Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

DOI:

10.3791/66930

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępność szeregu modyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów od komercyjnych dostawców pozwoliła na opracowanie zaawansowanych testów do charakteryzowania różnych właściwości enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, które mogą być uruchamiane w dowolnym standardowym laboratorium biologii molekularnej. Zastosowanie etykiet fluorescencyjnych sprawiło, że metody te stały się dostępne dla badaczy dysponujących standardowym sprzętem do elektroforezy PAGE i obrazownikiem fluorescencyjnym, bez użycia materiałów radioaktywnych lub bez konieczności korzystania z laboratorium przeznaczonego do przechowywania i przygotowywania materiałów radioaktywnych, tj. Hot Lab. Opcjonalne dodanie standardowych modyfikacji, takich jak fosforylacja, może uprościć konfigurację testu, podczas gdy specyficzne włączenie zmodyfikowanych nukleotydów, które naśladują uszkodzenia DNA lub produkty pośrednie, może być wykorzystane do zbadania określonych aspektów zachowania enzymu. W tym miejscu zademonstrowano projektowanie i wykonanie testów w celu zbadania kilku aspektów przetwarzania DNA przez enzymy przy użyciu dostępnych na rynku syntetycznych oligonukleotydów. Obejmują one zdolność ligaz do łączenia się lub nukleaz do degradacji różnych struktur hybrydowych DNA i RNA, zróżnicowane wykorzystanie kofaktorów przez ligazę DNA oraz ocenę zdolności enzymów do wiązania DNA. Omówiono czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania syntetycznych substratów nukleotydowych, a także przedstawiono podstawowy zestaw oligonukleotydów, które można wykorzystać do szeregu testów ligaz kwasów nukleinowych, polimerazy i enzymów nukleazy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie formy życia wymagają enzymów przetwarzających kwasy nukleinowe do przeprowadzenia podstawowych procesów biologicznych, w tym replikacji, transkrypcji i naprawy DNA. Kluczowymi funkcjami enzymatycznymi tych szlaków są polimerazy, które generują kopie cząsteczek RNA/DNA, ligazy, które łączą substraty polinukleotydowe, nukleazy, które je degradują, oraz helikazy i topoizomerazy, które topią dupleksy kwasów nukleinowych lub zmieniają ich topologię1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ponadto wiele z tych enzymów dostarcza niezbędnych narzędzi molekularnych do zastosowań takich jak klonowanie, diagnostyka i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości11,12,13,14,15.

Cechy funkcjonalne, kinetyka i specyficzność substratów tych enzymów mogą być określone za pomocą znakowanych substratów DNA/RNA wytwarzanych przez wyżarzanie oligonukleotydów. Śledzenie substratów i produktów tradycyjnie odbywało się poprzez wprowadzenie znacznika radioaktywnego (32P) na końcu nici 5', który można następnie wykryć za pomocą kliszy fotograficznej lub systemu obrazowania luminoforowego16,17. Podczas gdy znakowane radioizotopowo substraty oferują korzyści w postaci zwiększonej czułości eksperymentalnej i nie zmieniają właściwości chemicznych nukleotydu, potencjalne zagrożenia dla zdrowia wynikające z pracy z radioizotopami zachęciły do opracowania nieradioaktywnego znakowania kwasami nukleinowymi, aby zapewnić bezpieczniejszą alternatywę dla wykrywania DNA i RNA18,19,20. Wśród nich detekcja fluorescencji, w tym bezpośrednia detekcja fluorescencji, fluorescencja czasowo-rozdzielcza oraz testy transferu energii/wygaszania fluorescencji, wyróżniają się jako najbardziej wszechstronne21,22,23,24. Szeroka gama fluoroforów umożliwia różne projekty substratów DNA/RNA z unikalnymi reporterami na każdym oligonukleotydzie25. Dodatkowo, stabilność fluoroforów, w porównaniu z radioizotopami, pozwala użytkownikom na produkcję i zachowanie znacznych ilości fluorescencyjnie znakowanych substratów DNA19. Te znakowane fluoroforem substraty mogą być inkubowane z interesującym białkiem, wraz z różnymi kombinacjami kofaktorów metali i nukleotydów, w celu analizy aktywności wiązania i/lub enzymu. Wizualizację wiązania lub aktywności można zaobserwować za pomocą różnych kanałów barwnika fluoroforowego z systemem obrazowania żelowego. Ponieważ tylko fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy będą widoczne przy użyciu tej techniki, każdy wzrost lub spadek rozmiaru znakowanego oligonukleotydu będzie łatwy do prześledzenia. Żele można również później zabarwić barwnikami barwiącymi kwasy nukleinowe, aby uwidocznić wszystkie prążki DNA obecne na żelu.

Ligazy kwasu polinukleinowego to enzymy, które łączą fragmenty DNA/RNA, katalizując uszczelnianie pęknięć poprzez tworzenie wiązania fosfodiestrowego między 5' fosforylowanymi końcami DNA a 3' OH DNA. Można je podzielić na dwie grupy w zależności od wymagań dotyczących substratu nukleotydowego. Wysoce konserwatywne ligazy zależne od NAD znajdują się we wszystkich bakteriach26, podczas gdy strukturalnie zróżnicowane enzymy zależne od ATP można zidentyfikować we wszystkich domenach życia8,27. Ligazy DNA odgrywają ważną rolę w przetwarzaniu fragmentów Okazaki podczas replikacji, a także biorą udział w różnych szlakach naprawy DNA, takich jak naprawa nukleotydów i wycięć zasad, poprzez uszczelnianie spontanicznych nacięć i nacięć, które pozostają po naprawie8,10. Różne ligazy DNA wykazują różne zdolności do łączenia różnych konformacji pęknięć DNA, w tym nacięć w dupleksie, pęknięć dwuniciowych, niedopasowań i luk, a także hybryd RNA i DNA28,29,30. Różnorodna gama zligawalnych substratów może być łączona przez wyżarzanie oligonukleotydów fosforanem 5' w celu wytworzenia zestawionych końców 5' i 3' w dupleksie kwasu nukleinowego31,32,33. Najczęstszą metodą analizy jest rozdzielczość mocznika PAGE w formacie testu punktu końcowego; Jednak ostatnie innowacje obejmują zastosowanie elektroforezy w żelu kapilarnym, która umożliwia wysoką przepustowość34, profilowanie spektrometryczne mas35, a także jednorodny molekularny test nawigacyjny, który umożliwia monitorowanie z rozdzielczością czasową36.

Pierwszym krokiem w reakcji ligacji jest adenylacja enzymu ligazy przez trifosforan adenozyny (ATP) lub dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD), w wyniku czego powstaje pośredni enzym kowalencyjny. Drugim etapem reakcji jest adenylacja substratu kwasu nukleinowego na końcu 5' miejsca nacięcia, po której następuje ligacja nici nacięcia kwasu nukleinowego. Wiele enzymów ligazowych, które ulegają rekombinacyjnej ekspresji w E. coli, jest oczyszczanych w postaci adenylowanej i dlatego są w stanie z powodzeniem ligować kwasy nukleinowe bez dodawania kofaktora nukleotydowego. Utrudnia to określenie, jaki konkretny typ kofaktora nukleotydowego są potrzebne do ligacji kwasów nukleinowych. Oprócz opisu testów oceniających aktywność ligazy DNA, przedstawiono również metodę wiarygodnego określania użycia kofaktora poprzez deadenylację enzymu przy użyciu nieznakowanych substratów.

Nukleazy to duża i zróżnicowana grupa enzymów modyfikujących DNA/RNA oraz katalitycznych RNA, które rozszczepiają wiązania fosfodiestrowe między kwasami nukleinowymi37. Funkcje enzymów nukleazy są wymagane w replikacji, naprawie i przetwarzaniu DNA i można je sklasyfikować według ich specyficzności cukrowej dla DNA, RNA lub obu. Endonukleazy hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w nici DNA/RNA, podczas gdy egzonukleazy hydrolizują nici DNA/RNA po jednym nukleotydzie na raz od końca 3' lub 5' i mogą to robić od końca 3' do 5' lub od 5' do 3' klasy DNA38.

