Artykuł metodologiczny

Generowanie i charakterystyka organoidów macicy szczura z komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66928

⸱

2 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka endometrium szczurów (reESC), generując organoidy endometrialne szczurów. Metoda ta ułatwia badania in vitro chorób endometrium, umożliwiając edycję genów i inne manipulacje komórkowe.

Streszczenie

Organoidy endometrium dostarczają cennych informacji na temat rozwoju i patofizjologii chorób endometrium i służą jako platformy do testowania leków. Chociaż opracowano organoidy endometrialne u ludzi i myszy, badania nad organoidami endometrium szczurów pozostają ograniczone. Biorąc pod uwagę, że szczury mogą lepiej symulować niektóre patologie endometrium, takie jak zrosty wewnątrzmaciczne, badanie to miało na celu ustalenie organoidów endometrialnych szczurów. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura (reESC) oraz generowania organoidów endometrialnych szczurów. Korzystając z udoskonalonej pożywki ekspandującej reESC, udało nam się wyizolować i stabilnie rozprężyć reESC, demonstrując ich długoterminowy potencjał hodowlany. Organoidy wygenerowane za pomocą reESC wykazywały typowe cechy strukturalne i funkcjonalne endometrium, w tym reakcję hormonalną. Nasze wyniki wykazały, że organoidy endometrialne szczurów mogą być hodowane przez długi czas ze stabilną proliferacją, zachowując strukturę gruczołową, polaryzację komórek i cechy funkcjonalne nabłonka endometrium. Ten nowatorski model organoidów endometrialnych pochodzących od szczurów stanowi cenną platformę do badania chorób endometrium i testowania interwencji terapeutycznych, z potencjalnymi zastosowaniami u różnych gatunków ssaków.

Wprowadzenie

Endometrium, wszechstronna i regenerująca się tkanka w ludzkim ciele, ulega okresowemu złuszczaniu, regeneracji i różnicowaniu pod wpływem hormonów jajnikowych1. Nieprawidłowości w endometrium są związane z różnymi chorobami żeńskiego układu rozrodczego, takimi jak endometrioza, rak endometrium i niepłodność2. Brak wiarygodnych modeli badawczych dla endometrium utrudnia dogłębne badania patogenezy, diagnostyki klinicznej i leczenia tych chorób. Podczas gdy linie komórkowe i modele zwierzęce są powszechnie wykorzystywane do badań endometrium, wyzwania, takie jak niestabilność fenotypowa w liniach komórkowych, różnice międzygatunkowe w modelach zwierzęcych i inne ograniczenia, utrudniają odtworzenie złożonej struktury fizjologicznej i dynamicznych zmian funkcjonalnych w ludzkim endometrium3.

Organoidy to trójwymiarowe struktury utworzone przez hodowlę komórek macierzystych w środowisku pozakomórkowym, posiadające zdolność do samoodnowy i samoorganizacji. Mogą naśladować strukturę i funkcję fizjologicznych i patologicznych tkanek i są uznawane za przedkliniczne modele chorób człowieka4. W 2017 r. udało się zkonstruować organoidy endometrialne myszy i człowieka poprzez osadzenie rozdrobnionej wolnej tkanki endometrium uzyskanej w wyniku trawienia enzymatycznego w rusztowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie dodanie mieszaniny specyficznych czynników wzrostu i czynników sygnalizacyjnych do uprawy5. Wyniki wykazały, że organoidy endometrialne ex vivo wykazują długotrwałą i stabilną zdolność proliferacyjną, utrzymując strukturę gruczołową, polaryzację komórek i cechy funkcjonalne nabłonka endometrium, w tym wydzielanie śluzu i odpowiedź hormonalną6. Jednak hodowla ex vivo dorosłych komórek macierzystych tworzących organoidy endometrium wymaga wsparcia strukturalnego podobnego do gruczołu, co prowadzi do wyzwań, takich jak utrata łodygi i trudności w pasażowaniu7.

Obecnie, hodowla organoidów endometrialnych opiera się na metodzie hodowli trawienia bloków tkankowych. W poprzednim badaniu nasz zespół badawczy hodował ludzkie komórki macierzyste nabłonka endometrium przez dłuższy czas in vitro przy użyciu pierwotnej pożywki hodowlanej składającej się głównie z Y27632, którą wykorzystaliśmy do skonstruowania organoidów endometrialnych8. Opierając się na tym sukcesie, wyizolowaliśmy i wyhodowaliśmy komórki macierzyste nabłonka endometrium z tkanki endometrium szczura przy użyciu pożywki hodowlanej o niskiej cząsteczce, ustanawiając długoterminowy system hodowli in vitro. Ponadto wykorzystaliśmy komórki macierzyste nabłonka endometrium szczura (reESC) do wytworzenia organoidów endometrium szczura. Opracowanie tego modelu wzbogaci przyszłe badania in vitro i in vivo chorób związanych z endometrium w połączeniu z modelami szczurzymi.

