Artykuł metodologiczny

Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

1 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje użycie technologii kodów kreskowych DNA do uwierzytelniania materiałów leczniczych pochodzenia roślinnego, oraz rośliny leczniczej Angelica sinensis (Oliv.) Jako przykład wskazano Diels.

Streszczenie

Rośliny lecznicze są cennymi zasobami na całym świecie i są używane na całym świecie do utrzymania zdrowia i leczenia chorób; jednak obecność zafałszowań hamuje ich rozwój. Barcoding DNA, technika identyfikacji gatunków za pomocą standardowych regionów DNA, ułatwia szybką i dokładną identyfikację tradycyjnych roślin leczniczych. Proces kodowania kreskowego DNA obejmuje sześć podstawowych kroków: 1) przetwarzanie roślin leczniczych, 2) ekstrakcję wysokiej jakości całkowitego DNA z roślin leczniczych metodą kolumny odśrodkowej, 3) amplifikację wewnętrznego transkrybowanego obszaru DNA 2 (ITS2) za pomocą uniwersalnych starterów roślin i przeprowadzenie sekwencjonowania Sangera, 4) sekwencję łączenia i wyrównywania w celu uzyskania sekwencji docelowej, 5) dopasowanie sekwencji kodu kreskowego do biblioteki kodów kreskowych w celu identyfikacji, 6) wyrównanie sekwencji, porównanie zmienności wewnątrzgatunkowej i międzygatunkowej, skonstruowanie filogenetycznego drzewa łączenia sąsiadów. Jak pokazano w wynikach, uniwersalny podkład może wzmocnić obszar docelowy. Podstawowe narzędzie do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST) pokazuje, że zidentyfikowany procent wynosił 100%, a drzewo łączące sąsiadów pokazuje, że sekwencje splicingu były zgrupowane z kladem A. sinensis OR879715.1, a wartość wsparcia kladu wynosi 100. Protokół ten stanowi odniesienie do stosowania technologii kodowania kreskowego DNA jako skutecznej metody identyfikacji roślin leczniczych i domieszek.

Wprowadzenie

Rośliny lecznicze mają szeroki zakres działania farmakologicznego i są ważnymi substancjami w leczeniu i zapobieganiu chorobom. Zapotrzebowanie rynku na rośliny lecznicze w ziołolecznictwie i produktach farmaceutycznych jest ogromne i wciąż rośnie. Wraz z rosnącym rynkiem roślin leczniczych problem zafałszowań utrudnił rozwój roślin leczniczych. Obecnie zafałszowanie roślin leczniczych cierpi z następujących powodów: 1) podobna morfologia roślin leczniczych utrudnia ich prawidłową identyfikację i zastosowanie1,2,3,4,5, 2) rosnący popyt na rośliny lecznicze doprowadził do niewystarczającej podaży na rynku6,7, 3) rośliny lecznicze są drogie i mają zmienne ceny, a stosowanie tanich ziół zamiast ekonomicznie wartościowych materiałów doprowadziło do fałszerstw i spekulacji rynkowych8,9. Aby rozwiązać problemy związane z prawidłową identyfikacją i stosowaniem roślin leczniczych, potrzebna jest technologia, która pozwoli osobom niebędącym specjalistami zidentyfikować źródło10.