Podczas gdy wiele białek nukleazy jest niespecyficznych i może brać udział w wielu procesach, inne są wysoce specyficzne dla określonej sekwencji lub uszkodzenia DNA6,39,40. Nukleazy specyficzne dla sekwencji są wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych, takich jak klonowanie, mutageneza i edycja genomu. Popularnymi nukleazami do tych zastosowań są nukleazy restrykcyjne41, nukleazy palców cynkowych42, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, a ostatnio nukleazy CRISPR sterowane przez RNA43. Ostatnio zidentyfikowano nukleazy specyficzne dla uszkodzeń, takie jak nukleaza EndoMS, która ma swoistość dla niedopasowań w DNA dzięki specyficznej dla niedopasowania domenie nukleazy podobnej do RecB5,44. Historycznie rzecz biorąc, testy aktywności nukleazy były wykonywane jako testy nieciągłe z substratami znakowanymi radioaktywnie; Jednak oprócz innych wad, nie pozwalają one na identyfikację miejsca, które jest cięte przez białko nukleazy, co jest możliwe przy użyciu substratów znakowanych fluorescencyjnie45,46. Niedawno opracowano ciągłe testy nukleazy, które działają przy użyciu różnych barwników DNA, które oddziałują z DNA w różnych stanach; na przykład, emitując silniejszy sygnał fluorescencyjny podczas interakcji z dsDNA niż w stanie niezwiązanym lub wiążąc się specyficznie z krótkimi RNAs47. Inne ciągłe testy nukleazy wykorzystują spinki do włosów DNA z grupą fluoroforową na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3', dzięki czemu fluorescencja wzrasta wraz z degradacją oligonukleotydu w wyniku oddzielenia fluoroforu i wygaszacza48. Podczas gdy testy te pozwalają scharakteryzować kinetykę białek rozkładających DNA, wymagają one wcześniejszej wiedzy na temat funkcji i substratu enzymu, a także ograniczają się do enzymów, które zmieniają konformację DNA, powodując różnicę w wiązaniu barwnika. Z tego powodu testy punktów końcowych, które rozwiązują poszczególne produkty nukleazy, są nadal pożądane, aby zapewnić wgląd w modyfikacje DNA spowodowane aktywnością białka.

Tutaj przedstawiono szczegółową procedurę projektowania fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów DNA/RNA, które mogą być mieszane i dopasowywane w celu wygenerowania substratów do testowania aktywności nowych enzymów nukleazowych, polimerazowych i ligazowych. Walidacja tego podstawowego zestawu sekwencji oligonukleotydowych upraszcza projektowanie eksperymentów i ułatwia ekonomiczne profilowanie szerokiego zakresu funkcji enzymatycznych bez konieczności zakupu dużej liczby substratów na zamówienie. Przedstawiono szczegółową procedurę przeprowadzania standardowego testu enzymatycznego przetwarzania DNA z tymi substratami, na przykładzie aktywności ligazy DNA i opisano modyfikacje do oznaczania i analizy enzymów nukleazy i polimerazy. Ponadto podano zmodyfikowany test do określenia swoistości kofaktora enzymu ligazy DNA z dużą dokładnością, a podwójnie znakowane sondy są używane do oceny montażu ligacji wieloskładnikowych. Na koniec omówiono modyfikacje podstawowego formatu testu, aby umożliwić jego wykorzystanie do określenia interakcji białko-DNA z tymi samymi substratami za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i zakup oligonukleotydów

UWAGA: Zaprojektuj jednoniciowe oligonukleotydy do składania i wyżarzania w pożądane dupleksy. Jedna lub więcej nici w dupleksie musi mieć ugrupowanie fluorescencyjne do śledzenia przetwarzania oligonukleotydów przez enzym będący przedmiotem zainteresowania. Podstawowy zestaw jednoniciowych sekwencji, które można złożyć dla szeregu działań, przedstawiono w tabeli 1.

  1. Uwzględnij specyficzne modyfikacje potrzebne dla enzymu będącego przedmiotem zainteresowania, jak opisano poniżej.
    1. Dla substratów ligazy DNA (Rysunek 1): Złóż najprostszy substrat z trzech oligonukleotydów: 5' fosforylowanej nici donorowej (NL2), nici akceptorowej znakowanej 5' FAM (NL1) i dopełniacza, który łączy te dwa (NL3).
      1. Upewnij się, że pasma zapewniające 5' koniec związanego nacięcia są fosforylowane przed złożeniem mieszanki głównej substratu w kroku 2. Zamów to jako modyfikację NL2 (jak podano w Tabeli 1) lub zastosuj fosforylację enzymatyczną za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 po ponownym zawieszeniu oligonukleotydów.
      2. Obejmują 5'-końcową fosforylację NL6 i NL8, które składają się z dopełnienia dwuniciowych pęknięć przedstawionych w Rysunek 1A (NL6 / NL7 i NL8 / NL9), ponieważ najbardziej przypomina naturalny substrat wytwarzany z endonukleazy restrykcyjnej. Użyj podwójnie oznakowanego podłoża, aby określić względny zakres ligacji dla zespołów wieloczęściowych (patrz krok 6).
      3. Zmienić nić dopełniacza, aby uzyskać niezgodności (NL10) i przerwy (NL11).
        UWAGA: Wariacje na temat prostego podłoża z wyszczerbieniami są przedstawione w Rysunek 1A. Możliwe jest użycie innych sekwencji w celu uzyskania jeszcze szerszego zakresu niedopasowań lub dłuższych przerw poprzez zmianę podkreślonej pozycji.
      4. Zastąp oligonukleotydy DNA oligonukleotydami RNA.
        UWAGA: Wariacje na temat prostego podłoża z nacięciami są przedstawione w Rysunek 1B. Szerszy zakres dupleksów DNA/RNA może być generowany przez dodatkowe kombinacje podanego tutaj zestawu podstawowego w celu wygenerowania, na przykład, dwuniciowych pęknięć zawierających zarówno RNA, jak i DNA. Przykład tej odmiany znajduje się w kroku 6 poniżej, w którym stosuje się strategię podwójnej etykiety.
    2. Dla substratów polimerazy DNA: Zbierz oligonukleotydy NL1 i NL3 wymienione w tabeli 1, aby uzyskać prosty test wydłużenia startera. Zbadaj dodatkowe aspekty aktywności polimerazy, wprowadzając modyfikacje do nici NL1 (starter) lub NL3 (matryca).
      1. Włączyć uszkodzone analogi zasad do oligonukleotydu NL3 przed pozycją 20, aby określić zdolność do ominięcia uszkodzonych zmian na nici matrycy.
      2. Włącz uszkodzone analogi zasad do oligonukleotydu NL1 w pozycji 20, aby określić zdolność do przedłużenia uszkodzonego startera.
      3. Użyj RNL1 lub RNL3 w dupleksie, aby zbadać rozszerzenie startera RNA lub użycie matrycy RNA.
    3. Dla substratów nukleaz (Rysunek 2): Zbierz oligonukleotydy, aby uzyskać niewyczerpujący zakres dwu- i jednoniciowych substratów (Rysunek 2Ai), a także zakres trzepoczących i rozłożonych połączeń (Rysunek 2Aii) i uszkodzonych substratów (Rysunek 2B).
      1. Aby zbadać aktywność rybonukleazy, iteracyjnie zastąp NL1, NL2 i NL3 RNL1, RNL2 i RNL3. Użyj dodatkowych wersji RNA HJ5 i HJ6, aby jeszcze bardziej rozszerzyć ten zestaw.
      2. Użyj oligonukleotydów MD5, MD6 i MD9, które mają centralnie umieszczoną modyfikację, która naśladuje uszkodzenie oksydacyjne, podstawowy produkt pośredni naprawy lub produkt deaminacji (Rysunek 2B). Substraty wykryją rozszczepienie pasma w tej pozycji. Oznaczyć nić NL3 dopełniacza ortogonalnym fluoroforem, takim jak TAMRA, aby wykryć rozszczepienie dwuniciowe (patrz krok 6).
      3. Użyj ortogonalnego etykietowania dopełniacza, aby wykryć cięcie dwuniciowe w niedopasowanych miejscach zarówno na sondzie (NL5 i ND9), jak i na niciach dopełniacza (MD10 i NL10).
  2. Zamów syntetyczne oligonukleotydy zawierające odpowiednie fluorofory i inne modyfikacje od komercyjnego dostawcy.
    UWAGA: Skala syntezy 100 nM i oczyszczanie HPLC po syntezie są odpowiednie dla opisanych testów.

