Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66935

⸱

3 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Neuroscience Research Institute, University of California, Santa Barbara

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia metodę szybkiej ekstrakcji RNA i porównywania poziomów transkryptów do analizy ekspresji genów u niesporczaka Hypsibius exemplaris. Ta wysokoprzepustowa metoda, wykorzystująca fizyczną lizę, wymaga pojedynczego niesporczaka jako materiału wyjściowego i powoduje solidną produkcję cDNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).

Streszczenie

Niesporczak Hypsibius exemplaris to wyłaniający się organizm modelowy, znany ze swojej zdolności do przetrwania ekstremalnych warunków środowiskowych. Aby zbadać mechanizmy molekularne i genetyczne podstawy takiej ekstremotolerancji, wiele badań opiera się na sekwencjonowaniu RNA (RNA-seq), które można przeprowadzić na populacjach od dużych kohort po pojedyncze zwierzęta. Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i interferencja RNA (RNAi) są następnie wykorzystywane do potwierdzenia wyników sekwencjonowania RNA i oceny wymagań genetycznych dla genów kandydujących. Takie badania wymagają wydajnej, dokładnej i niedrogiej metody ekstrakcji RNA i pomiaru względnych poziomów transkryptu za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR). Praca ta przedstawia wydajną metodę ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporzkiem i pojedynczą rurką (STST), która nie tylko niezawodnie izoluje RNA z poszczególnych niesporczaków, ale także skraca czas i koszty każdej ekstrakcji. Ta metoda ekstrakcji RNA pozwala uzyskać ilości cDNA, które można wykorzystać do amplifikacji i wykrywania wielu transkryptów metodą ilościowego PCR (qRT-PCR). Metoda została zwalidowana poprzez analizę dynamicznych zmian w ekspresji genów kodujących dwa białka regulowane szokiem cieplnym, Heat-Shock Protein 70 β2 (HSP70 β2) i Heat-Shock Protein 90α (HSP90α), co umożliwia ocenę ich względnych poziomów ekspresji u osób narażonych na działanie ciepła za pomocą qRT-PCR. STST skutecznie uzupełnia istniejące metody ekstrakcji masowego i pojedynczego niesporczakowego RNA, umożliwiając szybkie i niedrogie badanie indywidualnych poziomów transkrypcji niesporczaków za pomocą qRT-PCR.

Wprowadzenie

Niesporczaki to małe wielokomórkowe zwierzęta znane ze swojej zdolności do przetrwania w ekstremalnych warunkach, które są śmiertelne dla większości innych form życia1. Na przykład, zwierzęta te mogą przetrwać prawie 1000 razy większą dawkę promieniowania jonizującego, która jest śmiertelna dla ludzi2,3,4,5,6,7,8,9,10, prawie całkowite wysuszenie11,12,13,14,15, zamrażanie przy braku dodanych krioprotektantów16,17,18, a w stanie wysuszonym nawet próżnia przestrzeni19,20. Ze względu na ich wyjątkową zdolność do przetrwania w ekstremalnych warunkach, zwierzęta te stały się podstawowymi modelami do zrozumienia ekstremoligencji w złożonych, wielokomórkowych organizmach1,21,22,23.

Stabilna manipulacja genetyczna tych niezwykłych zwierząt, w tym transgeneza i modyfikacja genów linii zarodkowej, pozostawała do niedawna nieuchwytna24,25. W związku z tym większość eksperymentów mających na celu ujawnienie molekularnych mechanizmów ekstremtolerancji przeprowadza się poprzez profilowanie transkrypcji za pomocą sekwencjonowania RNA. Istnieje wiele cennych i pouczających zestawów danych sekwencjonowania RNA dla niesporczaków w różnych ekstremalnych warunkach, począwszy od promieniowania8,9,26,27,28, stres cieplny29, stres zamrażający12, oraz desiccation27,30,31,32,33. Niektóre z tych badań wykorzystywały metody ekstrakcji i oczyszczania masowego RNA, aby rzucić światło na nasze molekularne zrozumienie ekstremtolerancji. Jednak masowa ekstrakcja transkryptów RNA od wielu zwierząt uniemożliwia analizę zmienności ekspresji genów między osobnikami, tracąc w ten sposób potencjalne bogactwo bardziej wyrafinowanych zestawów danych. Co ważne, badania te często analizują niejednorodne populacje zwierząt, które obejmują zarówno zwierzęta, które przetrwały stresory środowiskowe, jak i te, które tego nie przeżyły. W związku z tym badania te są mylone przez uśrednianie danych dotyczących ekspresji z wielu i potencjalnie dramatycznie różnych stanów odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, Arakawa i in., 201634 opracowali elegancki potok sekwencyjny RNA o niskim nakładzie wejściowym, który stosuje zestaw do ekstrakcji RNA, a następnie liniowy etap amplifikacji PCR przy użyciu single34,35,36 lub multiple30,37,38zwierząt jako danych wejściowych. Badania te miały fundamentalne znaczenie dla naszego zrozumienia ekstremolatolerancji niesporczaków22. Co ciekawe, protokół ten został również zastosowany do qRT-PCR przy użyciu siedmiu zwierząt jako materiału wyjściowego24.