Istnieją ograniczenia w prawidłowym rozpoznawaniu i używaniu roślin leczniczych na podstawie samego wyglądu i zapachu11. W celu dokładniejszej identyfikacji i kontroli jakości stosuje się metody fizykochemiczne12. Na przykład chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szybką metodą identyfikacji ziół leczniczych i jest zawarta w Farmakopei Chińskiej. Niemniej jednak wymaga standardów referencyjnych do identyfikacji roślin13. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może wykonywać zarówno testy jakościowe, jak i ilościowe, dzięki czemu nadaje się do testowania jakości leków. Jednak ten instrument jest drogi i wymaga specjalistycznej wiedzy do obsługi14,15. Technologia kodów kreskowych DNA to szybka i dokładna technologia identyfikacji gatunków, która identyfikuje gatunki przy użyciu stabilnych sekwencji DNA do różnicowania roślin o podobnej morfologii. Hebert i in. zaproponowali technologię kodowania kreskowego DNA do identyfikacji gatunków, która wykorzystuje uznaną i stosunkowo krótką sekwencję DNA w obrębie genome16, Chen i in. zaproponowali ITS2 jako uniwersalną sekwencję do identyfikacji molekularnej roślin leczniczych i zidentyfikowali ponad 6600 roślin i stwierdzili wysoką zdolność identyfikacji17. Badania roślin leczniczych w oparciu o ITS2 i fragmenty genów chloroplastów wykazały zdolność do rozróżniania gatunków na poziomie gatunku, z zastosowaniami w dziedzinie ochrony zasobów, regulacji rynku i handlu międzynarodowego17,18,19. Zastosowanie kreskowego kodowania DNA może przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych metod identyfikacji, co jest pomocne w zapewnieniu jakości i bezpieczeństwa roślin leczniczych, zapobiegając nadużyciom zasobów i zamieszaniu20. Okazał się korzystny dla badania roślin leczniczych, wspierając rozwój przemysłu zielarskiego w zrównoważony sposób i dając gwarancję, że konsument używa właściwych leków21,22,23,24.

Artykuł przedstawia protokoły stosowania kodów kreskowych DNA do identyfikacji roślin leczniczych na przykładzie A. sinensis. Barkodowanie DNA wykorzystuje jeden lub więcej standaryzowanych krótkich markerów genetycznych w DNA organizmu, aby rozpoznać go jako należący do określonego gatunku. Obecne metody identyfikacji roślin leczniczych mają pewne ograniczenia. Tradycyjna identyfikacja morfologiczna opiera się w dużej mierze na rozległym doświadczeniu ekspertów, na które mogą mieć wpływ czynniki ludzkie, podczas gdy identyfikacja chemiczna jest podatna na problemy, takie jak zafałszowanie kluczowych związków. W przeciwieństwie do tego, kodowanie kreskowe DNA zapewnia dokładniejszy sposób identyfikacji gatunków, oferując takie korzyści, jak szybkość, wysoka odtwarzalność i stabilność. Co więcej, technologia ta umożliwia scentralizowane zarządzanie i udostępnianie istniejących danych sekwencji gatunków za pośrednictwem Internetu i platform informacyjnych, znacznie poprawiając wydajność i niezawodność identyfikacji gatunków11,12. Ze względu na podobną morfologię i części lecznicze, A. sinensis jest często mylony z innymi gatunkami i często jest nadużywany lub celowo zastępowany na rynku25. Yang i in. zidentyfikowali A. anomala za pomocą kodu kreskowego DNA, aby odróżnić ją od fałszywych leków26. Yuan i in. zebrali 23 gatunki arcydzięgla i użyli kodu kreskowego DNA, aby rozróżnić różne gatunki27. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, użytkownicy będą mogli uwierzytelnić roślinne materiały lecznicze od wstępnego przetwarzania do ostatecznego dopasowania sekwencji kodów kreskowych do bazy danych kodów kreskowych (Rysunek 1).

Protokół

1. Przygotowanie próbki

  1. W niniejszym badaniu jako materiał doświadczalny wykorzystano dwuletnią A. sinensis o niskiej temperaturze i długim nasłonecznieniu na wysokości 2800 m n.p.m. z hrabstwa Min w prowincji Gansu. Wybrano trzy rośliny, z których do eksperymentów wybrano więcej niż trzy korzenie. Najpierw opłucz korzenie wysterylizowaną wodą, a następnie wyczyść je rozpylaczem nasączonym alkoholem lub wacikami nasączonymi alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu, które mogłoby wpłynąć na dokładność wyników eksperymentów. Pokrój korzenie na kawałki mniejsze niż 5 mm za pomocą wysterylizowanego skalpela i wymieszaj do dalszej analizy. (Rysunek 2).
    UWAGA: Alternatywnie umieść korzenie w ciekłym azocie, aby się schrupły, co ułatwi ich łamanie. W zależności od kształtu, twardości i innych cech roślin leczniczych, użyj narzędzi, aby sobie z nimi poradzić.
  2. Przygotuj trzy probówki z próbkami eksperymentalnymi do równoległych eksperymentów. Oznacz każdą próbkę jako AS-1, AS-2 i AS-3. Weź około 100 mg świeżej lub 20 mg suchej masy tkanki (suszonej na powietrzu) i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
  3. Umieść dwa koraliki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml. Przenieś probówki do wysokowydajnej rozdrabniacza do tkanek pracującego z częstotliwością 60 Hz przez 60 s.

