stabilnie i samodzielnie, a jeśli zwierzę zostało poddane sedacji na okres >Po 2 h podać podskórnie 0,5–1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.
   3. Przenieś zwierzę do osobnej klatki. Umieść klatkę w inkubatorze lub na macie grzewczej.
      UWAGA: Zwierzęta pod wpływem środków sedacyjnych są narażone na kanibalizm i nie mogą być umieszczane w klatce z innymi osobnikami do czasu pełnego powrotu do sprawności (t.j. do momentu samodzielnego poruszania się). Zwierzęta poddane sedacji nie są w stanie regulować temperatury ciała. Należy co kilka minut sprawdzać temperaturę zwierzęcia, dotykając go grzbietem dłoni.
   4. Należy uważnie monitorować zwierzę do momentu powrotu odruchu prostowania (tj. do czasu, gdy będzie ono w stanie samodzielnie przejść z pozycji na plecach do pozycji brzusznej).
   5. Usuń zwierzę z podgrzewacza, gdy będzie już w stanie poruszać się samodzielnie. Umieść zwierzę z powrotem w klatce z pozostałymi osobnikami.
      UWAGA: jeśli zwierzę nie ma współlokatorów w klatce, jest bardziej podatne na hipotermię wywołaną sedacją. Należy zapewnić zwierzęciu dodatkową ściółkę, a jeśli istnieje taka możliwość, pozostawić je na noc w inkubatorze.
   6. Mierz masę ciała zwierzęcia raz w tygodniu przez 2 tygodnie w celu monitorowania jego stanu zdrowia.
      ​UWAGA: Jeśli zwierzę odniosło obrażenia jamy ustnej lub przełyku w wyniku intubacji, może przestać przyjmować pokarm. Jeśli zwierzę straci >w przypadku utraty 20% początkowej masy ciała, należy skonsultować z lekarzem weterynarzem kwestię eutanazji.
2. Analiza obrazów wentylacji (Rycina 7).
   1. Wczytaj surowe dane do platformy programistycznej. Pobierz otwartoźródłowy framework rekonstrukcyjny dla obrazów niekartezjańskich.⁹¹.
   2. Zrekonstruuj obrazy zgodnie z instrukcjami otwartoźródłowego frameworka. Znormalizuj pierwszy punkt na każdej projekcji radialnej.³⁹.
   3. Wysegmentuj miąższ płuc na obrazach, uwzględniając woksele o niskiej lub zerowej ¹²⁹Sygnał Xe. Nie uwzględniać dużych dróg oddechowych. Wysegmentować szum tła na obrazie, z wyłączeniem płuc, dróg oddechowych oraz artefaktów obrazowania.
      UWAGA: Obraz lokalizacyjny protonów może pomóc w wyznaczeniu granic miąższu.
   4. Oblicz SNR (stosunek sygnału do szumu) korzystując ze wzoru:
           (3)
   5. Ilościowe określenie zaburzeń wentylacji.
      UWAGA: Zaproponowano różne metody ilościowego określania zaburzeń wentylacji w modelach zwierząt laboratoryjnych. Metody analizy pozostają obszarem otwartym na dalsze badania, jednak do podejść łatwych w implementacji należą: (i) półilościowa segmentacja manualna⁹², (ii) Metoda histogramowa wykorzystująca sygnał z tchawicy do normalizacji sygnału z miąższu⁴⁷oraz (iii) segmentacja całkowitej objętości płuc (TLV) oraz określenia progu sygnału (np. <60% całkowitej objętości płuc średnio) w celu podziału płuc na objętość uszkodzoną i objętość płuc wentylowanych (VV). Ilościowo określić VDP^93,94 zgodnie z:
           (4)
3. Analiza dynamicznej spektroskopii fazy rozpuszczonej (Rycina 8).
   1. Wczytaj surowe dane do platformy programistycznej. Wykonaj szybką transformację Fouriera i przeprowadź korekcję fazy widm (w przypadku tej aplikacji wystarczająca jest jednoczesna manualna korekcja fazy rzędu zerowego).
   2. Obliczanie standardowych danych rezonansu magnetycznego jądra (NMR)^95,96SNR, szerokość połówkowa maksymalna, polecałka, przesunięcie chemiczne i faza obu pikúw.
   3. Z danych dotyczących wielkości podziel amplitudę sygnału widma rozpuszczonego przez amplitudę sygnału widma gazowego dla każdego powtórzenia, aby wyznaczyć stosunek fazy rozpuszczonej do gazowej w czasie.
4. Analiza obrazów ważonych dyfuzyjnie (Rycina 9).
   1. Wczytaj surowe dane do platformy programistycznej. Wysegmentuj miąższ płucny b₀ obraz jak w kroku 3.2.3. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR) dla każdego obrazu o danej wartości b.
   2. Oblicz stosunek wartości sygnału do szumu, SVNR_0, poprzez podzielenie sygnału w każdym wokselu obrazu b₀ obrazu przez odchylenie standardowe szumu obrazu. Wykluczyć woksele o SVNR₀ < 2,5-krotność szumu obrazu⁹⁷.
      UWAGA: SVNR₀ jest miarą pojedynczego woksela, podczas gdy SNR miąższu jest miarą dla całych płuc.
   3. Oblicz Koniugat lek-przeciwciało poprzez dopasowanie spadku sygnału do wartości b (b_i) zgodnie z równaniem 5^98,99:
           (5)

Wyniki

Obrazy wentylacji

Jeśli procedury przygotowania zwierząt i wentylacji zostaną prawidłowo wdrożone, trójwymiarowe obrazowanie radialne może skutecznie uchwycić wzorce wentylacyjne, gdy akwizycja danych odbywa się podczas wdechowego lub wydechowego etapu cyklu (Rysunek 7). Chociaż obrazy te są gromadzone przez wiele oddechów, opisana tutaj metoda jest podobna do metody obrazowania pojedynczego oddechu stosowanej u ludzi. Wynika to z faktu, że wszystkie linie przestrzeni k są zbierane w konkretnym czasie cyklu oddechowego (np. wszystkie w końcowej fazie wdechu), co w sposób kumulatywny tworzy obraz reprezentujący pojedynczy wdech. Na obrazach tych główne drogi oddechowe (tchawica i oskrzela) są wyraźnie widoczne, nie występują żadne oczywiste artefakty obrazu, a miąższ płuc wydaje się w pełni rozwinięty z wysokim SNR (~15 lub wyższym, w zależności od polaryzacji początkowej). Choć może wydawać się to nieintuicyjne, obrazy uzyskane podczas wdechu (Rysunek 7A, SNR = 15) wykazują niższy SNR niż obrazy uzyskane podczas wydechu (Rysunek 7B, SNR = 27). Jest to związane z niewielkim ciśnieniem napędowym i powolnym przepływem stosowanym podczas wentylacji tej myszy. W przypadku obrazów wdechowych gaz HP nie został jeszcze w pełni wypłukany do miąższu płuc, co spowodowało koncentrację ¹²⁹Xe (a tym samym sygnału) w większych drogach oddechowych. Efekt ten jest wizualnie potęgowany przez skalowanie przestrzeni k podczas rekonstrukcji obrazu, ponieważ wysoki sygnał z dróg oddechowych dominuje w zakresie dynamicznym danych. Niemniej jednak analiza powinna być prosta, jeśli miąższ zostanie poddany segmentacji w taki sposób, aby pominąć duże drogi oddechowe.