Protokół

Sześć 7/8-tygodniowych samic szczurów rasy Sprague-Dawley o wadze 200-250 g zostało wykorzystanych w tej pracy. Szczury były trzymane w klimatyzowanym pomieszczeniu dla zwierząt z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi dotyczącymi Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną ds. eksperymentów na zwierzętach przy Komisji Etyki Badań Szpitala Ludowego w Meizhou.

Poniższa sekcja opisuje proces izolacji, pasmowania, zamrażania i rozmrażania komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura przy użyciu wyrafinowanego podłoża ekspansyjnego reESC (REEM) składającego się głównie z Y27632, A8301 i CHIR9902178,9. Formuła REEM oparta jest na bezsurowicowym DMEM/F12 wzbogaconym o określone stężenia kluczowych składników: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 i 0,5 μM A8301. Szczegółowe informacje na temat komponentów można znaleźć w Tabeli Materiałów. Po znieczuleniu szczurów inhalacją izofluranu, należy zastosować kolejne procedury przedstawione w Rysunek 1.

1. Zabieg chirurgiczny

  1. Znieczulić szczura przez inhalację izofluranu.
    1. Umieść szczury w komorze indukcyjnej wypełnionej 3-5% izofluranem zmieszanym z tlenem. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i utratę odruchu prostowania.
    2. Po znieczuleniu utrzymuj szczury poniżej 1-3% izofluranu przez stożek nosowy podczas zabiegu. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy szczur jest pod narkozą.
      UWAGA: Szczur jest znieczulany i umieszczany do operacji na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała i zapobiec hipotermii przez cały zabieg.
  2. Wykonaj niskie nacięcie linii środkowej brzucha, aby odsłonić rogi macicy.
    UWAGA: Obszar chirurgiczny szczura jest golony, a następnie kilkakrotnie dezynfekowany okrężnymi ruchami za pomocą roztworu do szorowania na bazie jodu lub chlorheksydyny, a następnie płukania alkoholem lub chusteczki w celu zapewnienia prawidłowej aseptyki. Zabieg chirurgiczny wykonywany jest przy użyciu sterylnych obłożeń umieszczonych pod i nad zwierzęciem, wraz ze sterylnymi gazikami 4×4, aby skutecznie izolować i utrzymywać sterylność wokół miejsca nacięcia.
  3. Wykonaj podłużne nacięcia po obu stronach macicy, aby odsłonić wewnętrzne endometrium. Użyj ostrza skalpela T10, aby zeskrobać endometrium, aż powierzchnia stanie się szorstka. Po zakończeniu zabiegu należy osobno zamknąć macicę i warstwę mięśni brzucha za pomocą wchłanialnych szwów monofilamentowych, aby zapewnić prawidłową odbudowę anatomiczną. Zamknij nacięcie skóry za pomocą niewchłanialnych szwów monofilamentowych lub sterylnych klipsów do ran, aby zabezpieczyć warstwę zewnętrzną.
  4. Po zabiegu chirurgicznym należy przenieść szczury do sterylnego i ciepłego obszaru rekonwalescencji o regulowanym poziomie temperatury i wilgotności i uważnie je monitorować, aż odzyskają pełną świadomość i będą mogły podeprzeć się w pozycji leżącej mostka. Trzymanie w grupach trzech szczurów pooperacyjnych oddzielnie w oddzielnych klatkach. Aby złagodzić ból pooperacyjny, podawaj opioidowe leki przeciwbólowe przez 48-72 godz.
    UWAGA: Buprenorfina (0,05–0,1 mg/kg) może być podawana podskórnie co 8 godzin w celu utrzymania skutecznej analgezji. Alternatywnie, pojedyncza dawka buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (0,5–1,2 mg/kg, podskórnie) może być stosowana w celu zapewnienia ciągłej analgezji przez 48–72 godzin.

