Artykuł metodologiczny

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66934

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular and Neurogenetic Disorders of Childhood Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2The Dubowitz Neuromuscular Centre, Molecular Neurosciences Section, Developmental Neurosciences Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 4NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, 5Genetics and Genomic Medicine Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Streszczenie

Wiele zaburzeń wpływa na wiele organów lub obejmuje różne regiony ciała, dlatego ważne jest, aby dostarczać terapie systemowo, aby celować w dotknięte komórki zlokalizowane w różnych miejscach. Wstrzyknięcie dożylne jest szeroko stosowaną drogą podawania ogólnoustrojowego w badaniach przedklinicznych, w których ocenia się leczenie przeznaczone do podawania w całym organizmie. U dorosłych myszy polega na dożylnym podaniu środka terapeutycznego do bocznych żył ogonowych myszy. Po opanowaniu iniekcje do żyły ogonowej są bezpieczne i szybkie, wymagają jedynie prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Jednak wstrzyknięcia do żyły ogonowej są technicznie trudne i wymagają intensywnego szkolenia oraz ciągłej praktyki, aby zapewnić dokładne podanie zamierzonej dawki.

Tutaj opisujemy szczegółowy, zoptymalizowany, boczny protokół iniekcji żyły ogonowej, który opracowaliśmy na podstawie naszego doświadczenia i zaleceń, które zostały wcześniej zgłoszone przez inne grupy. Poza ogranicznikami dla myszy i strzykawkami insulinowymi, protokół ten wymaga tylko odczynników i sprzętu, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów. Odkryliśmy, że przestrzeganie tego protokołu skutkuje konsekwentnie udanym dożylnym dostarczaniem wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do żył ogonowych nieuspokojonych myszy w wieku 7-9 tygodni. Dodatkowo opisujemy zoptymalizowane protokoły histologicznego wykrywania fluorescencyjnych białek reporterowych i kwantyfikacji genomu wektorowego na genom diploidalny (vg / dg) stosowane do oceny transdukcji i biodystrybucji AAV. Celem tego protokołu jest pomoc eksperymentatorom w łatwym i konsekwentnym wykonywaniu skutecznych i konsekwentnych iniekcji do żył ogonowych, co może skrócić czas ćwiczeń potrzebny do opanowania techniki.

Wprowadzenie

Choroby monogenowe stanowią 80% chorób rzadkich, które łącznie dotykają 300 milionów osób na całym świecie1,2. Obecnie nie ma zatwierdzonych terapii leczniczych dla większości tych bardzo wyniszczających rzadkich zaburzeń1,2,3. Jednak zaburzenia monogenowe są idealnymi kandydatami do terapii genowych, które mogą zastąpić, uzupełnić, poprawić lub wyciszyć dysfunkcyjne geny4,5. Obecnie opracowywanych jest wiele wektorów, które są wykorzystywane do dostarczania terapii genowych do określonych typów komórek4,6. Jednym z tych wektorów jest wirus związany z adenowirusem (AAV). AAV jest niepatogennym parwowirusem, który jest coraz częściej stosowany jako wektor terapii genowej7. W porównaniu z innymi wektorami wirusowymi, AAV ma niższą immunogenność, mniejszy potencjał integracji z genomem gospodarza oraz zdolność do efektywnej transdukcji komórek dzielących się i niedzielących w różnych tkankach7,8. Ponadto opracowano wiele podejść do inżynierii i identyfikacji AAV o pożądanych cechach, takich jak specyficzny tropizm tkankowy lub jeszcze bardziej zmniejszona immunogenność, co znacznie zwiększa wszechstronność AAV jako wektora wirusowego dla różnych wskazań9. Czynniki te sprawiły, że AAV stał się szeroko badanym wektorem terapii genowej i doprowadziły do opracowania wielu zatwierdzonych przez FDA terapii genowych opartych na AAV10.

Modele mysie są powszechnie używane do testowania potencjalnych terapii genowych in vivo i lepszego zrozumienia patomechanizmów zaburzeń monogenowych. Wynika to z rekapitulacji patologii różnych schorzeń w modelach mysich, podobieństwa ich genomu do genomu ludzkiego oraz względnej łatwości obsługi, utrzymania i generowania na myszach11,12,13. Badania in vivo są szczególnie ważne podczas badania zaburzeń, które wpływają na wiele układów lub regionów ciała, takich jak dystrofie mięśniowe. W przypadku tych zaburzeń badania in vitro mogą nie być wystarczające do kompleksowej oceny bezpieczeństwa, skuteczności, farmakokinetyki i farmakodynamiki środków terapeutycznych przeznaczonych do dotarcia do różnych obszarów ciała po podaniu ogólnoustrojowym14.

Różne drogi podawania ogólnoustrojowego mogą być używane do dostarczania leków. Każda trasa ma swoje zalety, wady i stopień zgodności z badanym modelem zwierzęcym i lekiem15. Dożylne (IV) wstrzyknięcie bocznej żyły ogonowej jest powszechnie stosowaną drogą ogólnoustrojowego dostarczania AAV u myszy16. Boczne zastrzyki do żyły ogonowej umożliwiają szybkie i bezpośrednie podanie iniekcji do krwiobiegu myszy, zapewniając wysoką biodostępność leku w krążeniu ogólnoustrojowym17. Wymagają one również do wykonania stosunkowo prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Jednakże, głównie ze względu na małą średnicę żyły ogonowej i trudności w zlokalizowaniu żyły, wstrzyknięcia boczne do żyły ogonowej są technicznie trudne i wymagają wysokiego stopnia umiejętności oraz stałej praktyki, aby uniknąć nieudanych prób wstrzyknięcia lub niepełnego podania dawki16,17,18,19. Może to spowodować utratę drogich odczynników lub niedokładne wyniki, zwłaszcza jeśli niepełne wstrzyknięcie nie zostanie rozpoznane podczas wykonywania iniekcji. Nasze podsumowane tutaj doświadczenie opiera się na protokołach opisanych w dobrze udokumentowanych artykułach, które dostosowaliśmy do naszego użytku, optymalizując różne etapy procedury iniekcji bocznej żyły ogonowej, aby zapewnić niezmiennie udane wstrzyknięcia20,21,22,23,24,25,26,27.

Tutaj opisujemy ten szczegółowy, zoptymalizowany protokół wstrzykiwania żyły bocznej w żyłę ogonową, aby dostarczyć AAV nieuspokojonym myszom w wieku 7-9 tygodni za pomocą prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Dodatkowo udostępniamy protokoły dla metod stosowanych do oceny dostarczania i biodystrybucji AAV. Protokoły te obejmują pobieranie tkanek po wstrzyknięciu, utrwalanie tkanek, ekstrakcję DNA i kwantyfikację ilościową genomu wektorowego cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) na genom diploidalny (vg/dg). Protokół wstrzyknięcia dożylnego i podane tutaj wskazówki mają na celu zwiększenie łatwości skutecznego wykonywania iniekcji do żył bocznych ogonowych. Potencjalnie przyczyni się to do skrócenia czasu potrzebnego do opanowania umiejętności wstrzykiwania, jednocześnie poprawiając dokładność i spójność wstrzyknięć.

Protokół

Wszystkie procedury związane z obsługą zwierząt i iniekcjami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w NINDS. Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NINDS dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.