W większości organizmów modelowych, po zidentyfikowaniu potencjalnych celów za pomocą sekwencji RNA, qRT-PCR jest następnie wykonywany w celu potwierdzenia zmian transkrypcyjnych zidentyfikowanych przez sekwencję RNA i oceny przebiegu czasowego ekspresji genów kandydujących w sposób wysokorozdzielczy. Aby przetestować funkcję zidentyfikowanych genów, po takich badaniach często przeprowadza się eliminację celów molekularnych za pośrednictwem RNAi39,40 oraz analizę zdolności ekstremalnego12,41. Skuteczność każdego knockdownu RNAi jest zwykle potwierdzana za pomocą qRT-PCR poprzez bezpośrednie monitorowanie spadku liczebności transkryptu. Jednak RNAi jest pracochłonnym procesem u niesporczaków, ponieważ każdy dsRNA musi być dostarczony poprzez ręczne mikrowstrzyknięcie osobników39,40. Ze względu na niską przepustowość tej strategii, szybka i tania metoda ekstrakcji RNA dostosowana do qRT-PCR od pojedynczych zwierząt byłaby bardzo cenna dla badań nad niesporczakami. Chociaż poprzednie metody zostały opracowane do ekstrakcji RNA z pojedynczych niesporczaków, protokoły te nie łączyły ich ekstrakcji z qRT-PCR, zamiast tego polegając na metodach opartych na gęstości optycznej12,40,41. Zmotywowani tymi wyzwaniami, staraliśmy się opracować protokół, który niezawodnie dostarcza RNA w ilości i jakości, który można wykorzystać do qRT-PCR z pojedynczego H. exemplaris.

Adaptacja z protokołu ekstrakcji RNA na jednym zwierzęciu opracowanego dla Caenorhabditis elegans42, STST jest zoptymalizowany dla H. exemplaris. Metoda ekstrakcji składa się z sześciu szybkich etapów zamrażania i rozmrażania, fizycznie rozrywających naskórek, umożliwiając ekstrakcję RNA, a następnie syntezę cDNA. Metoda STST skraca czas ekstrakcji ponad 24-krotnie w porównaniu z metodami ekstrakcji RNA luzem, opisanymi przez Boothby, 201843, oraz o 30% w porównaniu z zestawami do ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporakiem, jak opisali Arakawa i in., 201634. Co więcej, liczba interakcji próbka-eksperymentator została zmniejszona z 5 do zaledwie 1 w porównaniu z preparatami z zestawu do ekstrakcji RNA, zmniejszając w ten sposób ryzyko zanieczyszczenia egzogennymi rybonukleazami. Podczas poszukiwania genów o wysokiej ekspresji, metoda STST wytwarza wystarczającą ilość cDNA dla 25 ilościowych reakcji RT-PCR na pojedynczy niesporczak, wymagając tylko 1 μL z całkowitej objętości cDNA wynoszącej 25 μl na reakcję. Jednak stężenia matryc muszą być empirycznie określone dla transkryptów o niższej liczebności.

Skuteczność metody STST do analizy dynamicznych zmian w ekspresji genów została oceniona poprzez badanie różnicowej ekspresji genów kodujących białko szoku cieplnego-90α (HSP90α) i białko szoku cieplnego 70β2 (HSP70β2) w odpowiedzi na krótkotrwały szok termiczny w temperaturze 35°C przez 20 minut. Zarówno HSP70β2, jak i HSP90α w większości organizmów eukariotycznych są szybko regulowane w górę po krótkotrwałej ekspozycji na szok cieplny (20 min)42. Analiza H. exemplaris wykazała, że zarówno RNA kodujące HSP70β2, jak i HSP90α wyekstrahowane z pojedynczych niesporczaków poddanych obróbce cieplnej wykazywały statystycznie istotny wzrost ekspresji po krótkotrwałej ekspozycji na ciepło. Odkrycia te pokazują, że protokół STST może być używany do analizy dynamicznych zmian w ekspresji genów u poszczególnych zwierząt w czasie.

