Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66930

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Streszczenie

Dostępność szeregu modyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów od komercyjnych dostawców pozwoliła na opracowanie zaawansowanych testów do charakteryzowania różnych właściwości enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, które mogą być uruchamiane w dowolnym standardowym laboratorium biologii molekularnej. Zastosowanie etykiet fluorescencyjnych sprawiło, że metody te stały się dostępne dla badaczy dysponujących standardowym sprzętem do elektroforezy PAGE i obrazownikiem fluorescencyjnym, bez użycia materiałów radioaktywnych lub bez konieczności korzystania z laboratorium przeznaczonego do przechowywania i przygotowywania materiałów radioaktywnych, tj. Hot Lab. Opcjonalne dodanie standardowych modyfikacji, takich jak fosforylacja, może uprościć konfigurację testu, podczas gdy specyficzne włączenie zmodyfikowanych nukleotydów, które naśladują uszkodzenia DNA lub produkty pośrednie, może być wykorzystane do zbadania określonych aspektów zachowania enzymu. W tym miejscu zademonstrowano projektowanie i wykonanie testów w celu zbadania kilku aspektów przetwarzania DNA przez enzymy przy użyciu dostępnych na rynku syntetycznych oligonukleotydów. Obejmują one zdolność ligaz do łączenia się lub nukleaz do degradacji różnych struktur hybrydowych DNA i RNA, zróżnicowane wykorzystanie kofaktorów przez ligazę DNA oraz ocenę zdolności enzymów do wiązania DNA. Omówiono czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania syntetycznych substratów nukleotydowych, a także przedstawiono podstawowy zestaw oligonukleotydów, które można wykorzystać do szeregu testów ligaz kwasów nukleinowych, polimerazy i enzymów nukleazy.

Wprowadzenie

Wszystkie formy życia wymagają enzymów przetwarzających kwasy nukleinowe do przeprowadzenia podstawowych procesów biologicznych, w tym replikacji, transkrypcji i naprawy DNA. Kluczowymi funkcjami enzymatycznymi tych szlaków są polimerazy, które generują kopie cząsteczek RNA/DNA, ligazy, które łączą substraty polinukleotydowe, nukleazy, które je degradują, oraz helikazy i topoizomerazy, które topią dupleksy kwasów nukleinowych lub zmieniają ich topologię1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ponadto wiele z tych enzymów dostarcza niezbędnych narzędzi molekularnych do zastosowań takich jak klonowanie, diagnostyka i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości11,12,13,14,15.

Cechy funkcjonalne, kinetyka i specyficzność substratów tych enzymów mogą być określone za pomocą znakowanych substratów DNA/RNA wytwarzanych przez wyżarzanie oligonukleotydów. Śledzenie substratów i produktów tradycyjnie odbywało się poprzez wprowadzenie znacznika radioaktywnego (32P) na końcu nici 5', który można następnie wykryć za pomocą kliszy fotograficznej lub systemu obrazowania luminoforowego16,17. Podczas gdy znakowane radioizotopowo substraty oferują korzyści w postaci zwiększonej czułości eksperymentalnej i nie zmieniają właściwości chemicznych nukleotydu, potencjalne zagrożenia dla zdrowia wynikające z pracy z radioizotopami zachęciły do opracowania nieradioaktywnego znakowania kwasami nukleinowymi, aby zapewnić bezpieczniejszą alternatywę dla wykrywania DNA i RNA18,19,20. Wśród nich detekcja fluorescencji, w tym bezpośrednia detekcja fluorescencji, fluorescencja czasowo-rozdzielcza oraz testy transferu energii/wygaszania fluorescencji, wyróżniają się jako najbardziej wszechstronne21,22,23,24. Szeroka gama fluoroforów umożliwia różne projekty substratów DNA/RNA z unikalnymi reporterami na każdym oligonukleotydzie25. Dodatkowo, stabilność fluoroforów, w porównaniu z radioizotopami, pozwala użytkownikom na produkcję i zachowanie znacznych ilości fluorescencyjnie znakowanych substratów DNA19. Te znakowane fluoroforem substraty mogą być inkubowane z interesującym białkiem, wraz z różnymi kombinacjami kofaktorów metali i nukleotydów, w celu analizy aktywności wiązania i/lub enzymu. Wizualizację wiązania lub aktywności można zaobserwować za pomocą różnych kanałów barwnika fluoroforowego z systemem obrazowania żelowego. Ponieważ tylko fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy będą widoczne przy użyciu tej techniki, każdy wzrost lub spadek rozmiaru znakowanego oligonukleotydu będzie łatwy do prześledzenia. Żele można również później zabarwić barwnikami barwiącymi kwasy nukleinowe, aby uwidocznić wszystkie prążki DNA obecne na żelu.

Ligazy kwasu polinukleinowego to enzymy, które łączą fragmenty DNA/RNA, katalizując uszczelnianie pęknięć poprzez tworzenie wiązania fosfodiestrowego między 5' fosforylowanymi końcami DNA a 3' OH DNA. Można je podzielić na dwie grupy w zależności od wymagań dotyczących substratu nukleotydowego. Wysoce konserwatywne ligazy zależne od NAD znajdują się we wszystkich bakteriach26, podczas gdy strukturalnie zróżnicowane enzymy zależne od ATP można zidentyfikować we wszystkich domenach życia8,27. Ligazy DNA odgrywają ważną rolę w przetwarzaniu fragmentów Okazaki podczas replikacji, a także biorą udział w różnych szlakach naprawy DNA, takich jak naprawa nukleotydów i wycięć zasad, poprzez uszczelnianie spontanicznych nacięć i nacięć, które pozostają po naprawie8,10. Różne ligazy DNA wykazują różne zdolności do łączenia różnych konformacji pęknięć DNA, w tym nacięć w dupleksie, pęknięć dwuniciowych, niedopasowań i luk, a także hybryd RNA i DNA28,29,30. Różnorodna gama zligawalnych substratów może być łączona przez wyżarzanie oligonukleotydów fosforanem 5' w celu wytworzenia zestawionych końców 5' i 3' w dupleksie kwasu nukleinowego31,32,33. Najczęstszą metodą analizy jest rozdzielczość mocznika PAGE w formacie testu punktu końcowego; Jednak ostatnie innowacje obejmują zastosowanie elektroforezy w żelu kapilarnym, która umożliwia wysoką przepustowość34, profilowanie spektrometryczne mas35, a także jednorodny molekularny test nawigacyjny, który umożliwia monitorowanie z rozdzielczością czasową36.

Pierwszym krokiem w reakcji ligacji jest adenylacja enzymu ligazy przez trifosforan adenozyny (ATP) lub dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD), w wyniku czego powstaje pośredni enzym kowalencyjny. Drugim etapem reakcji jest adenylacja substratu kwasu nukleinowego na końcu 5' miejsca nacięcia, po której następuje ligacja nici nacięcia kwasu nukleinowego. Wiele enzymów ligazowych, które ulegają rekombinacyjnej ekspresji w E. coli, jest oczyszczanych w postaci adenylowanej i dlatego są w stanie z powodzeniem ligować kwasy nukleinowe bez dodawania kofaktora nukleotydowego. Utrudnia to określenie, jaki konkretny typ kofaktora nukleotydowego są potrzebne do ligacji kwasów nukleinowych. Oprócz opisu testów oceniających aktywność ligazy DNA, przedstawiono również metodę wiarygodnego określania użycia kofaktora poprzez deadenylację enzymu przy użyciu nieznakowanych substratów.

Nukleazy to duża i zróżnicowana grupa enzymów modyfikujących DNA/RNA oraz katalitycznych RNA, które rozszczepiają wiązania fosfodiestrowe między kwasami nukleinowymi37. Funkcje enzymów nukleazy są wymagane w replikacji, naprawie i przetwarzaniu DNA i można je sklasyfikować według ich specyficzności cukrowej dla DNA, RNA lub obu. Endonukleazy hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w nici DNA/RNA, podczas gdy egzonukleazy hydrolizują nici DNA/RNA po jednym nukleotydzie na raz od końca 3' lub 5' i mogą to robić od końca 3' do 5' lub od 5' do 3' klasy DNA38.