2. Montaż i wyżarzanie dupleksów z kwasami nukleinowymi

  1. Ponowne zawieszenie i rozcieńczenie oligonukleotydów
    1. Przed otwarciem odwiruj liofilizowane oligonukleotydy w probówkach o pojemności 2 ml z pełną prędkością w wirówce stołowej przez 2-5 minut, aby upewnić się, że kwas nukleinowy znajduje się na dnie probówki.
    2. Przygotować zapas główny 100 μM przez ponowne zawieszenie oligonukleotydów w buforze TE (10 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)). Upewnij się, że oligonukleotydy są dokładnie zawieszone przez wielokrotne delikatne wirowanie i krótkie wirowanie z pełną prędkością.
    3. Przygotować materiał o objętości 10 μM, rozcieńczając podwielokrotność materiału wzorcowego buforem TE. Rozcieńczyć 10 μM wodą ultraczystą (wodą MQ), aby przygotować zapasy robocze o stężeniach 0,5 μM, 0,7 μM lub 2,5 μM, zgodnie z tabelą 2.
  2. Montaż i wyżarzanie głównych mieszanek reakcyjnych
    1. Użyć zapasów roboczych do uzupełnienia głównych mieszanek reakcyjnych, stosując kombinacje podane w tabeli 2 i objętości podane w tabeli 3. W przypadku standardowego testu ligazy DNA i większości innych opisanych tutaj testów, ostateczny skład buforu to 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM Ditiothreitol (DTT) z 10 mM Mg jako kationem dwuwartościowym.
    2. Wyżarzać oligonukleotydy w probówce do PCR lub mikrowirówki, ogrzewając w temperaturze 95 °C przez 5 minut przy użyciu bloku grzewczego lub termocyklera. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30 minut (objętość <1 ml) do 1 godziny (objętość >1 ml). W przypadku dłuższych oligonukleotydów (>40 nt) należy przeprowadzić wolniejsze chłodzenie za pomocą termocyklera z rampą opadającą od 95 °C do 25 °C przez 45 minut lub umieścić probówkę zawierającą mieszaninę wyżarzania w 1 litrowej zlewce z wrzącą wodą i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej na noc.
    3. Dodaj kofaktory nukleotydowe i inne wrażliwe na ciepło składniki buforowe do mieszanki głównej po schłodzeniu do temperatury pokojowej. Końcową mieszaninę reakcyjną należy wykorzystać bezpośrednio do analizy przez dodanie enzymu (patrz krok 3 poniżej) lub przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Standardowa konfiguracja testu

  1. Montaż i rozpoczęcie reakcji oznaczania
    1. Połączyć 22,5 μl mieszaniny głównej substratu z 2,5 μl ligazy DNA lub innego enzymu będącego przedmiotem zainteresowania w probówce PCR. Przeprowadzaj reakcje w dwóch lub trzech powtórzeniach, zwłaszcza jeśli wyniki będą oznaczane ilościowo.
    2. Do próbek testowych należy dołączyć kontrolę niezawierającą białka (tylko bufor). W razie potrzeby w tym momencie nie dołączaj żadnych kontrolek kofaktora.
      UWAGA: Enzymy mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w 50% v/v glicerolu, co pozwala na ich pipetowanie bezpośrednio z roztworu. Upewnij się, że roztwory enzymów z glicerolem są dobrze wymieszane przed dodaniem, albo przez pipetowanie w celu wymieszania, albo przez delikatne wirowanie.
  2. Natychmiast przenieść reakcje do maszyny PCR w temperaturze 25 °C i inkubować przez 30 minut. Zmieniaj temperaturę i czas trwania w zależności od optymalnych warunków aktywności enzymu.
  3. Stłumić reakcje, dodając 5 μl barwnika ładującego (95% formamidu, 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), błękit bromofenolowy) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.

4. Analiza wyników testów

  1. Przygotuj żele Tris-Borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotuj zapas 20% akrylamidu, 7 M mocznika i 1x roztwór TBE. W przypadku opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów należy użyć roztworu akrylamidu/Bis w stosunku 29:1, aby uzyskać optymalną rozdzielczość.
    2. W przypadku jednego żelu połączyć 10 ml 20% roztworu akryloamidu i 7 M roztworu mocznika ze 100 μl APS (10%) i 3 μl tetrametyloetylenodiaminy (TMED) i odlać w żelowym kółku.
  2. Po zestaleniu się żelu należy rozprowadzić próbki na żelu mocznikowym TBE w temperaturze 45 - 55 °C.
    1. Wstępnie uruchom żel w 1x bufor TBE przez 30 minut przy 10 mA na żel z zewnętrznym ogrzewaniem.
    2. Usunąć nadmiar mocznika z dołków żelu, przepłukując 1x TBE za pomocą pipety pastwiskowej.
    3. Załaduj 10 μl każdej reakcji i pracuj pod ciśnieniem 10 mA przez 1,0-1,5 godziny z ogrzewaniem zewnętrznym.
  3. Wizualizuj żel na imagerze z prawidłowymi ustawieniami dla wybranego fluoroforu. W przypadku FAM należy użyć zestawu filtrów, który daje wzbudzenie/emisję przy 495/519 nm, który jest przechowywany jako ustawienie wstępne w większości imagerów.
  4. Określ ilościowo intensywność pasma produktu i podłoża za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu z imagerem lub zewnętrznego programu, takiego jak ImageJ49,50 i oblicz procent produktu, korzystając ze wzoru
    Wzór na proporcję, P/(P+S)×100, używany do obliczania procentu w analizie danych.
    Gdzie P jest integralną wartością pasma produktu, a S jest zintegrowanym obszarem pasma substratu. W przypadku przykładu reakcji ligazy DNA pasmo produktu przebiega przy 40 nukleotydach (nt), a pasmo substratu przy 20 nt.

5. Dedenylacja ligazy DNA w celu zbadania swoistości kofaktora

  1. Przygotowanie wzorcowych mieszanek reakcyjnych
    1. Przygotować jeden zestaw mieszanki wzorcowej zawierającej oligonukleotyd NL1 znakowany FAM, jak opisano w tabeli 4. Przygotować drugi zestaw zawierający oligonukleotyd NL1 bez znacznika FAM, jak opisano w Tabeli 4.
    2. Oddzielnie podgrzewać oba dupleksy DNA do 95 °C przez 5 minut i schładzać przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 25 °C. Nie dodawaj kofaktora nukleotydowego do żadnej z głównych mieszanek.
  2. Montaż i inicjacja reakcji deadenylacji
    1. Przygotować pojedynczą reakcję deadenylacji dla każdego typu/stężenia kofaktora, który ma być badany, łącząc 10 μl nieznakowanej mieszanki wzorcowej z 2,5 μl enzymu ligazy.
    2. Przygotuj dodatkowe probówki jako kontrolę bez kofaktora i bez kontroli białkowej (2,5 μl buforu dodane w miejsce enzymu).
    3. Inkubować reakcje w temperaturze odpowiedniej do optymalnej aktywności enzymu przez 1-2 godziny. Czas inkubacji można wydłużyć, jeśli enzym jest nadal adenylowany.
  3. Przeprowadź reakcję ligacji z kofaktorem.
    1. Dodać 10 μl znakowanej mieszanki głównej i 2,5 μl pożądanych kofaktorów nukleotydowych (np. ATP, NAD, ADP lub GTP) bezpośrednio do reakcji dedenylowanej (stężenie końcowe 0,1-1 mM).
    2. Dodać 2,5 μl buforu reakcyjnego do kontroli kofaktora bez nukleotydów.
    3. Inkubować reakcje przez ten sam okres czasu i temperaturę, jak poprzednio stosowane. Wygaszaj i wizualizuj zgodnie z opisem w kroku 4.

6. Używanie podwójnie znakowanych substratów do szynowania podwiązania lub montażu wieloczęściowego

  1. Zaprojektuj i kup oligonukleotyd z ugrupowaniem fluorescencyjnym, który ma inne widmo wzbudzenia/emisji niż już użyty fluorofor.
    1. W opisanym tutaj układzie użyj oligonukleotydu NL2 (TAMRA) zawierającego 5-karboksytetrametylorodaminę (TAMRA) na końcu 3' (Tabela 1).
  2. Złóż mieszankę wzorcową zgodnie z poniższym opisem.
    1. Połączyć składniki reakcji opisane w kroku 2, w tym proporcje równomolowe wszystkich oligonukleotydów użytych w złożeniu, a także kationy buforowe i dwuwartościowe.
    2. Wyżarzanie przez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut i chłodzenie w temperaturze 25 °C przez 30 minut - 1 h. Dodać kofaktor i enzym i inkubować zgodnie z opisem w kroku 3.
  3. Uruchom i zobrazuj próbki zgodnie z opisem w kroku 4, używając odpowiednich kanałów dla pary fluoroforów w podłożu. W przypadku FAM i TAMRA są to kanały fluoresceiny (FITC) i tetrametylodaminy (TRITC) obecne w większości kamer.