2. Przetwarzanie tkanek

  1. Umieść wszystkie fragmenty endometrium macicy w naczyniu o średnicy 3,5 cm i umyj je 3x PBS.
  2. Wymieszać fragmenty błony śluzowej macicy z 3 ml 1% kolagenazy typu I (rozcieńczonej w 0,25% trypsyny/1 mM EDTA) w temperaturze 37 °C przez 60 min. Przefiltrować niestrawioną tkankę za pomocą sitka do komórek 100 μm w celu wyizolowania i zebrania filtratu do dalszej hodowli.
  3. Zebrane komórki należy umieścić na 12-dołkowych płytkach w pożywce REEM w celu dalszej hodowli. Obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do zasiania komórek w każdym dołku 12-dołkowej płytki, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek (zwykle ~1-2 × 105 komórek/dołek w 1,5 ml REEM).
  4. Umyj komórki zebrane w kroku 2.2 3x za pomocą PBS. Po wstępnym umyciu odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant; ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS zawierającym 1% BSA (albumina surowicy bydlęcej) w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania i inkubować przez 15-30 minut na lodzie.
  5. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla różnych markerów (patrz tabela materiałów) przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciała w PBS 1% BSA zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Po inkubacji przemyć komórki 2x PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 600 μl PBS z 1% BSA do analizy cytometrii przepływowej.
  7. Skonfiguruj instrument z laserami i filtrami odpowiednimi dla fluoroforów użytych w eksperymencie (np. FITC, PE, APC). Użyj ustawień rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby przebramować żywą, pojedynczą populację, z wyłączeniem szczątków i agregatów komórek. Skalibruj cytometr przepływowy za pomocą niezabarwionej kontrolki, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie. Ustaw określone bramki na podstawie niebarwionej kontroli, aby zdefiniować populacje dodatnie dla każdego markera zainteresowania (próg wynosi 0,02%).

3. Długoterminowa hodowla komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura

  1. Test tworzenia kolonii
    UWAGA: Test ten pomógł określić optymalną pożywkę dla reESC.
    1. Wysiewaj reESC P0 na 6-dołkowe płytki o gęstości 1,000 komórek/dołek i hoduj je przez 14 dni w REEM lub REEM bez A8301, Y27632 lub CHIR99021.
    2. Po okresie hodowli utrwalić komórki 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wybarwić je roztworem fioletu krystalicznego przez kolejne 20 minut.
    3. Określ ilościowo liczbę klastrów komórek zawierających więcej niż 50 komórek. Wybierz pożywkę w oparciu o to, która pożywka wspomaga wzrost klastrów komórkowych.
      UWAGA: Pominięcie określonych czynników w REEM spowodowało zmniejszenie zdolności proliferacyjnej reESC (Rysunek 1B,C). Na podstawie tych ustaleń wybrano REEM jako preferowaną pożywkę dla hodowli reESC w celu optymalizacji warunków hodowli.
  2. Zmieniaj REEM co 2 dni. Gdy komórki osiągną 80-90% zbieżności, traw je 0,25% trypsyny/1 mM EDTA przez 5-6 minut.
  3. Przejdź komórki w stosunku 1:3 w REEM.
  4. Test proliferacji
    1. Zasiać reESC P1, P7 i P14 na 96-dołkowych płytkach o gęstości 4 × 103 komórek/basenik w 150 μl REEM.
    2. Dodać 10 μl odczynnika CCK-8 do każdego dołka po 24, 48, 72 i 96 godzinach hodowli, a następnie po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C.
    3. Określić szybkość proliferacji, mierząc absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  5. Przygotowanie i wykorzystanie mrożonych bulionów
    1. Przygotuj zamrożony roztwór podstawowy za pomocą REEM z 10% DMSO.
    2. Zbierz reESC z 0,25% trypsyny/1 mM EDTA.
    3. Zawiesić osad komórkowy w zamrożonym roztworze podstawowym o stężeniu 1 × 106 komórek/ml. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek.
    4. Najpierw zamrozić probówki w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść je do ciekłego azotu w ciągu 24 h.
      UWAGA: W przypadku zamiaru szybkiego rozmrożenia komórek zaleca się przechowywanie zamrożonych komórek w temperaturze -80 °C przez maksymalny okres 6 miesięcy.
    5. Podgrzej REEM do 37 °C.
    6. Wyjmij zamrożone reESC i zanurz je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty.
    7. Przenieść rozmrożone reESC na płytki 6-dołkowe o gęstości wysiewu 1 × 105 komórek/basenik w REEM.
  6. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Umieść reESC w logarytmicznej fazie wzrostu na 8-dołkowych płytkach u-Slide o gęstości 2 × 103 komórek na dołek i hoduj je w REEM.
    2. Gdy reESC osiągną 90% konfluencji, utrwal je 4% paraformaldehydem przez 20 minut. Umyj reESC PBS 2x przed i po utrwaleniu.
    3. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,2% Triton X-100 przez 10 minut.
    4. Zablokuj komórki 30% surowicą kozią rozcieńczoną w 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj reESC PBS 2x przed i po zablokowaniu.
    5. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-SSEA-1 i anty-Cytokeratyna) przez 12 godzin w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przemyć reESC PBS 2x.
    6. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć reESC PBS 2x.
    7. Wybarwić komórki przeciw 150 μl DAPI, aby oznaczyć wszystkie jądra.
    8. Uchwyć obrazy barwionych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.

