W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siły mechaniczne dostarczają ważnych sygnałów dla prawidłowego funkcjonowania komórek i tworzenia wzorców w rozwijających się tkankach, a ich rola była szeroko badana podczas embriogenezy i patogenezy. Stosunkowo niewiele wiadomo na temat tych sygnałów podczas regeneracji zwierząt.
Aksolotl jest ważnym organizmem modelowym do badań nad regeneracją, ze względu na jego zdolność do pełnej odbudowy wielu organów i tkanek po urazach, w tym brakujących chrząstek i kości. Ze względu na jej kluczową rolę jako głównej tkanki podporowej w organizmie kręgowców, odzyskanie funkcji kośćca podczas regeneracji wymaga zarówno odtworzenia brakujących struktur, jak i ich właściwości mechanicznych. Protokół ten opisuje metodę przetwarzania próbek kończyn aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM), która jest złotym standardem w badaniu właściwości mechanicznych komórek i tkanek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
Korzystając z możliwości regeneracyjnych aksolotl, to badanie zmierzyło sztywność chrząstki kończyny podczas homeostazy i dwóch etapów regeneracji kończyn: histolizy tkanek i kondensacji chrząstki. Pokazujemy, że AFM jest cennym narzędziem do uzyskania wglądu w dynamiczną restrukturyzację tkanek i zmiany mechaniczne, które zachodzą podczas regeneracji.
Wprowadzenie
Szkielet, zwłaszcza chrząstki i kości, stanowi główne mechaniczne wsparcie dla tkanek miękkich ciała u kręgowców. Dlatego wszelkie uszkodzenia układu kostnego mogą znacznie zagrozić funkcjonalności, a nawet przeżyciu. U ludzi złamania kości są jednym z najczęstszych urazów1, z których większość naprawia się w ciągu kilku tygodni, ale 5%-10% z nich będzie miało opóźnienia w gojeniu lub nigdy nie wyzdrowieje w pełni2,3. Co więcej, ludzie nie są w stanie odzyskać sił po rozległej utracie kości lub chrząstki4,5. Niektóre salamandry ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Aksolotle (Ambystoma mexicanum) były hodowane w ośrodku dla aksolotli w Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie (CRTD) na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie (TUD). Pełny opis warunków hodowli znajduje się w24. W skrócie, w pomieszczeniach utrzymywano temperaturę 20-22 °C przy 12/12 h cyklu dnia i nocy. Wszystkie zabiegi i procedury chirurgiczne były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etycznej i zostały zatwierdzone przez Landesdirektion Sachsen w Niemczech.
W niniejszym badaniu we wszystkich eksperymentach wykorzystano białe (d/d) aksolotle, naturalnie występujący szczep mutantó....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Korzystając z opisanego powyżej protokołu, zmierzyliśmy pozorny moduł Younga tkanek chrzęstnych kończyn aksolotla w warunkach homeostatycznych („Intact”), podczas wczesnej histolizy chrząstki oraz w późniejszych etapach kondensacji chrząstki (Rycina 1A). Zbadaliśmy również właściwości mechaniczne elementów szkieletowych w różnych obszarach, w tym w ich centrum i na obwodzie, co przedstawiono na obrazach obrazujących położenie wspornika (Rycina 1B). Aby zobrazowa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj demonstrujemy technikę pomiaru sztywności chrząstki w kończynach aksolotla z AFM. Jednak metoda ta może być rozszerzona o sondowanie również innych typów tkanek. Kluczowym krokiem do udanych pomiarów AFM jest przygotowanie próbki, która okazała się szczególnie trudna w przypadku próbek aksolotlów. Odkryliśmy, że badanie powierzchni tkanki, która była nadal osadzona w bloku agarozowym, było najlepszym sposobem na zachowanie integralności tkanki. Dzieje się tak, ponieważ skóra aksolotla wydziela duże ilości śluzu na .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów
Podziękowania
Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Sandoval-Guzmán za ciągłe wsparcie i towarzystwo podczas rozwoju tej pracy. Jesteśmy również wdzięczni Anji Wagner, Beate Gruhl i Judith Konantz za ich zaangażowanie w opiekę nad aksolotlami. Dziękujemy również Paulowi Müllerowi za dostarczenie kodów do analizy danych AFM. Prace te były wspierane przez Zakład Mikroskopii Świetlnej Platformy Technologicznej CMCB na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. AT jest stypendystą Mildred Scheel Early Career Center Dresden P2 finansowanego przez Niemiecką Pomoc Onkologicznemu (Deutsche Krebshilfe). RA jest finansowany przez tymczasowe stanowisko kierownika (Eigene Stelle) z Deutsche For....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Affinity Designer | Affinity | wersja 1.10.4 | Do montażu figur |
| Agaroza o niskiej stopie topliwości | Roth | 6351.1 | Do przygotowania próbki |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Do barwienia tkanek |
| Axiozoom | Zeiss | Do obrazowania próbki pod AFM | |
| Benzokaina | Sigma-Aldrich | E1501 | Aby znieczulić zwierzęta |
| Winian butorfanolu (+) sól | Sigma-Aldrich | B9156 | Jako środek przeciwbólowy |
| Cantilever | NanoWorld | Arrow TL1 | Do pomiarów wgnieceń AFM |
| Zestaw Cellhesion 200 wyposażony w motorstage | JPK/Bruker | Do pomiarów wgłębień AFM | |
| CellSense Entry | Do obrazowania w stereoskopie Olympus UC90 | ||
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS, 1x) | Gibco | 14190-144 | Do czyszczenia próbek i sekcji pod wibratomem |
| FIJI (ImageJ2) | https://imagej.net/software/fiji | wersja 2.9.0/1.53t | Do przetwarzania obrazu |
| GraphPad | Prism Oprogramowanie GraphPad | (wersja 8.4.3) | Do wykresu i analizy statystycznej danych |
| Inaktywowany termicznie FBS | Gibco | 10270-106 | Do komórki pożywka |
| hodowlana Klej histoakrylowy (2-butyl-cyjanoakryl) | Braun | Do przyklejania próbki do szalek Petriego | |
| Hoechst 33258 | Abcam | ab228550 | Do barwienia tkanek |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I5500 | Do pożywki do hodowli komórkowych |
| Odwrócony mikroskop konfokalny | Zeiss | 780 LSM | Do obrazowania skrawków tkanek |
| Odwrócony mikroskop konfokalny | Zeiss | 980 LSM | Do obrazowania skrawków tkanek |
| Oprogramowanie do przetwarzania danych JPK/Bruker | JPK/Bruker | SPM 6.4 | Do analizy krzywych siła-odległość |
| L15 medium (Leibovitz) | Sigma | L1518 | Do pożywki do hodowli komórkowych |
| L-glutamina | Gibco | 25030-024 | Do pożywki do hodowli komórkowych |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | Do komórki pożywka |
| hodowlana kulki polistyrenowe ( 20 & mikro; m średnicy); ) | mikrocząstki | do pomiarów wgnieceń AFM | |
| Pyjibe | napisane przez Paula Mü ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe | 0.15.0 | Do analizy lepkosprężystej |
| Stereoskop Olympus SX10 | Olympus | SX10 | Do amputacji kończyn i montażu tkanek |
| Stereoskop Olympus UC90 | Olympus | UC90 | Do obrazowania |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200S | Do sekcji tkanek |
Bibliografia
- Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults. Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clin Cases Miner Bone Metab....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