Metoda ekstrakcji STST powinna uzupełniać istniejące metody eksperymentalne, takie jak sekwencjonowanie RNA, ułatwiając szybką i tanią ekstrakcję RNA oraz późniejsze porównywanie poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR. Metoda ta będzie również przydatna do oceny wydajności i penetracji RNAi u osób, którym wstrzyknięto ręcznie więcej niż sama gęstość optyczna. Wreszcie, ze względu na ich podobne struktury kutykularne i cechy fizyczne, jest prawdopodobne, że metoda ta będzie również skuteczna w analizie ekspresji genów u innych gatunków niesporczaków44.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Proces syntezy cDNA niesiorów: schemat cykli zamrażania i rozmrażania, analiza RT-PCR, zestaw do pipetowania.
Rycina 1: Jednoprotokółowa procedura ekstrakcji RNA z pojedynczego niesiora w jednej probówce. (A) Schemat przedstawiający protokół ekstrakcji RNA z pojedynczego niesiora, obejmujący sześć cykli zamrażania i rozmrażania oraz następującą po nich syntezę cDNA. Próbki mogą być następnie wykorzystane do analiz RT-PCR i qRT-PCR. (B) Zdjęcie końcówki mikropipety użytej do usunięcia wody. Pasek skali: 2 mm. (C) Obraz w polu jasnym przedstawiający niesiora w niewielkiej objętości wody (linia przerywana). Usunięcie większości wody do poziomu wskazanego na zdjęciu jest niezbędne do prawidłowej ekstrakcji i zapobiega rozcieńczeniu buforu lizującego. Pasek skali: 50 μm. (D) Zdjęcie przedstawiające zanurzanie próbek w ciekłym azocie za pomocą długiej pęsety w celu bezpiecznego i szybkiego zamrażania i rozmrażania próbek. Część treści została przygotowana w programie BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Rysunek 1A przedstawia schemat procedury. Szczegółowe procedury hodowli niesiorówek i glonów opisano w opublikowanych wcześniej raportach45,46,47.

1. Sterylizacja wody źródlanej

  1. Wlać 2 L wody źródlanej z 5-galonowego baniaka (szczegóły w Tabeli materiałów) do 2 L szklanej butelki odpornej na autoklawowanie.
  2. Nałożyć zakrętkę na butelkę odporną na autoklawowanie i zabezpieczyć niewielką ilością taśmy do autoklawowania. Nie dokręcać butelki; zakrętkę należy jedynie położyć na górze.
  3. Autoklawować wodę źródlaną przez 50 min w cyklu mokrym, bez etapu suszenia.
  4. Odstawić wodę do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT), a następnie mocno zakręcić butelkę przed przechowywaniem w RT.

2. Wytwarzanie szklanych mikropipet (za pomocą wyciągacza do pipet)

  1. Zamocuj szklaną mikropipetę (średnica zewnętrzna: 1 mm, średnica wewnętrzna: 0.58 mm, długość: 10 cm) w wyciągaczu do mikropipet. Należy unikać kontaktu z włóknem grzejnym, ponieważ spowoduje to zmianę kształtu pipety i uszkodzenie włókna.
    1. Parametry wyciągania pipety należy ustalić empirycznie dla każdego włókna i wyciągacza. Jako punkt wyjścia do optymalizacji należy jednak zastosować temperaturę 78 °C oraz pojedynczy krok wyciągania z ciężarem 182.2 g.
  2. Pozwól włóknu się rozgrzać i grawitacji rozdzielić szklaną mikropipetę na dwie szklane mikropipety z ostrymi końcówkami (Ryc. 1B).
  3. Przechowuj wyciągnięte szklane mikropipety w zamkniętej szalce Petri 100 mm z woskiem lub gliną, aby utrzymać je w miejscu i zapobiec złamaniu ostrych końcówek.

3. Wytwarzanie szklanych mikropipet (bez użycia wyciągacza do pipet)

  1. Zapalić palnik Bunsena lub inne kontrolowane źródło ognia, ustawiając mały płomień.
  2. Chwycić szklaną mikropipetę, trzymając jej końce w obu dłoniach.
  3. Przymieścić środek szklanej mikropipety do płomienia, aż szkło zacznie topnieć. Następnie gwałtownie rozciągnąć oba końce. W ten sposób powstaną dwie bardzo delikatne, ostre końcówki.
  4. Ostrożnie ułamać wierzchołek końcówki za pomocą sterylnej pęsety precyzyjnej.
  5. Przechowywać tak przygotowane wyciągane szklane mikropipety w zamkniętej szalce Petriego o średnicy 100 mm, używając wosku lub gliny do ich unieruchomienia i zapobiegania pękaniu ostrych końcówek.

