Artykuł metodologiczny

Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

8 listopada 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę donosowego podawania agregatów α-synukleiny. Metoda ta dostarcza informacji na temat propagacji α-synukleiny z błony śluzowej węchu do opuszki węchowej w chorobie Parkinsona.

Streszczenie

Choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się obecnością ciał Lewy'ego, które są agregatami α-synukleiny (α-Syn). Niedawno zaproponowano, aby choroba rozwijała się i postępowała poprzez podobną do prionów propagację agregatów α-Syn z opuszki węchowej (OB) lub jądra grzbietowego nerwu błędnego. Chociaż pochodzenie agregatów α-Syn w OB pozostaje niejasne, ostatnio zasugerowano ich rozmnażanie z błony śluzowej węchu. Wcześniej wykazaliśmy, że donosowe podawanie agregatów α-Syn w modelu mysim indukowało patologię α-Syn w OB myszy. W niniejszej pracy przedstawiono metodę donosowego podawania agregatów α-Syn, które indukowały patologię α-Syn w OB myszy. Donosowe podawanie agregatów α-Syn jest bardzo prostą i nieskomplikowaną metodą i wierzymy, że będzie użytecznym narzędziem w badaniach nad wyjaśnieniem pochodzenia patologii α-Syn w OB oraz szlaku propagacji α-Syn przez układ węchowy.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD), która charakteryzuje się objawami motorycznymi, takimi jak bradykinezja, drżenie spoczynkowe i sztywność mięśni, jest drugim najczęstszym zaburzeniem neurodegeneracyjnym1. PD objawia się również objawami niemotorycznymi, w tym dysfunkcją węchu, upośledzeniem funkcji poznawczych, depresją, halucynacjami, zaparciami i niedociśnieniem ortostatycznym. Jego patologicznymi cechami charakterystycznymi są śmierć komórek dopaminergicznych w istocie czarnej oraz obecność agregatów α-synukleiny (α-Syn), zwanych ciałami Lewy'ego2.

Warto zauważyć, że α-Syn to 140-aminokwasowe białko, które występuje w postaci rozpuszczalnego monomeru (lub tetrameru) w normalnych warunkach. Jednak w nienormalnych warunkach rozpuszczalny monomer jest przekształcany w nierozpuszczalne agregaty o dużej masie cząsteczkowej, w tym oligomery i fibryle. Przejście α-Syn do oligomerów i włókienek jest podobno związane z toksycznością komórkową3.

Ostatnie badania sugerują podobne do prionów rozchodzenie się agregatów α-Syn między neuronami. Opierając się na licznych badaniach pośmiertnych, Braak i in. zaproponowali w 2003 roku hipotezę, że patologia ciał Lewy'ego rozprzestrzenia się stopniowo w mózgu w nieco stereotypowy sposób (hipoteza Braaka)4,5. W 2008 roku badanie pośmiertne pacjentów z chorobą Parkinsona, którzy otrzymali przeszczep śródmózgowia płodu, ujawniło ciała Lewy'ego w neuronach dopaminergicznych pochodzących z tkanek płodu6,7. Badania te sugerowały, że agregaty α-Syn mogą rozprzestrzeniać się z chorego mózgu do przeszczepów, co potwierdza hipotezę Braaka.

Po tych obserwacjach, eksperymenty obejmujące pierwotne hodowle neuronów i domózgowe wstrzykiwanie agregatów α-Syn u myszy odtworzyły rozprzestrzenianie się agregatów podobnych do ciał Lewy'ego, dostarczając dalszych dowodów na propagację α-Syn w sposób podobny do prionów8,9.