Rysunek 7: Reprezentatywne trójwymiarowe obrazy wentylacji radialnej u dorosłej myszy C57BL/6J, uzyskane przy użyciu opublikowanych wcześniej metod³⁹. Choć oba obrazy charakteryzują się stosunkowo wysokim stosunkiem sygnału do szumu (SNR), obrazy przy (A) inspiracji mają niższy stosunek sygnału do szumu (SNR) niż obrazy przy (B) wygaśnięcia głównie dlatego, że ¹²⁹Gaz Xe nie miał jeszcze czasu, aby przedostać się do płuc. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ważne jest odróżnienie patologicznej niedrożności dróg oddechowych od innych przyczyn niskiego stosunku sygnału do szumu (SNR). Na Ryc. 7A nie przewiduje się niedrożności wentylacji (tj. niskiego VDP), ponieważ zwierzę było zdrową myszą typu dzikiego. W przypadku niedrożności wentylacji defekty zazwyczaj objawiałyby się jako obszary o niskim lub żadnym sygnale ¹²⁹Xe. Niepatologiczne przyczyny niskiego sygnału obejmują zazwyczaj:

(i)  Niska polaryzacja ¹²⁹Xe: Powoduje ona niski SNR w miąższu płuc i drogach oddechowych bez towarzyszących artefaktów. Niską polaryzację można zazwyczaj przypisać nieprawidłowemu przeprowadzeniu procedur polaryzacji, depolaryzacji podczas transportu lub nadmiernej zawartości tlenu O₂ w przewodach doprowadzających HP ¹²⁹Xe (np. z powodu nieprawidłowo skalibrowanego respiratora).

(ii)  Zbyt głębokie wprowadzenie kaniuli intubacyjnej: Jeśli kaniula zostanie wprowadzona zbyt głęboko do tchawicy, może ona przesunąć się w stronę lewego lub prawego oskrzela. W przypadku silnego zaklinowania, objętość oddechowa całego płuca może zostać ograniczona do zaledwie kilku płatów i dróg oddechowych, podczas gdy reszta płuca nie będzie otrzymywać powietrza. Jeśli tak się stanie, nadmiernie rozdęte płaty mogą ulec uszkodzeniu, co może wymagać eutanazji zwierzęcia. Alternatywnie, końcówka kaniuli może wejść w bezpośredni kontakt z tkanką. W takim przypadku ¹²⁹Xe będzie w głównej mierze ograniczony do wnętrza kaniuli, co spowoduje uzyskanie silnego sygnału z widocznie prostej rurki i minimalnego sygnału w obrębie miąższu. W takiej sytuacji należy niezwłocznie skorygować położenie kaniuli i monitorować zwierzę pod kątem objawów stresu (np. nieprawidłowy, brak lub asynchroniczny ruch klatki piersiowej w stosunku do respiratora).

(iii)  Zbyt płytkie wprowadzenie kaniuli intubacyjnej: Gdy bolus gazu jest podawany zbyt płytko w obrębie gardła, opór przepływu tego bolusa do płuc może być większy niż opór jego przepływu wokół zewnętrznej części kaniuli i wydostawania się przez usta. Może to skutkować niewystarczającym napowietrzeniem płuc. Stosunek sygnału do szumu (SNR) w tchawicy może być wysoki, podczas gdy SNR w miąższu płucnym będzie niski. Ze względu na przepływ gazu w górę tchawicy podczas akwizycji danych mogą wystąpić artefakty ruchowe. Charakter artefaktu będzie zależeć od rodzaju sekwencji (GRE, radialna itp.).

(iv)  Nieprawidłowy moment akwizycji: Jeśli impulsy RF i akwizycja danych odbywały się w okresach wdechowego lub wydechowego przepływu gazów, zazwyczaj wystąpią silne artefakty ruchowe — szczególnie przy zastosowaniu sekwencji kartezjańskich — a SNR miąższu będzie niski.

(v)  Oddychanie spontaniczne: Jeśli zwierzę jest niewystarczająco uspokojone podczas akwizycji danych, ruchy oddechowe spontaniczne będą nakładać się asynchronicznie na wzorzec wentylacji mechanicznej. Będzie to skutkować zmienną podażą ¹²⁹Xe z oddechu na oddech, umiarkowanymi lub silnymi artefaktami ruchowymi oraz niskim stosunkiem sygnału do szumu (SNR) w miąższu. Kluczowe jest uważne monitorowanie dawki i czasu podania środków sedacyjnych.

(vi)  Śmierć zwierzęcia: W rzadkich przypadkach myszy mogą zginąć (np. z powodu nieprawidłowego umiejscowienia kaniuli, niewystarczającej podaży O₂, przedawkowania środków uspokajających lub ciężkiej patologii eksperymentalnej). Jeśli tak się stanie, tkanka płuca szybko sztywnieje, a miąższ płuc będzie  słabo wypełniał się powietrzem. Górny odcinek tchawicy może pozostać jasny, ale sygnał z miąższu płuca będzie bardzo niski.