Podczas gdy wiele białek nukleazy jest niespecyficznych i może brać udział w wielu procesach, inne są wysoce specyficzne dla określonej sekwencji lub uszkodzenia DNA6,39,40. Nukleazy specyficzne dla sekwencji są wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych, takich jak klonowanie, mutageneza i edycja genomu. Popularnymi nukleazami do tych zastosowań są nukleazy restrykcyjne41, nukleazy palców cynkowych42, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, a ostatnio nukleazy CRISPR sterowane przez RNA43. Ostatnio zidentyfikowano nukleazy specyficzne dla uszkodzeń, takie jak nukleaza EndoMS, która ma swoistość dla niedopasowań w DNA dzięki specyficznej dla niedopasowania domenie nukleazy podobnej do RecB5,44. Historycznie rzecz biorąc, testy aktywności nukleazy były wykonywane jako testy nieciągłe z substratami znakowanymi radioaktywnie; Jednak oprócz innych wad, nie pozwalają one na identyfikację miejsca, które jest cięte przez białko nukleazy, co jest możliwe przy użyciu substratów znakowanych fluorescencyjnie45,46. Niedawno opracowano ciągłe testy nukleazy, które działają przy użyciu różnych barwników DNA, które oddziałują z DNA w różnych stanach; na przykład, emitując silniejszy sygnał fluorescencyjny podczas interakcji z dsDNA niż w stanie niezwiązanym lub wiążąc się specyficznie z krótkimi RNAs47. Inne ciągłe testy nukleazy wykorzystują spinki do włosów DNA z grupą fluoroforową na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3', dzięki czemu fluorescencja wzrasta wraz z degradacją oligonukleotydu w wyniku oddzielenia fluoroforu i wygaszacza48. Podczas gdy testy te pozwalają scharakteryzować kinetykę białek rozkładających DNA, wymagają one wcześniejszej wiedzy na temat funkcji i substratu enzymu, a także ograniczają się do enzymów, które zmieniają konformację DNA, powodując różnicę w wiązaniu barwnika. Z tego powodu testy punktów końcowych, które rozwiązują poszczególne produkty nukleazy, są nadal pożądane, aby zapewnić wgląd w modyfikacje DNA spowodowane aktywnością białka.

Tutaj przedstawiono szczegółową procedurę projektowania fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów DNA/RNA, które mogą być mieszane i dopasowywane w celu wygenerowania substratów do testowania aktywności nowych enzymów nukleazowych, polimerazowych i ligazowych. Walidacja tego podstawowego zestawu sekwencji oligonukleotydowych upraszcza projektowanie eksperymentów i ułatwia ekonomiczne profilowanie szerokiego zakresu funkcji enzymatycznych bez konieczności zakupu dużej liczby substratów na zamówienie. Przedstawiono szczegółową procedurę przeprowadzania standardowego testu enzymatycznego przetwarzania DNA z tymi substratami, na przykładzie aktywności ligazy DNA i opisano modyfikacje do oznaczania i analizy enzymów nukleazy i polimerazy. Ponadto podano zmodyfikowany test do określenia swoistości kofaktora enzymu ligazy DNA z dużą dokładnością, a podwójnie znakowane sondy są używane do oceny montażu ligacji wieloskładnikowych. Na koniec omówiono modyfikacje podstawowego formatu testu, aby umożliwić jego wykorzystanie do określenia interakcji białko-DNA z tymi samymi substratami za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA).

Protokół

1. Projektowanie i zakup oligonukleotydów

UWAGA: Zaprojektuj jednoniciowe oligonukleotydy, które zostaną złożone i poddane hybrydyzacji w celu utworzenia pożądanych dupleksów. Jedna lub więcej nici w dupleksie musi posiadać grupę fluorescencyjną, aby umożliwić śledzenie przetwarzania oligonukleotydów przez badany enzym. Podstawowy zestaw sekwencji jednoniciowych, które można złożyć dla różnych zakresów aktywności, przedstawiono w Tabeli 1.

  1. Wprowadź specyficzne modyfikacje wymagane dla analizowanego enzymu, zgodnie z poniższym opisem.
    1. W przypadku substratów dla ligazy DNA (Rycina 1): Złóż najprostszy substrat z trzech oligonukleotydów: fosforylowanej na końcu 5' nici donora (NL2), znakowanej FAM na końcu 5' nici akceptora (NL1) oraz nici komplementarnej, która łączy obie nici (NL3).
      1. Upewnij się, że nici stanowiące koniec 5' ligowalnego nacięcia (nick) są fosforylowane przed przygotowaniem mieszaniny głównej substratu w kroku 2. Zamów tę modyfikację dla NL2 (zgodnie z Tabelą 1) lub zastosuj fosforylowanie enzymatyczne za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 po resuspensji oligonukleotydów.
      2. Uwzględnij fosforylowanie końcowe 5' dla NL6 i NL8, które stanowią komplement do pęknięć dwuniciowych przedstawionych na Rycynie 1A (NL6/NL7 oraz NL8/NL9), ponieważ najlepiej odwzorowuje to naturalny substrat powstający w wyniku działania endonukleazy restrykcyjnej. Użyj substratu z podwójnym znakowaniem, aby określić względny stopień ligacji dla złożonych konstrukcji wieloczęściowych (patrz krok 6).
      3. Zmodyfikuj nić komplementarną, aby uzyskać niedopasowania (NL10) i przerwy (NL11).
        UWAGA: Warianty prostego substratu z nacięciem przedstawiono na Rycynie 1A. Można zastosować inne sekwencje, aby uzyskać jeszcze szerszy zakres niedopasowań lub dłuższe przerwy poprzez zmianę podkreślonej pozycji.
      4. Zastąp oligonukleotydy DNA oligonukleotydami RNA.
        UWAGA: Warianty prostego substratu z nacięciem przedstawiono na Rycynie 1B. Szerszy zakres dupleksów DNA/RNA można wygenerować poprzez dodatkowe kombinacje zestawu bazowego podanego tutaj, aby stworzyć na przykład pęknięcia dwuniciowe zawierające zarówno RNA, jak i DNA. Przykład takiej modyfikacji podano w kroku 6 poniżej, gdzie zastosowano strategię podwójnego znakowania.
    2. W przypadku substratów dla polimerazy DNA: Złóż oligonukleotydy NL1 i NL3 wymienione w Tabeli 1, aby uzyskać prosty test elongacji primera. Badaj dodatkowe aspekty aktywności polimerazy, wprowadzając modyfikacje do nici NL1 (primer) lub NL3 (matryca).
      1. Wprowadź analogi uszkodzonych zasad do oligonukleotydu NL3 przed pozycją 20, aby określić zdolność do omijania uszkodzeń w nici matrycy.
      2. Wprowadź analogi uszkodzonych zasad do oligonukleotydu NL1 w pozycji 20, aby określić zdolność do elongacji uszkodzonego primera.
      3. Użyj RNL1 lub RNL3 w dupleksie, aby zbadać elongację primera RNA lub wykorzystanie matrycy RNA.
    3. W przypadku substratów dla nukleaz (Rycina 2): Złóż oligonukleotydy, aby uzyskać niwyczerpujący zakres substratów dwu- i jednoniciowych (Rycina 2Ai), a także zakres połączeń z tzw. „flaps” (flapped) i „splayed” (Rycina 2Aii) oraz substraty uszkodzone (Rycina 2B).
      1. Aby zbadać aktywność rybonukleazy, iteracyjnie zastępuj NL1, NL2 i NL3 odpowiednio RNL1, RNL2 i RNL3. Użyj dodatkowych wersji RNA dla HJ5 i HJ6, aby dalej rozszerzyć ten zestaw.
      2. Użyj oligonukleotydów MD5, MD6 i MD9, które posiadają centralnie umieszczoną modyfikację naśladującą uszkodzenie oksydacyjne, abazyjny produkt pośredni naprawy lub produkt deaminacji (Rycina 2B). Substraty te pozwolą wykryć rozcięcie nici w tej pozycji. Znakuj komplementarną nić NL3 ortogonalnym fluoroforem, takim jak TAMRA, aby wykryć rozcięcie dwuniciowe (patrz krok 6).
      3. Zastosuj ortogonalne znakowanie komplementu, aby wykryć cięcie dwuniciowe w miejscach niedopasowań zarówno w nici sondy (NL5 i ND9), jak i w nici komplementarnej (MD10 i NL10).
  2. Zamów syntetyczne oligonukleotydy zawierające odpowiednie fluorofory i inne modyfikacje u komercyjnego dostawcy.
    UWAGA: Dla opisanych testów odpowiednia jest skala syntezy 100 nM oraz oczyszczanie metodą HPLC po syntezie.