Braak i wsp. wykazali, że patologia ciał Lewy'ego w PD rozpoczyna się w opuszce węchowej (OB) i/lub jądrze grzbietowym nerwu błędnego (dmX)4. Opierając się na hipotezie Braaka, kilka badań donosiło o podawaniu agregatów α-Syn lub ekstraktów z ciał Lewy'ego z mózgów PD do OB i przewodu pokarmowego zwierząt doświadczalnych10,11,12. W 2018 r. badanie wykazało, że podanie agregatów α-Syn do OB myszy typu dzikiego wywołało propagację patologii α-Syn wzdłuż szlaku węchowego, powodując dysfunkcję węchu13. Wcześniej zaszczepiliśmy agregaty α-Syn w OB transgenicznych myszy transgenicznych α-Syn i stwierdziliśmy, że prowadzi to do atrofii hipokampa i upośledzenia pamięci14.

W 2022 roku zaszczepiliśmy agregaty α-Syn w OB marmozet, małego naczelnego niebędącego człowiekiem; spowodowało to rozprzestrzenianie się patologii α-Syn wzdłuż szlaku węchowego, atrofię OB i powszechny hipometabolizm glukozy w mózgu10.

Jeśli jednak propagacja agregatów α-Syn odbywa się z OB, pojawia się krytyczne pytanie: jakim mechanizmem początkowo pojawiają się agregaty α-Syn? Saito i wsp. wcześniej informowali o obecności ciał Lewy'ego w błonie śluzowej nosa15. Obecność agregatów α-Syn wykryto w błonie śluzowej nosa pacjentów z PD i zanikiem wieloukładowym (MSA) za pomocą analizy konwersji indukowanej drżeniem w czasie rzeczywistym (RT-QUIC)16. Warto zauważyć, że analiza próbek błony śluzowej nosa od pacjentów z zaburzeniem zachowania podczas snu (RBD), które jest uważane za stadium prodromalne PD, ujawniła wzrost poziomów α-Syn17. Badanie to sugerowało, że patologia α-Syn może istnieć w błonie śluzowej nosa nawet od fazy prodromalnej PD.

Chociaż te wyniki sugerowały potencjalną drogę od błony śluzowej nosa do OB, istnieją ograniczone dowody eksperymentalne potwierdzające ten scenariusz. Aby wypełnić tę lukę, podaliśmy agregaty α-Syn do jamy nosowej myszy i zbadaliśmy propagację patologii α-Syn z błony śluzowej nosa do OB. Nasze podejście eksperymentalne wykazało, że podanie donosowe pojedynczej dawki agregatów α-Syn myszom typu dzikiego wywołało patologię α-Syn w OB, dostarczając eksperymentalnych dowodów na szlak propagacji z błony śluzowej nosa do OB.

Protokół

C57BL/6J samce myszy w wieku 2 miesięcy zostały użyte do tego badania. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi krajowymi. Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Kioto udzielił etycznej aprobaty i pozwolenia na to badanie (MedKyo 23,544).