1. Przygotowanie do iniekcji

  1. Przygotowanie dawki AAV
    1. Wyznacz średnią masę myszy, które zostaną poddane iniekcji.
    2. Oblicz maksymalną dopuszczalną objętość iniekcyjną zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami, jak pokazano w równaniu (1). Maksymalna objętość iniekcyjna to zazwyczaj wartość objętości (µL)/masa myszy (g) (np. 10 µL/g).
      Maksymalna objętość iniekcyjna (µL)/mysz = (maksymalna objętość iniekcyjna (µL/g)) × (średnia masa myszy (g))   (1)
      UWAGA: Przykładowe obliczenie: Maksymalna objętość iniekcyjna/mysz = 10 µL/g × 20 g/mysz = 200 µL/mysz
    3. Ustal dawkę genomów wektora (vg) AAV, która ma zostać podana każdej myszy.
      UWAGA: Może to być ta sama wartość bezwzględna dla wszystkich myszy (np. wszystkie myszy otrzymują 1,5 × 1012 vg niezależnie od ich masy). Dawka może być również podana w vg/kg, w takim przypadku całkowita liczba vg do wstrzyknięcia każdej myszy musi zostać obliczona indywidualnie na podstawie masy myszy w dniu iniekcji.
      1. Jeśli dawka jest podana w vg/kg, zważ każdą mysz w dniu iniekcji przed przygotowaniem dawki.
      2. Oblicz liczbę genomów wektora do podania dla każdej myszy zgodnie z jej masą, korzystając z równania (2):
        Liczba genomów wektora do podania konkretnej myszy (vg) = Wyznaczona wartość vg/kg (vg/kg) × Równanie konwersji masy myszy; schemat obliczania masy, formuła konwersji gramów na kilogramy.    (2)
        UWAGA: Stosowanie vg/kg jako jednostki dawki zamiast vg/mysz może być bardziej odpowiednie w niektórych badaniach przedklinicznych, aby zapewnić poprawne porównanie między dawkami iniekcyjnymi. Wynika to z różnic w masie między myszami samcami i samicami w tym samym wieku lub potencjalnie między myszami tej samej płci.
      3. Wykorzystaj maksymalną objętość iniekcyjną oraz dawkę AAV (vg), aby obliczyć objętości roztworu zapasowego AAV i sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) niezbędne do przygotowania wymaganej dawki (patrz równania (3-6)). Upewnij się, że objętość do wstrzyknięcia jest równa lub mniejsza od dopuszczalnej maksymalnej objętości iniekcyjnej. Zawsze przygotuj objętość iniekcyjną o co najmniej 15 µL większą niż objętość, która zostanie wstrzyknięta, aby uwzględnić błędy pipetowania oraz przestrzeń martwą strzykawki.
        Stężenie preparatu iniekcyjnego (vg/µL) = Formuła dawkowania wektora AAV dla myszy; powiązanie genomów wektora z objętością iniekcji, tabela badawcza.    (3)
        Całkowita liczba genomów wektora AAV do dodania w celu przygotowania preparatu (vg) = Stężenie preparatu iniekcyjnego (vg/µL) × objętość do przygotowania (µL)    (4)
        Objętość roztworu zapasowego AAV do dodania w celu przygotowania preparatu (µL) = Formuła obliczania dawki wektora AAV; wyrażenie matematyczne dla przygotowania objętości iniekcyjnej. (5)
        Objętość PBS do dodania w celu przygotowania preparatu (µL) = Objętość do przygotowania (µL) - Objętość roztworu zapasowego AAV do dodania w celu przygotowania preparatu (µL)    (6)
        UWAGA: Przykładowe obliczenie:
        Dawka 6 × 1013 vg/kg zostanie podana w objętości 200 µL/mysz myszy o masie 25 g. Miano zapasu AAV wynosi 3,0 × 1013 (vg/mL).
        Liczba genomów wektora do podania tej konkretnej myszy (vg) = 6 × 1013 (vg/kg) × Formuła konwersji masy, 25 gramów na kilogramy. = 1,5 × 1012 vg dla tej myszy
        Stężenie preparatu iniekcyjnego = Formuła obliczania dawki genowej, 1,5e+12 vg/mysz podzielone przez 200 µL/mysz, schemat równania. = 7,5 × 109 (vg/µL)
        Całkowita liczba genomów wektora AAV do dodania w celu przygotowania preparatu = 7,5 × 109 (vg/µL) × (200 (µL) + 15 (µL)) = 1,6125 × 1012 (vg)
        Objętość roztworu zapasowego AAV do dodania w celu przygotowania preparatu = Obliczanie miana wirusa, metoda formuły, zastosowanie w badaniach naukowych, obliczanie stosunku. = 53,75 (µL)
        Objętość PBS do dodania w celu przygotowania preparatu = 215 (µL) - 53,75 (µL) = 161,25 (µL)
    4. Procedura przygotowania dawki AAV
      UWAGA: Postępując zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi biobezpieczeństwa i środków ochrony indywidualnej (PPE) przy pracy z AAV, w autoklawowanej, sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL, wolnej od RNaz i DNaz, przygotuj preparat iniekcyjny AAV, wykorzystując roztwór zapasowy AAV i sterylny PBS zgodnie z obliczeniami w kroku 1.1.3.3. Zawsze przechowuj roztwór zapasowy AAV oraz preparat iniekcyjny na lodzie. Używaj czystych mikropipet i nowych opakowań końcówek do mikropipet, aby zapewnić sterylność. Utylizuj zanieczyszczone AAV końcówki do mikropipet zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi gospodarowania odpadami.
      1. Odroluj roztwór zapasowy AAV na lodzie.
        UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania zapasu AAV. Zamawiaj lub przygotowuj zapas AAV w alikwotach 100-200 µL, aby uniknąć powstawania nadmiaru AAV po przygotowaniu dawki, który musiałby zostać ponownie zamrożony.
  2. Przygotowanie stanowiska do iniekcji
    1. Czyszczenie
      1. Oczyść obszar roboczy 70% etanolem (EtOH).
      2. Zdezynfekuj obszar roboczy za pomocą reagentów bakteriobójczych, grzybobójczych i wirusobójczych.
      3. Umyj rurkę ograniczającą dla myszy wodą z mydłem.
    2. Przygotowanie narzędzi na stanowisku
      1. Umieść czystą, pustą probówkę stożkową 15 mL w uchwycie/statywie do probówek.
      2. Ustaw podwyższoną platformę, na której zostanie umieszczona rurka ograniczająca dla myszy (Rycina 1A,B).
      3. Umieść czystą rurkę ograniczającą dla myszy w obszarze roboczym.
      4. W przypadku iniekcji u myszy znacznie mniejszych niż dostępna rurka ograniczająca, użyj plastikowego stożka ograniczającego dla gryzoni, aby stworzyć rękaw ograniczający. Patrz kroki 2.1.3-4.
      5. Umieść w obszarze roboczym strzykawki, które będą wykorzystywane do iniekcji. Użyj strzykawek insulinowych 0,3 mL z igłami 29 G.
      6. Umieść pojemnik na odpady jak najbliżej stanowiska iniekcyjnego, aby umożliwić natychmiastową utylizację narzędzi zanieczyszczonych AAV.
      7. Kilka razy wyciągnij i wsuń tłok każdej strzykawki, aby upewnić się, że tłok porusza się gładko i nie stawi oporu podczas iniekcji. Jeśli tłok nie porusza się gładko, wyrzuć tę strzykawkę i zastąp ją nową.
      8. Przygotuj wagę do myszy i miniwirówkę obok obszaru iniekcji.
      9. Przygotuj dawkę AAV na lodzie w obszarze iniekcji.
      10. Przygotuj ciepłą wodę (38-40 °C). Dopilnuj, aby temperatura wody nie przekroczyła 40 °C, aby uniknąć poparzenia ogona myszy.