4. Ustalanie organoidów endometrialnych szczurów z reESC

  1. Wytwarzanie organoidów
    1. Gdy reESC osiągną 70% konfluencji, trawić komórki 0,25% trypsyny/1 mM EDTA przez 5-6 minut.
    2. Zawiesić 5 × 105 reESC w 500 μl rozmrożonego Matrigelu i umieścić w płytkach 12-dołkowych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby umożliwić żelowanie.
    3. Gdy mieszanina komórka-Matrigel zestala się, dodaj 1,5 ml/dołek REEM, aby przykryć Matrigel. Zmieniaj REEM co 2-3 dni.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Odessać REEM i dodać 1 ml/dołek wstępnie schłodzonego roztworu do zbierania organoidów do płytek 12-dołkowych. Inkubować na lodzie przez 40-60 min.
    2. Zebrać organoidy za pomocą pipety Pasteura i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    3. Opłucz organoidy 2-3x PBS.
    4. Utrwalić organoidy za pomocą 4% paraformaldehydu przez 20 minut i zablokować za pomocą 5% BSA przez 60 min.
      UWAGA: Umyj 2x PBS przed i po każdym kroku.
    5. Inkubować organoidy przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 1% powierzchni ciała.
    6. Inkubować organoidy z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Przeciwbarwić organoidy za pomocą 200 μl DAPI.
    8. Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.
  3. Barwienie HE
    1. Odwodnić organoidy za pomocą serii stopniowanych etanoli: 70% etanolu przez 30 minut; 80% etanolu przez 30 minut; 95% etanolu przez 30 minut; 100% etanolu przez 2 x 30 min. Usunąć organoidy, zanurzając je w ksylenie na 2 x 30 min.
    2. Zanurzyć oczyszczone organoidy w stopionej parafinie w temperaturze 60 °C na 1 godzinę. Przenieść organoidy naciekane parafiną do form do zatapiania, wypełnić formy stopioną parafiną i umieścić formy na zimnej płycie, aby parafina zastygła. Usuń bloki parafiny z form po zestaleniu się parafiny i odetnij nadmiar parafiny.
    3. Zamontuj bloki parafiny na mikrotomie. Wytnij odcinki o grubości 5 μm i umieść je na ciepłej łaźni wodnej (42-45 °C) w celu spłaszczenia. Ostrożnie przenieś sekcje na szkiełka podstawowe i wysusz je na podgrzewaczu do szkiełek.
    4. Odparafinować sekcje, zanurzając szkiełka w ksylenie na 2 x 5 min. Ponownie uwodnić za pomocą serii stopniowanych etanolu: 100% etanolu przez 2 x 3 min; 95% etanolu przez 3 min; 70% etanolu przez 3 min; spłukać w wodzie destylowanej.
    5. Barwieć hematoksyną przez 5 min, następnie płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min. Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez kilka sekund; płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min; umieszczać na niebiesko w 0,2% wodzie amoniakalnej przez 30 s; płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min; plamić eozyną przez 2 min. Odwodnić za pomocą sortowanego etanolu: 70% etanolu przez 1 min; 95% etanolu przez 1 min; 100% etanol przez 2 x 1 min. Klarować w ksylenie przez 2 x 1 min.
    6. Dodaj kroplę podłoża montażowego do poplamionych sekcji. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na części tkanki, unikając pęcherzyków powietrza. Obserwuj poplamione skrawki pod mikroskopem świetlnym.
  4. Barwienie fluorescencyjne
    1. Przeprowadzić deparafinowanie i ponowne nawodnienie zgodnie z opisem w krokach od 4.3.1 do 4.3.4.
    2. Podgrzej roztwór do pobierania antygenu w kuchence mikrofalowej. Umieścić szkiełka w podgrzanym roztworze do pobierania antygenu i utrzymywać je w temperaturze podwrzącej przez 20 minut. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w roztworze do pobierania antygenu przez 40 minut. Szkiełka płucz w wodzie dejonizowanej przez 5 min.
    3. Inkubować szkiełka w 0,3% nadtlenku wodoru w metanolu przez 10 minut, aby wygasić aktywność endogennej peroksydazy. Płukać szkiełka przez 3 x 5 min w PBS i inkubować je w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Strzepnąć nadmiar roztworu blokującego, ale nie spłukiwać.
    4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta. Nałożyć rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe na skrawki tkanki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    5. Myj szkiełka przez 3 x 5 minut w PBS. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP w roztworze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta. Nałożyć rozcieńczone przeciwciało wtórne na skrawki tkanki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Myć szkiełka podstawowe przez 3 x 5 minut w PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.
    6. Przygotuj roztwór roboczy fluoresceiny i tyramidu zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Nanieść roztwór roboczy na skrawki tkanki i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Płukać szkiełka przez 3 x 5 min w PBS.
    7. Powtarzać kroki od 4.4.1 do 4.4.5 aż do zakończenia barwienia wszystkimi trzema przeciwciałami. Nałóż kroplę fluorescencyjnego medium montażowego z DAPI na każdy fragment tkanki. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na części tkanki, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Zbadaj odwrócony mikroskop konfokalny szkiełków.
  5. Ilościowy PCR
    1. Zebrać organoidy zgodnie z opisem w krokach 4.2.1–4.2.3. Odessać PBS i wyekstrahować całkowite RNA z organoidów zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Użyj dowolnego dostępnego na rynku zestawu do odwrotnej transkrypcji, aby zsyntetyzować cDNA z 1 μg całkowitego RNA. Ustaw reakcję q-PCR zgodnie z protokołem producenta zestawu. Zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami starterów stosowanymi do q-PCR.