1. Donosowe podawanie włókienek preformowanych α-Syn

  1. Przygotować mysi roztwór włókien α-Syn w PBS (4 mg/ml) zgodnie z wcześniej opisanymi metodami11. Owiń tubę przezroczystą folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  2. Sonizować 200 μl roztworu włókien α-Syn w celu wytworzenia wstępnie uformowanych włókien α-Syn (PFF) za pomocą sonikatora typu kąpieli wodnej (Tabela Materiałów). Napełnij kąpiel ultradźwiękową wodą i dodaj kostki lodu, aby ostygły do 4 °C w celu sonikacji. Sonizować fibryle przez łącznie 5 minut, przy czym każdy cykl składa się z 30 s sonikacji, po której następuje 30-sekundowy odstęp (w sumie pięć cykli).
    UWAGA: Używaj środków ochrony osobistej, takich jak rękawice jednorazowe, maska i okulary ochronne, aby zapobiec narażeniu na działanie α-Syn.
  3. Przygotuj pipetę P10 (tabela materiałów) z końcówką do pipety o pojemności 10 μl. Znieczulić każdą mysz za pomocą kombinacji chlorowodorku medetomidyny, midazolamu i butorfanolu (MMB) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). Złożony środek znieczulający MMB zawierał midazolam (0,3 mg/kg), medetomidynę (4 mg/kg) i winian butorfanolu (5 mg/kg). Stosować 0,005 ml / g przez wstrzyknięcie dożylnie podczas mieszania midazolamu (1 mg / ml) 0,3 ml, medetomidyny (5 mg / ml) 0,8 ml, winianu butorfanolu (5 mg / ml) 1 ml i soli fizjologicznej 2,9 ml.
  4. Odczekaj 10 minut, aby upewnić się, że myszy są całkowicie znieczulone. Prawidłowe znieczulenie można potwierdzić, jeśli mysz znajduje się w pozycji leżącej bocznej i nie może się wyprostować. Po znieczuleniu nałóż maść okulistyczną za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    UWAGA: Bez znieczulenia, podczas podawania dawek donosowych, trudno jest utrzymać myszy w pozycji leżącej i prawidłowo podawać roztwór α-Syn podczas kichania myszy. Z tych powodów konieczna była sedacja.
  5. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Umieść ręcznik papierowy lub podobny materiał pod ciałem, upewniając się, że głowa jest lekko pochylona w dół (Rysunek 1A,B). Takie ułożenie zapobiega szybkiemu przepływowi podanego roztworu α-Syn do płuc lub przełyku, ułatwiając jego zatrzymanie w jamie nosowej. Nozdrza są widoczne w Rysunek 1C.
  6. Pobrać 1 μl roztworu α-Syn (4 mg/ml) do pipety P10 i umieścić końcówkę pipety w pobliżu nosa myszy. Powoli uformuj okrągłą kroplę i trzymaj ją na końcu końcówki pipety (Rysunek 1D, czerwona strzałka). Podawanie donosowe wykonuje się do nozdrza jednostronnego, należy użyć strony przeciwległej jako strony kontrolnej.
  7. Zbliż kroplę do jednej strony nozdrzy myszy i pozwól myszy naturalnie ją wdychać. Obserwuj inhalację i odczekaj od 30 s do 1 minuty (Rysunek 1E).
  8. Powtarzać kroki 1.6.-1.7. aż do podania całkowitej objętości 20 μl roztworu α-Syn. Po wszystkich zabiegach wyrzuć rękawice i przetrzyj ławkę dostępnymi w handlu detergentami, jeśli powierzchnia jest zanieczyszczona α-Syn
    UWAGA: Cała procedura powinna być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa, aby zapobiec wdychaniu włókien α-Syn przez personel wykonujący zabieg. Poprzedni raport wykazał, że objętość 25 μl jest najbardziej efektywna w przypadku podawania leków od nosa do mózgu18. W niniejszym badaniu używamy podobnej objętości 20 μl. Używamy również tego samego stężenia PFF, co do wstrzykiwania do OB w poprzednim raporcie10, co jest bliskie 400 μM (5,6 mg/mL) PFFs19.
  9. Podawać atipamezol (3 mg/kg; Tabela materiałów) Przez wstrzyknięcie dożylne w celu odwrócenia medetomidyny i ułatwienia powrotu do zdrowia. Stosować 0,005 ml/g do wstrzykiwań dożylnie podczas mieszania atipamezolu (5 mg/ml) 0,6 ml i soli fizjologicznej 4,4 ml.
    UWAGA: Zapewnij analgezję, ponieważ nie do końca wiadomo, jak stresujące byłoby donosowe podanie α-Syn.
  10. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Po pełnym wyzdrowieniu włóż mysz z powrotem do klatki.