2 Ekstrakcja DNA z próbki

UWAGA: W tym badaniu użyto zestawu do ekstrakcji DNA genomu roślinnego, który jest oparty na metodzie CCAB. Ekstrakcja DNA odbywa się zgodnie z instrukcją obsługi z pewnymi modyfikacjami, w tym dodaniem unikalnego buforu do izolacji jądrowej (NIB). Protokół poprawia czystość DNA, najpierw oddzielając zanieczyszczenia od tkanki, a następnie dodając początkowy etap izolacji jąder28,29,30.

  1. Dodać 800 μl wstępnie schłodzonego NIB i umieścić próbkę w mieszalniku wirowym, wibrując przez 5 minut.
  2. Umieścić w wirówce i przetwarzać w temperaturze 13 780 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.
  3. Powtórz kroki 2.1-2.2 przez dodatkowe 3 rundy.
    UWAGA: NIB ekstrahuje DNA wyższej jakości, a jego preparat zawiera pewne niebezpieczne substancje chemiczne, z którymi należy obchodzić się w dygestorium, co utrudnia obsługę nowicjuszom. Ten krok nie jest jednak obowiązkowy. Użytkownicy mogą zdecydować się na zastosowanie się do tego zalecenia lub pominąć te kroki. Jego szczegółowy wzór znajduje się w tabeli 1.
  4. Dodać 600 μl buforu P1 i 5 μl RNazy A (10 mg/ml). Umieścić próbkę w mieszalniku wirowym i wirować do wymieszania. Próbki inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez 1,5 godziny, odwracając probówki 2x3x podczas inkubacji.
  5. Dodać 200 μl buforu P2, dokładnie wymieszać, umieścić na lodzie na 15 min, a następnie odwirować przy 13 780 x g przez 10 min.
  6. Ostrożnie zassać supernatant do kolumny filtracyjnej AF, odwirować przy 13 780 x g przez 2 minuty i przenieść dolny filtrat zebrany w probówce zbiorczej do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  7. Obliczyć objętość filtratu, dodać 1,5 raza objętość P3 i natychmiast wstrząsnąć, aby uzyskać mieszany roztwór.
  8. Dodać 650 μl przygotowanej mieszaniny do kolumny adsorpcyjnej kolumny adsorpcyjnej (AC) i inkubować przez 5 minut, a następnie odwirować przy 13,780 x g przez 30-60 s.
  9. Dodać filtrat otrzymany w kroku 2.8 ponownie do prądu przemiennego, odwirować i wyrzucić odpad płynny. Powtórz procedurę z pozostałym zmieszanym roztworem z kroku 2.7.
  10. Dodać 600 μl roztworu płuczącego WB, odwirować przy 13,780 x g przez 30 s, wyrzucić roztwór odpadowy i powtórzyć procedurę 1x.
  11. Umieścić kolumnę AC z powrotem w pustej probówce zbiorczej, odwirować przy 13 780 x g przez 2 minuty i pozostawić w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości etanolu.
  12. Weź kolumnę adsorpcyjną AC i umieść ją w czystej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 45 μl wysterylizowanej wody dejonizowanej (ddH2O) do środka membrany adsorbcyjnej, która została podgrzana do 65 °C. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Wirować przy 13 780 x g przez 2 min.
  13. Dodać otrzymany roztwór z powrotem do kolumny i odwirować przy 13,780 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  14. Zebrać przefiltrowany roztwór. Użyj spektrofotometru, aby określić stężenie DNA; OD260 reprezentuje absorbancję kwasów nukleinowych. Zastosuj następujące kryteria oznaczania standardu jakości DNA: OD260 / OD280 = 1,80-2,00, normalny zakres; OD260/OD280>2.00; występuje duża ilość zanieczyszczenia RNA; OD260/OD280<1,80, są białka, fenole i inne zanieczyszczenia.