Spektroskopia wymiany gazowej

U ludzi parametry pochodne ze spektroskopii (np. intensywność sygnału, szerokość widma, przesunięcie chemiczne i faza) dostarczają informacji o dynamice krążeniowo-oddechowej i stanie chorobowym^52,53. W przeciwieństwie do ludzi⁸⁶, psów¹⁰ i szczurów^20,101, widma całych płuc myszy otrzymywane, gdy namagnesowanie ¹²⁹Xe jest ograniczone do miąższu płuca, wykazują pojedynczy, szeroki rezonans fazy rozpuszczonej, odpowiadający ¹²⁹Xe rozpuszczonemu w tkance błony kapilarnej, osoczu krwi i erytrocytach⁵⁴ (Rycina 8A, 197 ppm). Gdy ¹²⁹Xe jest transportowany przez przepływ krwi do tkanek bardziej dystalnych, generuje odrębne częstotliwości rezonansowe z różnych tkanek, w tym z tkanki tłuszczowej⁵⁴, mięśni, istoty szarej i białej^102,103. Jednak ze względu na stosunkowo długie czasy przejścia (kilka sekund) i umiarkowaną rozpuszczalność¹⁰⁴ (rozpuszczalność Ostwalda = 0,1 - 0,3), sygnały te są zazwyczaj słabe i obserwuje się je jedynie podczas dedykowanych, starannie przeprowadzonych eksperymentów. Wyjątkiem jest ¹²⁹Xe rozpuszczony w tkankach tłuszczowych (Rycina 8A, 189 ppm). Z tych tkanek sygnał ¹²⁹Xe może pojawić się w ciągu kilku sekund (np. podczas pierwszych kilku oddechów podczas przygotowania zwierzęcia). Ponadto intensywność sygnału może być wysoka, ponieważ rozpuszczalność Ostwalda ¹²⁹Xe w tkankach tłuszczowych jest niemal 20-krotnie większa niż w osoczu krwi (tj. odpowiednio 1,7 vs 0,094 w 37 ˚C¹⁰⁴). Przewiduje się również, że czasy relaksacji podłużnej będą stosunkowo długie (T₁ in vivo wynosi ~20 s w lipidach¹⁰⁵ w porównaniu do 3-8 s we krwi¹⁰⁶). W rezultacie sygnał ¹²⁹Xe z tkanki tłuszczowej może być stosunkowo wysoki w porównaniu z innymi tkankami.

Ze względu na odmienną dynamikę sygnału, eksperymenty z spektroskopii ¹²⁹Xe mogą być dostosowane do badania tkanki tłuszczowej (np. w celu pomiaru termometrii tkanki tłuszczowej brunatnej¹⁰⁷) lub wchłaniania gazu w płucach poprzez dobór odpowiednich parametrów akwizycji. Gdy widma ¹²⁹Xe z płuc są rejestrowane przy ustawieniach opisanych w Tabeli 4 (tzn. TR = 50 ms i kąt flip 90˚ wycentrowany na piku fazy rozpuszczonej), obserwowane są piki zarówno fazy gazowej, jak i fazy rozpuszczonej (Rysunek 8A,B). Warto zauważyć, że objętość gazu w płucach myszy jest 2-3x większa od objętości tkanki, a rozpuszczalność ¹²⁹Xe w tej tkance wynosi zaledwie ~10%^{104,108,109,10,1}. Pomimo tego amplituda sygnału rozpuszczonego przekracza amplitudę fazy gazowej około 2-krotnie, ponieważ wzbudzenie fazy gazowej odbywa się daleko poza rezonansem (~15 kHz przy 7 T; Rysunek 8B, SNR odpowiednio 102 vs. 43). Zatem 20- do 30-krotnie większa pula magnetyzacji w fazie gazowej może być traktowana jako stabilny (tzn. niewyczerpany) rezerwuar dla sygnału z fazy rozpuszczonej podczas statycznych części cyklu oddechowego.

Przy nowym cyklu namagnesowania co ok. 60 ms i TR wynoszącym 50 ms, intensywność sygnału z fazy gazowej oraz fazy rozpuszczonej ¹²⁹Xe oscyluje. W przypadku sygnału gazowego wynika to ze zmiany całkowitej objętości gazu (tj. wysokiej podczas wdechu i niskiej podczas wydechu). Sytuacja jest bardziej złożona dla sygnału rozpuszczonego, ponieważ namagnesowanie gazu źródłowego, T₂* oraz objętość krwi w naczyniach włosowatych mogą fluktuować w zależności od stanu nadmuchania. W rezultacie stosunek amplitudy sygnału rozpuszczonego do gazowego również oscyluje w odniesieniu do cyklu oddechowego (Rysunek 8C, średni stosunek rozpuszczony:gaz = 1,9 ± 0,39).

Rycina 8: Reprezentatywna spektroskopia dynamiczna w ramach dorosła mysz szczepu C57BL/6J. (A) Widmo pojedynczego impulsu wykazuje sygnał pochodzący z ¹²⁹Xe w fazie gazowej, rozpuszczony w tkance tłuszczowej (189 ppm) oraz rozpuszczony w błonie kapilarnej i tkankach krwi (197 ppm).B) Spektroskopia dynamiczna wykazująca zmienną w czasie intensywność sygnału zarówno dla formy rozpuszczonej, jak i gazowej ¹²⁹Xe (czas powtórzenia = 50 ms). Aby ułatwić wizualizację, wyświetlono tylko pięć widm. Linie ukośne na osi czasu oznaczają przerwy w skali. (CStosunek amplitudy sygnału fazy rozpuszczonej do fazy gazowej w odstępie 2 s (odpowiadający czerwonej przerwie w skali na panelu B) wykazuje wyraźną zmienność w zależności od cyklu oddechowego (0,6 s na oddech). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Poniżej znajduje się lista czynników, które mogą wpłynąć negatywnie na wyniki spektroskopii wymiany gazowej ¹²⁹Xe. W każdym z tych przypadków prawdopodobnym skutkiem jest niski stosunek sygnału do szumu (SNR), co może sprawić, że dopasowanie widma i wynikowe parametry (np. stosunek amplitudy sygnału rozpuszczonego do gazowego, przesunięcie chemiczne, szerokość widma oraz faza) będą niedokładne.

(i)  Błędna częstotliwość robocza: Ze względu na znacznie większą objętość gazu i niską rozpuszczalność w tkankach, impulsy RF wycentrowane na częstotliwości fazy gazowej nie wywołają sygnału z fazy rozpuszczonej. Impulsy RF powinny być wycentrowane na częstotliwości fazy rozpuszczonej lub w jej pobliżu.