5. Długoterminowa hodowla organoidów endometrialnych szczurów

  1. Odessać REEM i dodać 1 ml roztworu do zbierania organoidów przez 40 minut, aby oddzielić organoidy. Inkubować na lodzie, aby zachować integralność organoidów.
  2. Po inkubacji zebrać organoidy za pomocą pipety Pasteura i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu ich osadzenia do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Przycinanie końcówki pipety może być pomocne w przenoszeniu większych organoidów (powyżej 500 μm) bez powodowania uszkodzeń.
  3. Zawiesić granulowane organoidy w Matrigelu, w stosunku 1:2 lub 1:3, w celu zatopienia, a następnie hodowli na płytkach 12-dołkowych.
  4. Przygotuj zamrożony roztwór podstawowy: REEM z 10% DMSO.
  5. Zebrać organoidy, zawiesić je ponownie w zamrożonym roztworze podstawowym, a następnie przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie w celu długotrwałej konserwacji.
  6. Aby rozmrozić zamrożone organoidy, należy podgrzać REEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i zanurzyć zamrożoną rurkę w łaźni wodnej, aby delikatnie rozmrozić organoidy.
  7. Po rozmrożeniu ponownie zawiesić organoidy w 500 μl Matrigelu w celu ponownego zatopienia i hodowli na płytce 12-dołkowej. Wykonaj kroki 4.1.2. do 4.1.3.
    UWAGA: Zaleca się przechowywanie zamrożonych organoidów w temperaturze -80 °C przez krótszy czas lub przeniesienie do ciekłego azotu w celu dłuższego przechowywania.

6. Opcjonalnie: Przejście organoidów do kultury przylegającej

UWAGA: Protokół wspomina o alternatywnej metodzie uzyskiwania reESC o płaskiej hodowli poprzez przejście organoidów do hodowli przylegającej, co pozwala na restrukturyzację morfologii organoidów.

  1. Odessać REEM i dodać 1 ml roztworu do zbierania organoidów, aby oddzielić organoidy. Inkubować na lodzie, aby zachować integralność organoidów.
  2. Po inkubacji zebrać organoidy za pomocą pipety Pasteura i odwirować je w celu osadzania ich w temperaturze 300 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Ponownie zawiesić organoidy w 3 ml wstępnie podgrzanego REEM i przenieść zawieszone organoidy do naczynia o średnicy 3,5 cm. Wymieniaj nośnik REEM co 2 dni.
  4. Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, traw je 0,25% trypsyny/1 mM EDTA przez 5-6 minut.
  5. Zrekonstruować organoidy za pomocą reESC, wykonując czynności od 4.1.1 do 4.1.3.

7. Sekwencyjne hodowle organoidów z estradiolem (E2) i progesteronem (P4)

  1. Przygotować roztwory podstawowe E2 i P4 w DMSO. Rozcieńczyć roztwory podstawowe do pożądanych stężeń roboczych (E2:10 nM; P4: 1 μM) w REEM, zapewniając, że końcowe stężenie DMSO nie przekracza 0,1%, aby uniknąć skutków cytotoksycznych.
  2. Hodowla organoidów w REEM zgodnie z etapami 4.1.1–4.1.3 przez 4 dni. Zastąp pożywkę REEM uzupełnionym E2 i hoduj przez 7 dni. Codziennie monitoruj wzrost i morfologię organoidów. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
  3. Zastąp pożywkę REEM uzupełnioną E2 i P4. Codziennie monitoruj wzrost i morfologię organoidów. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Kontynuuj hodowlę organoidów przez 7 dni.