3 Wzmocnienie i wykrywanie fragmentów celu

UWAGA: Wybierz odpowiednie startery do amplifikacji na podstawie proponowanych regionów kodowania kreskowego DNA rośliny; warunki reakcji są pokazane w Tabeli 2.

  1. Ustawić warunki reakcji odpowiadające amplifikacji startera. Użyj 0,2 ml probówek wirówkowych wypełnionych 9,5 μl ddH2O, 12,5 μl 2x PCR Master Mix i po 1 μl startera do przodu, startera wstecznego i matrycy DNA o całkowitej objętości 25 μl. Przygotować kontrolę ujemną, zastępując szablon wodą.
  2. Dodaj 20 ml 1x buforu Tris Acetate-EDTA (TEA) i 0,2 g agarozy do podgrzania i przygotowania 1% żelu agarozowego, następnie dodaj 2 μl barwnika z żelu kwasu nukleinowego (10 000x) i dokładnie wymieszaj. Wlej mieszaninę do tacki do odlewania żelu i pozwól jej zestalić się, aby uzyskać żel agarozowy. Do żelu dodać 3 μl produktu PCR i 2 μl markera DNA 5000 pz.
  3. Ustaw napięcie na 120 V, prąd na 400 mA i elektroforezę na 40 minut. Użyj wszechstronnego systemu analizy obrazu żelu, aby wyświetlić żele i sprawdzić wyniki.

4. Zbieranie i analiza danych

UWAGA: Istnieje szeroki wybór oprogramowania do montażu i analizy sekwencji; używamy Codon code aligner V11.0.1 i MEGA11 jako przykładów do ilustracji.

  1. Użyj wyrównywacza, aby otworzyć plik sekwencjonowania, aby obserwować mapę pików i łączyć pliki map pików sekwencjonowania dwukierunkowego.
    1. Wybierz pozycję Utwórz nowy projekt i kliknij przycisk OK, aby przejść do strony głównej oprogramowania. Wybierz opcję Dodaj próbki w menu Plik, wybierz plik do przetworzenia w formacie śledzenia sekwencji i zaimportuj go bezpośrednio do oprogramowania jako zaimportowany plik w sekcji Niezmontowane próbki.
    2. Wybierz pozycję Contig, a następnie w sekcji wybierz pozycję Zestaw zaawansowany, a następnie wybierz pozycję Złóż w grupach. Nowi użytkownicy, po wybraniu opcji Złóż w grupach, zobaczą to okno dialogowe: Wybierz pozycję Definiuj nazwy. Zmodyfikuj części Zdefiniuj nazwę próbki zgodnie z nazwą pliku i kliknij Złóż. Zostanie wyświetlona wyrównana sekwencja.
    3. Pobierz pełne sekwencje ITS2 zgodnie z analizą modelu opartego na ukrytym modelu Markowa (HMM). Użyj sekwencji 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) i 28s (CGACCCCAGGTCAGGGGGGGGCCACC) sekwencji31, aby przeszukać wyrównaną sekwencję od początku i usunąć regiony 5.8s i 28s.
    4. Wybierz pozycję Przejdź, a następnie w sekcji wybierz pozycję Sekwencja wyszukiwania i kliknij przycisk OK, aby uzyskać pasującą sekwencję. Wybierz Contig, wybierz Usuń w sekcji, aby usunąć regiony 5.8s i 28s oraz sekwencje o niskiej jakości, a następnie oprogramowanie wyświetli sekwencje łączenia do dopasowania.
  2. Użyj sekwencji splicingu uzyskanych z trzech równoległych etapów eksperymentalnych do identyfikacji, wybierz wyszukiwanie BLAST przy użyciu bazy danych nukleotydów w The National Center for Biotechnology Information (NCBI) i wybierz narzędzie do identyfikacji gatunków i specyficzny starter ITS2 odpowiadające w bazie danych Globalnej Bazy Danych Genomu Farmakopei (GPGD).
    UWAGA: NCBI32 i GPGD33 zawierają sekwencje nukleotydowe roślin leczniczych i zwierząt i są uznawane za autorytatywne bazy danych. Ich głównymi metodami identyfikacji są metody oparte na porównaniu sekwencji34 (BLAST). Procentowa identyczność z wyników identyczności służy do określenia, czy gatunek o największym podobieństwie jest rodzajem docelowym.
  3. Użyj MEGA11 do wyrównania sekwencji, analizuj i porównuj wewnątrzgatunkową i międzygatunkową zmienność sekwencji oraz skonstruuj filogenetyczne drzewo łączące sąsiadów.
    1. Pobierz sekwencje trzech gatunków arcydzięgla i jednego gatunku Peucedanum praeruptorum jako grupy zewnętrznej z NCBI. Przeanalizuj te sekwencje wraz z uzyskaną sekwencją wyników.
    2. Kliknij Plik, wybierz Otwórz plik/sesję, aby zaimportować plik, a pojawi się okno dialogowe. Wybierz opcję Align > DNA i wybierz opcję Align by ClustalW, aby porównać sekwencje. Wybierz opcję Analiza filogenetyczna w obszarze Dane, a następnie wróć do strony głównej. Kliknij opcję Zbuduj/Przetestuj drzewo łączenia sąsiadów w FLOGENEZIE. Oprogramowanie generuje drzewo filogenetyczne.