4. Izolacja RNA

  1. Przygotować 0,5 L ciekłego azotu w pojemniku odpornym na niskie temperatury.
    OSTROŻNIE: Ciekły azot jest substancją kriogeniczną i może powodować oparzenia w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Podczas pracy należy używać odzieży ochronnej, gogli ochronnych, rękawic nitrylowych, rękawic kriogenicznych, fartucha laboratoryjnego i zamkniętego obuwia. Przed transportem należy upewnić się, że pojemnik jest przystosowany do przechowywania ciekłego azotu. Na tym etapie możliwe jest również zastosowanie łaźni z etanolem i suchym lodem.
  2. Przygotować mieszaninę master mix do syntezy cDNA: roztwór o objętości 10 µL zawierający 1 µL startera z przypadkowych heksamerów, 2 µL DNazy, 4 µL buforu RT 5x, 1 µL mieszaniny enzymów, 1 µL H2O oraz 1 µL dNTPs 10 mM. Roztwór przechowywać w lodzie.
  3. Przygotować bufor do lizy niesiorów (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergentu 1, 0,5% (v/v) Detergentu 2, 0,25 mM EDTA w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz).
    UWAGA: Roztwór ten można przechowywać na blacie przez 6 miesięcy. Należy jednak zachować sterylność i unikać potencjalnych źródeł kontaminacji RNazami.
  4. Odmierzyć odpowiednią ilość buforu do lizy niezbędną do ekstrakcji (2 μL na niesiora).
  5. Do roztworu buforu do lizy niesiorów dodać inhibitor RNazy do uzyskania stężenia końcowego 4 U/μL.
  6. Wymieszać roztwór w wirówce typu vortex i odwirować w temperaturze pokojowej (RT) w wirówce stołowej z prędkością 2000 x g przez 5 s, a następnie przechowywać w lodzie.
  7. Za pomocą sterylnej pipety P1000 z końcówką z filtrem pobrać z hodowli taką liczbę niesiorów, jaka jest potrzebna do eksperymentu, i umieścić je w sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
    UWAGA: W ten sposób można przetworzyć dowolną liczbę niesiorów. Zazwyczaj do ekstrakcji wykorzystuje się trzy niesiory na każdą warunek.
  8. Przemyć niesiory trzykrotnie, używając 1 mL autoklawowanej sterylnej wody źródlanej i sterylnej pipety P1000 z końcówką z filtrem. Powolne pipetowanie w górę i w dół pomaga usunąć zanieczyszczenia algami.
  9. Używając mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od 25x do 50x, przenieść pojedynczego niesiora z przemytej hodowli do nowej sterylnej szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą sterylnej pipety P10 z końcówką z filtrem.
  10. Używając sterylnej pipety P200 z końcówką z filtrem, przemyć pojedynczego niesiora w 100 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Ten etap przemywania służy do dalszego usuwania zanieczyszczeń, w tym rybonukleaz.
  11. Przenieść przemytego niesiora na dno czystej, sterylnej probówki PCR w 1-2 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz, używając sterylnej pipety P10 z końcówką z filtrem, uważając, aby niesiór nie przykleił się do ścianki końcówki.
  12. Zwizualizować niesiora pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 25x.
  13. Aby ułatwić usuwanie wody, lekko odłamać końcówkę wyciąganej szklanej mikropipety poza probówką. Upewnić się, że otwór jest wystarczająco duży, aby pobrać wodę, ale nie niesiora.
  14. Wykorzystując zjawisko kapilarne szklanej mikropipety, usuwać wodę do momentu, aż zwierzę zostanie otoczone małą pęcherzykiem wody o średnicy około dwóch długości niesiora.
  15. Monitorować proces usuwania wody za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że poziom wody jest odpowiedni i niesiór pozostaje nawodniony.
    UWAGA: Rycina 1C przedstawia przykład ilości wody do usunięcia. Jest to krytyczny etap. Mały pęcherzyk wody wokół niesiora zapobiegnie jego wyschnięciu, ale należy usunąć jak najwięcej nadmiaru wody, aby uniknąć rozcieńczenia buforu do lizy. Przykład pozostałych poziomów wody znajduje się na Rycini 1C.
  16. Natychmiast po usunięciu wody dodać 2 μL buforu do lizy niesiorów na dno probówki, krótko wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2000 x g w wirówce stołowej.
  17. Niezwłocznie umieścić próbki zawierające niesiory w statywie do probówek PCR i upewnić się, że są one mocno utrzymane przez statyw.
  18. Chwycić statyw za pomocą długich pęsety i ostrożnie zanurzyć statyw z próbkami w ciekłym azocie do całkowitego zamrożenia (Rycina 1D).
  19. Wyjąć statyw z ciekłego azotu i natychmiast umieścić go w lodzie. Pozostawić próbkę do rozmrożenia (trwa to ok. 45 s do 1 min). Monitorować próbkę co 15 s, wyjmując ją z lodu i dokonując inspekcji wizualnej. Gdy próbka stanie się wyraźnie przezroczysta, przejść do następnego kroku.
  20. Powtórzyć kroki 4.18-4.19 jeszcze pięć razy. Do maksymalnej lizy i ekstrakcji wymaganych jest łącznie sześć cykli zamrażania i rozmrażania (Rycina 2A,B).
  21. Po zakończeniu cykli zamrażania i rozmrażania umieścić próbki w lodzie i niezwłocznie przejść do następnego etapu. Na tym etapie nie zamrażać próbek w celu przechowywania, ponieważ zmniejszy to ilość dostępnego RNA do przygotowania cDNA.