(ii)  Zbyt szerokie pasmo: Pasmo wzbudzenia powinno być wystarczająco szerokie, aby wzbudzić część ¹²⁹Xe w fazie gazowej w celu pomiaru stosunku amplitudy sygnału fazy rozpuszczonej do gazowej. Jeśli jednak pasmo jest zbyt szerokie, impuls wzbudzenia zniszczy magnetyzację w fazie gazowej, zanim ta rozpuści się w tkance. Przejawia się to jako bardzo wysoki sygnał gazowy oraz niski lub brak sygnału z fazy rozpuszczonej, pomimo że impuls został wycentrowany na częstotliwości fazy rozpuszczonej.

(iii)  Nieoptymalizowany TR: Aby zbadać dynamikę sygnału w trakcie jednego oddechu, twierdzenie Nyquista-Shannona o próbkowaniu wymaga, aby sygnał był próbkowany z częstotliwością co najmniej dwukrotnie większą niż jego częstotliwość (tutaj 10 oddechów na minutę próbkowano co 50 ms, czyli ~12x na oddech). W zależności od warunków eksperymentalnych możliwe jest dalsze badanie dynamiki sygnału kardiopulmonarnego przy szybszej częstotliwości próbkowania. Wyniki tych eksperymentów zależałyby od wielu czynników, w tym od szerokości pasma wzbudzenia, częstości oddychania i tętna. Należy również wziąć pod uwagę czas wymiany ksenonu (tzn. czas rozpuszczania się ksenonu w tkance; ~56 ms⁵⁴) oraz czas przejścia płucnego (tzn. czas przepływu krwi z prawej do lewej komory; ~830 ms przy tętnie ~436 uderzeń/min¹¹²). Zbyt częste próbkowanie doprowadzi do przedwczesnego zniszczenia namagnesowania i niskiego poziomu sygnału, ale jednocześnie zmniejszy wpływ przepływu krwi. Rzadsze próbkowanie pozwoli na dalsze rozpuszczanie namagnesowania i uzyskanie silniejszego sygnału, jednak stanie się ono bardziej zależne od przepływu krwi i mniej zlokalizowane w obszarach wymiany gazowej w pęcherzykach płucnych.

Obrazy dyfuzyjne

Obrazy ważone dyfuzją, stosowane do ilościowego określania wielkości przestrzeni powietrznych pęcherzyków płucnych, zostały rygorystycznie zwalidowane w modelach małych zwierząt za pomocą tradycyjnych metod histomorfometrii^98,13,14. W niniejszej pracy ograniczyliśmy dyskusję do obrazowania 2D z selekcją warstw, aby zminimalizować czas skanowania i zużycie gazu, zachowując zgodność z wcześniej zwalidowanymi protokołami⁹⁸. Do obliczenia ADC wystarczające są co najmniej 2 obrazy o różnych wartościach b, natomiast do zaawansowanych obliczeń morfometrycznych (takich jak średnia odległość między ściankami pęcherzyków, tzw. mean linear intercept) niezbędne są 4 lub więcej obrazy o różnych wartościach b. Pozyskanie wielu obrazów o różnych wartościach b oferuje znaczącą zaletę w postaci zwiększenia dokładności obliczeń. W przeciwieństwie do obrazowania ludzi podczas pojedynczego wstrzymania oddechu, obrazowanie przedkliniczne obejmujące wiele oddechów zapewnia stale odnawiany sygnał. Dzięki temu możliwe jest pozyskanie wielu obrazów o wysokim SNR dla różnych wartości b, ograniczonych jedynie objętością dostępnego gazu HP oraz czasem sedacji zwierzęcia. W tym przypadku pozyskano 7 obrazów o różnych wartościach b, każdy z SNR >15, wykorzystując 400 mL gazu ¹²⁹Xe w czasie skanowania wynoszącym 18 min (Rysunek 9). Sygnał w każdym obrazie zanika wraz ze wzrostem natężenia gradientu dyfuzji (wartości b). Ten zanik sygnału jest proporcjonalny do ADC ¹²⁹Xe w płucach. Duże drogi oddechowe można odróżnić od tkanki pęcherzykowej, porównując obrazy b₀ i b₆. W obszarach, które anatomicznie prawdopodobnie zawierają drogi oddechowe, piksele będą bardzo jasne na obrazie b₀, ale ciemne na obrazie b₆ (czerwone strzałki, Rysunek 9). Piksele te powinny zostać wykluczone z analizy miąższu płuc.

Rysunek 9Reprezentatywne obrazy obrazowania rozproszonego (DWI) u dorosłej myszy szczepu C57BL/6J. Duże drogi oddechowe (czerwone strzałki), przez które ¹²⁹Xe dyfunduje swobodnie podczas rozcieńczenia tlenem, wykazując zwiększone tłumienie sygnału w stosunku do miąższu płuc. Skutkuje to jasnymi drogami oddechowymi w b₀ obrazowanie i drogi oddechowe o niskim sygnale w b₆ obraz. Myszy i szczury mają podobnie niskie wartości ADC w stosunku do ludzi, jednak wartości te będą zależeć od czynników biologicznych i eksperymentalnych, takich jak wiek, objętość tidalna, ciśnienie i parametry dyfuzyjne. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Współczynnik dyfuzji pozornej (ADC) tej zdrowej, dorosłej myszy typu dzikiego jest zgodny z oczekiwanym wynikiem na podstawie literatury, wieku zwierzęcia, stosunku sygnału do szumu (SNR), parametrów akwizycji i innych czynników. Czynniki, które mogą negatywnie wpływać na precyzję i dokładność wyników ADC, obejmują:

(i)  Niski stosunek sygnału do szumu (SNR): Ważne jest, że niski stosunek sygnału do szumu (SNR) w obrazach powoduje przesunięcie obliczeń ADC w stronę wartości niższych.^99,115Z tego powodu wykluczamy voksele o SVNR₀ < 2,5-krotność szumu obrazu⁹⁷.

(ii)  Nieprawidłowa segmentacja: Niewłaściwa segmentacja (np. stosowanie progowania sygnału bez wizualnej kontroli jakości) może zniekształcić wyniki. Jeśli obrazy zawierają artefakty (np. spowodowane ruchem), mogą one przekroczyć próg i zostać błędnie zakwalifikowane jako miąższ. Ponadto szczególnie ważne jest wykluczenie pikseli w pobliżu dużych dróg oddechowych, ponieważ efekty objętości cząstkowej mogą przesunąć wartości ADC w stronę wartości wyższych.