2. Składanie i wyżarzanie dupleksów kwasów nukleinowych

  1. Resuspensja i rozcieńczanie oligonukleotydów
    1. Przed otwarciem liofilizowane oligonukleotydy w probówkach 2 mL należy odwirować z maksymalną prędkością w wirówce nakładkowej przez 2-5 min, aby upewnić się, że kwasy nukleinowe znajdują się na dnie probówki.
    2. Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 100 µM poprzez resuspensję oligonukleotydów w buforze TE (10 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)). Należy upewnić się, że oligonukleotydy zostały całkowicie resuspendowane poprzez wielokrotne delikatne mieszanie w wortexie i krótkie odwirowanie z maksymalną prędkością.
    3. Przygotować roztwór zapasowy 10 µM poprzez rozcieńczenie aликwoty roztworu zapasowego buforem TE. Roztwór 10 µM rozcieńczyć wodą ultrapure (wodą MQ), aby przygotować roztwory robocze o stężeniach 0,5 µM, 0,7 µM lub 2,5 µM zgodnie z Tabelą 2.
  2. Przygotowanie i hybrydyzacja mieszanin reakcyjnych (master mix)
    1. Przygotować mieszaniny reakcyjne, korzystając z roztworów roboczych, zgodnie z kombinacjami podanymi w Tabeli 2 oraz objętościami wskazanymi w Tabeli 3. W przypadku standardowego testu ligazy DNA oraz większości pozostałych opisanych tutaj testów, końcowy skład buforu to 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol (DTT) z 10 mM Mg jako kationem dwuwartościowym.
    2. Hybrydyzację oligonukleotydów przeprowadzić w probówce do PCR lub mikroprobówce, ogrzewając w 95 °C przez 5 min przy użyciu bloku grzejnego lub termocyklera. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30 min (objętości <1 mL) do 1 h (objętości >1 mL). W przypadku dłuższych oligonukleotydów (>40 nt) przeprowadzić wolniejsze chłodzenie, używając termocyklera z rampą obniżania temperatury od 95 °C do 25 °C w ciągu 45 min lub umieszczając probówkę z mieszaniną hybrydyzacyjną w 1 L zlewce z wrzącą wodą i pozostawiając do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez noc.
    3. Kofaktory nukleotydowe oraz pozostałe termolabilne składniki buforu dodać do mieszaniny master mix po ostygnięciu do temperatury pokojowej. Końcową mieszaninę reakcyjną wykorzystać bezpośrednio do testu poprzez dodanie enzymu (patrz krok 3 poniżej) lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

3. Standardowe przygotowanie do analizy

  1. Przygotowanie i rozpoczęcie reakcji testowej
    1. W probówce do PCR połączyć 22.5 µL odpowiedniego roztworu głównego (master mix) substratu z 2.5 µL ligazy DNA lub innego badanego enzymu. Reakcje należy przeprowadzić w dubletach lub triplikatach, szczególnie w przypadku planowania analizy ilościowej wyników.
    2. W próbkach testowych należy uwzględnić kontrolę bez białka (sam bufor). W razie potrzeby na tym etapie dodać kontrole bez kofaktora.
      UWAGA: Enzymy można przechowywać w temperaturze -20 °C w 50% v/v glicerolu, co umożliwia ich pobieranie bezpośrednio z roztworu. Przed dodaniem należy upewnić się, że roztwory enzymów z glicerolem zostały dobrze wymieszane, poprzez pipetowanie lub delikatne wirowanie w wortexie.
  2. Niezwłocznie przenieść próbki do termocyklera ustawionego na 25 °C i inkubować przez 30 min. Temperaturę i czas inkubacji należy dostosować do optymalnych warunków aktywności enzymu.
  3. Zatrzymać reakcje poprzez dodanie 5 µL barwnika do nakładania (95% formamid, 0.5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), błękit bromofenolowy) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 min.

4. Analiza wyników testu

  1. Przygotuj żele PAGE z Tris-boranem-EDTA (TBE) i mocznikiem zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotuj roztwór stokowy zawierający 20% akryloamidu, 7 M mocznika oraz 1x TBE. Dla opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów należy użyć roztworu akryloamidu/bis w stosunku 29:1 w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości.
    2. Aby przygotować jeden żel, połącz 10 mL 20% akryloamidu i 7 M roztworu mocznika z 100 µL APS (10 %) oraz 3 µL tetrametyloetylenodiaminy (TMED), a następnie odlej w formie do żeli.
  2. Po zastygnięciu żelu przeprowadź elektroforezę próbek na żelu TBE z mocznikiem w temperaturze 45 - 55 °C.
    1. Przeprowadź wstępny przebieg żelu w buforze 1x TBE przez 30 min przy natężeniu 10 mA na żel z zastosowaniem zewnętrznego ogrzewania.
    2. Usuń nadmiar mocznika z dołków żelu, przepłukując je buforem 1x TBE za pomocą pipety Pasteura.
    3. Naniesienie 10 µL każdej z reakcji i prowadź elektroforezę przy 10 mA przez 1,0-1,5 h z zastosowaniem zewnętrznego ogrzewania.
  3. Wizualizuj żel na skanerze (imagerze), stosując odpowiednie ustawienia dla wybranego fluoroforu. Dla FAM użyj zestawu filtrów zapewniającego wzbudzenie/emisję przy 495/519 nm, który jest zapisany jako ustawienie fabryczne w większości skanerów.
  4. Ilościowo określ intensywność prążka produktu i substratu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów dołączonego do skanera lub programu zewnętrznego, takiego jak ImageJ49,50, a następnie oblicz procentowy udział produktu, korzystając ze wzoru:
    Wzór na procenty: P/(P+S)×100; równanie służące do obliczania wydajności lub pomiaru stężenia.
    Gdzie P to zintegrowana wartość prążka produktu, a S to zintegrowana powierzchnia prążka substratu. W przypadku przykładu reakcji ligazy DNA prążek produktu znajduje się na poziomie 40 nukleotydów (nt), a prążek substratu na poziomie 20 nt.

5. Deadenylacja ligazy DNA w celu przetestowania specyficzności kofaktora

  1. Przygotowanie głównych mieszanin reakcyjnych (master mix)
    1. Przygotować jeden zestaw master mix zawierający oligonukleotyd NL1 znakowany FAM, zgodnie z opisem w Tabeli 4. Przygotować drugi zestaw zawierający oligonukleotyd NL1 bez znacznika FAM, zgodnie z opisem w Tabeli 4.
    2. Oddzielnie podgrzać oba dupleksy DNA do 95 °C przez 5 min, a następnie chłodzić przez 30 min do 1 h w temperaturze 25 °C. Do żadnego z zestawów master mix nie dodawać kofaktora nukleotydowego.
  2. Złożenie i zainicjowanie reakcji deadenylacji
    1. Przygotować pojedynczą reakcję deadenylacji dla każdego testowanego typu/stężenia kofaktora, łącząc 10 µL nieznakowanego master mix z 2,5 µL enzymu ligazy.
    2. Przygotować dodatkowe probówki jako kontrolę bez kofaktora oraz kontrolę bez białka (w miejsce enzymu dodać 2,5 µL buforu).
    3. Inkubować reakcje w temperaturze odpowiadającej optymalnej aktywności enzymu przez 1-2 h. Czas inkubacji można wydłużyć, jeśli enzym nadal jest adenylowany.
  3. Przeprowadzenie reakcji ligacji z kofaktorem.
    1. Dodać 10 µL znakowanego master mix oraz 2,5 µL wybranych kofaktorów nukleotydowych (np. ATP, NAD, ADP lub GTP) bezpośrednio do reakcji po deadenylacji (stężenie końcowe 0,1-1 mM).
    2. Do kontroli bez kofaktora nukleotydowego dodać 2,5 µL buforu reakcyjnego.
    3. Inkubować reakcje przez ten sam czas i w tej samej temperaturze, co w poprzednim etapie. Przerwać reakcję i przeprowadzić wizualizację zgodnie z opisem w kroku 4.

6. Wykorzystanie substratów z podwójnym znakowaniem do ligacji z użyciem szyn (splinted ligation) lub montażu wieloelementowego

  1. Zaprojektuj i zamów oligonukleotyd z grupą fluorescencyjną, która posiada inne widmo wzbudzenia/emisji niż fluorofor użyty wcześniej.
    1. W opisanej tutaj konfiguracji użyj oligonukleotydu NL2 (TAMRA) z 5-karboksy-tetrametylorodaminą (TAMRA) na końcu 3' (Tabela 1).
  2. Przygotuj master mix zgodnie z opisem poniżej.
    1. Połącz składniki reakcji opisane w kroku 2, w tym ekwimolarne ilości wszystkich oligonukleotydów wykorzystanych w składaniu, a także bufor i kationy dwudoboczne.
    2. Przeprowadź hybrydyzację poprzez ogrzanie do 95 °C przez 5 min i schładzanie do 25 °C przez 30 min – 1 h. Dodaj kofaktor oraz enzym i inkubuj zgodnie z opisem w kroku 3.
  3. Przeprowadź analizę i obrazowanie próbek zgodnie z opisem w kroku 4, używając odpowiednich kanałów dla pary fluoroforów w substracie. W przypadku FAM i TAMRA są to kanały fluoresceiny (FITC) i tetrametylorodaminy (TRITC) dostępne w większości urządzeń do obrazowania.