5. Synteza cDNA

  1. Do probówki PCR zawierającej lizat niesiorów należy dodać 2 μL master mixu do syntezy cDNA. Krótko potrząsnąć probówką i wirować w temperaturze pokojowej przy 2000 x g przez 5 s w wirówce stołowej, a następnie umieścić próbki w lodzie.
  2. Próbki należy umieścić w termocyklerze i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 min w celu przyłączenia starterów, w 55 °C przez 30 min w celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji, a na koniec inaktywować enzymy termicznie w 85 °C przez 5 min.
  3. Po inkubacji należy niezwłocznie umieścić probówkę w lodzie i rozcieńczyć próbkę do całkowitej objętości 25 μL, dodając 21 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz. W przypadku transkryptów o niskiej liczbie kopii należy zmodyfikować ten etap rozcieńczania na podstawie wyników empirycznych.

6. qPCR

  1. Wyznaczyć temperaturę przyłączania zestawu starterów, wykorzystując całkowite RNA przygotowane z większej ilości niesiorówek, np. metodą ekstrakcji masowej przedstawioną w pracy Boothby, 201843.
  2. Przeprowadzić PCR z gradientem temperatury w celu ustalenia optymalnej temperatury przyłączania przed wykonaniem qRT-PCR (wszystkie parametry PCR zastosowane w niniejszym protokole znajdują się w Tabeli 1 oraz Tabeli 2).
  3. Rozmrozić na lodzie jedną probówkę supermixu z barwnikiem wskaźnikowym i chronić przed światłem. Umieścić 96-dołkową płytkę qPCR na lodzie, a następnie do odpowiedniej liczby dołków nanieść 5 μL supermixu, 2 μL wody, 1 μL każdego startera (10 μM) oraz 1 μL produktu cDNA.
  4. Uszczelnić płytkę PCR folią uszczelniającą i przeprowadzić qRT-PCR, stosując temperaturę przyłączania odpowiednią dla danego zestawu starterów (wszystkie parametry qRT-PCR zastosowane w niniejszej pracy znajdują się w Tabeli 3).