2. Procedura iniekcji

  1. Unieruchomienie myszy
    1. Zważ każdą mysz, aby w razie potrzeby obliczyć dawkę w vg/kg.
    2. Upewnij się, że mysz jest całkowicie unieruchomiona i nie może się poruszać.
      UWAGA: Jeśli mysz nie jest w pełni unieruchomiona, może poruszyć się podczas podania dożylnego (IV), co doprowadzi do przesunięcia igły. Może to spowodować wypadnięcie igły z żyły i/lub zranienie myszy.
    3. W przypadku unieruchamiacza rurkowego:
      1. Myj unieruchamiacz ciepłą wodą z mydłem pomiędzy myszami, aby oczyścić i ogrzać uchwyt.
      2. Wsuń ogon myszy do górnego otworu rurki, a następnie powoli wsuń mysz do unieruchamiacza rurkowego. Jeśli rozmiar unieruchamiacza jest odpowiedni do wielkości myszy, umieść zatyczkę przed myszą, aby zapobiec jej ucieczce.
        UWAGA: Zatyczka powinna znajdować się wystarczająco blisko myszy, aby zapobiec jej przemieszczaniu się lub obracaniu wewnątrz rurki, ale nie może zasłaniać nosa myszy, aby umożliwić jej swobodne oddychanie. Jeśli mysz jest mniejsza niż rozmiar unieruchamiacza rurkowego, użyj elastycznego jednorazowego stożka unieruchamiającego dodatkowo do unieruchamiacza rurkowego, zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.
    4. W przypadku elastycznych jednorazowych stożków unieruchamiających, jeśli są potrzebne (w celu wykonania rękawa unieruchamiającego dla mniejszych myszy):
      1. Wykonaj nacięcie na końcu stożka przy nosie, aby upewnić się, że nos myszy nie jest zasłonięty i że mysz ma wystarczającą przestrzeń do oddychania.
      2. Odetnij tył stożka tak, aby stożek miał prawie taką samą długość jak mysz (aby stożek pasował do wnętrza rurki) (Rycina 1A,B).
      3. Umieść mysz w unieruchamiaczu rurkowym zgodnie z opisem w kroku 2.1.3. Trzymając ogon myszy, wsuń stożek unieruchamiający do rurki szerokim końcem w pierwszej kolejności.
      4. Trzymając ogon myszy, pozwól myszy wejść do stożka, a następnie wsuń resztę stożka do rurki. Upewnij się, że ogon myszy wystaje całkowicie z tyłu rurki i że mysz ma miejsce do oddychania wewnątrz stożka.
      5. Zabezpiecz zatyczkę rurki bezpośrednio przed otworem dla nosa w stożku, upewniając się, że mysz jest całkowicie unieruchomiona i ma wystarczającą przestrzeń do oddychania.
  2. Iniekcja u myszy
    1. Napełnij 15 mL probówkę stożkową ciepłą wodą.
    2. Umieść unieruchamiacz rurkowy z myszą wewnątrz na podwyższonej platformie (Rycina 1B).
    3. Zanurz tak dużą część ogona unieruchomionej myszy w ciepłej wodzie, jak to możliwe, przez co najmniej 1 min, aż żyły boczne zostaną wyraźnie rozszerzone i staną się widoczne (Rycina 1B).
    4. Podczas ogrzewania ogona nabierz dawkę AAV do strzykawki.
      1. Umieść niezatykaną probówkę do mikrocentryfugi 1,7 mL zawierającą AAV w statywie. Wprowadź igłę pionowo do probówki ręką dominującą. Gdy igła znajdzie się wewnątrz probówki, przytrzymaj probówkę ręką niedominującą.
        UWAGA: Pionowe wprowadzanie igły zapobiega jej uszkodzeniu, które mogłoby wystąpić w wyniku dotknięcia ścianki probówki. Można stosować inne alternatywne metody nabierania do strzykawki, jednak należy zapewnić bezpieczeństwo eksperymentatora i wstrzykiwanej myszy. Przytrzymywanie probówki ręką niedominującą chroni przed przypadkowym ukłuciem igłą w przypadku wprowadzenia jej podczas trzymania probówki.
      2. Z igłą wewnątrz probówki jednoczesnie podnieś probówkę i strzykawkę na wysokość oczu, upewniając się, że igła nie dotyka ścianki probówki. Oprzyj oba ramiona o stół, aby je ustabilizować. Powoli nabierz dawkę do strzykawki.
        UWAGA: Powolna aspiracja zapobiega przyklejaniu się drobnych pęcherzyków powietrza do ścianek cylindra strzykawki.
      3. Usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawki. W przypadku wstrzykiwania AAV upewnij się, że pęcherzyki powietrza są usuwane nad jednorazową podkładką chłonną, która zostanie zutylizowana w pojemniku na odpady biologiczne.
      4. Przytrzymaj preparat przez co najmniej 40 s, aby go ogrzać.
        UWAGA: Zawsze upewnij się, że preparat jest ciepły przed iniekcją. Jeśli podany zostanie zimny preparat, iniekcja może nie przepływać przez żyłę, poza pierwszymi kilkoma µL.
      5. Sprawdzaj żyły ogonowe w każdej minucie.
        UWAGA: Żyły muszą być BARDZO widoczne aż do miejsca iniekcji (wydłuż czas ogrzewania ogona i w razie potrzeby wymień wodę na nową, ciepłą, aż żyła będzie wyraźnie widoczna, ale nie przekraczaj czasu unieruchomienia myszy dozwolonego przez protokół instytucjonalny dotyczący obchodzenia się ze zwierzętami).
      6. Po upewnieniu się, że żyły są wyraźnie widoczne, zdejmij unieruchamiacz rurkowy z góry podwyższonej platformy i połóż go bezpośrednio na stole. Ustaw mysz w unieruchamiaczu stopami w dół, a nie na bok, aby ułatwić operowanie ogonem.
        UWAGA: Mysz nie powinna znajdować się na boku ani na plecach wewnątrz unieruchamiacza. Mysz powinna być całkowicie unieruchomiona i niezdolna do poruszania się lub obracania wewnątrz unieruchamiacza ani do poruszania/wycofywania ogona.
      7. Szybko przetrzyj ogon gazą, aby go osuszyć; przetrzyj ogon wacikiem z alkoholem, a następnie osusz go suchą gazą.
        UWAGA: Użyj suchej gazy, aby ogon był wystarczająco suchy, by umożliwić pewne chwycenie, ale nie całkowicie suchy. Gdy ogon jest całkowicie suchy, żyła może być trudniejsza do zauważenia.
      8. Obróć ogon o około 90° w lewo lub w prawo, tak aby jedna z dwóch żył bocznych była skierowana do góry. Zlokalizuj odpowiednie miejsce iniekcji w środkowej jednej trzeciej ogona. Rozpocznij pierwszą iniekcję dystalnie (bliżej końca ogona) i przesuwaj się proksymalnie, jeśli wymagane są dodatkowe iniekcje z powodu niepowodzeń lub wymogów projektu eksperymentalnego.
        UWAGA: Nie próbuj wstrzykiwać dystalnie w stosunku do poprzedniego miejsca iniekcji, ponieważ preparat może wyciec z poprzedniego miejsca. Liczba nieudanych prób iniekcji nie powinna przekraczać 3 na jedną boczną żyłę ogonową, aby uniknąć stresowania myszy lub podania niedokładnych dawek. Opcjonalnie: Użyj kciuka i palca wskazującego ręki niedominującej, aby wywrzeć nacisk proksymalnie (powyżej/bliżej ciała myszy) względem miejsca iniekcji przez 10 s. Palce działają jak staza, aby dodatkowo rozszerzyć żyłę w miejscu iniekcji. Natychmiast po 10 s stosowania stazy puść palce i upewnij się, że jedna z dwóch żył bocznych jest skierowana do góry i jest wyraźnie widoczna.
      9. Przytrzymaj ogon ręką niedominującą, używając kciuka i palca wskazującego bezpośrednio dystalnie względem miejsca iniekcji. Zegnij ogon nad palcem wskazującym tak, aby miejsce iniekcji spoczywało płasko na palcu. Odciągnij ogon, aby był rozciągnięty, a miejsce iniekcji znajdowało się całkowicie poziomo (pod kątem 0°) (równolegle do poziomu stołu) (Rycina 1C).
      10. Trzymaj strzykawkę, używając palca wskazującego i środkowego ręki dominującej po obu stronach kołnierza cylindra strzykawki, trzymając kciuk w gotowości przy tłoku.
        ​UWAGA: Ułatwi to uniknięcie ruchu kciuka lub igły po wprowadzeniu igły do żyły (Rycina 1C).
      11. Oprzyj obie ręce o stół, aby je ustabilizować, i przyłóż igłę bezpośrednio na ogon i żyłę, równolegle do nich, z otworem igły skierowanym do góry. Trzymaj miejsce iniekcji blisko palca wskazującego trzymającego ogon, aby poprawić kontrolę i stabilność miejsca iniekcji.
        UWAGA: Unieruchamiacz rurkowy powinien być na tyle głęboko na stole, aby obie ręce były wsparte o jego powierzchnię.
      12. Trzymając igłę równolegle do żyły ogonowej i wywierając nacisk w dół na igłę, wsuń igłę do przodu do żyły.
        UWAGA: Nacisk w dół powinien być wystarczający, aby wprowadzić igłę pod odpowiednim kątem do żyły. Żyła jest niezwykle płytka, więc igła powinna być tak płasko, jak to możliwe podczas próby wejścia do żyły.
      13. Powoli wstrzyknij roztwór do żyły. Po podaniu dawki powoli wycofaj igłę i natychmiast przyciśnij miejsce iniekcji gazą przez co najmniej 10 s, aby zatamować krwawienie.
        ​UWAGA: Wywieraj nacisk tak długo, aż krwawienie całkowicie ustanie, aby uniknąć potencjalnej utraty wstrzykniętego odczynnika. Po wycofaniu igły zazwyczaj pojawia się kropla krwi, co wskazuje, że igła przebiła żyłę. Sporadycznie kropla krwi nie pojawia się nawet przy udanej iniekcji. Kropla krwi nie jest wskaźnikiem udanej iniekcji; wskazuje jedynie, że igła przebiła żyłę. Niezawodnym wskaźnikiem udanej iniekcji jest całkowity brak oporu tłoka podczas wtryskiwania. Jeśli igła znajduje się wewnątrz żyły, podczas podawania preparatu nie powinno być oporu tłoka igły, a żyła proksymalnie względem miejsca iniekcji przez chwilę wyda się nieco jaśniejsza (zbladnie) (blaknięcie żyły może nie być bardzo wyraźne u niektórych szczepów myszy). Jeśli występuje opór i/lub w miejscu iniekcji zaczyna pojawiać się wybrzuszenie, oznacza to, że igła nie została prawidłowo umieszczona w żyle. W takim przypadku całkowicie usuń igłę z ogona i spróbuj wstrzyknąć do żyły w nowym miejscu iniekcji proksymalnie względem nieudanego miejsca (bliżej ciała myszy).
      14. Utylizuj strzykawki i probówki zanieczyszczone AAV zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi gospodarki odpadami.
      15. Uwolnij mysz z unieruchamiaczy i umieść ją z powrotem w nowej klatce oddzielnie od myszy niepoddanych iniekcji. Monitoruj myszy przez 10 min, aby upewnić się, że poziom aktywności po iniekcji jest normalny.
        UWAGA: Pozwala to uniknąć potencjalnej transmisji wstrzykniętych czynników na myszy niepoddane iniekcji, jeśli podawane są czynniki transmisyjne.
      16. Zdezynfekuj obszar roboczy za pomocą odczynników bakteriobójczych, grzybobójczych i wirusobójczych oraz 70% EtOH. Wyczyść rurkowy unieruchamiacz myszy wodą z mydłem.