7. Ocena wiązania DNA za pomocą testu EMSA (Electroforetic Mobility Shift Assay) na natywnym żelu

  1. Przygotuj 10% natywny żel TBE PAGE zgodnie z poniższym opisem.
    1. Połącz 2,5 ml 40% akrylamidu, 1 ml 10 x TBE, 100 μl 10% APS, 3 μl TMED i 6,5 ml wody MQ i odlej w żelowym kółku.
  2. Zebrać reakcję wiązania zgodnie z opisem poniżej.
    1. Zmontować podłoże EMSA zgodnie z tabelą 5 tak, aby EDTA (10 mM) był włączony, a jony metali pominięte.
    2. Połączyć 20 μl głównej mieszanki substratowej EMSA z 5 μl białka w probówce do PCR. Dołączyć próbkę kontrolną bez białka. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
  3. Analizuj za pomocą natywnej elektroforezy, jak opisano poniżej.
    1. Do próbek dodać 5 μl 5x natywnego barwnika ładującego (100 mM EDTA, 0,25% błękitu bromofenolowego, 25% v/v glicerolu i wody MQ do 1 ml) do próbek.
    2. Załaduj przygotowany żel i pracuj pod napięciem 60 V przez 2-3 godziny z chłodzeniem przez cyrkulację wody, aż czoło barwnika znajdzie się kilka cm nad końcem żelu.
    3. Wizualizuj i analizuj żele zgodnie z opisem w kroku 4.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligacja za pomocą ligazy DNA
Aktywność enzymatyczna ligazy DNA spowoduje wzrost wielkości fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu po wizualizacji na żelu mocznikowym PAGE. W przypadku substratów zarówno do ligacji DNA, jak i RNA wymienionych w tabeli 2, odpowiada to podwojeniu wielkości z 20 nt do 40 nt (Rysunek 3A). Optymalna aktywność enzymu może być określona przez zmieniające się warunki, takie jak temperatura, stężenie białka lub czas inkubacji ( Rysunek 3B) kofaktory nukleotydów, kofaktory metali (Rysunek 3C). Względne aktywności ligazy na różnych podłożach mogą być porównywane równolegle (Rysunek 3D).

Kwantyfikacja pasm produktu i substratu jest wyrażona jako procent całkowitego podwojonego substratu i, jak pokazano w Rysunek 3, może być użyta do oceny specyficznej aktywności enzymu lub do określenia optima aktywności, takiego jak preferencja kationów dwuwartościowych, temperatura lub pH.

Bakteryjna ligaza DNA DV-1-1-Lig (Rysunek 3) jest zdolna do ligowania nacięć i niedopasowanych substratów DNA i może wykorzystywać zarówno magnez, jak i mangan do aktywności ligacji, z preferencją dla magnezu. Więcej szczegółów na temat tego enzymu można znaleźć w51.

Rozszerzenie startera przez polimerazę DNA
Aktywność polimerazy DNA poprzez rozszerzenie 20 nt znakowanego fluorescencyjnie startera spowoduje wzrost rozmiaru do 40 nt przy użyciu przedstawionego tutaj zestawu oligonukleotydów (Rysunek 4A). Częściowo rozszerzone produkty pojawią się jako drabina produktów do rozmiaru szablonu (Rysunek 4B i Rysunek 4C). Przedstawiony tutaj test wydłużenia startera (Rysunek 4C) doprowadził do pełnej syntezy nici startera.

Degradacja przez nukleazę
Aktywność nukleazy powoduje zmniejszenie wielkości znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu po wizualizacji na żelu mocznikowym PAGE. Nukleazy o specyficznej aktywności endonukleazy mogą prowadzić do powstania pojedynczego produktu o stężeniu 20 nt (Rysunek 5A-C). Nukleazy o aktywności egzonukleazy spowodują powstanie fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów o różnych rozmiarach (Rysunek 5D-F). W tym miejscu przedstawiono wyniki bakteryjnego antarktycznego białka nukleazy metagenomu, które wykazuje specyficzną aktywność endonukleazy na dwuniciowym substracie w miejscu apodstawowym i niespecyficzną aktywność egzonukleazy na podłożu jednoniciowym (Rysunek 5C i Rysunek 5F, odpowiednio).

Test użycia dedenylacji ligazy i kofaktora nukleotydowego
Wiele rekombinowanych enzymów ligazy ulega ekspresji i jest oczyszczanych w stanie już adenylowanym z ATP lub NAD wyczyszczonych z ich host51,52,53,54,55. Usunięcie tego kowalencyjnego produktu pośredniego AMP jest konieczne do dokładnej identyfikacji zakresu kofaktorów nukleotydowych, które enzym może wykorzystać do ligacji substratów kwasów nukleinowych51. Obrót adenylowanego enzymu ligazy z nieznakowanym substratem przy braku egzogennego kofaktora nukleotydowego zuboży produkt pośredni adenylacji. Stosując znakowane fluorescencyjnie substraty DNA i dodając kofaktor nukleotydowy tylko w drugim etapie, każdy produkt ligacji, który jest widoczny podczas korzystania z kanału fluorescencyjnego (Fluoresceina-FITC) w obrazie żelowym, jest wynikiem adenylacji z kofaktorem nukleotydowym dodanym na tym etapie.

Testy aktywności ustawione z ligazą DNA bakterii wyrażoną w systemie E. coli pokazują, że została ona oczyszczona w formie wstępnie adenylowanej i wykazywała zdolność tła do ligacji naciętego DNA bez dodatkowego kofaktora (Rysunek 6Ai-ii). Dodanie ATP do adenylowanej ligazy zwiększa ilość ligowanego produktu powstającego w reakcji, ale nie zawsze jest to wiarygodne, ponieważ ta podstawowa aktywność może dawać błędne wrażenie użycia kofaktora o szerokim spektrum działania lub dalsze dodawanie kofaktorów nukleotydowych do reakcji może hamować ligację substratu. Najpierw inkubując ligazę z nieznakowaną wersją naciętego substratu DNA, AMP jest odwracany i nie obserwuje się ligacji na znakowanym substracie nacięcia DNA, chyba że do reakcji dodaje się ATP. Drugi test aktywności (Rysunek 6B) pokazuje, że de-adenylowana ligaza DNA poprawiła aktywność ligacji na substracie DNA z dodatkiem ATP i ADP. Następuje również pewna poprawa w podwiązaniu po dodaniu GTP, która jest większa niż ligacja tła obserwowana w kontroli bez kofaktora. Ligacja obserwowana w reakcjach z NAD jest porównywalna z ligacją obserwowaną w reakcjach kontrolnych bez kofaktora, co wyklucza NAD jako kofaktor dla ligacji.

Wyniki testu podwójnie znakowanego
Ortogonalne fluorofory mogą być używane do ustalania aktywności w różnych częściach złożonego podłoża. Przykład w Rysunek 7 pokazuje aktywność niedawno opisanej ligazy DNA R2D56 w porównaniu z ligazą DNA T4 na szynowanym dupleksie DNA/RNA. Ligację akceptora DNA do sekcji dawcy RNA substratu wykryto przy użyciu 6-FAM, podczas gdy ligację akceptora RNA do dawcy DNA wykryto za pomocą 5-TAMRA (Figura 7A). Względny zakres ligacji DNA do obu końców substratu RNA można ocenić na podstawie obecności pasma produktu z fluorescencją zarówno w kanałach 6-TAM, jak i 5-TAMRA, który na obrazie złożonym pojawia się jako żółty, podczas gdy poszczególne 6-FAM i 5-TAMRA są odpowiednio zielone i żółte (Figura 7B). Jak szczegółowo opisano w poprzedniej publikacji56, tylko ligaza R2D była w stanie związać DNA do końca 5' RNA, podczas gdy obie ligazy były w stanie związać DNA do końca 3' RNA. Podczas ligacji obu cząsteczek DNA do RNA w mieszaninach jednoreakcyjnych, ligaza R2D może ligować oligonukleotydy DNA do obu końców RNA, gdy pasmo przesuwa się w górę i obserwuje się zmianę koloru na żółty (Rysunek 7C).

Drugi przykład w Rysunek 8 wykorzystuje podejście podwójnego znakowania, aby zademonstrować ligację wielu oligonukleotydów o różnym pH. Substrat, złożony z mieszaniny siedmiu oligonukleotydów, wykorzystano do wykazania zdolności ligazy R2D do składania krótkich fragmentów. Nić 5' ma znakowaną fluoroforem nić 14 nt znakowaną fluoroforem, podczas gdy nić dopełniacza ma fluorofor TAMRA na końcu 3' oligonukleotydu 16 nt. Udane podwiązanie można zaobserwować za pomocą dodatkowych wyższych prążków dla oligonugoligugolaktykugi FAM (zielonej) i oligonugoligugolaktykugi TAMRA (czerwonej). Nakładanie się obu fluoroforów daje pasmo nukleotydowe w kolorze żółtym jako całkowicie podwiązane nici tego samego rozmiaru.