7. Ilościowe oznaczenie i interpretacja wyników

  1. Porównaj ilościowo wyniki z jednym lub więcej kontrolnymi genami housekeepingowymi, których ekspresja powinna pozostać stała w zastosowanych warunkach. W niniejszym badaniu wykorzystano gen aktyny.
  2. Wyznacz wartości Ct (próg cyklu) dla każdej studzienki i porównaj je z wartościami Ct dla reakcji z kontrolnym genem housekeepingowym. Oblicz krotność zmiany ekspresji genu, korzystając z poniższego równania:
    Równanie analizy qPCR: ΔCt = Ct(gen badanego) - Ct(gen housekeepingowy), porównanie formuł.
    Równanie metody ΔΔCt dla porównawczej analizy ekspresji genów, przedstawiające ΔCt(Próbka)−ΔCt(Kontrola).
    Równanie krotności ekspresji genu, 2^(-ΔΔCt), analiza regulacji genów; formuła.
    UWAGA: Krotność ekspresji genu dla każdego transkryptu i niesiorza jest przedstawiona jako 2-(ΔΔCt)48.
  3. Aby uzyskać przybliżoną liczbę transkryptów na podstawie wartości Ct, zastosuj poniższe równanie:
    Równanie wykładniczego spadku N=10×2^(35-ct), wyrażenie matematyczne.
    Gdzie N oznacza liczbę transkryptów, a 2 jest przyjętą wydajnością PCR lub krotnością wzrostu fluorescencji w każdym cyklu PCR48.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowanie i optymalizacja ekstrakcji RNA z pojedynczego niesporczaka
Dostosowując protokół Ly i wsp., 201542 do ekstrakcji RNA u niesporczaków, zoptymalizowano system STST w celu maksymalizacji ilości i jakości preparatu (Ryc. 1A). Wykonano RT-PCR dla transkryptów aktyny, kwantyfikując wydajność transkrypcji poprzez amplifikację regionu o długości 527 bp obejmującego eksony 1 i 2 (sekwencje tych starterów znajdują się w Tabeli 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy przedstawiono skuteczną metodę ekstrakcji RNA do pojedynczego niesporczaka qRT-PCR. Bezpośrednie porównanie metodologii STST z istniejącym zestawem do ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporniakiem ujawniło, że ekstrakcja RNA STST daje >200-krotnie większe ilości transkryptów RNA aktyny, co zmniejsza koszt do mniej niż jednego dolara za próbkę i skraca czas potrzebny na ekstrakcję o 30%. Aby zastosować STST do odpowiedniego pytania biologicznego, oceniliśmy krótkoterminowy profil ekspresji reakcji na szok cieplny. O...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Chcemy podziękować NIH Ruth Kirschstein Fellowship # 5F32AG081056-02 oraz Errett Fisher Post-Doctoral Fellowship, które wsparło dr Molly J. Kirk, Crowe Family Fellowship, które wsparło Chaoming Xu, oraz University of California, Santa Barbara Academic Senate Grant, oraz granty NIH #R01GM143771 i #2R01HD081266, które wsparły te wysiłki badawcze. Autorzy przyznają również o wykorzystaniu Laboratorium Nanostruktur Biologicznych w ramach Kalifornijskiego Instytutu NanoSystemów, wspieranego przez Uniwersytet Kalifornijski w Santa Barbara i Uniwersytet Kalifornijski, Biuro Prezydenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 &mikro; L Końcówki barierowe Premium Słabo wiążące, zębate, sterylneGenesee Scientific23-401określane jako sterylna pipeta P 10 z końcówką filtra  Porady
1000 & mikro; L  Wysokiej jakości końcówki do pipet, o niskim wiązaniu, zębate, sterylneGenesee Scientific23-165RSokreślane jako sterylna pipeta P 1000 z końcówką filtra  Porady
200 & mikro; L  Końcówki barierowe premium o niskim poziomie wiązania, zębate, sterylneGenesee Scientific23-412określane jako sterylna pipeta P 200 z końcówką filtra  Porady
4-gwiazdkowa prosta, mocna pęseta średniopunktowa Excelta 00-SA-DCOkreślany jako długie kleszcze
96-dołkowy stojak do PCR z pokrywką Różne, 5 stojaków / jednostkęGenesee Scientific27-202AOkreślany jako stojak do PCR