2. Przygotowanie próbki

  1. Poświęć leczone myszy po 1, 3, 6 i 12 miesiącach po donosowym podaniu uformowanych włókienek α-Syn.
    1. Umieść myszy w pudełku indukcyjnym, podaj sewofluran (>6,5%) i kontynuuj, aż dojdzie do zatrzymania oddechu przez > 60 s. Usuń myszy i wykonaj szybkie wykrwawienie przez nacięcie prawego przedsionka, aby zapewnić eutanazję.
  2. Wbij igłę 25G (Tabela materiałów) do wierzchołka serca. Wykonać perfuzję myszy w dawce 4 ml/min z 15 ml PBS, a następnie 15 ml 4% PFA w PBS.
  3. Odetnij głowę nożyczkami i wykonaj skalpelem 2 cm nacięcie w skórze głowy. Naciąć kość czaszki nożyczkami po bocznej stronie od dołu do nosa (Rysunek 2A,B). Aby uzyskać OB, należy całkowicie usunąć kość czaszki na OB (Ryc. 2B, żółte kółko).
  4. Odwróć głowę, przetnij nerwy mózgowe, a następnie ostrożnie usuń mózg kleszczami (Rysunek 2C, D). Uzyskaj mózg z nienaruszonymi OB (Rysunek 2E). Aby uzyskać nienaruszone OB, ostrożnie przetnij nerwy węchowe kleszczami, gdy OB przyczepiają się do kości czaszki (Ryc. 2D, żółte kółko).
  5. Umieścić próbki mózgu w 4% PFA w PBS na noc w temperaturze 4 °C. Nie pozostawiaj próbek mózgu na dłużej niż 24 godziny < br /> UWAGA: Nadmierne utrwalenie zmniejszy barwienie immunohistochemiczne. Jeśli wymagane jest długotrwałe przechowywanie, należy zachować próbki mózgu w 70% etanolu lub PBS zawierającym 0,1% azydku sodu, aby zachować sterylność.

3. Barwienie immunohistochemiczne OB

  1. Próbki należy parafinizować za pomocą automatycznego procesora tkanek (tabela materiałów) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zanurz w 70% etanolu na 120 minut, a następnie zanurz w 100% etanolu 8x na 60 minut. Następnie zanurz w 100% ksylenie na 3x na 120 min.
    2. Zanurzyć w parafinie w temperaturze 60 °C na 120 minut, a następnie zanurzyć w parafinie w temperaturze 60 °C na 240 minut.
  2. Zanurz próbki w parafinie, jak opisano poniżej.
    1. Zanurzyć próbki w parafinie w temperaturze 60 °C za pomocą modułowego centrum zatapiania tkanek (tabela materiałów). Ostudzić je na lodzie.
  3. Pociąć próbki na odcinki o grubości 8 μm za pomocą mikrotomu (Tabela materiałów)18.
  4. Przeprowadzić deparafinowanie zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zanurz w 100% ksylenie na 2x na 5 min, a następnie zanurz w 100% etanolu na 2x na 3 min.
    2. Zanurz w 70% etanolu na 3 min. Umyj w PBS na 3 min.
  5. Przeprowadź pobieranie antygenu zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zanurzyć w 100% kwasie mrówkowym na 15 minut. Płukać w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 2 minuty.
    2. Autoklaw w temperaturze 120 °C przez 10 min. Pozostawić do naturalnego ostygnięcia.
  6. Zanurzyć w 1% nadtlenku wodoru w metanolu na 10 min. Myć w PBS przez 5 min.
  7. Na szkiełka dodać 500 μl 5% odtłuszczonego mleka w PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umieścić 500 μl przeciwciała anty-fosforylowanego α-Syn (p-α-Syn, 1/10000) w PBS na szkiełkach i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Myć 2x PBS przez 5 minut każde.
  9. Inkubować z uniwersalnym polimerem immuno-peroksydazy, anty-króliczym (tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Myć 2x PBS przez 5 minut każdy.
  10. Wywoływać przy użyciu zestawu do barwienia 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (tabela materiałów) przez 5 minut zgodnie z instrukcjami producenta.
  11. Zanurzyć w roztworze hematoksyliny na 1 minutę (tabela materiałów). Odbarwić pod bieżącą wodą przez 10 min.
  12. Wykonaj montaż zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zanurz w 70% etanolu na 5 min. Zanurz w 100% etanolu 2x na 5 min.
    2. Zanurz w 100% ksylenie na 2x na 5 min. Zamontuj za pomocą medium do zatapiania (Tabela Materiałów). Nanieść 100 μl podłoża do osadzania na szkiełka podstawowe i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
  13. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu wielofunkcyjnego przy powiększeniu 20x i 40x (tabela materiałów).