Wyniki

Jakość próbki DNA

Zakres stosunków absorbancji OD260/OD280 wynosił 1,80-1,84. Ilość DNA zmierzona spektrofotometrycznie dla każdej próbki przekraczała 100 ng/µL (Tabela 3), co wskazuje na wysoką jakość ekstrakcji DNA z próbek. Świadczy to o braku zanieczyszczeń białkami, RNA lub odczynnikami podczas procesu ekstrakcji oraz o dobrej jakości i przydatności próbek do dalszej amplifikacji PCR.

Analiza PCR

Przeprowadzono elektroforezę żelową produktów PCR trzech równoległych próbek eksperymentalnych. Układ był następujący: marker, próbki 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) oraz kontrola negatywna (0), jak pokazano na Rysunku 3. Wielkości AS-1, AS-2 i AS-3 wynoszą wszystkie około 500 bp, z pojedynczymi, jasnymi i wyraźnymi prążkami, natomiast w próbce 0 nie stwierdzono obecności prążków, co wskazuje na amplifikację wyekstrahowanego DNA do 500 bp przy użyciu starterów ITS2.

Porównanie wyników sekwencjonowania w bazie danych

Wyniki sekwencjonowania zidentyfikowały A. sinensis ze 100% podobieństwem sekwencji poprzez połączenie wyników identyfikacji BLAST z bazy danych NCBI, co jest zgodne z wynikami identyfikacji gatunkowej z bazy danych GPGD (Tabela 4). Wynik BLAST określono na podstawie najwyższej wartości procentowej tożsamości oraz najniższej wartości e-value. Identyfikację gatunkową uznano za pomyślną, gdy najwyższa maksymalna wartość procentowa tożsamości obejmowała jeden gatunek i wynosiła >99%. Jeśli wynik wynosi ≤ 99%, należy sprawdzić jakość pliku sekwencjonowania lub zweryfikować, czy produkt PCR nie jest zanieczyszczony.

Analiza identyfikacji gatunków w oparciu o drzewo filogenetyczne

Wyniki wykazały, że na skonstruowanym drzewie filogenetycznym NJ wszystkie cztery gatunki zostały zgrupowane w osobnych kladach, a P. praeruptorum jako grupa zewnętrzna została oddzielona od kladów Angelica. Sekwencje Splicing zostały zgrupowane z kladem A. sinensis OR879715.1, a wartość wsparcia kladu (bootstrap) wyniosła 100; dwa pozostałe gatunki, A. dahurica oraz A. cartilaginomarginata, zostały zgrupowane w osobnych kladach, co dowiodło, że sekwencje Splicing należą do A. sinensis (Rysunek 4).