Andwin Scientific  3M BEZOŁOWIOWA TAŚMA AUTOKLAWU 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040nazywana taśmą autoklawową 
Taśma autoklawowaThermo Fisher ScientificAB1170określana jako uszczelki płytowe do PCR
Benchling V8BenchlingN/Aokreślana jako Benchling 
BioRadHard-Shell 96-dołkowa płytka do PCR BioRad HSS9641Określany jako płytka PCR 
Fartuch laboratoryjny BULWARK FR: Grainger 26CF64określany jako termocykler Lab Coat
C1000 Touch Bio-rad BioRad1851148określany mianem termocyklera 
Termocykler C1000 Touch Bio-rad z modułem optyki CFX BioRad1845097określany jako termocykler qPCR 
Chloroccoccum hypnosporum.   Carolina152091określana jako Algae
Corning  Butelki do przechowywania multimediów wielokrotnego użytku PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1EOkreślane jako 2-litrowa szklana butelka bezpieczna w autoklawie
Daigger & O firmie Vortex-Genie 2 Mieszalnik laboratoryjny Thermo Fisher Naukowy 3030Aokreślany jako Vortexer 
Preparat Direct-zol Micro Badania Zymo R2060Określany jako zestaw do ekstrakcji RNA 
Pęseta biologiczna Dumont 5Narzędzia do nauki pięknej 11254-20Określany jako kleszcze drobne
EDTA Fisher ScientificS311-500 Określany jako EDTA 
FIDŻI v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/AOkreślany jako filament FIJI/ImageJ
do ściągacza pipet Tritech ResearchPC-10Hokreślany jako
Filament Fisherbrand Economy Impact GogleFisher Scientific19-181-501Określany jako Gogle Splash 
Szklana mikropipeta Ø Zewnętrzna 1mm ID 0,58, Długość 10 cmTriTech ResearchGD-1 Określana jako szklana mikropipeta
Szczep Hypsibius exemplaris Z151 Carolina133960Określana jako niesporczaki  lub H. exemplaris 
Ciekły azot Dewar 1 LAgar Scientific AGB7475Określany jako pojemnik kriobezpieczny 
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Maxima H Minus Thermo Fisher ScientificK1651określany jako cDNA Synthesis Master Mix 
Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych Narishige Badania Tritech  PC-10Określany jako ściągacz do mikropipet 
Rękawice nitryloweFisher Scientific17-000-314określane jako rękawice nitrylowe 
SZALKA PETRIEGO, PS, 35/10 mm, Z OTWORAMI WENTYLACYJNYMIGrenier627102Określany jako szalka Petriego 35 mm 
PIPETMAN P10, 1– 10 &mikro; L, metalowy wyrzutnikGilsonF144055Mokreślany jako pipeta P 10
PIPETMAN P1000, 100– 1000 &mikro; L, metalowy wyrzutnikGilsonF144059Mokreślany jako P 1000 Pipeta
PIPETMAN P200, 20– 200 i mikro; L, Wyrzutnik metalowyGilson F144058Mokreślany jako P 200 Pipette
Pound Ta 4-kolorowa plastelina Amerykańska nadwyżka naukowa  96517P001Określany jako glina 
Pryzmat v10.0 GraphPadN/Aodnosi się do pryzmatu 
Bez RNAse, 8-paskowe probówki do PCR 0,2 ml z nakrętkami InvitrogenAM12230określany jako sterylny
inhibitor rybonukleazy RNasinPromega N2111określany jako inhibitor RNAzy 
Woda źródlana Nestlé Pure Life44221229nazywany wodą źródlaną
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO RAD1725271określany jako barwnik wskaźnikowy Super mix 
System stereomikroskopowy z optyką i oświetleniem TriTech ResearchSMT1określany jako mikroskop preparacyjny
Supertek Scientific  Palniki TirrillThermo Fisher ScientificS09572Bokreślane jako Bunsen Burner 
Wirówka stołowaQualitron  DW-41-115-NOWOŚĆOkreślany jako wirówka stołowa 
Osłona tymczasowa  Rękawice kriogeniczneFisher Scientific11-394-305określane jako rękawice krio 
Thermo Scientific  Szalki PetriegoNunc Thermo Fisher Scientific08-757-099Określane jako szalka Petriego 100 mm 
Baza TrisFisher ScientificT395-500 Określany jako Tris lub Tris Base 
Triton X-100Fluka 93443Określany jako detergent 1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 Określany jako detergent 2
Woda - Certyfikat PCR / RT-PCR, wolne od nukleazGrowcellsPCPW-0500określane jako sterylna woda wolna od nukleaz
w probówce do PCR