3. Disekcja, pobieranie i utrwalanie tkanek27

  1. Przygotowanie stanowiska do pobierania tkanek
    1. Oczyścić stanowisko pracy odczynnikiem do degradacji DNA zgodnie z instrukcją producenta, aby zdegradować zanieczyszczające DNA, które mogą znajdować się w obszarze roboczym.
    2. Wlać metylobutan do metalowego pojemnika. Umieścić metalowy pojemnik z metylobutanem w styropianowym pudełku, a następnie otoczyć pojemnik suchym lodem tak, aby poziom suchego lodu wokół pojemnika był wyższy niż poziom metylobutanu wewnątrz pojemnika.
    3. Oznaczyć i umieścić puste probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL do przechowywania tkanek na suchym lodzie. Pozostawić metylobutan i probówki do przechowywania tkanek do schłodzenia na suchym lodzie przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem zamrażania tkanek. Umieścić pęsetę do przenoszenia tkanek na suchym lodzie.
    4. Oznaczyć i napełnić drugi zestaw probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL świeżą 4% paraformaldehydem (PFA) i przechowywać je w temperaturze pokojowej. Dodać do każdej probówki wystarczającą ilość 4% PFA, aby całkowicie zanurzyć tkanki, które zostaną w niej umieszczone.
  2. Pobieranie i fiksacja tkanek
    1. Eutanazować mysz zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
      UWAGA: W tym przypadku myszy zostały poddane głębokiej narkozie poprzez inhalację izofluranem, a następnie natychmiast poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyi.
    2. Całkowicie spryskać mysz 70% EtOH.
    3. Pobrać wymagane tkanki.
      UWAGA: Opisany tutaj protokół pobierania i fiksacji został przetestowany na mięśniach szkieletowych i wątrobie.
    4. W przypadku tkanek, które zostaną wykorzystane do ekstrakcji DNA:
      1. Wrzucić tkankę do metylobutanu schłodzonego wcześniej na suchym lodzie i pozostawić ją w metylobutanie przez co najmniej 1 min. Używając schłodzonej wcześniej pęsety, przenieść zamrożone tkanki z metylobutanu do schłodzonych wcześniej pustych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 ˚C.
        UWAGA: Opcjonalnie: Tkankę można pociąć na kawałki o masie 20 mg przed wrzuceniem do metylobutanu, aby była gotowa do użycia w kroku 4.1.4.
    5. W przypadku tkanek, które zostaną wykorzystane do analizy histologicznej i do zachowania fluorescencji białek reporterowych:
      1. Używając pęsety przeznaczonej do PFA przechowywanej w temperaturze pokojowej, wrzucić tkanki do odpowiednich probówek do mikrocentryfugi zawierających 4% PFA (przechowywanych w temperaturze pokojowej), upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w 4% roztworze PFA.
        UWAGA: Zanieczyszczenie PFA może negatywnie wpływać na różne późniejsze analizy molekularne. Używać pęset przeznaczonych do PFA wyłącznie podczas pracy z PFA, aby zapobiec zanieczyszczeniu innych tkanek lub narzędzi PFA.
      2. Umieścić probówki do mikrocentryfugi w statywie i przykryć statyw folią aluminiową, aby chronić probówki przed światłem. Inkubować przykryty statyw w temperaturze 4 ˚C na wytrząsarce przy łagodnym wstrząsaniu przez noc.
      3. Po inkubacji nocnej przygotować 5% sacharozę (% w/v) w 1x PBS, rozpuszczając 5,0 g sacharozy w 70 mL 1x PBS poprzez energiczne wstrząsanie. Dodać 1x PBS do uzyskania końcowej objętości całkowitej 100 mL, aby otrzymać 5% roztwór sacharozy (% w/v).
      4. Zsterylizować 5% roztwór sacharozy za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm. Oznaczyć i napełnić probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL świeżo przygotowaną 5% sacharozą.
      5. Przenieść tkanki z 4% PFA do odpowiednich probówek do mikrocentryfugi zawierających 5% sacharozę (przechowywanych w temperaturze pokojowej), upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w 5% roztworze sacharozy.
      6. Umieścić probówki do mikrocentryfugi w statywie i przykryć statyw folią aluminiową, aby chronić probówki przed światłem. Inkubować przykryty statyw w temperaturze 4 ˚C na wytrząsarce przy łagodnym wstrząsaniu przez noc.
      7. Po inkubacji nocnej przygotować 20% sacharozę (% w/v) w 1x PBS, rozpuszczając 20,0 g sacharozy w 70 mL 1x PBS poprzez energiczne wstrząsanie. Dodać 1x PBS do uzyskania końcowej objętości całkowitej 100 mL, aby otrzymać 20% roztwór sacharozy (% w/v).
      8. Zsterylizować 20% roztwór sacharozy za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm. Oznaczyć i napełnić probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL świeżo przygotowaną 20% sacharozą.
      9. Przenieść tkanki z 5% sacharozy do odpowiednich probówek do mikrocentryfugi zawierających 20% sacharozę (przechowywanych w temperaturze pokojowej), upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w 20% roztworze sacharozy.
      10. Umieścić probówki do mikrocentryfugi w statywie i przykryć statyw folią aluminiową, aby chronić probówki przed światłem. Inkubować przykryty statyw w temperaturze 4 ˚C na wytrząsarce przy łagodnym wstrząsaniu przez noc.
      11. Po inkubacji nocnej wlać metylobutan do metalowego pojemnika i umieścić metalowy pojemnik z metylobutanem w styropianowym pudełku. Otoczyć pojemnik suchym lodem tak, aby poziom suchego lodu wokół pojemnika był wyższy niż poziom metylobutanu wewnątrz pojemnika.
      12. Oznaczyć i umieścić puste probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL do przechowywania tkanek na suchym lodzie. Pozostawić metylobutan i probówki do przechowywania tkanek do schłodzenia na suchym lodzie przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem zamrażania tkanek. Umieścić pęsetę do przenoszenia na suchym lodzie.
      13. Szybko osuszyć tkanki za pomocą chusteczek precyzyjnych, aby usunąć nadmiar 20% sacharozy. Wrzucić tkankę do metylobutanu schłodzonego wcześniej na suchym lodzie. Pozostawić tkankę w metylobutanie przez co najmniej 1 min.
      14. Używając schłodzonej wcześniej pęsety, przenieść zamrożone tkanki z metylobutanu do schłodzonych wcześniej pustych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 ˚C.