Schemat procesu sekwencjonowania DNA: ekstrakcja, amplifikacja, dopasowanie do bazy danych, analiza filogenetyczna.
Rysunek 1: Schemat identyfikacji gatunków roślin leczniczych. (A) Obróbka rośliny, ekstrakcja DNA i sekwencjonowanie rośliny leczniczej, (B) porównanie sekwencji gatunkowych z wykorzystaniem baz danych oraz (C) zastosowanie drzew filogenetycznych do walidacji taksonomicznej w celu potwierdzenia relacji filogenetycznych między gatunkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kroki procesu ekstrakcji DNA, konfiguracja urządzenia do PCR, analiza elektroforetyczna, wykres wyników sekwencjonowania.
Rysunek 2: Schemat ekstrakcji DNA z roślin leczniczych. (A) Ekstrakcja DNA z roślin leczniczych obejmuje łącznie 6 etapów. (B) Amplifikacja w urządzeniu do PCR i proces cykli PCR. (C) Elektroforeza. (D) Sekwencjonowanie metodą Sangera i chromatogram sekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wynik elektroforezy w żelu agarozowym; drabina wielkości prążków DNA; wykres porównawczy masy cząsteczkowej.
Rysunek 3: Elektroforeza żelowa Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Przy użyciu markera DNA DL5000 jako markera cząsteczkowego, próbkami były AS-1, AS-2 i AS-3, a grupą kontrolną była próba 0. Przeprowadzono elektroforezę żelową, a wyniki wykazały, że w próbkach AS-1, AS-2 i AS-3 pojawiły się prążki o wielkości 500 bp, natomiast w kontroli nie zaobserwowano prążków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat drzewa filogenetycznego; relacje między gatunkami; analiza sekwencji genetycznych; badanie ewolucyjne.
Rycina 4: Drzewo filogenetyczne zbudowane metodą Neighbor-Joining na podstawie 13 sekwencji. Łącznie 10 sekwencji z czterech gatunków roślin pobrano z bazy danych NCBI, a następnie porównano sekwencje Splicing w celu analizy i porównania zmienności sekwencji wewnątrzgatunkowej i międzygatunkowej oraz w celu konstrukcji drzew filogenetycznych metodą neighbor-joining. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa materiału/sprzętudawka
Poliwinylo-pirolidon10 g
Tris-HCl1 M  50 mL
Kwas etylenodiaminotetraoctowy0.5 M 20 mL
NaCl20.45 g
β-merkaptoetanol10 mL
sterylizowana woda dejonizowana500 mL

Tabela 1: Odczynniki do przygotowania buforu do izolacji jąder.

Kod kreskowyStarterSekwencja startera (5'-3')Sekwencjonowanie amplifikacji PCR
ITS2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 min
94°C30 s40 cykli
56°C30 s
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45 s
72°C10 min

Tabela 2: Primery do kodowania DNA i warunki reakcji PCR.

próbkiEkstrakcja DNA (ng/µL)OD260/OD280
AS-11241.84
AS-21841.81
AS-31641.82

Tabela 3: Jakość wyekstrahowanego DNA z Angelica sinensis (Oliv.) Diels.

PróbkiDługość sekwencji dopasowanej (bp)Długość sekwencji splicingowej (bp)GC(%)NCBI:procentowa tożsamość BLAST (%)GPGD: Procentowa identyfikacja gatunków (%)
AS-1500 bp229 bp55.50%100%100%
AS-2504 bp229 bp55.50%100%100%
AS-3499 bp229 pz55.50%100%100%

Tabela 4: Porównanie wyników sekwencjonowania w bazie danych.

Dyskusja

Technologia identyfikacji molekularnej jest łatwiejsza do nauczenia i opanowania niż tradycyjne metody identyfikacji. Przezwycięża ograniczenia tradycyjnej identyfikacji ziół leczniczych, ponieważ nie ma na nią wpływu faza wzrostu rośliny i nie opiera się na subiektywnej ocenie ani akumulacji specjalistycznej wiedzy35. Inne gatunki są mylone z A. sinensis ze względu na podobną morfologię i części lecznicze, ale dzięki zastosowaniu kodów kreskowych DNA można go ostatecznie zidentyfikować36.