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia kilka przykładów agregatów α-Syn w OB. W niniejszym badaniu wprowadzono agregaty α-Syn do jednego otworu nosowego. Dwie jamy nosowe są oddzielone przegrodą nosową, a każda OB przesyła neurony sensoryczne węchowe do każdej jamy nosowej oddzielnie. W związku z tym OB po stronie przeciwległej może służyć jako kontrola.

Patologii P-α-Syn nie zaobserwowano w OB po stronie traktowanej po 1 i 3 miesiącach (Rysunek 3A, B). Agregaty p-α-Syn przypominające neuryty Lewy'ego zaobserwowano w kłębkach po stronie traktowanej po 6 i 12 miesiącach (Rysunek 3C,D,F,G). Agregatów tych nie zaobserwowano w OB po stronie kontrolnej (Rysunek 3E).

Patologię α-Syn można oszacować poprzez liczenie agregatów α-Syn lub badanie ich wielkości itp., wykorzystując program ImageJ (Tabela materiałów). Na przykład wcześniej obliczyliśmy i zaraportowaliśmy liczbę agregatów α-Syn w tym modelu20W obrębie opuszki węchowej (OB) po stronie traktowanej odnotowano istotny wzrost liczby agregatów przypominających neurity Lewy w ciągu 12 miesięcy (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, a następnie test Dunnetta, p < 0.01; Rysunek 3H). W obrębie OB po stronie kontrolnej stwierdzono niewielką liczbę agregatów $\alpha$-Syn.

Poprzednie badanie wykazało, że wstrzyknięte do mózgu myszy PFF uległy degradacji w ciągu tygodnia, a endogenna mysia α-Syn została przekształcona w agregaty α-Syn19. W niniejszym badaniu wzrost patologii α-Syn w czasie wskazuje, że endogenna mysia α-Syn została przekształcona w agregaty α-Syn w wyniku jednorazowej podaży donosowej PFF. Wyniki te wskazują, że patologia α-Syn może rozprzestrzeniać się z błony śluzowej nosa do OB.

Układ eksperymentalny i schemat podawania agregatów α-Syn do mózgu myszy w badaniu neurologicznym.
Rysunek 1: Metoda podawania do jamy nosowej myszy. (A) Mysz znajduje się w pozycji grzbietowej z głową lekko pochyloną w dół. (B) Nozdrza myszy wskazane są żółtymi grotami strzałek. (C, D) Roztwór włókien α-Syn jest wpuszczany do nozdrza myszy (C, czerwona strzałka) i szybko wdychany (D, czerwone strzałki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces wycinania cebulek węchowych, schemat anatomiczny krok po kroku, metoda badań neuronaukowych.
Rysunek 2: Schemat kroków prowadzących do uzyskania nienaruszonych cebulek węchowych. (A) Za pomocą nożyczek naciąć kość czaszki wzdłużnie (strzałkowo) i bocznie (żółta przerywana linia). (B) Całkowicie usunąć kość czaszki nad cebulkami węchowymi (OBs). (C) Odwrócić głowę i ostrożnie usunąć mózg. Przeciąć nerwy mózgowe. (D) Przeciąć nerwy węchowe przytwierdzone do kości czaszki. (E) Cały mózg z nienaruszonymi cebulkami węchowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza równowagi statycznej; przekroje histologiczne, neuryty Lewygo w grupie leczonej/kontrolnej, mikroskopia.
Rycina 3: Agregaty P-α-Syn w kłębkach cebulki węchowej. (A-G) Immunohistochemia P-α-Syn (EP1536Y) cebulki węchowej (OB) po (A-D) stronie leczonej 1, 3, 6 i 12 miesiące (odpowiednio 1 m, 3 m, 6 m i 12 m) po podaniu donosowym oraz (E) po stronie kontrolnej 12 miesięcy po podaniu donosowym. (C, D) Agregaty α-Syn przypominające nitkowate neuryty Lewygo pojawiają się wokół kłębków. (F, G) Powiększone obrazy to zdjęcia wysokiej rozdzielczości p-α-Syn przypominającej neuryty Lewygo 6 i 12 miesięcy po podaniu donosowym. (H) Ilość złogów p-α-Syn przypominających neuryty Lewygo w OB po stronach leczonej i kontrolnej (n = 4-5). Wykresy przedstawiają średnią ± SEM. Jednoczynnikowa ANOVA z testem Dunnetta; **<0,01. Rycina ta została zmodyfikowana z poprzedniego raportu20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W poprzednim badaniu podawanie agregatów α-Syn do jamy nosowej makaków indukowało śmierć komórek dopaminergicznych i odkładanie się żelaza w istocie czarnej, chociaż nie obserwowano agregatów α-Syn21. Codzienne podawanie ludzkich agregatów α-Syn A53T do jamy nosowej transgenicznych myszy α-Syn (myszy M83) przez 28 dni indukowało patologię α-Syn w mózgach i objawy motoryczne u myszy19,22. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że podanie pojedynczej dawki α-Syn agreguje się do jamy nosowej myszy typu dzikiego wywołało patologię α-Syn w położnictwie. Ta prosta metoda może być uznana za cenną w badaniu propagacji α-Syn z błony śluzowej nosa do OB.