4. dPCR do ilościowego oznaczenia vg/dg

  1. Ekstrakcja DNA z tkanek i wstępne trawienie RNA
    UWAGA: Protokół ekstrakcji DNA opracowano na podstawie instrukcji do zestawu do ekstrakcji DNA wymienionego w Tabeli materiałów. Probówki zawierające zamrożone fragmenty tkanek należy zawsze przechowywać na suchego lodu.
    1. Przygotować naczynie z lodem.
    2. Dla każdej próbki DNA oznakować jedną probówkę z kuleczkami do lizy o pojemności 1,5 mL oraz dwie pustre, wolne od RNaz i DNaz probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL.
    3. Do każdej probówki z kuleczkami dodać 180 µL pierwszego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA. Wyzerować wagę z pierwszą probówką zawierającą bufor.
      ​UWAGA: Jeśli tkanki nie zostały wstępnie pocięte w kroku 3.2.4.1, należy użyć żyletki schłodzonej na suchym lodzie, aby pociąć tkankę na fragmenty o masie 20 mg. Krok ten musi być wykonany w czystym kriostacie utrzymywanym w temperaturze -20 ˚C lub niższej.
    4. Do probówki dodać jeden fragment tkanki; zważyć i zapisać masę tkanki (powinna wynosić ok. 20 mg).
    5. Natychmiast umieścić probówkę z kuleczkami do lizy i tkanką na lodzie. Bufor może ulec krystalizacji.
    6. Powtórzyć poprzednie kroki dla każdej próbki tkanki.
    7. Przenieść probówki do homogenizatora z kuleczkami do lizy i uruchomić na 1 min z maksymalną prędkością (prędkość 10) w temperaturze 4 ˚C.
    8. Próbki umieścić na lodzie przed przeniesieniem do wirówki. Centryfugować przez 1 min przy 20 000 × g w temperaturze 4 ˚C.
    9. Podczas centryfugowania dodać 20 µL proteinazy K do pierwszej serii probówek do mikrocentryfugi 1,7 mL. Po centryfugowaniu przenieść supernatant z homogenizatów do probówek 1,7 mL zawierających proteinazę K i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze 56 ˚C przez 15 min przy mieszaniu z prędkością 500 RPM.
    10. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.
    11. Dodać 4 µL RNazy A i wymieszać krótkimi impulsami na wortexie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Vortexować impulsowo przez 15 s.
    12. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Dodać 200 µL drugiego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA. Vortexować impulsowo przez 15 s.
    13. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Dodać 200 µL 100% EtOH. Vortexować impulsowo przez 15 s.
    14. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Przenieść lizaty do kolumny wirującej do ekstrakcji DNA. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min.
    15. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 µL trzeciego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA do kolumny. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min.
    16. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 µL czwartego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA do kolumny. Wirować przy 20 000 × g przez 3 min.
    17. Umieścić kolumnę w nowej probówce do mikrocentryfugi 1,7 mL. Dodać 100 µL wody klasy molekularnej do kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
    18. W razie potrzeby zmierzyć stężenie DNA. Przechowywać w temperaturze 4 ˚C w przypadku przechowywania krótkoterminowego lub -20 ˚C w przypadku długoterminowego.
  2. Ekstrakcja DNA z komórek sortowanych metodą FACS
    UWAGA: Protokół ekstrakcji DNA opracowano na podstawie instrukcji do zestawu do ekstrakcji DNA wymienionego w Tabeli materiałów.
    1. Po posortowaniu komórek, scentryfugować próbki przy 300 × g przez 5 s, aby zebrać wszystkie krople ze ścianek i nakrętki. Upewnić się, że wszystkie krople zostały zebrane.
      UWAGA: Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 1,5 mL, przejść bezpośrednio do następnego kroku. Jeśli objętość próbki przekracza 1,5 mL, ostrożnie usunąć i odrzucić górną część supernatantu za pomocą mikropipety, pozostawiając 1-1,5 mL próbki.
    2. Wymieszać próbkę, wielokrotnie pipetując ją w górę i w dół, a następnie przenieść do probówki do mikrocentryfugi 1,7 mL. Centryfugować przy 515 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
    3. Odrzucić supernatant z wyjątkiem ostatnich 50 µL. Resuspender osad w 50 µL pierwszego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA, aby uzyskać objętość końcową 100 µL.
    4. Postępować zgodnie z protokołem producenta dotyczącym izolacji genomicznego DNA z małych objętości krwi (patrz Tabela materiałów).
      1. Dodać 10 µL proteinazy K i 100 µL drugiego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA; wymieszać impulsowo na wortexie przez 15 s. Inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 10 min przy mieszaniu z prędkością 300 RPM. Podczas inkubacji dwukrotnie wymieszać próbki poprzez delikatne odwracanie probówek.
      2. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Dodać 50 µL 100% EtOH i wymieszać impulsowo na wortexie przez 15 s. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      3. Zebrać krople ze ścianek i nakrętki probówki, wirując ją przez 1-2 s w miniwirówce. Przenieść próbki do kolumny do ekstrakcji DNA (kolumna znajduje się w probówce zbiorczej 2 mL), nie mocząc krawędzi. Centryfugować przy 6 000 × g przez 1 min.
      4. Po umieszczeniu kolumny w czystej probówce zbiorczej 2 mL, odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. Dodać 500 µL trzeciego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA do kolumny, nie mocząc krawędzi, i centryfugować przy 6 000 × g przez 1 min.
      5. Ponownie, po umieszczeniu kolumny w czystej probówce zbiorczej 2 mL, odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. Dodać 500 µL czwartego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA do kolumny, nie mocząc krawędzi, i centryfugować przy 6 000 × g przez 1 min.
      6. Umieścić kolumnę w czystej probówce zbiorczej 2 mL i odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. Centryfugować przy 20 000 × g przez 3 min.
      7. Umieścić kolumnę w czystej probówce do mikrocentryfugi 1,7 mL i odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. W celu elucji dodać 20 µL wody klasy molekularnej do środka membrany kolumny; zamknąć nakrętkę i inkubować próbki z wodą klasy molekularnej w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      8. Centryfugować przy 20 000 × g przez 1 min. Przechowywać eluowane DNA w temperaturze 4 ˚C w przypadku przechowywania krótkoterminowego lub -20 °C w przypadku długoterminowego.
  3. Trawienie RNA i oczyszczanie
    UWAGA: Protokół oczyszczania DNA opracowano na podstawie instrukcji do zestawu do ekstrakcji DNA wymienionego w Tabeli materiałów. W zależności od warunków dPCR, odczynników oraz konstrukcji starterów i sond, przed przystąpieniem do ilościowego oznaczenia vg/dg metodą dPCR może być konieczne zapewnienie całkowitego braku RNA w próbce DNA. Zanieczyszczenie RNA może prowadzić do różnego stopnia niedokładności wartości vg/dg w określonych warunkach dPCR.
    1. W probówce PCR 0,2 mL lub probówce do mikrocentryfugi 1,7 mL dodać do każdej próbki DNA maksymalnie 20 µL wyekstrahowanego DNA oraz 1,5 µL RNazy wolnej od DNaz. Jeśli objętość mieszaniny DNA/RNaza jest mniejsza niż 21,5 µL, dodać wodę klasy molekularnej do uzyskania objętości końcowej 21,5 µL i wymieszać, odwracając probówki 25 razy. Inkubować w temperaturze 37 ˚C przez 30 min, mieszając okresowo co 10 min poprzez odwracanie probówek.
      UWAGA: Całkowita ilość kwasów nukleinowych dodana do probówki powinna wynosić od 175 ng do 700 ng. Mogą być wymagane modyfikacje, jeśli próbki DNA zawierają objętości lub ilości kwasów nukleinowych poza tym zakresem lub jeśli próbki DNA zostały izolowane w inny sposób.
    2. Umieścić na lodzie przez 2 min. Dodać do każdej mieszaniny DNA/RNaza odpowiednią ilość wody klasy molekularnej do uzyskania objętości końcowej 100 µL.
      UWAGA: Rekomendowana jest wymieniona tutaj RNaza, ponieważ trawi zanieczyszczające RNA, nie wpływając negatywnie na docelowe DNA ani na późniejsze testy PCR.
    3. Postępować zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oczyszczania genomicznego DNA (patrz Tabela materiałów).
      1. Dodać 10 µL pierwszego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA i 250 µL drugiego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA. Wymieszać impulsowo na wortexie przez 10 s.
      2. Przenieść próbki do kolumny do ekstrakcji DNA w probówce zbiorczej 2 mL, nie mocząc krawędzi. Centryfugować przy 6 000 × g przez 1 min.
      3. Po umieszczeniu kolumny w czystej probówce zbiorczej 2 mL, odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. Dodać 500 µL drugiego buforu z zestawu do ekstrakcji DNA do kolumny, nie mocząc krawędzi. Centryfugować przy 6 000 × g przez 1 min.
      4. Umieścić kolumnę w czystej probówce zbiorczej 2 mL i odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. Centryfugować przy 20 000 × g przez 6 min.
      5. Umieścić kolumnę w czystej probówce do mikrocentryfugi 1,7 mL i odrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przefiltrowany płyn. W celu elucji dodać 20 µL wody klasy molekularnej do środka membrany kolumny, zamknąć nakrętkę i inkubować próbki z wodą klasy molekularnej w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      6. Centryfugować przy 20 000 × g przez 1 min. Przechowywać w temperaturze 4 ˚C w przypadku przechowywania krótkoterminowego lub -20 °C w przypadku długoterminowego.
      7. Potwierdzić brak zanieczyszczenia RNA w próbce trawionej RNazą za pomocą PCR końcowego, dPCR lub ilościowego PCR (qPCR), używając pary starterów PCR, która amplifikowałaby region mRNA obejmujący wiele eksonów, a nie tylko pojedynczy ekson.
        UWAGA: Cel mRNA powinien być genem wysoce eksponowanym w badanej tkance/typie komórek, aby zapewnić poprawną identyfikację zanieczyszczenia mRNA, jeśli występuje. Amplikony obejmujące wiele eksonów pozwalają odróżnić prążki powstałe z zanieczyszczającego mRNA od tych z DNA genomicznego. Zawsze należy posiadać próbkę DNA nietrawioną RNazą jako kontrolę pozytywną reakcji PCR, aby upewnić się, że zanieczyszczenie mRNA zostanie wykryte w przypadku jego obecności.
  4. Cyfrowy PCR (dPCR)
    1. PCR końcowy w celu sprawdzenia specyficzności starterów i optymalnych warunków PCR (opcjonalnie)
      1. Zaprojektować pary starterów i sond dPCR dla genomu wektora oraz pary starterów i sond dPCR dla mysiego genu referencyjnego, który zostanie użyty do ilościowego oznaczenia genomów diploidalnych w próbce.
        UWAGA: Dążyć do uzyskania wielkości amplikonu między 60 bp a 150 bp. Myszim genem referencyjnym powinien być gen o stałej liczbie kopii na genom diploidalny. Dla obliczeń przedstawionych tutaj, gen referencyjny (Polr2a) posiada dwie kopie na genom diploidalny.
      2. Dla reakcji PCR końcowego o objętości 10 µL przygotować mieszaninę PCR, używając odczynników i stężeń końcowych, które zostaną później zastosowane w reakcji dPCR. Dodać próbkę matrycowego DNA trawionego RNazą (zakres ilości kwasów nukleinowych 56-223 ng) do stężenia końcowego 1x dPCR master mix zawierającego polimerazę DNA i dNTP, 0,8 µM każdego startera forward, 0,8 µM każdego startera reverse, 0,4 µM każdej sondy oraz 0,025 U/µL enzymu restrykcyjnego (stężenie końcowe enzymu restrykcyjnego zależy od użytego enzymu i marki). Dodać wodę klasy molekularnej do uzyskania objętości końcowej 10 µL.
        UWAGA: W mieszaninie PCR powinny znaleźć się co najmniej dwie pary starterów i dwie sondy: jedna para starterów i jedna sonda do wykrywania genomu wektora oraz jedna para starterów i jedna sonda do wykrywania genomu myszy.
      3. Warunki cyklicznej termostatyzacji PCR: Wstępny krok aktywacji cieplnej w 95 °C przez 2 min, a następnie 35-45 cykli obejmujących krok denaturacji w 95 °C przez 25 s oraz połączony krok hybrydyzacji/elongacji w 58-62 °C przez 1 min.
        UWAGA: Optymalna temperatura hybrydyzacji musi zostać określona dla każdego amplikonu i pary starterów. Liczba cykli może być dostosowana do ilości matrycowego DNA w próbce.
      4. Wizualizować produkt PCR na żelu agarozowym za pomocą elektroforezy żelowej, aby określić obecność docelowych prążków amplikonów oraz wszelkich możliwych niespecyficznych prążków amplifikacji.
      5. Przejść do następnego kroku dPCR po potwierdzeniu, że pary starterów i warunki cykliczne prowadzą do specyficznej amplifikacji sekwencji docelowych.
    2. Reakcja dPCR
      1. Dla reakcji dPCR o objętości 40 µL dodać do 4 µL próbki matrycowego DNA trawionego RNazą (zakres ilości kwasów nukleinowych 50-330 ng) do stężenia końcowego 1x dPCR master mix zawierającego polimerazę DNA i dNTP, 0,8 µM każdego startera forward, 0,8 µM każdego startera reverse, 0,4 µM każdej sondy oraz 0,025 U/µL enzymu restrykcyjnego (stężenie końcowe enzymu restrykcyjnego zależy od użytego enzymu i marki). Dodać wodę klasy molekularnej do uzyskania objętości końcowej 40 µL.
      2. Warunki cyklicznej termostatyzacji dPCR: Wstępny krok aktywacji cieplnej w 95 °C przez 2 min, a następnie 40-50 cykli obejmujących krok denaturacji w 95 °C przez 25 s oraz połączony krok hybrydyzacji/elongacji w 58-62 °C przez 1 min.
        UWAGA: Optymalna temperatura hybrydyzacji musi zostać określona dla każdego amplikonu i pary starterów. Liczba cykli może być dostosowana do ilości matrycowego DNA w próbce. Przedstawione tutaj objętości, stężenia i warunki są zoptymalizowane dla płytek dPCR, odczynników i urządzenia wymienionego w Tabeli materiałów. Warunki te ograniczają wpływ potencjalnych inhibitorów dPCR, które mogłyby zmniejszyć dokładność reakcji.
      3. Po przeprowadzeniu reakcji dPCR i uzyskaniu wartości bezwzględnych dla genomów wektorowych i mysiego genu referencyjnego, obliczyć vg/dg w próbce, korzystając z równań (7-8).
        Dla genów referencyjnych z dwiema kopiami genu/genom diploidalny:
        Wartość bezwzględna genomów diploidalnych (dg) = Obliczanie bezwzględnej liczby kopii, równanie; schemat; wyniki analizy ilościowej genów.    (7)
        vg/dg = Stosunek genomów wektorowych do diploidalnych (vg/dg); analiza ekspresji; schemat genetyczny.    (8)
      4. Sprawdzić jednowymiarowy wykres rozrzutu (1D scatterplot) reakcji dPCR, aby potwierdzić poprawność testu i kwantyfikacji (Rysunek 3A,C). Aby test był uznany za poprawny, należy potwierdzić, że wykres rozrzutu spełnia wszystkie poniższe kryteria: obecność partycji pozytywnych i negatywnych; wyraźny rozdział między partycjami pozytywnymi a negatywnymi, umożliwiający dokładne wyznaczenie progu; oraz brak lub niewielką liczbę kropel pomiędzy partycjami pozytywnymi a negatywnymi (zjawisko znane jako „deszcz”), co może obniżyć dokładność kwantyfikacji dPCR.