(iii)  Źle skalibrowany respirator: Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie ¹²⁹Xe lżejszymi gazami (np. O₂ lub N₂) może przesunąć ADC w stronę wyższych wartości, dlatego w celu porównań ilościowych niezbędna jest wentylacja ze znanymi mieszankami gazowymi. W przypadku wentylacji mieszaniną ¹²⁹Xe/O₂, zwiększenie stężenia tlenu przed podaniem zwiększy relaksację T₁ i zmniejszy namagnesowanie ¹²⁹Xe w przewodach doprowadzających gaz, co obniży SNR.

(iv)  Derekrutacja płuc: U zwierząt zanieczulonych i wentylowanych mechanicznie z czasem może dojść do zapadnięcia się pęcherzyków płucnych (miażdrycy). Gdy zjawisko to występuje podczas podczas wentylacji o stałej objętości ta sama objętość oddechowa jest nieuchronnie redystrybuowana do pęcherzyków płucnych, które pozostają otwarte. W miarę rozwoju umiarkowanej lub ciężkiej atelektazy pozostała część płuca może ulec nadmiernemu rozdęciu, co prowadzi do uszkodzeń i zwiększenia wartości ADC w tych obszarach. Regularne manewry rekrutacyjne oraz zastosowanie PEEP zapobiegają zapadaniu się pęcherzyków płucnych, przeciwdziałają zmniejszeniu podatności płuc i minimalizują ryzyko uszkodzenia płuc, które mogłoby zniekształcić wyniki ADC.

(v)  Słabe dopasowanie danych: Należy wziąć pod uwagę metodę szacowania ADC. Dopasowanie log-liniowe jest najbardziej wydajne obliczeniowo, ale wprowadza błąd systematyczny w obrazach o niskim SNR. Dlatego najlepiej stosować je w obrazach o wysokim SNR (>20). Metoda liniowa ważona zmniejsza ten błąd i jest odpowiednia dla obrazów z SNR > 15. Estymacja bayesowska może dostarczać wartości ADC z niską niepewnością nawet przy SNR <10, ale jest kosztowna obliczeniowo⁹.

(vi)  Nieoptymalny czas dyfuzji: Optymalny czas dyfuzji zależy od maksymalnej siły gradientu skanera MRI oraz promienia dróg oddechowych w obrębie acinusów u myszy (promień ~10 µm⁴⁹), który jest około trzy razy mniejszy niż u ludzi. Aby zapewnić optymalne warunki, czas dyfuzji ustawia się tak, aby osiągnąć długość dyfuzji większą niż średni promień pęcherzyka płucnego, ale mniejszą niż średnia długość przewodów pęcherzykowych. Optymalny czas dyfuzji dla maksymalnej siły gradientu w danej lokalizacji można wyznaczyć stosując metody opisane przez Sukstanskiego i Yablonskiego⁴⁹. Zastosowanie nieoptymalnego czasu dyfuzji może prowadzić do nieliniowych spadków ADC ¹²⁹Xe, co komplikuje interpretację wyników.

(vii)  Suboptymalne wartości b: Istnieje kompromis między maksymalizacją SNR a maksymalizacją stosunku kontrastu do szumu (CNR) generowanego na obrazach o różnych wartościach b. Jeśli poświęci się CNR, stosując wyłącznie niskie wartości b (tj. spadek sygnału dyfuzyjnego, jak w przypadku pozyskania tylko pierwszych 3 obrazów o różnych wartościach b na Rysunku 9), oszacowanie ADC będzie niedokładne ze względu na słabe dopasowanie. Jeśli ważenie dyfuzyjne jest zbyt silne, wynikowy SNR będzie niewystarczający, a wartość ADC zostanie przesunięta w stronę niższych wartości.

Dyskusja

Hiperspolaryzowany rezonans magnetyczny ¹²⁹Xe staje się wyrafinowaną i potężną techniką badania mikrostruktury i funkcji płuc w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten ma na celu ukierunkowanie wstępnego przygotowania miejsca i opisanie procedur eksperymentalnych potrzebnych do ilościowego określenia wentylacji, dyfuzji i wymiany gazowej w płucach myszy za pomocą HP ¹²⁹Xe. Kluczowe warunki wstępne dla eksperymentów obejmują ustanowienie fantomu ^{gazu 129}Xe i zapewnienie, że do zwierzęcia dostarczana jest wysoka polaryzacja gazu. To ostatnie wymaga starannego zaplanowania parametrów polaryzacji, złagodzenia strat polaryzacji podczas transportu gazu (np. zbudowania magnetycznej walizki transportowej) oraz scharakteryzowania (i najlepiej uniknięcia) relaksacji T₁ w polu granicznym przedklinicznego magnesu MRI^116,125. Równolegle z rozwojem niezbędnej infrastruktury HP ¹²⁹Xe konieczne jest ustanowienie solidnych protokołów i procedur postępowania ze zwierzętami. Obejmują one skuteczną sedację, która umożliwia solidną wentylację mechaniczną, niepowodującą uszkodzeń intubację umożliwiającą badania podłużne oraz strategie wentylacji, które równoważą potrzebę dostarczania wysokiego namagnesowania ¹²⁹Xe z bezpiecznymi i fizjologicznie istotnymi warunkami wentylacji.

Do pewnego stopnia opisane tutaj metody, procedury i wyniki zależą od konkretnego używanego sprzętu (np. respiratora, polaryzatora i typu skanera MRI). Jeżeli dostępny jest alternatywny sprzęt, techniki eksperymentalne mogą być stosunkowo łatwo modyfikowane. Ponadto można zoptymalizować codzienne procedury zapewnienia jakości (krok 1.2, rysunek 4 i tabela 1). Skrupulatne prowadzenie dokumentacji przez ~30 minut kontroli jakości ma kluczowe znaczenie podczas tworzenia nowej lokalizacji. Umożliwia wczesne wykrywanie problemów sprzętowych i możliwość ich wykluczenia podczas rozwiązywania problemów. Po dokładnym scharakteryzowaniu codziennych zmian w wskaźnikach kontroli jakości, kalibracja kąta odwrócenia i ~21-minutowe skanowanie QA mogą zostać zmniejszone w celu zwiększenia wydajności. Ponadto ogólne podejście można rozszerzyć na inne popularne gatunki małych zwierząt (np. szczury i króliki) poprzez dostosowanie dawek środka znieczulającego, ustawień respiratora i parametrów akwizycji. Podstawowe protokoły można wykorzystać do zbadania fizjologii zależnej od respiratora, takiej jak wpływ częstości oddechów, objętości i poziomów PEEP na wymianę gazową lub rekrutację pęcherzyków płucnych. Jeśli dane podłużne nie są wymagane lub badanie podłużne zostało zakończone, kaniula intubacyjna umożliwia płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub szybkie ustabilizowanie płuc i pobranie do konwencjonalnych analiz (np. pomiarów histologicznych lub morfometrycznych). Co więcej, potencjał modyfikacji tego protokołu rozciąga się na sekwencje i parametry MRI, co stanowi dynamiczny aspekt badań ¹²⁹Xe MRI.