Kluczowe kroki w tym protokole obejmują kilka krytycznych kwestii. Po pierwsze, unikanie zanieczyszczenia podczas obchodzenia się z ziołami i ekstrakcji DNA jest niezbędne, aby zapobiec pogorszeniu wyników przez obce DNA lub zanieczyszczenia. Właściwe czyszczenie próbek jest konieczne w celu usunięcia zanieczyszczeń zewnętrznych, podczas gdy dokładne sproszkowanie usprawnia ekstrakcję DNA poprzez zwiększenie powierzchni interakcji odczynników. Ważne jest również, aby użyć odpowiedniej ilości próbki, aby zapewnić skuteczne wymieszanie z odczynnikami, co pozwala na lepszą cytolizę i uwolnienie DNA. Wreszcie, kontrolowanie czasu kąpieli wodnej ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierne ogrzewanie może prowadzić do degradacji DNA, wpływając na jakość wyekstrahowanego DNA. Razem te kroki zapewniają pomyślną ekstrakcję wysokiej jakości DNA do analizy.

Rośliny lecznicze zawierają polisacharydy i polifenole, które wpływają na ekstrakcję i amplifikację DNA. Zastosowanie buforu do izolacji jądrowej zmniejsza działanie tych substancji i umożliwia lizę jąder, co skutkuje lepszą ekstrakcją gDNA o wysokiej czystości 28,29,30. Obecnie istnieją trzy podstawowe metody ekstrakcji DNA: metoda kolumny odśrodkowej, metoda CTAB i metoda SDS. Jednak w tym badaniu wybrano do eksperymentów metodę kolumny odśrodkowej ze względu na jej stabilność, prostotę, wydajność i zdolność do ekstrakcji wysokich stężeń DNA37, a ogrzewanie buforu elucyjnego może pomóc w elucji DNA o lepszej jakości. W tym badaniu wybrano starteryspecyficzne dla ITS2 17,38, krótka sekwencja ITS2 służy jako wydajny znacznik sekwencji taksonomicznej w porównaniu z innymi starterami39, które mają wysoką zmienność międzygatunkową i szerszy zakres identyfikacji. Możliwą przyczyną niepowodzenia amplifikacji jest degradacja DNA w niektórych próbkach; inną możliwością jest to, że zastosowana para uniwersalnych starterów ITS2 może nie działać dla niektórych gatunków lub przy użyciu alternatywnego zestawu uniwersalnych starterów40. Wynik BLAST został określony przy użyciu najwyższego procentowego wyniku tożsamości i najniższej wartości e. Identyfikacja gatunku została uznana za udaną, gdy najwyższy maksymalny procent tożsamości obejmował pojedynczy gatunek i uzyskał wynik >99%40,41, dla wyniku ≤99%, sprawdzając jakość pliku sekwencjonowania lub to, czy produkt PCR jest zanieczyszczony.