Wyniki wiązania DNA z enzymu ligazy DNA za pomocą EMSA
Wiązanie enzymu ligazy DNA z fosforylowanym, naciętym DNA powoduje powstanie kompleksu, który działa z większą masą cząsteczkową niż sam oligonukleotyd (Figura 9A). Tutaj pokazano wiązanie bakteryjnej ligazy DNA zależnej od ATP z substratem DNA nacięcia. Przy wysokich stężeniach białek większość znakowanego substratu DNA jest związana i widoczna w pasmach o wyższej masie cząsteczkowej; przy niższych stężeniach białek dominuje wolny substrat DNA (Ryc. 9B).

Schemat substratów ligazy DNA/RNA; nick,, spójny, niedopasowanie, luka; Hybrydowe nici RNA-DNA.
Rysunek 1: Schematy różnych substratów kwasów nukleinowych przeznaczone do testowania aktywności enzymatycznej ligazy. Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5' FAM). Znakowane nici są oznaczone czarną lub ciemnoniebieską/czerwoną (w przypadku dupleksów DNA/RNA), podczas gdy nieznakowane części dupleksów substratowych są oznaczone szarą lub jasnoniebieską/czerwoną (w przypadku dupleksów DNA/RNA). Oznakowane pasma mają 20 nt, a jeśli pasma są podwiązane, tworzą produkt 40 nt. Miejsca fosforylowane 5' są oznaczone literą P w okręgu. Nici oligonukleotydowe są oznaczone, a nazwy są wymienione w Tabeli 1 i Tabeli 2. (A) Projektowanie dwuniciowych substratów DNA z różnymi typami pęknięć, wykorzystywanych do badania aktywności enzymatycznej ligaz DNA. (B) Projektowanie dwuniciowych substratów RNA i RNA/DNA, które zawierają oligonukleotydy DNA i RNA. Substraty zawierają pojedyncze miejsce nacięcia i są używane do testowania zdolności ligaz do uszczelniania pęknięć nacięć dupleksów RNA / DNA. Czerwona linia reprezentuje oligonukleotydy RNA, a niebieskie linie reprezentują oligonukleotydy DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat substratu DNA: nukleaza, zmodyfikowana, uszkodzona. Typy: Ds, Ss, ogon, klapa, rozchylenie. Niezgodności podstawowe.
Rysunek 2: Schematy różnych substratów kwasów nukleinowych przeznaczonych do testowania aktywności enzymatycznej nukleazy. Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5' FAM). Oznakowane pasma są oznaczone czarną linią, podczas gdy nieoznaczone części dupleksów podłoża są oznaczone szarą linią. Miejsca fosforylowane 5' są oznaczone literą P w okręgu. Nici oligonukleotydowe są oznaczone, a nazwy są wymienione w Tabeli 1 i Tabeli 2. (A) Projektowanie podłoży z częściami dwu- i jednoniciowymi. (B) Konstrukcja dwuniciowych substratów DNA jest modyfikowana w celu wygenerowania jednoniciowych płatów na końcu 3' lub 5' (Flapped 3', Flapped 5' lub flapped oba końce (rozchylone)). (C) Projektowanie dwuniciowych podłoży zawierających uszkodzone zasady lub niedopasowania w centralnym położeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Proces ligacji DNA, analiza żelu PAGE; oddziaływanie enzym-substrat, wyniki elektroforezy.
Rysunek 3: Testowanie aktywności ligacji bakteryjnej ligazy DNA zależnej od ATP DV-1-1-Lig. (A) Schemat testów enzymatycznych aktywności ligazy na substratach DNA z wynikami analizowanymi na żelu mocznikowym TBE PAGE. Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5' FAM). Oznakowane pasma są oznaczone czarną linią, natomiast nieoznaczone części dupleksów podłoża, które nie są widoczne podczas analizy, są oznaczone szarymi liniami. (B) Kwantyfikacja ligacji przez DV-1-1-Lig na naciętym DNA w różnych punktach czasowych. Działanie na każdym substracie przeprowadzono w dwóch egzemplarzach. Reakcje inkubowano przez różne okresy czasu (0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h i 4 h) w temperaturze 25 °C, przy końcowym stężeniu białka 4 μM, końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowym stężeniu jonów magnezu 10 mM. (C) Ligacja naciętego substratu DNA magnezem (Mg) lub manganem (Mn). Reakcje prowadzono przez 3 godziny, w temperaturze 25 °C, przy końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowym stężeniu jonów metali 10 mM. (D) Wyniki ligacji na różnych substratach DNA. Reakcje prowadzono przez 8 godzin, w temperaturze 20 °C, przy końcowym stężeniu białka 2 μM, końcowym stężeniu ATP 1 mM i końcowym stężeniu magnezu 10 mM. Dodanie białka do reakcji jest oznaczone symbolem plusa (+). Reakcje kontrolne są oznaczone symbolem C, a brak zawartego białka jest oznaczony symbolem minus (-). Produkt (40 nt) i podłoże (20 nt) są oznaczone czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności zostały zobrazowane za pomocą systemu obrazowania. Pasma zostały określone ilościowo przez całkowanie intensywności za pomocą oprogramowania ImageJ49, a wykresy zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram reakcji polimerazy DNA; żel denaturujący PAGE; analiza produktu, proces przedłużania DNA.
Rysunek 4: Test polimerazy DNA. (A) Schemat testu przedłużania startera na substracie DNA. Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5' FAM). Oznakowane pasma są oznaczone czarną linią, natomiast nieoznaczone części dupleksów podłoża, które nie są widoczne podczas analizy, są oznaczone szarymi liniami. (B) Schemat przewidywanych wyników żelu TBE Urea PAGE pokazujących wzrost długości znakowanego startera po dodaniu nukleotydów. (C) Przykład rozszerzenia startera za pomocą enzymu polimerazy DNA fragmentu E. coli Klenowa. Dodanie białka do reakcji jest oznaczone symbolem plusa (+). Pas 1, 12,5 U; Pas 2, 2,5 U; Pas 3, 1.25U. Reakcje kontrolne są oznaczone literą C, a brak zawartego białka jest oznaczony symbolem minus (-). Reakcje prowadzono przez 15 minut w temperaturze 25 °C i zawierały 5 mM MgCl2, 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl2, 1 mM DTT i 0,25 mM dNTP. Produkt (40 nt) i podłoże (20 nt) są oznaczone czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności zostały zobrazowane za pomocą systemu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