Wyniki

reESC oraz organoidy macicy szczura utworzono z sześciu samic szczurów Sprague-Dawley o masie od 200 g do 250 g zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1. Opierając się na sukcesie długoterminowej hodowli ludzkich macierzystych komórek nabłonkowych endometrium, skład pożywki REEM składał się głównie z Y27632, A8301 oraz CHIR99021. Aby ustabilizować reESC in vitro, początkowo wyizolowano komórki endometrium z endometrium szczura, stosując techniki enzymatyczne i mechaniczne. Analiza cytometryczna w Rysunku 2A wykazała, że pierwotne komórki endometrium składały się w około 50% z komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję CD9 (49,8%), przy niskich poziomach EpCAM (4,49%) i CD24 (2,64%). Marker SSEA-1 dla reESC występował na poziomie 6,58%, podczas gdy markery śródbłonkowe CD31 (30,9%) i CD45 (70,3%) były stosunkowo wysokie.

Jednakże hodowla w pożywce REEM sprawiła, że reESC P1 wykazywały jednorodną morfologię wirskowatą lub wieloboczną i tworzyły zwarte struktury klonalne (Rysunek 2D). Stopniowe usuwanie poszczególnych czynników z REEM prowadziło do odpowiadającego im spadku zdolności proliferacyjnej reESC. Test tworzenia kolonii podkreślił krytyczną rolę Y27632 w stabilnej hodowli reESC (Rysunek 2B,C). W trzecim pasażu reESC wykazywały spójną ekspresję SSEA-1 i cytokeratyny, co wskazuje na skuteczną ekspansję pierwotnych reESC podczas hodowli (Rysunek 2F). Co więcej, reESC zachowały silną i stabilną zdolność proliferacyjną nawet w późnych pasażach (Rysunek 2E), co dowodzi ich skutecznej izolacji i ekspansji w obecnym systemie REEM.

Hodowle organoidów ustanowiono zgodnie z wcześniej opisanym systemem opartym na ludzkich komórkach macierzystych endometrium8. W ciągu 3 dni reESC wykazały szybką samoorganizację w struktury przypominające organoidy z pustym centrum, które następnie zwiększały swój rozmiar i grubość (patrz Rycina 3A). Typowe wyniki barwienia HE ilustrujące tworzenie organoidów przez reESC przedstawiono na Rycynie 3B. Hodowle te można podtrzymywać poprzez pasażowanie, co potwierdza wysoka żywotność komórek wykazana w barwieniu Ki67 po bezpośrednim pasażowaniu oraz po cyklach zamrażania i rozmrażania. Ponadto wykonano barwienie HE dziesiątej generacji organoidów, a wyniki wykazały, że struktura organoidów pozostała nienaruszona (patrz Rycina 3E). Dodatkowo wyniki qPCR wskazały, że Nanog, Sox2 i Oct4 były ekspresowane na poziomach porównywalnych z generacją P1 (Rycina 3F). Wynik ten sugeruje możliwość długoterminowej hodowli organoidów w ramach obecnego systemu.

W naszym badaniu przeprowadzono wstępną analizę reakcji struktur przypominających macicę szczura na E2 i P4. Barwienie immunofluorescencyjne przedstawione na Rysunku 4A wykazało obecność receptorów estrogenów i progesteronu. Po suplementacji E2 organoidy te przeszły transformację z pustej formy sferycznej w gęstszy wzorzec wzrostu wewnętrznego (Rysunek 4C). Następująca po tym ekspozycja na P4 doprowadziła do zmniejszenia przepuszczalności gęstych struktur, co ostatecznie skutkowało ich dezintegracją (Rysunek 4B). Wyniki te sugerują, że E2 potencjalnie stymuluje dalsze różnicowanie struktur przypominających macicę szczura, podczas gdy P4 może uruchamiać szlaki apoptotyczne.