Wystarczająca sonikacja włókienek α-Syn w tej metodzie ma kluczowe znaczenie, ponieważ poprzednie doniesienia wykazały, że mały rozmiar rozdrobnionych agregatów α-Syn jest najbardziej skuteczny w wyzwalaniu patologii α-Syn23,24. Niewystarczająca sonikacja włókienek α-Syn spowoduje niewielką propagację do OB. Ponieważ różne sonifikatory mają różną moc sonikacji, konieczna jest optymalizacja tego procesu. Kluczowe znaczenie ma również pozycja myszy w pozycji leżącej, gdy roztwór α-Syn jest podawany do nozdrzy myszy. Jeśli głowa myszy jest uniesiona, roztwór α-Syn wpłynie do płuc i przełyku. Niewłaściwa postawa może spowodować nieoczekiwaną śmierć lub niewystarczającą propagację α-Syn.

W niniejszym badaniu i.p. zastosował złożony środek znieczulający MMB do znieczulenia. Doniesiono, że znieczulenie skojarzone MMB zapewnia dobrą sedację i analgezję, a jego działanie może być szybko odwrócone przez atipamezol23. Ponieważ znieczulenie wziewne wymaga zakrycia nozdrzy maską w celu podtrzymania znieczulenia, trudniej jest podać roztwór α-Syn donosowo. Ponadto model rotenonu był szeroko badany i jest bardzo użytecznym modelem25. Jest to jednak model indukowany przez lek i może mieć inne patomechanizmy niż idiopatyczna choroba Parkinsona (iPD)25. Ponieważ model ten indukował propagację α-Syn, uważamy, że jest on bliższy iPD.

Nasze badanie sugerowało również, że egzogenne agregaty α-Syn mogą przenosić się przez błonę śluzową nosa. Dlatego, gdy badacze przeprowadzają eksperymenty z użyciem agregatów α-Syn, należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć wdychania agregatów α-Syn. Na przykład, aerozole α-Syn mogą być generowane na etapie sonikacji. Zalecamy użycie sonikatora typu zamkniętego lub sonikacji w komorze bezpieczeństwa. Dodatkowo myszy mogą kichać, potencjalnie wytwarzając aerozole α-Syn. Aby zminimalizować to ryzyko, wszystkie operacje powinny być wykonywane w szafie bezpieczeństwa. Badacze powinni również używać środków ochrony osobistej, takich jak jednorazowe rękawiczki, maski i okulary ochronne, aby zapobiec narażeniu na α-Syn. Po wszystkich zabiegach naukowcy muszą przetrzeć ławkę dostępnymi w handlu detergentami, jeśli powierzchnia jest zanieczyszczona α-Syn. Wcześniejsze raporty wykazały, że zarówno detergenty dostępne na rynku, jak i karty charakterystyki oddzielały kruszywa od zanieczyszczonych powierzchni26,27.