7. Ocena wiązania DNA za pomocą testu przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) na żelu natywnym

  1. Przygotować 10% natywny żel TBE PAGE zgodnie z poniższym opisem.
    1. Wymieszać 2,5 mL 40% akryloamidu, 1 mL 10x TBE, 100 µL 10% APS, 3 µL TMED oraz 6,5 mL wody MQ i odlać w formie do żelu.
  2. Przygotować reakcję wiązania zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotować substrat do EMSA zgodnie z Tabelą 5, tak aby uwzględnić EDTA (10 mM) i pominąć jony metali.
    2. W probówce PCR połączyć 20 µL mieszaniny matki (master mix) substratu EMSA z 5 µL białka. Uwzględnić próbkę kontrolną bez białka. Inkubować przez 30 min w temperaturze 25 °C.
  3. Przeprowadzić analizę za pomocą elektroforezy natywnej zgodnie z poniższym opisem.
    1. Do próbek dodać 5 µL 5x natywnego barwnika do nakładania (100 mM EDTA, 0,25% błękitu bromofenolowego, 25% v/v glicerolu i woda MQ do objętości 1 mL).
    2. Nanieść na przygotowany żel i prowadzić elektroforezę przy napięciu 60 V przez 2-3 h z chłodzeniem przez obieg wody, aż czoło barwnika znajdzie się kilka cm powyżej końca żelu.
    3. Zwizualizować i przeanalizować żele zgodnie z opisem w kroku 4.

Wyniki

Ligacja za pomocą ligazy DNA
Aktywność enzymatyczna ligazy DNA spowoduje zwiększenie rozmiaru znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu podczas wizualizacji na żelu PAGE z mocznikiem. W przypadku substratów do ligacji DNA i RNA wymienionych w Tabeli 2, odpowiada to podwojeniu rozmiaru z 20 nt do 40 nt (Rycina 3A). Optymalną aktywność enzymu można określić poprzez zmianę takich warunków jak temperatura, stężenie białka lub czas inkubacji (Rycina 3B), kofaktory nukleotydowe oraz kofaktory metaliczne (Rycina 3C). Względną aktywność ligazy na różnych substratach można porównać w układach równoległych (Rycina 3D).

Ilościowe oznaczenie prążków produktu i substratu wyrażono jako procent całkowitego ligowanego substratu, co – jak pokazano na Rysunku 3 – może służyć do oceny aktywności specyficznej enzymu lub wyznaczania optimów aktywności, takich jak preferencje względem kationów dwuwartościowych, temperatury lub pH.

Bakteryjna ligaza DNA DV-1-1-Lig (Rysunek 3) jest zdolna do ligacji substratów DNA z nacięciami (nicks) oraz niedopasowaniami zasad i może wykorzystywać zarówno magnez, jak i mangan do aktywności ligacyjnej, wykazując preferencję dla magnezu. Dalsze szczegóły dotyczące tego enzymu podano w51.

Wydłużanie startera przez polimerazę DNA
Aktywność polimerazy DNA polegająca na wydłużaniu 20 nt znakowanego fluorescencyjnie startera spowoduje zwiększenie rozmiaru do 40 nt przy użyciu zaprezentowanego tutaj zestawu oligonukleotydów (Rycina 4A). Produkty częściowo wydłużone pojawią się jako drabinka produktów o rozmiarach do długości matrycy (Rycina 4B i Rycina 4C). Przedstawiony tutaj test wydłużania startera (Rycina 4C) doprowadził do pełnej syntezy nici startera.

Degradacja przez nukleazę
Aktywność nukleazy prowadzi do zmniejszenia rozmiaru znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu w wizualizacji na żelu PAGE z mocznikiem. Nukleazy o specyficznej aktywności endonukleazy mogą prowadzić do powstania pojedynczego produktu o długości 20 nt (Rycina 5A-C). Nukleazy o aktywności egzonukleazy będą skutkować powstaniem znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów o różnych rozmiarach (Rycina 5D-F). Przedstawiono tutaj wyniki dla białka nukleazy z bakteryjnego metagenomu antarktycznego, które wykazuje specyficzną aktywność endonukleazy względem dwuniciowego substratu z miejscem abazowym oraz niespecyficzną aktywność egzonukleazy względem substratu jednoniciowego (odpowiednio Rycina 5C i Rycina 5F).

Test deadenylacji ligazy i wykorzystania kofaktora nukleotydowego
Wiele rekombinacyjnie ekspresowanych enzymów ligaz jest oczyszczanych w stanie już zaadenylowanym z ATP lub NAD pozyskanych z organizmu gospodarza51,52,53,54,55. Usunięcie tego kowalencyjnego produktu pośredniego AMP jest niezbędne do dokładnej identyfikacji zakresu kofaktorów nukleotydowych, których enzym może użyć do ligacji substratów kwasów nukleinowych51. Przeróbka zaadenylowanego enzymu ligazy z nieznakowanym substratem w obecności egzogennego kofaktora nukleotydowego doprowadzi do wyczerpania produktu pośredniego adenylacji. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnie znakowanych substratów DNA i dodaniu kofaktora nukleotydowego wyłącznie w drugim kroku, każdy produkt ligacji widoczny w kanale fluorescencji (Fluoresceina-FITC) na obrazowniku żeli jest wynikiem adenylacji kofaktorem nukleotydowym dodanym na tym etapie.

Testy aktywności przeprowadzone z wykorzystaniem bakteryjnej ligazy DNA wykazanej w systemie E. coli wykazują, że została ona oczyszczona w formie preadenylowanej i wykazywała podstawową zdolność do ligacji naciętego DNA bez dodatkowego kofaktora (Rycyna 6Ai-ii). Dodanie ATP do adenylowanej ligazy zwiększa ilość powstałego w reakcji produktu ligacji, ale nie zawsze jest to wiarygodne, ponieważ ta aktywność bazowa mogłaby dawać błędne wrażenie szerokiego spektrum wykorzystania kofaktorów, a dalsze dodatki kofaktorów nukleotydowych do reakcji mogłyby zahamować ligację substratu. Poprzez wstępną inkubację ligazy z nieoznakowaną wersją naciętego substratu DNA, AMP zostaje zużyte i nie obserwuje się ligacji na oznakowanym substracie z nacięciem DNA, chyba że do reakcji dodano ATP. Drugi test aktywności (Rycina 6B) pokazuje, że deadenylowana ligaza DNA wykazuje poprawioną aktywność ligacji w odniesieniu do naciętego substratu DNA po dodaniu ATP i ADP. Odnotowano również pewną poprawę ligacji po dodaniu GTP, która jest większa niż ligacja tła zaobserwowana w próbie kontrolnej bez kofaktora. Ligacja zaobserwowana w reakcjach z NAD jest porównywalna z ligacją widzianą w reakcjach kontrolnych bez kofaktora, co wyklucza NAD jako kofaktor ligacji.

Wyniki analizy z podwójnym znakowaniem
Ortogonalne fluorofory mogą być wykorzystane do wykazania aktywności w różnych częściach złożonego substratu. Przykład na Rycynie 7 przedstawia aktywność niedawno opisanej ligazy DNA R2D56 w porównaniu z ligazą DNA T4 w odniesieniu do duplexu DNA/RNA z zastosowaniem splintu. Ligację akceptora DNA do sekcji donora RNA substratu wykryto za pomocą 6-FAM, natomiast ligację akceptora RNA do donora DNA wykryto za pomocą 5-TAMRA (Rycyna 7A). Względny stopień ligacji DNA do obu końców substratu RNA można ocenić na podstawie obecności prążka produktu z fluorescencją w obu kanałach, 6-FAM i 5-TAMRA, który na obrazie złożonym przejawia się kolorem żółtym, podczas gdy poszczególne sygnały 6-FAM i 5-TAMRA są odpowiednio zielone i żółte (Rycyna 7B). Jak szczegółowo opisano w poprzedniej publikacji56, tylko ligaza R2D była zdolna do ligacji DNA do końca 5' RNA, podczas gdy obie ligazy potrafiły ligować DNA do końca 3' RNA. Podczas ligacji obu cząsteczek DNA do RNA w pojedynczych mieszaninach reakcyjnych ligaza R2D może ligować oligonukleotydy DNA do obu końców RNA, co objawia się przesunięciem prążka w górę oraz zmianą koloru na żółty (Rycyna 7C).