Schemat ekspansji macicznych komórek macierzystych szczura, kroki hodowli organoidów i metoda pasażowania
Rysunek 1: Procedury stosowane w celu ustanowienia linii macicznych nabłonkowych komórek macierzystych szczura oraz organoidów macicy szczura. Skrót: SD = Sprague-Dawley. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Histogramy cytometrii przepływowej analizujące markery CD; testy hodowli komórkowych z krzywymi wzrostu i immunobarwieniem.
Rycina 2: Generowanie i długoterminowa hodowla komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura in vitro. (A) Analiza cytometryczna przepływowo pokazująca proporcję komórek pozytywnych w endometrium szczura. (B) Barwienie fioletem krystalicznym klonów w REEM odpowiednio z dodatkiem lub bez dodatku A8301, Y27632 lub CHIR99021. Paski skali = 1 cm. (C) Liczba klonów w REEM z dodatkiem lub bez dodatku czynników. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; n = 3 dawców (***, p<0.001). (D) Obrazy z mikroskopii świetlnej komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura w pasażu P1 z barwieniem fioletem krystalicznym i bez niego. (E) Analizy CCK-8 komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura w pasażu 1, pasażu 7 i pasażu 14. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe, n = 3. (F) Analizy immunofluorescencyjne wykazujące ekspresję Cytokeratyny i SSEA-1. Skrót: REEM = medium do ekspansji reESCs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost komórek w ciągu 144 h; mikroskopia fluorescencyjna z markerami DAPI, cytokeratyną i SSEA-1; dane o ekspresji.
Rycina 3: Generowanie i długoterminowa hodowla organoidów błony śluzowej endometrium szczura in vitro. (A) Obrazy z mikroskopii świetlnej organoidów błony śluzowej endometrium szczura w pasażu P1. (B) Barwienie H&E organoidów P1 pochodzących z komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura. (C) Analizy immunofluorescencyjne wykazujące ekspresję cytokeratyny i SSEA-1. (D) Analizy immunofluorescencyjne wykazujące ekspresję Ki67 i SSEA-1. (E) Barwienie H&E organoidów szczura w pasażu P10. (F) Analizy qPCR ekspresji Nanog, Sox2 i Oct-4 w organoidach błony śluzowej endometrium szczura w pasażach P1 i P10. Ekspresja znormalizowana względem GAPDH (n = 3, jednostronny nieparzysty test t, n.s. = brak istotności statystycznej). Skrót: H&E = hematoksylina i eozyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna markerów komórkowych DAPI, SSEA-1, ER, PR; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 4: Sekwencyjna hodowla organoidów z E2 i P4. (A) Analizy immunofluorescencyjne wykazujące ekspresję receptora estrogenowego, receptora progestagenu oraz SSEA-1. (B) Przegląd obrazów z mikroskopii świetlnej organoidów szczura hodowanych w E2 i P4. (C) Obrazy z mikroskopii świetlnej wykazujące przekształcenie pustej sfery w strukturę gęstą wewnątrz jamie organoidów po 7 dniach hodowli w E2. Skróty: ER = receptor estrogenowy; PR = receptor progestagenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu opisaliśmy prostą metodę izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka endometrium szczurów (reESC) i udoskonaliliśmy wcześniej ustalony system ex vivo dla ludzkich komórek macierzystych nabłonka endometrium8. Nasze podejście wykorzystuje małocząsteczkową pożywkę hodowlaną zawierającą Y27632, A8301 i CHIR99021 jako podstawowe składniki, aby umożliwić stabilną i długoterminową hodowlę ex vivo . Co więcej, udało nam się wygenerować organoidy endometrialne szczurów w czasie rzeczywistym za pomocą reESC. Ten nowatorski system upraszcza obecne metody hodowli organoidów endometrialnych, które zazwyczaj opierają się na blokach tkankowych, zapewniając w ten sposób większą jasność co do linii komórkowej10. Co ważne, nasz system ułatwia edycję genów i inne manipulacje na poziomie komórkowym w celu wygenerowania organoidów wyrażających określone geny. Co więcej, ten system organoidów pozwala na celowy nokaut lub nadekspresję określonych genów w endometrium szczura, umożliwiając badania przesiewowe i hodowlę komórek macierzystych nabłonka endometrium w celu wytworzenia organoidów endometrialnych. To kompleksowe podejście badawcze wyjaśnia konkretne funkcje genów zarówno z perspektywy in vivo , jak i ex vivo , torując drogę do badania chorób związanych z nabłonkiem endometrium.