analiza rozszczepienia DNA, schemat żelu PAGE; wpływ temperatury, wpływ jonów; Wizualizacja aktywności enzymów.
Rysunek 5: Testowanie aktywności nukleazy metagenomu bakteryjnego Antarktydy przy użyciu różnych substratów, metali i temperatur inkubacji. (A) Specyficzna dla schematu aktywność endonukleazy białka nukleazy na podłożu w miejscu zasadowym (oznaczonym znakiem x). Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5' FAM). Czarne linie reprezentują oznaczone nici, a szare linie reprezentują nieoznakowane nici DNA. Specyficzne cięcie przez nukleazę jest pokazane po prawej stronie miejsca apodstawowego, ale może również wystąpić po lewej stronie. (B) Schemat denaturującego żelu mocznikowego PAGE z nieoszlifowanym substratem (40 nt) przy braku białka oznaczonego symbolem minus (-) i pociętym produktem (20 nt), w obecności nukleazy oznaczonej symbolem plus (+). (C) Przykład żelu mocznikowego TBE PAGE pokazujący wyniki specyficznej aktywności nukleazy endonukleazy na dwuniciowym substracie DNA z miejscem zasadowym. Test przeprowadzono przy stężeniu białka 1,0 μM i 1 mM MgCl2. Dwie reakcje kontrolne przeprowadzono w temperaturze 20 °C, jedną bez białka (studzienka 1) i jedną bez metalu (studzienka 2). Reakcje inkubowano przez 5 godzin w temperaturach rosnących od 1 °C do 50 °C, jak pokazano powyżej na obrazie żelu. Dodanie białka jest oznaczone symbolem plus (+), a brak białka jest oznaczone symbolem minus (-). Podłoże i produkt są oznaczone czerwonymi strzałkami. (D) Schemat przedstawiający niespecyficzną aktywność egzonukleazy białka nukleazy na podłożu jednoniciowym. Gwiazdy reprezentują znakowanie za pomocą 6-karboksyfluoresceiny na końcu 5' (5'FAM). Czarne linie reprezentują oznaczone pasma. Niespecyficzne cięcie nukleazy powoduje powstanie znakowanych nici o różnej długości (<39 nt). (E) Schemat przedstawiający denaturujący żel mocznikowy PAGE przedstawiający nieoszlifowany substrat (40 nt), do którego nie dodano białka (-), oraz przedstawiający cięty substrat o różnej długości, do którego dodano białko (+), który może wynikać z aktywności niespecyficznej egzonukleazy. (F) Żele mocznikowe TBE PAGE pokazują przykład niespecyficznej aktywności egzonukleazy tej samej antarktycznej nukleazy metagenomu z jednoniciowym substratem. Test przeprowadzono w temperaturze 20 °C przez 4 godziny z białkiem o końcowym stężeniu 1,5 μM i końcowym stężeniem jonu metalu o stężeniu 10 mM. Zastosowany jon metalu jest wskazany nad obrazem. Dodanie białka jest oznaczone symbolem plus (+), a brak białka jest oznaczone symbolem minus (-). Podłoże (40 nt) jest oznaczone czerwoną strzałką, a produkty o różnych długościach są oznaczone czerwoną obejmą. Wyniki wszystkich reakcji nukleaz zostały zobrazowane za pomocą systemu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres wydajności ligacji i analiza żelu, wpływ ATP i kofaktorów, wyniki aktywności ligazy DNA.
Rysunek 6: Wyniki ligacji naciętego substratu DNA przez adenylowane i de-adenylowane wersje bakteryjnej ligazy DNA. (A) i) Kwantyfikacja ligacji przez enzym ligazy adenylowanej i de-adenylowanej, z ATP i bez ATP. Punkty na wykresie reprezentują średnie z każdej kontrpróby reakcji. Dołączone są standardowe słupki błędów. ii) Żel mocznikowy TBE PAGE przedstawiający wyniki ligacji na substracie DNA przez adenylowany i de-adenylowany enzym ligazy, z ATP i bez ATP. Reakcje przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Enzym pozbawiony adenylu inkubowano wstępnie przez 2 godziny w temperaturze 25 °C z nieznakowanym substratem DNA z nacięciem i enzymem 0,1 μM, a następnie przez 1 godzinę inkubowano z znakowanym substratem DNA nacięcia. Adenylowany enzym nie był wstępnie inkubowany z nieznakowanym substratem. ATP (1 mM) dodawano do reakcji wraz z dodawaniem znakowanego substratu DNA. (B) i) Kwantyfikacja ligacji przez de-adenylowaną ligazę na DNA nacięcia z różnymi kofaktorami (ATP, NAD, ADP i GTP). Punkty na wykresie reprezentują średnie dla każdego stężenia. Uwzględnione są słupki błędu odchylenia standardowego. ii) STRONA MOCZNIKA THE przedstawiająca wyniki ligacji przez ligazę, z dodatkiem i bez dodatku różnych kofaktorów. Działanie na każdym substracie przeprowadzono w dwóch egzemplarzach. Reakcje prowadzono wstępnie inkubując przez 2 godziny w temperaturze 25 °C z nieznakowanym naciętym substratem DNA, białkiem 4 μM i jonem magnezu 5 mM, a następnie 4-godzinną inkubacją z dodatkiem znakowanego naciętego substratu DNA, 5 mM magnezu i różnych kofaktorów przy końcowym stężeniu 1 mM. Dodanie białka do reakcji jest oznaczone symbolem plusa (+). Zastosowano reakcje kontrolne, które nie zawierały białka (Kontrole, C) ani kofaktora (Brak kofaktora). Produkt (40 nt) i podłoże (20 nt) są oznaczone czerwonymi strzałkami. Wyniki testów aktywności zostały zobrazowane za pomocą systemu obrazowania. Pasma określono ilościowo przez całkowanie intensywności za pomocą oprogramowania ImageJ49. Wykresy zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza ligacji DNA za pomocą znaczników FAM/TAMRA: diagram, wyniki żelu, wykres żelu PAGE, aktywność ligazy.
Rysunek 7: Ligacja krótkich, znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów DNA do obu końców 5' fosforylowanego oligonukleotydu RNA, umieszczonego za pomocą matryc DNA. (A) Schemat ligacji DNA-RNA z szynowaniem DNA pokazujący, jak możliwe produkty ligacji mogą być wizualizowane przy użyciu strategii podwójnego znakowania. (B) Schemat możliwych produktów, które mogą być widoczne na żelu Urea-PAGE, zobrazowany w dwóch kanałach. (C) Wyniki doświadczalne podwójnej ligacji fluoroforowej. Reakcje ligacji badano przy użyciu ligazy DNA T4 i ligazy R2D, zarówno w izolowanych reakcjach, w których DNA ligowano do końca 5' (tor 2-4) lub końca 3' (tor 5-7) RNA, jak i w pojedynczej reakcji, w której oba oligonukleotydy DNA ligowano w tej samej mieszaninie reakcyjnej (tor 8-10). Do żadnej kontroli białkowej (NPC) nie dodano enzymu. Warunki reakcji i specyficzne oligonukleotydy użyte w tym przykładzie są takie same, jak podano w56. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram ligacji DNA z wynikami elektroforezy pokazującymi skuteczność ligacji na różnych poziomach pH.
Rysunek 8: Ligacja wielu krótkich segmentów oligonukleotydowych z trzema wariantami R2D przy różnym pH. (A) Schemat strategii ligacji wieloczęściowej. (B) Reprezentatywny żel pokazujący zależność pH zespołu wieloczęściowego, zobrazowany zarówno za pomocą kanałów FAM, jak i TAMRA. Pas C bez kontroli enzymatycznej, Pasy 1-3 pH 6,0, Pas 4-6 pH 6,5, Pas 7-9 pH 7 i Pas 10-12 pH 7,5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres elektroforezy i wynik żelu pokazujący zmienność wiązania białko-substrat wraz ze spadkiem stężenia białka.
Rysunek 9: Wyniki EMSA. Schematyczny i natywny żel TBE PAGE testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) wizualizujący aktywność wiązania zależnej od ATP ligazy DNA (pochodzącej z danych metagenomuz suchychdolin MC Murdo na Antarktydzie) na podłożu DNA. (A) Schemat aktywności wiązania EMSA/DNA przez ligazę DNA na substracie DNA nacięcia. Wyniki wiązania są wizualizowane na niedenaturującym żelu TBE PAGE. Substraty DNA związane z enzymem ligazy migrują wolniej przez żel, podczas gdy substraty wolne od enzymów migrują szybciej, co powoduje przesunięcie rozmiaru pasma (żółte pola) widoczne na żelu. Ponieważ substraty są wizualizowane na żelu niedenaturującym, oligonukleotydy pozostaną wyżarzane, co pozwoli na obecność nici znakowanej FAM (żółta gwiazda) zarówno na wolnych, jak i związanych podłożach. Gradient stężenia białka może być wykorzystany do określenia stężenia białka w celu optymalnego wiązania. (B) Wizualizacja EMSA na natywnym żelu TBE PAGE, wykazująca zdolność wiązania zależnej od ATP ligazy DNA z substratem DNA przy różnych stężeniach białka. Enzym inkubowano z naciętym substratem DNA przez 30 minut w temperaturze 25 °C, z końcowym stężeniem ATP 1 mM i 40 mM EDTA. Zastosowano trzy różne stężenia białek (5,5 μM, 2,3 μM i 1,5 μM). Reakcje prowadzono na 10% natywnym żelu TBE, z natywnym barwnikiem ładującym w reakcjach. Próbki zawierające białko wyprowadzono w trzech egzemplarzach dla różnych stężeń białka. Pasy kontrolne zawierają nacięty substrat DNA z 1 mM, końcowym ATP i EDTA, ale bez białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Sekwencje oligonukleotydowe substratów DNA używane do konstruowania substratów testowych. Uszkodzenia są zaznaczone pogrubioną czcionką i podkreślone. Pozycje niezgodności i luk w końcowym dupleksie są podkreślone. Skróty: 5' 6-karboksyfluorescien (5' FAM), 8-Oxo-deoksyguanozyna (8OxodG), azasadowy tetrohydrofuran (dSpacer). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kombinacje oligonukleotydów używane do składania głównych mieszanek do różnych testów enzymatycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Konfiguracja wzorcowych mieszanek testowych z maksymalnie czterema oligonukleotydami. W tabeli 2 przedstawiono kombinacje oligonukleotydów do wykorzystania dla różnych substratów testowych oraz w tekście w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat warunków reakcji. Jako minimum wymagany jest znakowany oligonukleotyd - dodatkowe części dupleksu są oznaczone nawiasami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Składniki dla oznaczonej i nieoznakowanej mieszanki wzorcowej do tworzenia dupleksu DNA nicka. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Konfiguracja głównych miksów EMSA dla różnych kombinacji dupleksów. W Tabeli 3 przedstawiono kombinacje oligonukleotydów do stosowania dla różnych substratów EMSA oraz tekst zawierający szczegółowe informacje na temat warunków reakcji. Substraty EMSA są zaprojektowane przy użyciu tych samych oligonukleotydów, co te do testów aktywności. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokole
Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Kupując oligonukleotydy do tworzenia dupleksu, należy wziąć pod uwagę projekt sekwencji. Zaleca się użycie narzędzia do analizatora oligonów do przewidywania właściwości sekwencji nukleotydowej, takich jak zawartość GC, temperatura topnienia, struktura drugorzędowa i potencjał dimeryzacji, przed zamówieniem57.