Umieszczenie kaniuli ma kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa zwierząt i jakości obrazu. Ponieważ kaniula intubacyjna nie jest sztywno przymocowana – na przykład poprzez zszycie wokół tchawicy – stosunkowo niewielkie przemieszczenia (np. ruchy podczas podłączania sprzętu do monitorowania fizjologicznego) mogą zerwać hermetyczne uszczelnienie z tchawicą. To hermetyczne uszczelnienie jest niezbędne do manewrów rekrutacyjnych (szczytowe ciśnienie wdechowe ~35 cm H₂O), które mają kluczowe znaczenie dla utrzymania podatności płuc i zapobiegania niedodmie. Jeśli manewr rekrutacyjny nie osiągnie docelowego ciśnienia, badacz musi rozważyć strategie korekcyjne w kontekście celów badania (np. obrazowanie zależne dyfuzją vs. obrazowanie wentylacji; pojedynczy punkt czasowy vs. podłużny). Strategie łagodzące mogą obejmować: 1) usunięcie kaniuli i ponowną intubację, 2) dostosowanie pozycji kaniuli w celu zwiększenia kontaktu ze ściankami tchawicy, gdy jest ona nadal włożona, oraz 3) kontynuowanie eksperymentu bez uzyskania gazoszczelnego uszczelnienia. Z punktu widzenia wierności danych, reintubacja jest najbardziej niezawodną opcją, ale może być czasochłonna i prowadzić do niepożądanego rozpadu namagnesowania ¹²⁹Xe. Regulacja pozycji kaniuli jest szybsza, ale należy ją wykonywać ostrożnie, ponieważ niesie ze sobą większe ryzyko kontuzji. Kontynuowanie eksperymentu bez RM jest najlepiej stosowane, gdy mysz będzie wentylowana przez <20 minut, aby uniknąć wywołanych niedodmą zmian w dynamice płuc¹¹⁷.

Poza oczywistą potrzebą bezpiecznego obchodzenia się ze zwierzętami, kluczem do opracowania solidnego i niezawodnego programu MRI za pomocą myszy HP ¹²⁹Xe — i rozwiązywania problemów z nim związanych — jest skrupulatne prowadzenie dokumentacji. W przypadku produkcji HP ¹²⁹Xe zaleca się śledzenie mocy lasera, czasu akumulacji, natężenia przepływu i polaryzacji. Podczas obrazowania fantomowego i spektroskopii najlepiej jest rejestrować SNR obrazu, pozycję szczytu, szerokość linii widmowej oraz moc RF potrzebną do uzyskania impulsu 90°. W przypadku obrazowania in vivo podobne dane dotyczące kontroli jakości powinny być rejestrowane wraz z parametrami monitorowania fizjologicznego (szczytowe ciśnienie wdechowe, temperatura ciała itp.) oraz szczegółowym harmonogramem zdarzeń związanych z obchodzeniem się ze zwierzętami. Kilka kluczowych elementów wyposażenia może ułatwić rozwiązywanie problemów z respiratorem. Należą do nich czujnik_O2 , spirometr dla małych zwierząt oraz manometr do kalibracji wentylacji i ciśnienia PEEP. Oscyloskop i woltomierz mogą pomóc w potwierdzeniu, że czas pracy respiratora jest precyzyjny i dopasowany do bramkowania skanera MRI. Wreszcie, ręczny gaussmetr jest niezbędny do potwierdzenia integralności magnetycznej walizki transportowej, jeśli jest ona wymagana do transportu. Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów z sekwencją MRI, zaleca się użycie zarówno fantomu gazowego opisanego w tym protokole, jak i strzykawki wypełnionej gazem HP. Użycie strzykawki zawierającej gaz HP ¹²⁹Xe jest szczególnie korzystne w przypadku rozwiązywania problemów z sekwencjami ważonymi dyfuzją, ponieważ dokładność danych można ocenić na podstawie tego, czy odzwierciedlają one znaną prawdę podstawową: współczynnik swobodnej dyfuzji czystego ¹²⁹Xe w strzykawce.

Przy stosowaniu tego protokołu należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Po pierwsze, zależy to od specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej, co zmniejsza dostępność dla nowych lokalizacji. Jednak wraz z niedawnym zatwierdzeniem przez organy regulacyjne do użytku klinicznego w USA, oczekuje się, że liczba ośrodków wyposażonych w ¹²⁹funkcji Xe MRI wzrośnie. Technika ta jest również ograniczona przez nieodłączne ograniczenia hiperspolaryzowanego gazu, w tym stosunkowo krótki czas trwania polaryzacji i potrzebę szybkiego pozyskiwania danych. Zastosowanie respiratora mechanicznego zazwyczaj poprawia stosunek sygnału do szumu obrazu i z natury rzeczy pozwala uniknąć artefaktów ruchu, ale maskuje naturalną dynamikę oddychania, którą można uchwycić za pomocą urządzenia do swobodnego dostarczania gazu. Ponadto wyniki uzyskane na modelach małych zwierząt przy użyciu tego protokołu powinny być interpretowane ostrożnie przy ekstrapolacji na fizjologię człowieka, biorąc pod uwagę znaczne różnice między gatunkami. Kolejnym ograniczeniem jest trudny charakter intubacji doustnej i wentylacji mechanicznej, które są trudne u myszy ważących mniej niż 25 g. Może to wykluczać samce w wieku poniżej ~8 tygodni i samice w wieku poniżej ~20 tygodni, chyba że stosuje się dedykowany sprzęt i procedury. Najbardziej rażącym ograniczeniem tego protokołu jest brak programowania impulsów i zaawansowanych technik rekonstrukcji obrazu. Włączenie takich metod do uogólnionego protokołu jest niepraktyczne ze względu na ich skomplikowane szczegóły techniczne i specjalistyczną wiedzę. Wreszcie, protokół ten opisuje podstawowe wskaźniki ilościowe, takie jak SNR, VDP i ADC, ale nie bardziej zaawansowane miary, takie jak regionalna wentylacja frakcyjna, morfometria dyfuzyjna i obrazowanie wymiany gazowej. Te zaawansowane metryki będą łatwiejsze do wdrożenia po skonfigurowaniu podstawowej infrastruktury opisanej w tym miejscu.