Badania przesiewowe leków są krytycznym zastosowaniem organoidów. Jednak obecne źródła i metody przygotowania organoidów są złożone, co prowadzi do znacznej zmienności między seriami, co może mieć wpływ na wyniki badań przesiewowych leków11,12. Nasz system pokazuje, że organoidy pochodzące ze stabilnych linii komórkowych hodowanych ex vivo mogą skutecznie minimalizować różnice między powstałymi organoidami, zwiększając jednorodność w konfiguracjach eksperymentalnych. Co więcej, organoidy szczurów utworzone przez reESC wykazały zdolność do reagowania na stymulację estrogenową in vitro, prowadząc do zmian morfologicznych, co sugeruje, że mogą być wykorzystywane jako narzędzie do badań przesiewowych leków ex vivo. ReESC można łatwo wyizolować z tkanki endometrium i namnażać ex vivo przy użyciu mniejszej liczby małych cząsteczek w porównaniu z ludzkimi komórkami macierzystymi nabłonka endometrium. Cecha ta jest szczególnie cenna w badaniu właściwości komórek macierzystych, komórek prekursorowych, procesów różnicowania i interakcji mikrośrodowiskowych. Co ważne, podejście to można ekstrapolować na inne gatunki ssaków, takie jak małpy, świnie i psy, umożliwiając ustanowienie systemów hodowli organoidów endometrialnych, które służą jako bardziej fizjologicznie istotne modele do badania biologii, funkcji, chorób i reakcji na leki endometrium. Pomimo swoich zalet ta technika ma ograniczenia. Jednym z głównych ograniczeń jest poleganie na Matrigel, złożonej i zmiennej macierzy zewnątrzkomórkowej, która może wprowadzać niespójności między eksperymentami. Co więcej, chociaż modele szczurze dostarczają cennych informacji, nadal istnieją różnice międzygatunkowe, a wyniki mogą nie w pełni przekładać się na fizjologię i patologie endometrium u ludzi. Przyszłe badania powinny mieć na celu wyeliminowanie tych ograniczeń, potencjalnie poprzez opracowanie bardziej zdefiniowanych i spójnych matryc zewnątrzkomórkowych oraz zbadanie możliwości zastosowania tego modelu u innych gatunków.

Pomimo swoich zalet ta technika ma ograniczenia. Jednym z głównych ograniczeń jest poleganie na Matrigel, złożonej i zmiennej macierzy zewnątrzkomórkowej, która może wprowadzać niespójności między eksperymentami. Dlatego kluczową techniką w tym badaniu jest usunięcie Matrigel. Zastosowanie delikatnego środka fermentującego w żelu matrycowym, zapewniającego operacje na lodzie i wystarczającego czasu trawienia ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Ze względu na większą średnicę pipety Pasteura, aspiracja pipetą Pasteura może zmniejszyć uszkodzenia organoidów i przyspieszyć trawienie żelu matrycowego. Kolejne badania mogą porównać różne metody hodowli żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w celu dalszej optymalizacji systemów hodowli i trawienia organoidów. Przyszłe badania powinny mieć na celu wyeliminowanie tych ograniczeń, potencjalnie poprzez opracowanie bardziej zdefiniowanych i spójnych matryc zewnątrzkomórkowych oraz zbadanie możliwości zastosowania tego modelu u innych gatunków.

Podczas gdy istniejąca literatura opisywała techniki hodowli ex vivo organoidów nabłonkowych, niniejsze badanie przedstawia nowatorski, prosty i łatwy do odtworzenia system hodowli i ekspansji organoidów endometrialnych szczurów pochodzących z czystych komórek. Postęp ten może zwiększyć tempo badań w dziedzinie biologii rozrodu kobiet.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez GuangDong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515110760).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Królik, 1:200 (IHC)
Receptor antyestrogenowy alfaAbcamab32063Królik, 1:200 (IHC)
Anty-pan CytokeratynaAbcamab7753Mysz, 1:250 (IHC)
Receptor anty-progesteronowyAbcamab101688Królik, 1:200 (IHC)
Anty-Ki67Abcamab279653Mysz, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-EstradiolMerckE8875
Zestaw do liczenia komórek-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC),
FITC CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Roztwór do zbioru organoidów R& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Zestaw systemu fluorescencyjnegoAPExBIOK1051
Cy5 Zestaw systemu fluorescencyjnego TSAAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μ g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescencyjny zestaw systemu fluorescencyjnegoAPExBIOK1050
Koza anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG/HRPAPExBIObs-0295G-HRP
Zamiennik surowicy nokautującejInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteronMerck57-83-0
Sprague-Dawley szczur Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Chiny
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNEkstrakcja RNA
U-Slide 8-dołkowe płytkiIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
startery qPCR docelowych genów 
GensCompanySequences
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
szczur Nanog R Sangon biotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
szczur Sox2 FSangon biotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
szczur Sox2 RSangon biotechATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
szczur Oct4 FSangon biotechCCCAGCCGTGAAGTTGGA
szczur Oct4 RSangon biotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Bibliografia

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy endometriumhodowla organoid wcharakterystyka organoid wchoroby endometriumtestowanie lek w na organoidachedycja gen w w organoidachizolacja kom rekosadzanie w Matrigelu
Generowanie i charakterystyka organoidów macicy szczura z komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.