Montaż i wyżarzanie dupleksów kwasów nukleinowych: Podczas przygotowywania dupleksów RNA/RNA-DNA należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą, stosując odczynniki i wodę, które są wolne od RNaz lub dodając inhibitor RNAzy (o ile badany enzym sam w sobie nie jest RNAzą). Sprzęt, rękawice i miejsce na stole powinny być potraktowane roztworem do odkażania RNazy przed złożeniem mieszanek głównych, aby uniknąć degradacji oligonukleotydów58. Zapasy główne oligonukleotydów RNA mogą być tworzone w mniejszych partiach w przypadku zanieczyszczenia.

Ligazy DNA zawsze wymagają kofaktora nukleotydowego, ATP lub NAD, w końcowym stężeniu od 0,1 do 1 mM. Polimerazy DNA wymagają dNTP do syntezy nici, a te są zwykle dodawane w proporcjach równomolowych po 50 μM każdej. Podczas przygotowywania mieszanin wzorcowych dla dupleksów ligazy i polimerazy, kofaktory nukleotydowe, takie jak ATP, NAD i dNTP, muszą zostać dodane do mieszanki głównej po podgrzaniu mieszaniny i schłodzeniu do temperatury pokojowej, ponieważ są one wrażliwe na ciepło.

10-krotny bufor do wyżarzania oligonukleotydów wymaga dodania DTT, który ma krótki okres półtrwania i najlepiej przygotować go na świeżo lub zamrożonego przed użyciem. Mniejsze porcje bufora 10x mogą być przygotowywane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, z dodatkiem naziemnej telewizji cyfrowej przed użyciem.

Oligonukleotydy i mieszanki wzorcowe powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania, a znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy lub mieszaniny powinny być owinięte folią, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforu. Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą zagrozić integralności oligonukleotydów, zaleca się przygotowanie i użycie mniejszych objętości (>1 ml).

Konfiguracja testu i analiza wyników: Włączenie kontroli ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników testu. Należy zastosować kontrolę bezbiałkową (substrat DNA z roztworem buforowym), aby upewnić się, że pozorna aktywność na substracie jest wynikiem działania enzymu. W przypadku nukleazy degradacja substratu egzogennego spowoduje pasma o niskiej masie cząsteczkowej lub drabinki w kontroli, podczas gdy w przypadku ligazy lub polimerazy niepełna denaturacja dupleksowa spowoduje kontrolę pasma o dużej masie cząsteczkowej. Pozytywna kontrola wielkości oczekiwanego produktu znajduje się w tabeli 2 i powinna zostać uwzględniona w celu sprawdzenia prawidłowego rozmiaru produktu.

Ważne parametry wpływające na udaną elektroforezę produktu testowego zostały opisane w poprzednim protokole59. Obejmują one zapewnienie, że procentowa zawartość akrylamidu jest odpowiednia do wielkości podłoża oraz użycie odpowiedniego barwnika obciążającego w zależności od wielkości podłoża i rodzaju żelu wymaganego do wizualizacji wyników. Barwnik śledzący błękit bromofenolowy ma przybliżoną wielkość 10-zasadowego oligonukleotydu i dlatego jest odpowiedni dla opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów; Jeśli jednak pasmo barwnika nakłada się na produkt fluorescencyjny lub pasma substratu przy użyciu krótszych nukleotydów, barwnik śledzący można wymienić na ksylocyjanol, który działa wolniej60.

Aby zapewnić dobrą rozdzielczość pasm substratu/produktu, zbiornik żelu powinien być ogrzewany zewnętrznie za pomocą łaźni wodnej lub pod wysokim napięciem (np. 180 V). Wstępne działanie żeli mocznikowych PAGE przez co najmniej 30 minut i przepłukiwanie studzienek pipetą w celu usunięcia nadmiaru mocznika jest niezbędne do uzyskania ostrych, prostych pasm nadających się do oznaczania ilościowego.

W celu ilościowego określenia substratów i produktów zakres 20%-80% całego materiału powinien zostać przekształcony w produkt, aby umożliwić dokładną integrację pasków żelu fluorescencyjnego. W przypadku oznaczania nowego enzymu zaleca się przeprowadzenie gradientu stężeń białka, aby umożliwić wykonanie kolejnych pomiarów w tym zakresie. Wiele kamer fluorescencyjnych ma wbudowane funkcje integracji pasma, które można wykorzystać do tego celu. Jeśli używasz zewnętrznego programu, takiego jak ImageJ49, upewnij się, że obraz żelu jest eksportowany w wysokiej jakości w formacie tiff.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z techniką
Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Oligonukleotydy podane w tym protokole są użytecznymi punktami wyjścia i mogą być rozszerzane, zgodnie z sugestią w sekcji dotyczącej metod, poprzez zmianę sekwencji oligonukleotydów i wprowadzanie modyfikacji.

Standardowa konfiguracja testu i analiza wyników: Eksperymenty pilotażowe są niezbędne podczas testowania aktywności nowego enzymu, ponieważ optymalne warunki reakcji będą się różnić w zależności od różnych białek; Parametry podane w niniejszym protokole służą jedynie jako punkt wyjścia. Czynniki takie jak stężenie enzymu, temperatura reakcji, czas trwania inkubacji, kofaktor i skład buforu/pH mogą ulegać zmianom podczas mieszania wzorcowego i zespołu reakcji testu. Stężenia kofaktorów są szczególnie ważne, ponieważ nadmiar kofaktorów nukleotydowych lub jonów metali może być hamujący i zaleca się testowanie zakresu stężeń każdego z nich. W przypadku polimeraz DNA zalecane stężenia dNTP wahają się od 20 do 200 μM ogółem, jednak wysokie stężenia dNTP zmniejszają wierność61. Podobnie, ligazy polinukleotydowe są zwykle oznaczane z kofaktorem nukleotydów 0,1-1,0 mM, ale nadmierne stężenia powodują adenylan nagromadzonego DNA i hamowanie reakcji62.

Standardowy protokół tutaj używa Mg jako kationu dwuwartościowego; jednak niektóre enzymy są bardziej aktywne z manganem (Mn) lub (Zn). Mieszanki wzorcowe zawierające Mn lub Zn należy przygotować z buforem o niższym pH (<7,5), a po podgrzaniu należy dodać metale. Mieszanki wzorcowe należy stosować tego samego dnia, aby uniknąć wytrącania się i hamowania aktywności enzymu.

Dodatki, w tym środki stłoczenia, takie jak glikol polietylenowy (PEG) lub stabilizatory, takie jak albumina surowicy bydlęcej, mogą być stosowane w celu zwiększenia aktywności niektórych enzymów63,64. Powinny one być dodawane po etapie wyżarzania ze względu na ich termoaplikowalność. Wszystkie odczynniki pochodzenia biologicznego powinny być klasy biologii molekularnej, aby uniknąć wprowadzania zanieczyszczających nukleaz.

Objętość buforu wygaszającego formamid stosowana w tym protokole jest odpowiednia dla podstawowego zestawu oligonukleotydów. Jednak w przypadku dłuższych oligonukleotydów objętość formamidu należy zwiększyć do poziomu od 10 μl do 20 μl, aby zapewnić całkowite oddzielenie nici, a reakcje hartowane można schładzać na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu elektroforezy.

W przypadku niektórych enzymów ścisłe wiązanie białka z substratem/produktem może wykluczać migrację oligonukleotydów do żelu podczas elektroforezy, zwłaszcza gdy enzym jest stosowany w wysokich stężeniach. Objawia się to brakiem pasm produktu/substratu na żelu i często nagromadzeniem materiału fluorescencyjnego (produktu i/lub substratu skompleksowanego z białkiem) w studzienkach. Aby rozbić te kompleksy, mieszaninę testową można poddać działaniu proteinazy K przed dodaniem buforu wygaszającego lub dodecylosiarczanu sodu (SDS) podczas hartowania.