Drugi przykład na Rysunku 8 wykorzystuje metodę podwójnego znakowania, aby zademonstrować ligację wielu oligonukleotydów przy różnych wartościach pH. Substrat, złożony z mieszaniny siedmiu oligonukleotydów, posłużył do wykazania zdolności ligazy R2D do łączenia krótkich fragmentów. Nić 5' składa się z 14 nt nici znakowanej fluorophorem FAM, natomiast nić komplementarna posiada fluorofor TAMRA na końcu 3' oligonukleotydu o długości 16 nt. Pomyślną ligację można zidentyfikować po pojawieniu się dodatkowych pasm o wyższej masie dla oligo FAM (zielone) i oligo TAMRA (czerwone). Nałożenie się obu fluoroforów daje żółte pasmo nukleotydowe, reprezentujące całkowicie zligowane nici o tej samej wielkości.

Wyniki wiązania DNA przez enzym ligazy DNA z wykorzystaniem EMSA
Wiązanie enzymu ligazy DNA z fosforylowanym naciętym DNA prowadzi do powstania kompleksu, który wędruje przy wyższej masie cząsteczkowej niż sam oligonukleotyd (Rycina 9A). Przedstawiono tutaj wiązanie bakteryjnej ATP-zależnej ligazy DNA z podłożem w postaci naciętego DNA. Przy wysokich stężeniach białka większość znakowanego podłoża DNA jest związana i widoczna w pasmach o wyższej masie cząsteczkowej; przy niższych stężeniach białka przeważa wolne podłoże DNA (Rycina 9B).