Wyniki

Samce myszy w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni otrzymały AAV poprzez wstrzyknięcie do bocznej żyły ogonowej w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości wstrzykiwanego roztworu od 150 do 200 µL. Zastosowany tutaj ssDNA AAV dostarczał transgen rekombinazy Cre pod kontrolą promotora CMV. Wstrzyknięte myszy były homozygotami pod względem allelu reporterowego Cre Ai14. W obecności rekombinazy Cre komórki zawierające allel Ai14 wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka tdTomato. Ponieważ ekspresja tdTomato jest wynikiem indukowanej przez Cre rekombinacji genomicznej, komórki wykazujące ekspresję tdTomato wskazują na komórki, które zostały bezpośrednio transdukowane przez AAV lub są komórkami potomnymi komórek transdukowanych. Przedstawione tutaj dane pochodzą od myszy wstrzykniętych AAV9-CMV-Cre w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości 160 µL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). Myszy uśmiercono 28 dni po wstrzyknięciu, a tkanki pobrano zgodnie z powyższym opisem. Kilka mięśni szkieletowych oraz płatów wątroby poddano trawieniu, a ich komórki wyizolowano za pomocą FACS. Kilka płatów wątroby zamrożono natychmiast przy użyciu schłodzonego metylobutanu w celu ekstrakcji kwasów nukle innych. Kilka mięśni szkieletowych i płatów wątroby utrwalono i zamrożono do obrazowania histologicznego fluorescencyjnego białka tdTomato. tdTomato wykazuje rozproszoną ekspresję w całej wątrobie (Rycina 2A) oraz w mięśniu czworogłowym (Rycina 2C), co wskazuje, że AAV9 w szerokim zakresie dotarł do różnych obszarów obu tkanek i dokonał ich transdukcji.

DNA wyekstrahowany z zamrożonej w świeżym stanie wątroby oraz komórek sortowanych metodą FACS wykorzystano do ilościowego oznaczenia vg/dg za pomocą dPCR. Ilościowe oznaczenie vg/dg może służyć do oceny powtarzalności wstrzykiwań oraz wydajności transdukcji AAV w analizowanej próbce. Jednowymiarowe wykresy rozrzutu kropel (scatterplots) z próbki tkanki wątroby zamrożonej w świeżym stanie oraz komórek sortowanych metodą FACS wykorzystano do zapewnienia poprawności analizy (Rysunek 3A,C). Wykres rozrzutu wykazał obecność partycji pozytywnych i negatywnych, wyraźne oddzielenie partycji pozytywnych od negatywnych, co pozwala na dokładne określenie progu detekcji, oraz obecność zerowej lub niewielkiej liczby kropel pomiędzy partycjami pozytywnymi a negatywnymi, co może obniżyć dokładność analizy dPCR. Spełnienie wszystkich tych kryteriów wskazało, że wyniki analizy dPCR były prawidłowe. Liczba Polr2a ilość kopii genu w każdej próbce została określona w celu wyznaczenia liczby diploidalnych genomów myszy (2 Polr2a kopii genu/diploidowy genom myszy), a primery/sonda przeciwko sekwencji transgenu rekombinazy Cre zostały użyte do ilościowego oznaczenia genomu wirusowego (1 kopia transgenu/genom wirusowy, Tabela 1). Wartość vg/dg została określona dla świeżomrożonej próbki tkanki wątroby oraz komórek sortowanych metodą FACS; w każdej z tych próbek stwierdzono obecność odpowiednio 187,7 vg/dg i 4,7 vg/dg (Rycina 3B,D). W charakterze kontroli negatywnych zastosowano próbki od myszy wstrzykniętych PBS oraz kontrole bez matrycy, niezawierające kwasów nukleinowych.