Podsumowując, kodowanie kreskowe DNA powinno odgrywać kluczową rolę w kontroli jakości tradycyjnego ziołolecznictwa i międzynarodowego handlu ziołami. Niniejszy artykuł zawiera kilka informacji na temat ekstrakcji DNA roślin oraz szczegółowy przewodnik na temat korzystania z technologii kodów kreskowych DNA do identyfikacji roślin leczniczych. Podkreśla kluczowe punkty, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu eksperymentalnego. W związku z tym niniejszy artykuł zawiera odniesienia do podstawowej identyfikacji ziół i pomaga większej liczbie osób szybko opanować tę technologię. Jednak w szczególnych przypadkach, gdy skuteczność identyfikacji kodów kreskowych w jednym miejscu jest niewystarczająca, zależy to od biblioteki referencyjnej. Skonstruowanie biblioteki referencyjnej o dużym pokryciu gatunkowym byłoby ważnym krokiem w kierunku identyfikacji gatunków za pomocą kodów kreskowych DNA42, a wielu badaczy zaproponowało, że technologia kodów kreskowych z wieloma miejscami może poprawić wydajność43,44. Ponadto, wraz z rozwojem technologii molekularnej, Zheng i in. połączyli technologię kodowania kreskowego DNA z izotermiczną technologią amplifikacji DNA i wykrywaniem RPA-LFD w celu szybkiego uwierzytelnienia trujących roślin45, a także opracowano kilka gotowych zestawów46. Baza danych kodów kreskowych DNA jest stale ulepszana, co odgrywa ważną rolę w promowaniu uogólnienia, standaryzacji i internacjonalizacji metod identyfikacji ziołolecznictwa.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez projekt dotowania Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (030040015).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do szybkiej ekstrakcji genomowego DNA roślin CTABShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MNadaje się do szybkiej ekstrakcji wysokiej jakości genomowego DNA z różnych tkanek szerokiej gamy roślin
Marker DNA DL5000Nanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Produkt gotowy do użycia, odpowiednią ilość tego produktu należy pobrać bezpośrednio do elektroforezy podczas uruchamiania żelu.
ElektroforezaBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CZastosuj konstrukcję ekranu dotykowego, może wyświetlać ustawione napięcie, ustawiać prąd w tym samym czasie, wyjście równoległe
Kwas etylenodiaminotetraoctowyBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100GOdczynniki do tworzenia izolacji jądrowej
Goldview Barwnik żelu kwasu nukleinowego (10 000 razy)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03Podczas stosowania elektroforezy w żelu agarozowym do wykrywania DNA, wiąże się on z DNA i wytwarza silny sygnał fluorescencyjny.
Szybkoobrotowa wirówka stołowaChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650Ta kompaktowa i lekka wirówka zapewnia szybkie i wydajne oddzielanie próbek, zapewniając niezawodne bezpieczeństwo
Wysokowydajna szlifierka do tkanekShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48Przyrząd wibracyjny o wysokiej częstotliwości do mielenia próbek
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese MedicalSciences-Baza danych HerbGenomics zawiera sekwencje genomu, zestawy genów, genomy organelli, dane genomu o niskim pokryciu i sekwencje kodów kreskowych DNA.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Amerykańska Narodowa Biblioteka Medyczna–Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej rozwija naukę i zdrowie, zapewniając dostęp do informacji biomedycznych i genomicznych.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Szybkie mieszanie w postaci wiru o dużej prędkości, szybkość mieszania, jednorodność, dokładność
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BZastosowanie zaawansowanej technologii chłodzenia termoelektrycznego i nowo utworzonej technologii TAS w celu zwiększenia jej ogólnej wydajności
Wielofunkcyjny system analizy obrazu żeluPołudniowo-zachodnie centrum operacyjne Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Przeprowadza szybkie eksperymenty z amplifikacją genów z funkcją gradientu do mapowania warunków amplifikacji i gradientowym zakresem temperatur do 30° C
NaClPekin Solarbio Science& Technologia Co., Sp. z o.o.S8210-100Odczynniki do tworzenia do izolacji jądrowej
Nanodrop OneGens Sp. z o.o.ND ONEIlościowa identyfikacja próbek DNA, RNA i białek w ciągu kilku sekund za pomocą zaledwie 1-2 &mikro; L próbki
PoliwinylopirolidonShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gOdczynniki do tworzenia do izolacji jądrowej.
Kostkarka do lodu w kształcie płatków śnieguShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XPrzyjęcie metody wytwarzania lodu do wytłaczania obrotowego, szybka prędkość wytwarzania lodu i wysoka wydajność produkcji lodu
Koraliki ze stali nierdzewnej do homogenizatora tkanekBeyotime Biotechnology. F6623Sprzęt do mielenia i mieszania tkanek i innych próbek za pomocą wibracji
Bufor Tris Acetate-EDTABeyotime Biotech IncST716TAE jest powszechnie stosowanym buforem do elektroforezy DNA, często stosowanym w elektroforezie żelu agarozowego.
Tris-HClPekin Solarbio Science& Technologia Co., Sp. z o.o.Odczynniki do tworzenia buforu izolacji jądrowejT8230
Czajnik do kąpieli wodnejShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecyzyjny termostat i regulacja temperatury, dokładna i niezawodna kontrola temperatury
i beta;-merkaptoetanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml   Odczynniki do tworzenia do izolacji jądrowej
....

Bibliografia

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Identyfikacja roślin leczniczychidentyfikacja gatunkówekstrakcja DNAamplifikacja ITS2sekwencjonowanie metodą Sangeraelektroforeza w żeluwyszukiwanie BLASTdrzewo filogenetyczneprimery uniwersalne
Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.