Schemat substratów do ligacji DNA/RNA; nacięcie, końce tępłe, lepkie, niedopasowanie, luka; układ biochemiczny.
Rycina 1: Schematy różnych substratów kwasów nukleinowych zaprojektowanych do badania aktywności enzymatycznej ligazy. Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5' FAM). Znakowane nici są zaznaczone czarną lub ciemnoniebieską/czerwoną linią (w przypadku dupleksów DNA/RNA), natomiast nieznakowane części dupleksów substratowych są zaznaczone szarą lub jasnoniebieską/czerwoną linią (w przypadku dupleksów DNA/RNA). Znakowane nici mają długość 20 nt i w przypadku ligacji nici tworzą produkt o długości 40 nt. Miejsca z fosforanem na końcu 5' są oznaczone literą P w okręgu. Nić oligonukleotydowe są nazwane, a ich nazwy znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2. (A) Projekt dwuniciowych substratów DNA z różnymi rodzajami pęknięć, stosowanych do badania aktywności enzymatycznej ligaz DNA. (B) Projekt dwuniciowych substratów RNA oraz RNA/DNA, które zawierają oligonukleotydy DNA i RNA. Substraty zawierają pojedyncze miejsce nacięcia (nick) i są stosowane do badania zdolności ligaz do scalania nacięć w dupleksach RNA/DNA. Czerwona linia reprezentuje oligonukleotydy RNA, a niebieskie linie reprezentują oligonukleotydy DNA. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat substratów DNA: normalnych, zmodyfikowanych i uszkodzonych. Przedstawia sekwencje, modyfikacje i niedopasowania.
Rysunek 2: Schematy różnych substratów kwasów nukleinowych zaprojektowanych do badania aktywności enzymatycznej nukleaz. Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5' FAM). Zniesionowane nici są oznaczone czarną linią, natomiast nieznakowane fragmenty dupleksów substratowych są oznaczone linią szarą. Miejsca fosforylowane na końcu 5' są oznaczone literą P w kółku. Nici oligonukleotydowe są opisane, a ich nazwy znajdują się w Tabeli 1 oraz Tabeli 2. (A) Projekt substratów z fragmentami dwuniciowymi i jednoniciowymi. (B) Projekt dwuniciowych substratów DNA zmodyfikowany w celu wytworzenia jednoniciowych nawisów na końcu 3' lub 5' (Flapped 3', flapped 5' lub nawisy na obu końcach (splayed)). (C) Projekt substratów dwuniciowych zawierających uszkodzone zasady lub niedopasowania w pozycji centralnej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Proces ligacji DNA z wynikami żelu PAGE z denaturującym mocznikiem; analiza ligowanego produktu o długości 40 nt.
Rycina 3: Badanie aktywności ligacyjnej bakteryjnej ATP-zależnej ligazy DNA DV-1-1-Lig. (A) Schemat testów enzymatycznych aktywności ligazy na substratach DNA z wynikami analizowanymi na żelu TBE urea PAGE. Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5' FAM). Znakowane nici są oznaczone czarną linią, natomiast nieznakowane fragmenty dupleksów substratowych, niewidoczne podczas analizy, są oznaczone liniami szarymi. (B) Ilościowe oznaczenie ligacji przez DV-1-1-Lig w naciętym DNA w różnych punktach czasowych. Aktywność wobec każdego substratu badano w duplikacie. Reakcje inkubowano przez różne okresy (0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h i 4 h) w temperaturze 25 °C, przy końcowym stężeniu białka 4 µM, końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowym stężeniu jonów magnezu 10 mM. (C) Ligacja naciętego substratu DNA z dodatkiem magnezu (Mg) lub manganu (Mn). Reakcje przeprowadzono przez 3 h w temperaturze 25 °C, przy końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowych stężeniach jonów metali 10 mM. (D) Wyniki ligacji na różnych substratach DNA. Reakcje przeprowadzono przez 8 h w temperaturze 20 °C, przy końcowym stężeniu białka 2 µM, końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowym stężeniu magnezu 10 mM. Dodanie białka do reakcji oznaczono symbolem plus (+). Reakcje kontrolne oznaczone są literą C, a brak białka w reakcji symbolem minus (-). Produkt (40 nt) i substrat (20 nt) zaznaczono czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności zwizualizowano za pomocą systemu obrazowania. Prążki ilościowo określono poprzez całkowanie intensywności przy użyciu oprogramowania ImageJ49, a wykresy wygenerowano za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces polimerazy DNA z wynikami żelu PAGE z denaturacją; schemat przedstawia dodawanie dNTP oraz analizę produktu.
Rycina 4: Analiza aktywności polimerazy DNA. (A) Schemat testu wydłużania primera na podłożu DNA. Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5' FAM). Nić znakowane są zaznaczone czarną linią, natomiast nieznakowane fragmenty dupleksów podłoża, które nie są widoczne podczas analizy, są zaznaczone szarymi liniami. (B) Schemat przewidywanych wyników żelu TBE Urea PAGE wykazujący wzrost długości znakowanego primera wraz z dodawaniem nukleotydów. (C) Przykład wydłużania primera za pomocą enzymu polimerazy DNA fragment Klenow z E. coli. Dodanie białka do reakcji zaznaczono symbolem plus (+). Ścieżka 1, 12.5 U; ścieżka 2, 2.5 U; ścieżka 3, 1.25U. Reakcje kontrolne oznaczono literą C, a brak zawartego białka zaznaczono symbolem minus (-). Reakcje prowadzono przez 15 min w 25 °C w obecności 5 mM MgCl2, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl2, 1 mM DTT oraz 0.25 mM dNTPs. Produkt (40 nt) i podłoże (20 nt) zaznaczono czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności wizualizowano za pomocą systemu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment cięcia DNA; schemat denaturującego żelu PAGE; aktywność nukleazy; rozdział substratu i produktu.
Rycina 5: Testowanie aktywności nukleazy z antarktycznego metagenomu bakteryjnego przy użyciu różnych substratów, metali i temperatur inkubacji. (A) Schemat specyficznej aktywności endonukleazy białka nukleazy na substracie z miejscem abazycznym (oznaczonym znakiem x). Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5' FAM). Czarne linie reprezentują nici znakowane, a szare linie reprezentują nieznakowane nici DNA. Specyficzne cięcie przez nukleazę pokazano po prawej stronie miejsca abazycznego, lecz może ono również zachodzić po lewej stronie. (B) Schemat denaturującego żelu PAGE z mocznikiem pokazujący nieprzecięty substrat (40 nt) w przypadku braku białka, oznaczonego symbolem minus (-), oraz przecięty produkt (20 nt) w obecności nukleazy, oznaczonej symbolem plus (+). (C) Przykład żelu TBE PAGE z mocznikiem pokazujący wyniki specyficznej aktywności endonukleazy na dwuniciowym substracie DNA z miejscem abazycznym. Analizę przeprowadzono przy stężeniu białka 1,0 µM i 1 mM MgCl2. Przeprowadzono dwie reakcje kontrolne w 20 °C, jedną bez białka (dołek 1) i jedną bez metalu (dołek 2). Reakcje inkubowano przez 5 h w rosnących temperaturach od 1 °C do 50 °C, zgodnie z oznaczeniami nad obrazem żelu. Dodatek białka oznaczono symbolem plus (+), a brak białka symbolem minus (-). Substrat i produkt wskazano czerwonymi strzałkami. (D) Schemat pokazujący niespecyficzną aktywność egzonukleazy białka nukleazy na substracie jednoniciowym. Gwiazdki reprezentują znakowanie 6-karboksyfluoresceiną na końcu 5' (5'FAM). Czarne linie reprezentują nici znakowane. Niespecyficzne cięcie przez nukleazę skutkuje powstaniem znakowanych nici o różnych długościach (<39 nt). (E) Schemat reprezentujący denaturujący żel PAGE z mocznikiem pokazujący nieprzecięty substrat (40 nt), gdzie nie dodano białka (-), oraz przecięty substrat o różnych długościach, gdzie dodano białko (+), co może wynikać z aktywności niespecyficznej egzonukleazy. (F) Żele TBE PAGE z mocznikiem pokazują przykład niespecyficznej aktywności egzonukleazy tej samej nukleazy z antarktycznego metagenomu z substratem jednoniciowym. Analizę przeprowadzono w 20 °C przez 4 h z białkiem w stężeniu końcowym 1,5 µM i stężeniem końcowym jonów metalu 10 mM. Użyty jon metalu jest wskazany nad obrazem. Dodatek białka oznaczono symbolem plus (+), a brak białka symbolem minus (-). Substrat (40 nt) wskazano czerwoną strzałką, a produkty o różnych długościach wskazano czerwonym nawiasem. Wyniki wszystkich reakcji nukleazy zwizualizowano za pomocą systemu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wydajność ligacji DNA, wyniki elektroforezy; wykresy i żele pokazujące wpływ kofaktorów na ligację.
Rysunek 6: Wyniki ligacji naciętego substratu DNA przez adenylowane i deadenylowane wersje bakteryjnej ligazy DNA. (A>) i) Ilościowe określenie ligacji przez adenylowany i deadenylowany enzym ligazy, z dodatkiem ATP oraz bez niego. Punkty na wykresie reprezentują średnie dla każdego powtórzenia reakcji. Uwzględniono słupki błędu standardowego. ii) Żel TBE urea PAGE pokazujący wyniki ligacji naciętego substratu DNA przez adenylowany i deadenylowany enzym ligazy, z dodatkiem ATP oraz bez niego. Reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Enzym deadenylowany inkubowano wstępnie przez 2 h w 25 °C z nieznakowanym naciętym substratem DNA i 0,1 µM enzymu, a następnie inkubowano przez 1 h z znakowanym naciętym substratem DNA. Enzym adenylowany nie był inkubowany wstępnie z nieznakowanym substratem. ATP (1 mM) dodawano do reakcji wraz z dodatkiem znakowanego substratu DNA. (B>) i) Ilościowe określenie ligacji naciętego DNA przez deadenylowaną ligazę z różnymi kofaktorami (ATP, NAD, ADP i GTP). Punkty na wykresie reprezentują średnie dla każdego stężenia. Uwzględniono słupki odchylenia standardowego. ii) TBE urea PAGE pokazujący wyniki ligacji przez ligazę, z dodatkiem różnych kofaktorów oraz bez nich. Aktywność wobec każdego substratu określano w dwóch powtórzeniach. Reakcje inkubowano wstępnie przez 2 h w 25 °C z nieznakowanym naciętym substratem DNA, 4 µM białka i 5 mM jonów magnezu, a następnie inkubowano przez 4 h po dodaniu znakowanego naciętego substratu DNA, 5 mM magnezu i różnych kofaktorów w końcowym stężeniu 1 mM. Dodatek białka do reakcji oznaczono symbolem plus (+). Zastosowano reakcje kontrolne bez białka (Kontrole, C) lub bez kofaktora (Brak kofaktora). Produkt (40 nt) i substrat (20 nt) wskazano czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności wizualizowano za pomocą systemu obrazowania. Prążki określono ilościowo poprzez integrację intensywności przy użyciu oprogramowania ImageJ49. Wykresy wygenerowano za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces ligacji DNA z oznakowaniem FAM i TAMRA; zawiera schemat elektroforezy żelowej oraz wyniki analizy.
Rysunek 7Ligacja krótkich znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów DNA do obu końców oligonukleotydu RNA z fosforylowanym końcem 5', pozycjonowana za pomocą matryc DNA. (A) Schemat ligacji DNA-RNA wspomaganej przez DNA-splint, pokazujący sposób wizualizacji możliwych produktów ligacji przy użyciu strategii podwójnego znakowania. (B) Schemat możliwych produktów, których oczekuje się na żelu Urea-PAGE obrazowanym w dwóch kanałach. (C) Wyniki eksperymentalne ligacji podwójnego fluoroforu. Reakcje ligacji przeprowadzono z użyciem ligazy T4 DNA oraz ligazy R2D, zarówno w odizolowanych reakcjach, w których DNA ligowano albo do końca 5' (ścieżki 2-4), albo do końca 3' (ścieżki 5-7) RNA, jak i w pojedynczej reakcji, w której oba oligonukleotydy DNA ligowano w tej samej mieszaninie reakcyjnej (ścieżki 8-10). W kontroli bezbiałkowej (NPC) nie dodano enzymu. Warunki reakcji oraz konkretne oligonukleotydy użyte w tym przykładzie są takie same, jak podano w56. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat ligacji DNA; wyniki elektroforezy w żelu dla różnych wartości pH, znakowania 6-FAM, TAMRA oraz ligacji.
Rysunek 8: Ligacja wielu krótkich segmentów oligonukleotydowych z trzema wariantami R2D przy różnych wartościach pH. (A) Schemat strategii ligacji wieloczęściowej. (B) Reprezentatywny żel pokazujący zależność od pH w przypadku montażu wieloczęściowego, obrazowany w kanałach FAM oraz TAMRA. Ścieżka C – kontrola bez enzymu, ścieżki 1-3 – pH 6,0, ścieżki 4-6 – pH 6,5, ścieżki 7-9 – pH 7 oraz ścieżki 10-12 – pH 7,5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat natywnego żelu TBE PAGE przedstawiający wiązanie białko-substrat za pomocą elektroforezy; stężenie białka.
Rysunek 9Wyniki EMSA. Schemat i natywny żel TBE PAGE z badania przesunięcia ruchomości elektroforetycznej (EMSA), obrazujący aktywność wiązania ligazy DNA zależnej od ATP (pochodzącej z danych metagenomowych z MProszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Dry Valleys w Górach McMurdo, Antarktyka) na podłożu z DNA. (ASchemat EMSA/aktywności wiązania DNA przez ligazę DNA na podłożu z nacięciem (nick DNA). Wyniki wiązania są wizualizowane na nieodśpiewającym żelu PAGE w buforze TBE. Podłoża DNA związane z enzymem ligazą migrują wolniej przez żel, podczas gdy podłoża wolne od enzymu migrują szybciej, co skutkuje przesunięciem wielkości prążka (żółte ramki) wizualizowanym na żelu. Ponieważ podłoża są wizualizowane na żelu nieodśpiewającym, oligonukleotydy pozostaną zdenaturowane, co pozwala na obecność nici znakowanej FAM (żółta gwiazdka) zarówno w podłożach wolnych, jak i związanych. Gradient stężenia białka może zostać wykorzystany do ustalenia stężenia białka zapewniającego optymalne wiązanie.B) Wizualizacja analizy EMSA na natywnym żelu TBE PAGE, przedstawiająca zdolność wiązania ATP-zależnej ligazy DNA z podłożem DNA z nacięciem (nick DNA) przy różnych stężeniach białka. Enzym inkubowano z podłożem DNA z nacięciem przez 30 min w 25 °Cz końcowym stężeniem ATP wynoszącym 1 mM i 40 mM EDTA. Wykorzystano trzy różne stężenia białka (5.5 µM, 2.3 µM, i 1.5 µMReakcje przeprowadzono w 10% natywnym żelu TBE, stosując natywny barwnik do prób w mieszaninach reakcyjnych. Próbki zawierające białko analizowano w trzech powtórzeniach dla różnych stężeń białka. Ścieżki kontrolne zawierały nacięty substrat DNA z końcowym stężeniem 1 mM ATP oraz EDTA, ale bez dodatku białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Sekwencje oligonukleotydowych substratów DNA użytych do konstrukcji substratów do analizy. Uszkodzenia są zaznaczone pogrubieniem i podkreśleniem. Pozycje niedopasowań oraz przerw w końcowym duplexie są podkreślone. Skróty: 5' 6-karboksyfluoresceina (5' FAM), 8-okso-deoksyguanozyna (8OxodG), abazyczny tetrahydrofuran (dSpacer). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kombinacje oligonukleotydów użytych do przygotowania mieszanin głównych (master mixes) dla różnych testów enzymatycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Przygotowanie głównych mieszanin reakcyjnych (master mixes) z maksymalnie czterema oligonukleotydami. Zobacz Tabelę 2 w celu zapoznania się z kombinacjami oligonukleotydów stosowanymi dla różnych substratów testowych oraz tekst w celu uzyskania szczegółów dotyczących warunków reakcji. Wymagany jest co najmniej jeden znakowany oligonukleotyd – dodatkowe fragmenty dupleksu zaznaczono nawiasami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Składniki znakowanej i nieznakowanej mieszaniny głównej (master mix) do przygotowania dupleksu DNA z nacięciem (nick DNA duplex). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Przygotowanie mieszanin głównych EMSA dla różnych kombinacji dupleksów. Zobacz Tabelę 3 w celu uzyskania informacji o kombinacjach oligonukleotydów stosowanych dla różnych substratów EMSA oraz tekst w celu uzyskania szczegółów dotyczących warunków reakcji. Substraty EMSA zostały zaprojektowane przy użyciu tych samych oligonukleotydów, co w przypadku testów aktywności. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole
Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Kupując oligonukleotydy do tworzenia dupleksu, należy wziąć pod uwagę projekt sekwencji. Zaleca się użycie narzędzia do analizatora oligonów do przewidywania właściwości sekwencji nukleotydowej, takich jak zawartość GC, temperatura topnienia, struktura drugorzędowa i potencjał dimeryzacji, przed zamówieniem57.