Bibliografia

  1. Møbjerg, N., Neves, R. C. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 254, 110890(2021).
  2. Jönsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. Int J Radiat Biol. 81 (9), 649-656 (2005).
  3. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. Int J Radiat Biol. 82 (12), 843-848 (2006).
  4. Bruckbauer, S. T., Cox, M. M. Experimental evolution of extremophile resistance to ionizing radiation. Trends Genet. 37 (9), 830-845 (2021).
  5. Jönsson, K. I., Hygum, T. L., Andersen, K. N., Clausen, L. K. B., Møbjerg, N. Tolerance to gamma radiation in the marine heterotardigrade, Echiniscoides sigismundi. PLoS One. 11 (12), e0168884(2016).
  6. Jönsson, K. I. Radiation tolerance in tardigrades: Current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 11 (9), 1333(2019).
  7. Yoshida, Y., et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 36, 107111(2021).
  8. Clark-Hachtel, C. M., et al. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 34 (9), 1819-1830.e6 (2024).
  9. Anoud, M., et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade specific DNA binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 13, RP92621(2024).
  10. Jönsson, K. I., Schill, R. O. Induction of Hsp70 by desiccation, ionising radiation and heat-shock in the eutardigrade Richtersius coronifer. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 146 (4), 456-460 (2007).
  11. Boothby, T. C. Desiccation of Hypsibius exemplaris. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 871-873 (2018).
  12. Boothby, T. C., et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 65 (6), 975-984.e5 (2017).
  13. Horikawa, D. D., Higashi, S. Desiccation tolerance of the tardigrade Milnesium tardigradum collected in Sapporo, Japan, and Bogor, Indonesia. Zoolog Sci. 21 (8), 813-816 (2004).
  14. Halberg, K. A., Jørgensen, A., Møbjerg, N. Desiccation tolerance in the tardigrade Richtersius coronifer relies on muscle mediated structural reorganization. PLoS One. 8 (12), e3330(2013).
  15. Sørensen-Hygum, T. L., Stuart, R. M., Jørgensen, A., Møbjerg, N. Modelling extreme desiccation tolerance in a marine tardigrade. Sci Rep. 8 (1), 11495(2018).
  16. Lyons, A. M., Roberts, K. T., Williams, C. M. Survival of tardigrades (Hypsibius exemplaris) to subzero temperatures depends on exposure intensity, duration, and ice-nucleation - as shown by large-scale mortality dye-based assays. bioRxiv. , (2024).
  17. Møbjerg, A., et al. Extreme freeze-tolerance in cryophilic tardigrades relies on controlled ice formation but does not involve significant change in transcription. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 271, 111245(2022).
  18. Tsujimoto, M., Imura, S., Kanda, H. Recovery and reproduction of an Antarctic tardigrade retrieved from a moss sample frozen for over 30 years. Cryobiology. 72 (1), 78-81 (2016).
  19. Jönsson, K. I. Tardigrades as a potential model organism in space research. Astrobiology. 7 (5), 757-766 (2007).
  20. Jönsson, K. I., Rabbow, E., Schill, R. O., Harms-Ringdahl, M., Rettberg, P. Tardigrades survive exposure to space in low Earth orbit. Curr Biol. 18 (17), R729-R731 (2008).
  21. Kasianchuk, N., Rzymski, P., Kaczmarek, Ł The biomedical potential of tardigrade proteins: A review. Biomed Pharmacother. 158, 113983(2023).
  22. Arakawa, K. Examples of extreme survival: Tardigrade genomics and molecular anhydrobiology. Annu Rev Anim Biosci. 10 (1), 519-542 (2022).
  23. Hvidepil, L. K. B., Møbjerg, N. New insights into osmobiosis and chemobiosis in tardigrades. Front Physiol. 14, 1274522(2023).
  24. Tanaka, S., Aoki, K., Arakawa, K. In vivo expression vector derived from anhydrobiotic tardigrade genome enables live imaging in Eutardigrada. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (5), e2216739120(2023).
  25. Kondo, K., Tanaka, A., Kunieda, T. Single-step generation of homozygous knockout/knock-in individuals in an extremotolerant parthenogenetic tardigrade using DIPA-CRISPR. PloS Genet. 20 (6), e1011298(2024).
  26. Yoshida, Y., Hirayama, A., Arakawa, K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. bioRxiv. , (2024).
  27. Yoshida, Y., et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 23 (1), 405(2022).
  28. Yoshida, Y., et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 36, 107111(2021).
  29. Neves, R. C., et al. Differential expression profiling of heat stressed tardigrades reveals major shift in the transcriptome. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 267, 111143(2022).
  30. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biol. 15 (7), e2002266(2017).
  31. Wang, C., Grohme, M. A., Mali, B., Schill, R. O., Frohme, M. Towards decrypting cryptobiosis - analyzing anhydrobiosis in the tardigrade Milnesium tardigradum using transcriptome sequencing. PLoS One. 9 (3), e92663(2014).
  32. Mali, B., et al. Transcriptome survey of the anhydrobiotic tardigrade Milnesium tardigradum in comparison with Hypsibius dujardini and Richtersius coronifer. BMC Genomics. 11 (1), 168(2010).
  33. Förster, F., et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 6, 69-96 (2012).
  34. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 3 (1), 160063(2016).
  35. Arakawa, K. Transcriptome assembly of Richtersius coronifer with annotated BLAST result against Ramazzottius varieornatus. Figshare. Dataset. , (2019).
  36. Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow input genome sequencing library preparation from a single tardigrade specimen. J Vis Exp. (137), (2018).
  37. Murai, Y., et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests convergent evolution of anhydrobiosis-related proteins in Tardigrada. bioRxiv. , (2020).
  38. Yoshida, Y., Sugiura, K., Tomita, M., Matsumoto, M., Arakawa, K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 19 (1), 24(2019).
  39. Tenlen, J. R. Microinjection of dsRNA in tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), (2018).
  40. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223 (3), 171-181 (2013).
  41. Giovannini, I., et al. Production of reactive oxygen species and involvement of bioprotectants during anhydrobiosis in the tardigrade Paramacrobiotus spatialis. Sci Rep. 12 (1), 15888(2022).
  42. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  43. Boothby, T. C. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 905-907 (2018).
  44. Czerneková, M., Vinopal, S. The tardigrade cuticle. Limnol Rev. 21 (3), 127-146 (2021).
  45. Goldstein, B. Hypsibius dujardini. collection notes and culture protocol from Bob McNuff. , At http://tardigrades.bio.unc.edu/protocols/CollectionCulture.pdf (2007).
  46. McNuff, R. Laboratory culture of Hypsibius exemplaris. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 867-870 (2018).
  47. Gabriel, W. N., et al. The tardigrade Hypsibius dujardini, a new model for studying the evolution of development. Dev Biol. 312 (2), 545-559 (2007).
  48. Ruiz-Villalba, A., Ruijter, J. M., van den Hoff, M. J. B. Use and misuse of cq in qPCR data analysis and reporting. Life (Basel). 11 (6), 508(2021).
  49. Antonov, J., et al. Reliable gene expression measurements from degraded RNA by quantitative real-time PCR depend on short amplicons and a proper normalization. Lab Invest. 85 (8), 1040-1050 (2005).
  50. Toussaint, J., et al. Improvement of the clinical applicability of the genomic grade index through a qRT-PCR test performed on frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC Genomics. 10, 424(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilo ciowa RT PCRtranskryptomika niesiorc winterferencja RNAsynteza komplementarnego DNAliza przez zamra anie i rozmra anieszklana mikropipetabia ko szoku cieplnegoprotok dla pojedynczego zwierz cia
Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.