Układ do edycji genów; stanowisko PCR; mikropipeta, elektroforeza żelowa; eksperyment analizy DNA.
Rysunek 1: Przegląd stanowiska do wstrzykiwań dożylnych. (A) Narzędzia niezbędne do wykonania wstrzyknięcia dożylnego (IV). Przedstawiono tutaj: (1) minutnik, (2) rurkę ograniczającą dla myszy, (3) nieocięty i (4) ocięty plastikowy stożek ograniczający, (5) gazik nasączony alkoholem, (6) puste pudełko na końcówki do pipet użyte jako platforma do podwyższenia rurki ograniczającej, (7) jednorazowe podkładki chłonne, (8) probówkę stożkową 15 mL z ciepłą wodą, (9) uchwyt do probówek 15 mL, (10) gazę oraz (11) strzykawkę insulinową. (B) Mysz jest najpierw umieszczana w rurce ograniczającej. Następnie, jeśli mysz jest zbyt mała, aby rurka mogła ją samodzielnie unieruchomić, wprowadza się ocięty stożek ograniczający, tworząc rękaw unieruchamiający wokół myszy. Należy upewnić się, że ograniczniki nie utrudniają oddychania myszy. Rurkę ograniczającą umieszcza się na podwyższonej platformie, aby umożliwić zanurzenie ogona myszy w ciepłej wodzie. (C) Pozycjonowanie ogona myszy i kąt trzymania igły bezpośrednio przed wykonaniem wstrzyknięcia. Należy odciągnąć ogon tak, aby był wyprostowany, a miejsce wstrzyknięcia znajdowało się całkowicie w poziomie. Igła jest równoległa do ogona i żyły, a ścięcie igły jest skierowane ku górze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ekspresja genu wirusowego AAV9-CMV-Cre w wątrobie i mięśniach czworogłowych; porównanie mikroskopii fluorescencyjnej z PBS.
Rysunek 2: Detekcja fluorescencyjnego białka reporterowego po wtryśnięciu dożylnym. Samcom myszom samcom w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni, posiadającym allel reporterowy Cre Ai14, wstrzyknięto dożylnie (IV) albo AAV9-CMV-Cre w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości 160 µL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg), albo PBS. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów (A) wątroby lub (C) mięśni czworogłowych myszy po dożylnym podaniu AAV9 dostarczającego Cre. (B) Przekroje wątroby lub (D) mięśni czworogłowych myszy po wstrzyknięciu PBS zostały zobrazowane w celu uzyskania kontroli negatywnej. Tkanki pobrano i zamrożono po utrwaleniu 28 dni po wtryśnięciu dożylnym. Po ekspozycji na Cre fluorescencyjne białko tdTomato jest wyrażane w komórkach transdukowanych oraz komórkach potomnych komórek transdukowanych. Przekroje o grubości 10 µm zobrazowano przy powiększeniu 10x. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki cytometrii przepływowej analizy wiązania DNA; wykresy kropkowe i grafiki analizowanych próbek partycji.
Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie genomów wektora na genom diploidalny (vg/dg). Jednowymiarowy wykres rozrzutu ilościowego genomów wektora dPCR w (A>) tkance wątroby lub (C>) komórkach sortowanych metodą FACS, pobranych od myszy wstrzykniętych AAV9-CMV-Cre lub PBS. Wykresy rozrzutu przedstawiają dodatnie i ujemne partycje dPCR, a także próg detekcji wskazany poziomą linią przechodzącą przez próbki. (B,D) Ilościowe oznaczenie vg/dg po analizie genomów diploidalnych myszy i genomów wektora w (B>) tkance wątroby lub (D>) próbkach komórek sortowanych metodą FACS. Przedstawione wyniki pochodzą od jednej myszy wstrzykniętej AAV9 oraz jednej myszy wstrzykniętej PBS, z technicznym duplikatem dPCR dla każdej myszy. Słupki błędów wskazują 95% przedział ufności dla każdej próbki. Skróty: NTC = kontrola bez matrycy; dPCR = cyfrowa PCR; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

StarterSekwencja
Cre starter prawyCTGACGGTGGGAGAATGTTAAT
Cre starter odwrotnyCATCGCTCGACCAGTTTAGTT
Cre sonda/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/
Polr2a starter prawyGACTCCTTCACTCACTGTCTTC
Polr2a starter rewersyjnyTCTTGCTAGGCAGTCCATTATC
Polr2a sonda/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/

Tabela 1: Sekwencje starterów i sond użytych do ilościowego oznaczania vg/dg. Startery i sonda Cre zostały użyte do ilościowego oznaczenia genomu wektora. Startery i sonda Polr2a zostały użyte do ilościowego oznaczenia diploidalnego genomu myszy.

Dyskusja

Terapie oparte na AAV mają ogromny potencjał w przypadku zaburzeń monogenowych ze względu na wszechstronność AAV jako wektora terapii genowej, co umożliwia dostosowanie AAV do różnych potrzeb związanych z dostarczaniem różnych zaburzeń 4,5,7,9. AAV są powszechnie podawane w postaci wstrzyknięcia dożylnego w przedklinicznych modelach mysich w celu przetestowania bezpieczeństwa i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych16. Ponieważ różne wstrzykiwane dawki AAV mogą powodować znaczne różnice w wynikach eksperymentalnych, niezwykle ważne jest, aby eksperymentatorzy byli w stanie konsekwentnie wstrzykiwać zamierzoną dawkę AAV, aby zapewnić ważność i solidność wygenerowanych danych in vivo 28. Zastrzyki dożylne są szeroko stosowane, ale są technicznie trudne, wymagają intensywnego szkolenia i ciągłej praktyki, aby rozwinąć i utrzymać poziom umiejętności, który zapewnia niezmiennie udane zastrzyki 16,17,18,19. Oprócz prawidłowego wstrzykiwania AAV, zwykle pożądane jest stosowanie testów w celu oceny biodystrybucji wstrzykniętego AAV i skuteczności dostarczania do tkanek lub komórek docelowych29,30.

Protokół ten ma na celu pomóc eksperymentatorom w łatwym wykonywaniu skutecznych i spójnych wstrzyknięć dożylnych poprzez dokładne opisanie szczegółów zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwania dożylnego w celu podania AAV u 7-9 tygodniowych myszy bez sedacji. Należy zauważyć, że myszy, które są znacznie mniejsze lub większe niż myszy typu dzikiego w zastosowanym tutaj przedziale wiekowym, mogą stanowić większe wyzwanie ze względu na zmniejszoną widoczność żył lub niekompatybilność z ogranicznikami stosowanymi w tej metodzie. Wcześniej donoszono, że zastrzyki dożylne z ogona nie są odpowiednie do dożylnego podawania odczynników myszom w wieku poniżej 6 tygodni ze względu na mały rozmiar naczynia31. Chociaż jest to możliwe, konsekwentne wstrzykiwanie myszom ważącym mniej niż 22,0 g może być trudne. Badacze wykorzystujący myszy o nietypowych rozmiarach mogą być zmuszeni do dostosowania procedury. Protokół ten przedstawia również kilka testów, które można wykorzystać do oceny biodystrybucji AAV i skuteczności transdukcji.

Podczas przestrzegania tego protokołu należy pamiętać o kilku krytycznych punktach. Podczas wstrzykiwania igły 29 G zapewniają większy opór, jeśli igła nie znajduje się wewnątrz żyły. Zmniejsza to objętość traconą w wyniku przypadkowego okołonaczyniowego wstrzyknięcia roztworu podczas nieudanych prób wstrzyknięcia. Strzykawki insulinowe mają mniejsze objętości martwe niż zwykłe strzykawki. W przypadku użycia innej strzykawki i (lub) igły niż wymienione tutaj, może być konieczne przygotowanie dodatkowej objętości wstrzykniętej w krokach protokołu 1.1.3.3 w celu uwzględnienia większej objętości przestrzeni martwej (np. dodać 30 μl do zamierzonej dawki zamiast 15 μl).

Jeśli podczas zasysania dawki AAV do strzykawki na bokach strzykawki tworzą się drobne pęcherzyki powietrza spowodowane aspiracją, należy powoli pociągnąć wstrzyknięcie w górę strzykawki. Spowoduje to usunięcie większości małych pęcherzyków powietrza. Załadować co najmniej dodatkowe 10-15 μl AAV do zamierzonej objętości do wstrzyknięcia. Ta dodatkowa objętość ma na celu uwzględnienie wszelkiej objętości, która może zostać utracona podczas usuwania pęcherzyków powietrza lub potencjalnych nieudanych prób wstrzyknięcia. (np. jeśli objętość docelowa do wstrzyknięcia wynosi 150 μl, należy załadować 165 μl do strzykawki (w połowie odległości między oznaczeniami 160 μl i 170 μl na skali strzykawki). Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle, a objętość w strzykawce wynosi 165 μl bezpośrednio przed udaną próbą wstrzyknięcia, należy dostarczyć odczynnik do momentu, gdy w strzykawce pozostanie 15 μl (w połowie drogi między znacznikami 10 μl i 20 μl), dostarczając w ten sposób 150 μl (165 μl - 150 μl = 15 μl)). Wyrównanie prześwitu skosu (skos skierowany do góry) ze skalą strzykawki umożliwia śledzenie dostarczanej objętości podczas iniekcji.