Chociaż rezonans magnetyczny małych zwierząt za pomocą gazu HP ¹²⁹Xe jest wymagający pod względem zasobów i wymagający doświadczalnie, może znacznie przyspieszyć przedkliniczne badania płuc. Oferuje minimalnie inwazyjny i czuły sposób ilościowego określania wentylacji regionalnej, wielkości pęcherzyków płucnych i przestrzeni powietrznej oraz dynamiki wymiany gazowej. W związku z tym może stanowić unikalny sposób oceny fizjologii płuc, postępu choroby i interwencji terapeutycznych w czasie. W związku z tym stanowi postęp w stosunku do tradycyjnych technik przedklinicznych, w tym histologii, analiz biochemicznych, metod obrazowania jonizującego i inwazyjnych pomiarów mechaniki płuc. Co więcej, rezonans magnetyczny ¹²⁹Xe u małych zwierząt pozostaje aktywnie rozwijającą się poddziedziną badań, a zrównoważenie odpowiedniej fizyki obrazowania z wymaganiami przedklinicznymi samo w sobie stanowi znaczne możliwości badawcze. Wreszcie, w miarę jak kliniczny ^{rezonans magnetyczny 129}Xe staje się coraz szerzej akceptowany i stosowany klinicznie, możliwości badań translacyjnych między myszą a człowiekiem i z powrotem będą z czasem rosły.