Montaż i wyżarzanie dupleksów kwasów nukleinowych: Podczas przygotowywania dupleksów RNA/RNA-DNA należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą, stosując odczynniki i wodę, które są wolne od RNaz lub dodając inhibitor RNAzy (o ile badany enzym sam w sobie nie jest RNAzą). Sprzęt, rękawice i miejsce na stole powinny być potraktowane roztworem do odkażania RNazy przed złożeniem mieszanek głównych, aby uniknąć degradacji oligonukleotydów58. Zapasy główne oligonukleotydów RNA mogą być tworzone w mniejszych partiach w przypadku zanieczyszczenia.

Ligazy DNA zawsze wymagają kofaktora nukleotydowego, ATP lub NAD, w końcowym stężeniu od 0,1 do 1 mM. Polimerazy DNA wymagają dNTP do syntezy nici, a te są zwykle dodawane w proporcjach równomolowych po 50 μM każdej. Podczas przygotowywania mieszanin wzorcowych dla dupleksów ligazy i polimerazy, kofaktory nukleotydowe, takie jak ATP, NAD i dNTP, muszą zostać dodane do mieszanki głównej po podgrzaniu mieszaniny i schłodzeniu do temperatury pokojowej, ponieważ są one wrażliwe na ciepło.

10-krotny bufor do wyżarzania oligonukleotydów wymaga dodania DTT, który ma krótki okres półtrwania i najlepiej przygotować go na świeżo lub zamrożonego przed użyciem. Mniejsze porcje bufora 10x mogą być przygotowywane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, z dodatkiem naziemnej telewizji cyfrowej przed użyciem.

Oligonukleotydy i mieszanki wzorcowe powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania, a znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy lub mieszaniny powinny być owinięte folią, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforu. Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą zagrozić integralności oligonukleotydów, zaleca się przygotowanie i użycie mniejszych objętości (>1 ml).

Konfiguracja testu i analiza wyników: Włączenie kontroli ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników testu. Należy zastosować kontrolę bezbiałkową (substrat DNA z roztworem buforowym), aby upewnić się, że pozorna aktywność na substracie jest wynikiem działania enzymu. W przypadku nukleazy degradacja substratu egzogennego spowoduje pasma o niskiej masie cząsteczkowej lub drabinki w kontroli, podczas gdy w przypadku ligazy lub polimerazy niepełna denaturacja dupleksowa spowoduje kontrolę pasma o dużej masie cząsteczkowej. Pozytywna kontrola wielkości oczekiwanego produktu znajduje się w tabeli 2 i powinna zostać uwzględniona w celu sprawdzenia prawidłowego rozmiaru produktu.

Ważne parametry wpływające na udaną elektroforezę produktu testowego zostały opisane w poprzednim protokole59. Obejmują one zapewnienie, że procentowa zawartość akrylamidu jest odpowiednia do wielkości podłoża oraz użycie odpowiedniego barwnika obciążającego w zależności od wielkości podłoża i rodzaju żelu wymaganego do wizualizacji wyników. Barwnik śledzący błękit bromofenolowy ma przybliżoną wielkość 10-zasadowego oligonukleotydu i dlatego jest odpowiedni dla opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów; Jeśli jednak pasmo barwnika nakłada się na produkt fluorescencyjny lub pasma substratu przy użyciu krótszych nukleotydów, barwnik śledzący można wymienić na ksylocyjanol, który działa wolniej60.

Aby zapewnić dobrą rozdzielczość pasm substratu/produktu, zbiornik żelu powinien być ogrzewany zewnętrznie za pomocą łaźni wodnej lub pod wysokim napięciem (np. 180 V). Wstępne działanie żeli mocznikowych PAGE przez co najmniej 30 minut i przepłukiwanie studzienek pipetą w celu usunięcia nadmiaru mocznika jest niezbędne do uzyskania ostrych, prostych pasm nadających się do oznaczania ilościowego.

W celu ilościowego określenia substratów i produktów zakres 20%-80% całego materiału powinien zostać przekształcony w produkt, aby umożliwić dokładną integrację pasków żelu fluorescencyjnego. W przypadku oznaczania nowego enzymu zaleca się przeprowadzenie gradientu stężeń białka, aby umożliwić wykonanie kolejnych pomiarów w tym zakresie. Wiele kamer fluorescencyjnych ma wbudowane funkcje integracji pasma, które można wykorzystać do tego celu. Jeśli używasz zewnętrznego programu, takiego jak ImageJ49, upewnij się, że obraz żelu jest eksportowany w wysokiej jakości w formacie tiff.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z techniką
Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Oligonukleotydy podane w tym protokole są użytecznymi punktami wyjścia i mogą być rozszerzane, zgodnie z sugestią w sekcji dotyczącej metod, poprzez zmianę sekwencji oligonukleotydów i wprowadzanie modyfikacji.

Standardowa konfiguracja testu i analiza wyników: Eksperymenty pilotażowe są niezbędne podczas testowania aktywności nowego enzymu, ponieważ optymalne warunki reakcji będą się różnić w zależności od różnych białek; Parametry podane w niniejszym protokole służą jedynie jako punkt wyjścia. Czynniki takie jak stężenie enzymu, temperatura reakcji, czas trwania inkubacji, kofaktor i skład buforu/pH mogą ulegać zmianom podczas mieszania wzorcowego i zespołu reakcji testu. Stężenia kofaktorów są szczególnie ważne, ponieważ nadmiar kofaktorów nukleotydowych lub jonów metali może być hamujący i zaleca się testowanie zakresu stężeń każdego z nich. W przypadku polimeraz DNA zalecane stężenia dNTP wahają się od 20 do 200 μM ogółem, jednak wysokie stężenia dNTP zmniejszają wierność61. Podobnie, ligazy polinukleotydowe są zwykle oznaczane z kofaktorem nukleotydów 0,1-1,0 mM, ale nadmierne stężenia powodują adenylan nagromadzonego DNA i hamowanie reakcji62.

Standardowy protokół tutaj używa Mg jako kationu dwuwartościowego; jednak niektóre enzymy są bardziej aktywne z manganem (Mn) lub (Zn). Mieszanki wzorcowe zawierające Mn lub Zn należy przygotować z buforem o niższym pH (<7,5), a po podgrzaniu należy dodać metale. Mieszanki wzorcowe należy stosować tego samego dnia, aby uniknąć wytrącania się i hamowania aktywności enzymu.

Dodatki, w tym środki stłoczenia, takie jak glikol polietylenowy (PEG) lub stabilizatory, takie jak albumina surowicy bydlęcej, mogą być stosowane w celu zwiększenia aktywności niektórych enzymów63,64. Powinny one być dodawane po etapie wyżarzania ze względu na ich termoaplikowalność. Wszystkie odczynniki pochodzenia biologicznego powinny być klasy biologii molekularnej, aby uniknąć wprowadzania zanieczyszczających nukleaz.

Objętość buforu wygaszającego formamid stosowana w tym protokole jest odpowiednia dla podstawowego zestawu oligonukleotydów. Jednak w przypadku dłuższych oligonukleotydów objętość formamidu należy zwiększyć do poziomu od 10 μl do 20 μl, aby zapewnić całkowite oddzielenie nici, a reakcje hartowane można schładzać na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu elektroforezy.