Aktywność ligazy DNA wytwarza dwa dyskretne prążki, które są łatwe do ilościowego określenia. Możliwe jest zastosowanie tej samej metody do ilościowego określenia aktywności endonukleazy na podłożu uszkodzenia DNA, w przypadku gdy przewiduje się pojedynczy produkt 20 nukleotydów, lub testów EMSA, w których wyraźnie rozróżnia się stany związane/niezwiązane. Dokładna kwantyfikacja aktywności polimerazy i nukleazy procesowej jest trudna ze względu na integrację pasmową i ogólnie zaleca się stosowanie testów w czasie rzeczywistym za pomocą sond lub sygnalizatorów, jak opisano we wprowadzeniu.

De-adenylacja i specyficzność kofaktora ligazy DNA: Może być wymagana pewna optymalizacja tego protokołu w celu usunięcia całej aktywności tła, która następnie zostanie przywrócona przez dodanie kofaktora (kofaktorów) nukleotydów. Jeśli aktywność ligazy tła pozostaje po dedenylacji (postrzeganej jako ligacja w kontroli bez kofaktora), czas inkubacji etapu dedenylacji może zostać wydłużony lub stężenie ligazy może zostać zmniejszone. Upewnij się, że dupleks DNA bez etykiety jest bardziej skoncentrowany niż białko (> 4:1::substrate: białko). Jeśli dodanie kofaktora w obecności znakowanego DNA nie przywróci ligacji dla żadnego z badanych kofaktorów, możliwe jest, że enzym uległ denaturacji i etap deadenylacji powinien zostać skrócony. W przypadku nowej ligazy lub nowej partii rekombinowanego enzymu przydatne jest określenie zakresu ligacji tła z adenylowanym enzymem przy braku dodatkowych kofaktorów nukleotydowych. Wiąże się to z przeprowadzeniem kolejnej reakcji, w której jednocześnie inkubuje się 10 μl nieznakowanej mieszanki wzorcowej, 10 μl znakowanej mieszanki głównej i 2,5 μl świeżego enzymu, który nie został zdeadenylowany.

Używaj podłoży z podwójnym oznaczeniem: Protokół ten wymaga zaprojektowania i zakupu oligonukleotydu z ugrupowaniem fluorescencyjnym, który ma inne widmo wzbudzenia/emisji niż pierwotnie użyty fluorofor, a następnie złożenia go w dupleks, tak aby dwa ortogonalne fluorofory znakowały różne części substratu. W razie wątpliwości dostępnych jest wiele internetowych przeglądarek widmowych do sprawdzania widm wzbudzenia i emisji, na przykład FPbase Spectra Viewer i BD Spectrum Viewer, które można wykorzystać do sprawdzenia zarówno kompatybilności pary fluoroforów, jak i najbardziej odpowiednich ustawień imagera. Konkretne ustawienia używane do wizualizacji żelu będą zależeć od modelu wyczuwalnika i użytego fluoroforu. Złożony obraz zarejestruje sygnał z obu kanałów na pojedynczym żelu, a pasmo, w którym oba fluorofory są przymocowane do tego samego produktu, będzie wyświetlane jako kolor pośredni. Oddzielne obrazy z poszczególnych kanałów mogą być analizowane w celu ilościowego określenia zakresu podwiązania lub degradacji na różnie znakowanych pasmach.

Ograniczenia techniki
Chociaż praca z podłożami znakowanymi fluorescencyjnie ma wiele zalet, takich jak niskie zagrożenie dla zdrowia, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy z tego typu oznakowanymi podłożami. Jednym z nich jest stosunkowo wysoki koszt zamówienia tych oligonukleotydów z etykietami fluoroforowymi lub modyfikacjami, takimi jak dodanie uszkodzonych zasad, w porównaniu z domieszkowaniem radioaktywnym. Innym jest to, że do wykrywania oznakowanych pasm wymagany jest specjalistyczny sprzęt i oprogramowanie do obrazowania. Jednak te cechy są teraz zawarte w większości nowych systemów wyobrażania sobie żeli. Należy również wziąć pod uwagę potencjał fluoroforów do zmiany właściwości wiązania docelowych białek interakcji. Fluoresceina i jej pochodna FAM są powszechnie używane do oznaczania oligonukleotydów i są wrażliwe na zmiany pH i wygaszanie zasad nukleotydowych65. Ograniczenia te należy dokładnie rozważyć przy podejmowaniu decyzji o rodzaju i rozmieszczeniu fluoroforów na oligonukleotydzie w przypadku projektowania dupleksowego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEG i UR są pracownikami firmy ArcticZymes Technologies AS, która zajmuje się dystrybucją ligazy R2D. AW, ER-S i RS nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AW jest wspierany przez Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS jest laureatem stypendium New Zealand Post Antarctic Scholarship. SG i UR dziękują Instytutowi Chemicznemu Uniwersytetu w Tromsø - Norweskiemu Uniwersytetowi Arktycznemu za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% Akrylamid/Bis Roztwór (29:1)BioRad1610156
Adenozynotrifosforan (ATP)Wielu dostawców
Nadsiarczan amonu (APS)Wielu dostawców
Wirówka stołowaWielu dostawców
BoranWielu dostawców
Błękit bromofenolowyWiele dostawcy
Ditiothreitol (DTT)Wielu dostawców
System elektroforezy z kąpielą z wodą obiegowąWielu dostawców
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Wielu dostawców
Obrazowanie fluorescencji, np. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamidWiele dostawcy
System odlewania żeluWielu dostawców
Blok grzewczyWielu dostawców
Chlorek magnezuWielu dostawcówInne jony metali mogą być preferowane w zależności od badanego białka
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)Wielu dostawców
Mikropipety i końcówkiWielu dostawców1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 ml
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)Wielu dostawców
OligonukleotydyZintegrowane technologie DNANAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript i inni również dostarczają te
pipety pastwiskoweWielu dostawców
Termocykler PCRWielu dostawców
Probówki PCRWielu dostawców
RNAse awayThermoFisher7002PKPotrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami
RNA RNase AWAYMerck83931-250MLŚrodek powierzchniowo czynny do usuwania RNAzy zanieczyszczenie powierzchni
Woda wolna od RNAzaNew England BiolabsB1500LPotrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami RNA
Chlorek soduWielu dostawców
SUPERaza IN: inhibitor RNazyThermo Fisher ScientificAM2694Inhibitor RNAzy, o szerokim spektrum działania, (na bazie białka)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Może to być używane do barwienia żeli i wizualizacji nieoznakowanych oligonukleotydów
Tetrametyloetylenodiamina (TMED)Wielu dostawców
Tris, czyli tris(hydroksymetylo)aminometanWielu dostawców
Woda ultraczysta (Milli-Q)MocznikMerck
Wielu dostawców
VortexWielu dostawców
:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), 7003(2019).
  2. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  3. Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009(2018).
  4. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  5. Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
  6. Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263(2020).
  7. Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
  8. Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
  9. Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
  10. Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
  11. Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 3, Unit 3.14 (2011).
  12. Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
  13. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5), Part b 963-989 (2016).
  14. Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
  15. Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
  16. Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3 (A) (2002).
  17. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  18. Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
  19. Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
  20. Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
  21. Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125(2017).
  22. Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
  23. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
  24. Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
  25. Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
  26. Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391(2016).
  27. Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
  28. Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
  29. Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062(2017).
  30. Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
  31. Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
  32. Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemistry. 43 (3), 710-717 (2004).
  33. Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
  34. Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14(2016).
  35. Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2(2010).
  36. Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148(2003).
  37. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
  38. Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
  39. Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389(2022).
  40. Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097(2021).
  41. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  42. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  43. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  44. Takemoto, N., Numata, I., Su'etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
  45. Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
  46. Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
  47. Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853(2019).
  48. Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), e52(2000).
  49. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  50. Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
  51. Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817(2023).
  52. Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97 (0), 29-36 (2014).
  53. Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
  54. Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65, Pt 6 544-550 (2009).
  55. Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
  56. Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711(2024).
  57. Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
  58. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), 10.1101/pdb.top101857 (2019).
  59. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
  60. Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-33 (1998).
  61. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  62. Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
  63. Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62(2019).
  64. Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257(2012).
  65. Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enzymy kwas w nukleinowychtest ligazy DNAtest ligazy RNAznakowanie fluorescencyjneelektroforeza PAGEenzymy naprawy DNAaktywno nukleazyhybrydy DNA RNAprojektowanie substrat w enzymatycznych

Powiązane artykuły