Niektórzy eksperymentatorzy mogą preferować umieszczenie myszy na boku, tak aby jedna z jej żył była prosta i łatwo dostępna, w porównaniu z myszą na nogach. Jednak ogon myszy na boku będzie nachylony pod różnymi kątami w zależności od wielkości myszy, co wymaga regulacji kąta wstrzyknięcia podczas wstrzykiwania myszom o różnych rozmiarach. Może to negatywnie wpłynąć na spójność powodzenia zabiegu. Podczas początkowych prób ćwiczeniowych eksperymentatorzy mogą wypróbować obie orientacje krępujące myszy, aby określić preferowane podejście. Trzymanie myszy na nogach umożliwia szybki i łatwy dostęp do obu bocznych żył ogonowych. Skraca to czas krępowania, gdy potrzebny jest dostęp do obu żył w przypadku wielu nieudanych prób wstrzyknięcia.

W przypadku wstrzykiwania żyły bocznej blisko podstawy ogona (bliżej ciała myszy) (szczególnie w przypadku myszy o masie ciała >30 g.), należy dostosować kąt wstrzyknięcia z równoległego do żyły na 5°-10° do żyły, ponieważ żyła u podstawy ogona jest nieco głębsza niż dystalnie.

Wymienione tutaj protokoły kontroli trawienia RNazy i zanieczyszczenia RNA zostały zweryfikowane na próbkach DNA wyizolowanych ze świeżo mrożonych tkanek wątroby zawierających łącznie 175-700 ng kwasów nukleinowych w 20 μL. Protokół trawienia RNazy został również przetestowany na próbkach DNA wyizolowanych ze świeżo zamrożonych tkanek wątroby i komórek posortowanych za pomocą FACS, aby potwierdzić obecność genomu wektora i genomu myszy po trawieniu RNazy. Wyniki zwizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym amplifikacji PCR docelowych amplikonów metodą PCR.

Postępowanie zgodnie z opisaną metodologią może skrócić czas szkolenia i praktyki potrzebny do opanowania iniekcji dożylnych i skutkować wyższym wskaźnikiem udanych wstrzyknięć, co pozwoliłoby zaoszczędzić odczynniki. Protokół ten wykorzystuje proste i powszechnie używane narzędzia bez potrzeby korzystania z zaawansowanego sprzętu lub konfiguracji, które mogą nie być łatwo dostępne. Ponadto, wymienione tutaj etapy iniekcji dożylnej mogą być stosowane do szerokiej gamy zastrzyków, które muszą być podawane dożylnie, takich jak oligonukleotydy antysensowne (ASO), z odpowiednimi modyfikacjami wprowadzonymi do etapów przygotowania iniekcji w zależności od wstrzyknięcia.

Oświadczenia

Autorzy nie posiadają żadnych ujawnień, które są istotne dla pracy opublikowanej w tym artykule.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować personelowi placówki opieki nad zwierzętami NINDS za wsparcie. Praca ta była wspierana przez Wydział Badań Wewnętrznych NIH, NINDS (Raport roczny nr 1ZIANS003129). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr strzykawkowyMilliporeSLGVM33RS
0,3 ml strzykawki insulinowe z igłą 29GBD Biosciences324702
Mikrowirówka 1,7 ml  probówkaCrystalgen23-2051
10 ml strzykawkaBD Biosciences302995
100% EtOHFirma Warner Graham 201096
10x buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS)Corning46-013-CMSłuży do przygotowania 1x PBS do utrwalania tkanek
15 ml stożkowa rurkaCorning430766
15 ml stożkowy uchwyt na probówkęWiele źródełNie dotyczy
190-procentowy alkohol etylowyWarner Graham Company6810-01-113-7320Służy do przygotowania 70% etanolu
1x sterylny PBSGibco10010023
2 ml probówki do przechowywania tkanek z mikrowirówkąEppendorf022363344
4% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences157-4
Wirus związany z adenowirusem (AAV)Charles RiverN/AJednoniciowy DNA (ssDNA) AAV został zapakowany w celu dostarczenia rekombinazy Cre jako transgenu napędzanego przez promotor CMV
Wacik nasączony alkoholemBD Biosciences326895
Rurka do lizy perełkowejNext AdvanceGREENE5
Enzym restrykcyjny BsuRI (HaeIII)Thermo Fisher ScientificER0151 
Mieszalnik pociskówNext AdvanceBBX24B
Myszy pochodzące z Ai14 ze szczepu 007914 JAX (tło genetyczne: C57BL/6J)N/AN/AMyszy zawierające allel Ai14 Cre-reporter zakupiono od JAX (numer katalogowy: 007914)
Jednorazowe wkłady chłonneFisherbrand1420662
Kleszcze preparacyjneFine Science Tools (FST)11251-35
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools (FST)14085-08
Odczynnik do degradacji DNA (DNAZap)InvitrogenAM9890
RNaza do ekstrakcji DNA AQiagen19101Do trawienia RNA podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych
RNaza wolna od DNaz do oczyszczania DNA F. Hoffmann-La Roche11119915001Do trawienia RNA po kwasie nukleinowym ekstrakcja
sondy dPCR Zestaw do PCRQiagen250102
oprogramowanie dPCR Qiagen Nie dotyczy Pakiet oprogramowania QIAcuity 
Podwyższona platformaWiele źródełNie dotyczyPuste pudełko na końcówki do pipet zostało użyte do podniesienia ogranicznika myszy podczas rozgrzewania ogona
Mikroskop fluorescencyjnyWiele źródełNie dotyczyModel użyty tutaj: Nikon Eclipse Ti
Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego Wiele źródeł Nie dotyczy Użyte tutaj oprogramowanie: NIS-Elements 
GazaCovidien9022
Blok grzewczyEppendorfThermomixer 5350
Wirówka szybkoobrotowaEppendorf22620689
Metalowy pojemnikVollrath80125
MetylobutanJ.T. BakerQ223-08
Jakość wody molekularnejBiologiczna351-029-131
Ogranicznik rurki myszyBraintree ScientificTV-RED-150-STD
Mini wirówka MyfugeBenchmark ScientificC1012
Termocykler do reakcji łańcuchowej polimerazyBio-Rad Laboratories1851148Model: Chusteczki precyzyjne C1000 Touch
Kimberly-Clark Professional7552
Proteinaza KQiagen19131
QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-dołkowysystem Qiagen250001
QIAcuity One dPCRQiagen911020
Qiagen DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504Używany do ekstrakcji DNA z tkanek
Qiagen QIAamp DNA Micro KitQiagen56304Używany do oczyszczania genomowego DNA i izolacji DNA z małych objętości krwi prtocotol był używany do ekstrakcji DNA z komórek posortowanych przez FACS
Stożek powstrzymujący gryzonieBraintree ScientificMDC-200
ScaleOhaus72212663
Pudełko styropianoweWiele źródełNie dotyczy
SacharozaSigma-AldrichS9378-1kg
Środek do czyszczenia i dezynfekcji powierzchniPeroxigard29101 
TimerWiele źródełNie dotyczy
Kleszcze transferoweFine Science Tools (FST)91113-10
VortexDaigger & Firma22220AModel: Daigger Vortex Genie 2

Bibliografia

  1. Tisdale, A., et al. The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429(2021).
  2. Condo, I. Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies. Int J Mol Sci. 23 (12), 6525(2022).
  3. Vaisitti, T., et al. The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374(2021).
  4. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  5. Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023. Viruses. 15 (3), 698(2023).
  6. Wang, C., et al. Emerging non-viral vectors for gene delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 272(2023).
  7. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl 3rd, W. R. Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  8. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).
  9. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  10. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  11. Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: A review. Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).
  12. Jucker, M. The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases. Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).
  13. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  14. Anders, H. J., Vielhauer, V. Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design. Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
  17. Hauff, P., Nebendahl, K. Drug administration. Small Animal Imaging: Basics and Practical. Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. , Springer International Publishing. Cham. 127-152 (2017).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), (2019).
  19. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).
  20. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
  21. Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction. J Vis Exp. (126), e55994(2017).
  22. Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model. J Vis Exp. (165), e61961(2020).
  23. Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs. J Vis Exp. (154), e60687(2019).
  24. JoVE. Lab Animal Research. Compound administration I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2023).
  25. Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice. UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf (2023).
  26. Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , Available from: https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf (2012).
  27. Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections. Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).
  28. Burr, A., et al. Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).
  29. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  30. Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics. Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).
  31. Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. Tumor formation assays. Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykiwanie do ylnedostarczanie systemowewektory terapii genowejunieruchomienie myszyfluorescencyjne bia ko reporteroweobrazowanie histologicznetransdukcja AAVanaliza biodystrybucji

Powiązane artykuły