W przypadku niektórych enzymów ścisłe wiązanie białka z substratem/produktem może wykluczać migrację oligonukleotydów do żelu podczas elektroforezy, zwłaszcza gdy enzym jest stosowany w wysokich stężeniach. Objawia się to brakiem pasm produktu/substratu na żelu i często nagromadzeniem materiału fluorescencyjnego (produktu i/lub substratu skompleksowanego z białkiem) w studzienkach. Aby rozbić te kompleksy, mieszaninę testową można poddać działaniu proteinazy K przed dodaniem buforu wygaszającego lub dodecylosiarczanu sodu (SDS) podczas hartowania.

Aktywność ligazy DNA wytwarza dwa dyskretne prążki, które są łatwe do ilościowego określenia. Możliwe jest zastosowanie tej samej metody do ilościowego określenia aktywności endonukleazy na podłożu uszkodzenia DNA, w przypadku gdy przewiduje się pojedynczy produkt 20 nukleotydów, lub testów EMSA, w których wyraźnie rozróżnia się stany związane/niezwiązane. Dokładna kwantyfikacja aktywności polimerazy i nukleazy procesowej jest trudna ze względu na integrację pasmową i ogólnie zaleca się stosowanie testów w czasie rzeczywistym za pomocą sond lub sygnalizatorów, jak opisano we wprowadzeniu.

De-adenylacja i specyficzność kofaktora ligazy DNA: Może być wymagana pewna optymalizacja tego protokołu w celu usunięcia całej aktywności tła, która następnie zostanie przywrócona przez dodanie kofaktora (kofaktorów) nukleotydów. Jeśli aktywność ligazy tła pozostaje po dedenylacji (postrzeganej jako ligacja w kontroli bez kofaktora), czas inkubacji etapu dedenylacji może zostać wydłużony lub stężenie ligazy może zostać zmniejszone. Upewnij się, że dupleks DNA bez etykiety jest bardziej skoncentrowany niż białko (> 4:1::substrate: białko). Jeśli dodanie kofaktora w obecności znakowanego DNA nie przywróci ligacji dla żadnego z badanych kofaktorów, możliwe jest, że enzym uległ denaturacji i etap deadenylacji powinien zostać skrócony. W przypadku nowej ligazy lub nowej partii rekombinowanego enzymu przydatne jest określenie zakresu ligacji tła z adenylowanym enzymem przy braku dodatkowych kofaktorów nukleotydowych. Wiąże się to z przeprowadzeniem kolejnej reakcji, w której jednocześnie inkubuje się 10 μl nieznakowanej mieszanki wzorcowej, 10 μl znakowanej mieszanki głównej i 2,5 μl świeżego enzymu, który nie został zdeadenylowany.

Używaj podłoży z podwójnym oznaczeniem: Protokół ten wymaga zaprojektowania i zakupu oligonukleotydu z ugrupowaniem fluorescencyjnym, który ma inne widmo wzbudzenia/emisji niż pierwotnie użyty fluorofor, a następnie złożenia go w dupleks, tak aby dwa ortogonalne fluorofory znakowały różne części substratu. W razie wątpliwości dostępnych jest wiele internetowych przeglądarek widmowych do sprawdzania widm wzbudzenia i emisji, na przykład FPbase Spectra Viewer i BD Spectrum Viewer, które można wykorzystać do sprawdzenia zarówno kompatybilności pary fluoroforów, jak i najbardziej odpowiednich ustawień imagera. Konkretne ustawienia używane do wizualizacji żelu będą zależeć od modelu wyczuwalnika i użytego fluoroforu. Złożony obraz zarejestruje sygnał z obu kanałów na pojedynczym żelu, a pasmo, w którym oba fluorofory są przymocowane do tego samego produktu, będzie wyświetlane jako kolor pośredni. Oddzielne obrazy z poszczególnych kanałów mogą być analizowane w celu ilościowego określenia zakresu podwiązania lub degradacji na różnie znakowanych pasmach.

Ograniczenia techniki
Chociaż praca z podłożami znakowanymi fluorescencyjnie ma wiele zalet, takich jak niskie zagrożenie dla zdrowia, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy z tego typu oznakowanymi podłożami. Jednym z nich jest stosunkowo wysoki koszt zamówienia tych oligonukleotydów z etykietami fluoroforowymi lub modyfikacjami, takimi jak dodanie uszkodzonych zasad, w porównaniu z domieszkowaniem radioaktywnym. Innym jest to, że do wykrywania oznakowanych pasm wymagany jest specjalistyczny sprzęt i oprogramowanie do obrazowania. Jednak te cechy są teraz zawarte w większości nowych systemów wyobrażania sobie żeli. Należy również wziąć pod uwagę potencjał fluoroforów do zmiany właściwości wiązania docelowych białek interakcji. Fluoresceina i jej pochodna FAM są powszechnie używane do oznaczania oligonukleotydów i są wrażliwe na zmiany pH i wygaszanie zasad nukleotydowych65. Ograniczenia te należy dokładnie rozważyć przy podejmowaniu decyzji o rodzaju i rozmieszczeniu fluoroforów na oligonukleotydzie w przypadku projektowania dupleksowego.

Oświadczenia

SEG i UR są pracownikami firmy ArcticZymes Technologies AS, która zajmuje się dystrybucją ligazy R2D. AW, ER-S i RS nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

AW jest wspierany przez Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS jest laureatem stypendium New Zealand Post Antarctic Scholarship. SG i UR dziękują Instytutowi Chemicznemu Uniwersytetu w Tromsø - Norweskiemu Uniwersytetowi Arktycznemu za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% Akrylamid/Bis Roztwór (29:1)BioRad1610156
Adenozynotrifosforan (ATP)Wielu dostawców
Nadsiarczan amonu (APS)Wielu dostawców
Wirówka stołowaWielu dostawców
BoranWielu dostawców
Błękit bromofenolowyWiele dostawcy
Ditiothreitol (DTT)Wielu dostawców
System elektroforezy z kąpielą z wodą obiegowąWielu dostawców
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Wielu dostawców
Obrazowanie fluorescencji, np. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamidWiele dostawcy
System odlewania żeluWielu dostawców
Blok grzewczyWielu dostawców
Chlorek magnezuWielu dostawcówInne jony metali mogą być preferowane w zależności od badanego białka
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)Wielu dostawców
Mikropipety i końcówkiWielu dostawców1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 ml
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)Wielu dostawców
OligonukleotydyZintegrowane technologie DNANAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript i inni również dostarczają te
pipety pastwiskoweWielu dostawców
Termocykler PCRWielu dostawców
Probówki PCRWielu dostawców
RNAse awayThermoFisher7002PKPotrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami
RNA RNase AWAYMerck83931-250MLŚrodek powierzchniowo czynny do usuwania RNAzy zanieczyszczenie powierzchni
Woda wolna od RNAzaNew England BiolabsB1500LPotrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami RNA
Chlorek soduWielu dostawców
SUPERaza IN: inhibitor RNazyThermo Fisher ScientificAM2694Inhibitor RNAzy, o szerokim spektrum działania, (na bazie białka)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Może to być używane do barwienia żeli i wizualizacji nieoznakowanych oligonukleotydów
Tetrametyloetylenodiamina (TMED)Wielu dostawców
Tris, czyli tris(hydroksymetylo)aminometanWielu dostawców
Woda ultraczysta (Milli-Q)MocznikMerck
Wielu dostawców
VortexWielu dostawców
:

Bibliografia

  1. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), 7003(2019).
  2. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  3. Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009(2018).
  4. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  5. Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
  6. Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263(2020).
  7. Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
  8. Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
  9. Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
  10. Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
  11. Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 3, Unit 3.14 (2011).
  12. Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
  13. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5), Part b 963-989 (2016).
  14. Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
  15. Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
  16. Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3 (A) (2002).
  17. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  18. Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
  19. Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
  20. Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
  21. Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125(2017).
  22. Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
  23. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
  24. Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
  25. Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
  26. Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391(2016).
  27. Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
  28. Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
  29. Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062(2017).
  30. Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
  31. Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
  32. Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemistry. 43 (3), 710-717 (2004).
  33. Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
  34. Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14(2016).
  35. Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2(2010).
  36. Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148(2003).
  37. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
  38. Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
  39. Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389(2022).
  40. Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097(2021).
  41. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  42. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  43. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  44. Takemoto, N., Numata, I., Su'etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
  45. Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
  46. Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
  47. Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853(2019).
  48. Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), e52(2000).
  49. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  50. Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
  51. Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817(2023).
  52. Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97 (0), 29-36 (2014).
  53. Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
  54. Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65, Pt 6 544-550 (2009).
  55. Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
  56. Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711(2024).
  57. Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
  58. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), 10.1101/pdb.top101857 (2019).
  59. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
  60. Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-33 (1998).
  61. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  62. Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
  63. Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62(2019).
  64. Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257(2012).
  65. Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enzymy kwasów nukleinowychtest ligazy DNAtest ligazy RNAznakowanie fluorescencyjneelektroforeza PAGEenzymy naprawy DNAaktywność nukleazyhybrydy DNA-RNAprojektowanie substratów enzymatycznych
Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.