W tym badaniu wykorzystano skrawki parafiny do oceny patologii α-Syn w OB, ponieważ mała struktura OB jest lepiej zachowana w skrawkach parafinowych w porównaniu z tymi w skrawkach zamrożonych. Badanie to wykazało, że patologia α-Syn została indukowana w położnictwie; jednak obserwowana patologia α-Syn była łagodna i ograniczona i była głównie reprezentowana przez nitkowate agregaty znane jako neuryty Lewy'ego w kłębuszkach nerkowych.

Należy zauważyć, że w niniejszym badaniu nie zaobserwowano widocznych zmian w zachowaniu myszy eksperymentalnych. Patologia α-Syn wywołana tą metodą może być niewystarczająca do wywołania zmian w fenotypie zachowania. Potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić specyficzne warunki prowadzące do poważnych patologii i zmian w zachowaniu. W przyszłości, gdybyśmy mogli ustalić bardziej efektywny sposób rozmnażania się z błony śluzowej nosa do położnictwa, ta prosta metoda zapewnia alternatywny sposób oceny propagacji α-Syn bez techniki chirurgicznej.

Ponadto użyliśmy OB po stronie przeciwnej u leczonych myszy jako kontroli. Jednak wsteczna propagacja z przedniego jądra węchowego lub kory gruszkowatej do przeciwległego OB może wystąpić w dłuższej obserwacji. W tym przypadku jako grupę kontrolną wykorzystano myszy nieleczone.

Chociaż ta prosta metoda dostarcza cennych informacji na temat propagacji α-Syn z błony śluzowej nosa do OB, potrzebne są dalsze badania, aby kompleksowo zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw PD.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wszystkie eksperymenty były wspierane przez Rie Hikawę. Serdecznie dziękujemy Yasuko Matsuzawie za dokumenty. Badanie to było wspierane przez JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 i JP20H00663).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop fluorescencyjny All-in-One BZ-X710KEYENCEN/AMikroskop All-in-One
Ampicillin Sól sodowaNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006ASonikator typu kąpiel wodna.
Winian butorfanoluMeiji Seika PharmaWAK-52850
Rurka celulozowaMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Właściwa komórka
EntellanSigma-Aldrich107961Medium do szybkiego montażu do mikroskopii
Graefe Bardzo drobne kleszcze Zakrzywione ząbkowaneFST11152-10 Kleszcze
Hartowane drobne nożyczkiNożyczkiFST14090-09
Histofine Prosta mysz plamista MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Uniwersalny polimer immuno-peroksydazy, anty-królik
ImageJ ver 1.52pNANA https://imagej.net/
innova4200New Brunswick naukowy9105085Wytrząsarka do inkubatora
Isopropyl-β- Rosół D-tiogalaktopiranozydNacalai tesque19742-94
LB, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modułowe centrum zatapiania tkanek
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Automatyczny procesor tkanek 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
Nowa hematoksylina typu GMuto65-9197-38Roztwór hematoksyliny
Igła normalna skrzydełkowa do żyły typu D, igła 25GTERUMONN2332R25G
Ultrawirówka Optima TLXBeckman Couler8043-30-1197Ultrawirówka
P10pipeta GilsonFA10002P
parafinaLeica39601095
paraformaldehydNacalai tesque30525-89-4
Zestaw DAB do barwienia peroksydaząNacalaitesque 25985-50
Zestawy do oznaczania białek Pirece BCATest BCA Thermo Scientific23225
pRK172Addgene#134504Plazmid
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001Żywica jonowymienna

Bibliografia

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Agregaty alfa synukleinyop atek w chowychoroba Parkinsonapropagacja prionopodobnamodel mysib ona luzowa nosapreformowane w knacia a Lewy egochoroba neurodegeneracyjna
Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.