Rysunek uzupełniający 1: Schemat obwodu magnetycznej walizki transportowej. Elektromagnes wykonany z emaliowanego drutu miedzianego, L1, jest połączony równolegle z V1, 12-woltowym, szczelnym akumulatorem kwasowo-ołowiowym. Rezystancję rezystora R1 można wybrać tak, aby kontrolować prąd przez V1 i L1. Lampka sygnalizatorowa LED, R2 i D1, jest również okablowana równolegle z V1. Włącznik dwufunkcyjny S1 jest połączony szeregowo z przełącznikiem V1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Wyniki kalibracji respiratora dla azotu. Objętość wydalana z 30 oddechów została zmierzona w trzech powtórzeniach. Przeprowadzono regresję liniową w celu określenia ciśnienia napędowego niezbędnego do wytworzenia odpowiednich ilości gazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Ściągawka dotycząca ustawień ciśnienia w respiratorze. Wyniki nachylenia i punktu przecięcia wynikające z regresji liniowej każdego gazu są używane w równaniu S1. Równanie to wykorzystano do wyznaczenia ciśnienia napędowego niezbędnego do wytworzenia objętości oddechowej wynoszącej 10 ml/kg idealnej masy ciała dla mieszanin gazów 70% N₂ + 30% O₂ i 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ dla odpowiedniej masy ciała. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 1 ml	fisher scientific	Nr katalogowy14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
10 mL cylinder z podziałką	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& _source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
18 G - cewniki dożylne PFTE (niesterylne)	Terumo Surflo	SROX1832CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-18-x-1-25inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ zakupy& _source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 4oTvZkAgWQCda6ocVtQlulVrG 2536FNbu5soMVSFN8xK_g1Uh pXIRoCGwoQAvD_BwE 20
G - cewniki żylne PFTE (niesterylne)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google& utm_medium=google_ zakupy& _source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - cewniki dożylne PFTE (niesterylne)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ zakupy& _source=1& gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
400 mL worki przetrząsacz	Jensen Inert Products	GST-001S-3507TJC	NA
60 mL strzykawka	fisher scientific	Numer katalogowy14-955-461	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461
70% alkoholu	Cole-Parmer	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= no& _source=1& gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
Dewar do ciekłego azotu	Terra Universal	4LDB	https://www.laboratory-equipment.com/tw-4ldb-liquid-nitrogen-dewar-ic-biomedical.html?srsltid=AfmBOooxwMtOA1Z2TweR P8V5Iy5EvYT3alZuzoiY 3UF3Ib9RgFnDxVTfWP0
Odświeżanie smaru do oczu		ODŚWIEŻ PO POŁUDNIU	https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-pm
Lampa światłowodowa	AmScope	HL250-AY	https://amscope.com/products/hl250-ay?tw_source=google & tw_adid=& tw_campaign= 16705014684& _source= 1& gclid=CjwKCAiA6KWvBhA REiwAFPZM7p-DpyvHJaGxR pAD1385hzGf1oPdKHHLFDR Sp8yrtxry11SNJeJnKxoCtAoQ AvD_BwE
Gaussmeter	Apex Magnesy	GMHT201	https://www.apexmagnets.com/magnets/accessories/ht-digital-gaussmeter-with-peak-hold-can-display-gauss-or-tesla
Naczynie szklane (fantomowe)	Ace Glass	8648-24	https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
Poduszka grzewcza	Office Depot	9206211	Pure Enrichment PureRelief Express Designer Series Poduszka grzewcza 12 x 15 Palm Aqua - Office Depot
Hiperpolaryzator	Polarean	9820	https://polarean.com/xenon-mri-platform/
Płyta do intubacji	Hallowell EMC	000A3467	https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/
Materiały do intubacji	Lista części opublikowana gdzie indziej	NA	https://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
Cylinder ksenonowy wzbogacony izotopowo	Izotopy Linde	XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZ	NA
Ciekły azot	Linde	NI LC160-22	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid _lc160_22_psi_ni_lc160_22 /ni-LC160-22?cat_id=sklep& node=b89
Męski poślizg luer	Cole-Parmer	UX-21943-27	https://www.coleparmer.com/i/diba-omnifit-t-series-solvent-waste-cap-adapter-polypropylene-male-luer-slip-x-1-16-id-hose-barb-5-pk/2194327
Manometr	Grainger	3T294	https://www.grainger.com/product/3T294?gucid=N:N:PS: Płatne:GGL:CSM-2295:4P7A1P: 20501231& _source=1& gclid =CjwKCAiAi6uvBhADEiwAWiyR dltxrPJmmcm0bFiYLuPrB25HV QFdEfKMBqvgJBNdQUs3DZ7b TLr8CRoCanAQAvD_BwE& gclsrc=aw.ds
Wentylator Minivent	harvard apparatus	73-0044	https://www.harvardapparatus.com/minivent-ventilator-for-mice-single-animal-volume-controlled-ventilators.html
Dziurkacz do uszu myszy	fisher scientific	13-812-201	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-animal-ear-tag-punch/13812201
Depresor języka myszy	Narzędzia medyczne	VRI-617	https://medical-tools.com/shop/rodent-tongue-depressor.html
Waga dla myszy	Cole-Parmer	UX-11712-12	https://www.coleparmer.com/i/adam-equipment-cqt2000-core-portable-balance-2000g-x-1g-220-v/1171212?PubID=UX&persist=true&ip=no& _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7iYnAG5Ilc Z5DZWrdJ6wcLDZSCSfNJHOH m2PQOpyyWe0TjFa75R3tBoCjB sQAvD_BwE
Skaner MRI	System poziomy Bruker	7T Biospec	https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/preclinical-imaging/mri/biospec.html
Multimetr	Home Depot	1007898529	https://www.homedepot.com/p/Klein-Tools-600-Volt-Digital-Multi-Meter-Manual-Ranging-MM325/320822947
Naturalna obfitość ksenonu	Izotopy Linde	Igła UN 2036	NA
	fisher scientific	305194	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-precisionglide-hypodermic-needles-20/148266C?keyword=true
Bezpieczny uchwyt na strzykawkę	fisher scientific	NC2703873	https://www.fishersci.com/shop/products/ndlsafe-ii-syr-uncap-deca/NC2703873#?keyword=needlesafe
Butla z azotem	Linde	NI MK	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_nf_k/ni-m-k?cat_id=shop&node=b89
Butla tlenowa	Linde	OX M-K	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/oxygen_o2_oxygen_usp_k/ox-m-k?cat_id=shop&node=b90
Czujnik tlenu	Apogee instruments	MO-200	https://www.apogeeinstruments.com/mo-200-oxygen-sensor-with-handheld-meter/
Czujnik tlenu inline flowhead	Apogee instruments	AO-002	https://www.apogeeinstruments.com/ao-002-oxygen-meter-sensor-flow-through-head/
Zawór PEEP	Hallowell EMC	000A6556A	https://hallowell.com/product/adjustable-peep-valve-with-exhaust-port-range-5-20cm-disposable/
Końcówki do pipet	fisher scientific	Numer katalogowy.02-707-108	Fisherbrand Rack-Stack Oszczędzające miejsce końcówki: 101-1000 L standard; Niebieski; Objętość: |
Zawór nurnikowy Fisher Scientific	Ace glass	8648-20	https://www.aceglass.com/results.php?t=8648
Cewka przedkliniczna	Doty scientific	na zamówienie	https://dotynmr.com/products/bmax-xy-low-e/
Regulatory ciśnienia	Cole-Parmer	UX-98202-11	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-single-stage-regulator-1500-scfh-capacity-346-cga-fitting/9820211?PubID=UX&persist=true&ip=no& _source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7pruR xCAiaj52nA_8Y1nveQZRsD6B f0QO65o2DKFYqRoz0PopSkX QxoCxqcQAvD_BwE
Wentylator spadkowy	Lista części opublikowana gdzie indziej	NA	https://sites.duke.edu/driehuyslab/resources/
rura PVC do fantomowego	Home Depot	193682	https://www.homedepot.com/p/IPEX-1-2-in-x-10-ft-White-PVC-SCH-40-Potable-Pressure-Water-Pipe-30-05010HD/319692959
System ogrzewania zwierząt SAI	SAII	Model 1030	https://i4sa.com/product/model-1030-monitoring-gating-system/
Saline	Farris Laboratories Inc.	0409488820-1	https://www.farrislabs.com/products/bacteriostatic-sodium-chloride-0-9-30ml-bottle?variant=42807174824167¤cy =USD& utm_medium=product_ synchronizacja& utm_source=Google& utm_ content=sag_organic& utm_ kampania=sag_organic& utm_ kampania=gs-2021-09-24& utm _source=google& utm_medium =smart_campaign& _source =1& gclid=CjwKCAiA6KWvBh AREiwAFPZM7oS3-hFDETO_2f6OWOoKyBMb WuDuWqYxdWRYUWEkY M2Py73VfGzVtRoC2FQQAvD_BwE
Pojemnik na ostre przedmioty	fisher scientific	22-730-455	https://www.fishersci.com/shop/products/sharps-container-47/p-7250579#?keyword=needle%20safe
Silikonowa żywica epoksydowa	Grainger	3KMY7	https://www.grainger.com/product/3KMY7?gucid=N:N:PS:Paid:GGL:CSM- 2295:4P7A1P:20501231& _ źródło=1& gclid=CjwKCAiA6KW vBhAREiwAFPZM7voahkm8tda t1Euql1A8DFhC6AZVJ0wXzCE PfE6iUzrIJXV-Hl8o4xoCQLYQA vD_BwE& gclsrc=aw.ds
Silikonowy smar antyadhezyjny do form	Grainger	19MW95	https://www.grainger.com/product/CRC-Mold-Release-Agent-16-oz-19MW95
Spirometr	ADInstruments	FE141	https://www.adinstruments.com/products/spirometer
Spirometr - mysz flowhead	ADInstruments	MLT1L	https://www.adinstruments.com/products/respiratory-flow-heads
Rurka - 1/4 OD	Clippard	URH1-0402-CLT-050	https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050
Rurka - 1/8 OD	Clippard	URH1-0804-CLT-050	https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050
Pompa próżniowa	Cole-Parmer	UX-60062-11	https://www.coleparmer.com/i/environmental-express-diaphragm-pump-high-volume-120v/6006211?PubID=UX&persist=true&ip=no& _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7uFGwmW pRelHNFgZVvJJV09vDUVyfyG HoKeZTiFNIiVTe-05IpJJPxoCO PoQAvD_BwE
Przewód - Digikey 18 gauge		2328-18H240-ND	https://www.digikey.com/en/products/detail/remington-industries/18H240/15202027?s=N4 IgjCBcoOwBxVAYygMwIYBsDOB TANCAPZQDa4YATPAGwgC6h ADgC5QgDKLATgJYB2AcxAB fQmAAMAFkqIQKSBhwFiZEA GZNATi0SGzNpE48BwsSErqw 6uQqV5CJSOQCsMF%2Bq11 GIVuy58QqLmss4gALbogvy4L AAEAO683LgMIkA
Stacja pomiaru polaryzacji ksenonowej	Polarean	NA	https://polarean.com/xenon-mri-platform/

.