Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Podsumowanie

W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.

Streszczenie

Siły mechaniczne dostarczają ważnych sygnałów dla prawidłowego funkcjonowania komórek i tworzenia wzorców w rozwijających się tkankach, a ich rola była szeroko badana podczas embriogenezy i patogenezy. Stosunkowo niewiele wiadomo na temat tych sygnałów podczas regeneracji zwierząt.

Aksolotl jest ważnym organizmem modelowym do badań nad regeneracją, ze względu na jego zdolność do pełnej odbudowy wielu organów i tkanek po urazach, w tym brakujących chrząstek i kości. Ze względu na jej kluczową rolę jako głównej tkanki podporowej w organizmie kręgowców, odzyskanie funkcji kośćca podczas regeneracji wymaga zarówno odtworzenia brakujących struktur, jak i ich właściwości mechanicznych. Protokół ten opisuje metodę przetwarzania próbek kończyn aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM), która jest złotym standardem w badaniu właściwości mechanicznych komórek i tkanek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Korzystając z możliwości regeneracyjnych aksolotl, to badanie zmierzyło sztywność chrząstki kończyny podczas homeostazy i dwóch etapów regeneracji kończyn: histolizy tkanek i kondensacji chrząstki. Pokazujemy, że AFM jest cennym narzędziem do uzyskania wglądu w dynamiczną restrukturyzację tkanek i zmiany mechaniczne, które zachodzą podczas regeneracji.

Wprowadzenie

Szkielet, zwłaszcza chrząstki i kości, stanowi główne mechaniczne wsparcie dla tkanek miękkich ciała u kręgowców. Dlatego wszelkie uszkodzenia układu kostnego mogą znacznie zagrozić funkcjonalności, a nawet przeżyciu. U ludzi złamania kości są jednym z najczęstszych urazów¹, z których większość naprawia się w ciągu kilku tygodni, ale 5%-10% z nich będzie miało opóźnienia w gojeniu lub nigdy nie wyzdrowieje w pełni^2,3. Co więcej, ludzie nie są w stanie odzyskać sił po rozległej utracie kości lub chrząstki^4,5. Niektóre salamandry mogą jednak regenerować różne struktury ciała, w tym pełne kończyny⁶, co czyni je idealnym modelem do badań nad regeneracją szkieletu.

Aksolotl (Ambystoma mexicanum) to rodzaj salamandry, gdzie regeneracja kończyn była szeroko badana. Proces ten zachodzi w czterech głównych, sekwencyjnych, ale nakładających się na siebie fazach: 1) gojenie się ran, 2) zapalenie/histoliza, 3) powstawanie blastemy i 4) wyrastanie/różnicowanie blastemy (przejrzane w^7,8). Po amputacji keratynocyty graniczące z miejscem urazu szybko migrują, zamykając ranę i tworząc nabłonek rany (WE). Podczas następującego po tym stanu zapalnego i histolizy patogeny są eliminowane, zanieczyszczenia i uszkodzone komórki są usuwane, a macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) pod powierzchnią amputacji jest przebudowywana⁹. Histoliza tkanek jest niezbędna do regeneracji kończyn¹⁰, gdzie wydzielanie enzymów proteolitycznych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla ogólnej przebudowy ECM, ale także dla uwolnienia komórek powodujących powstanie blastemy i wolnych bioaktywnych cząsteczek sekwestrowanych w samym ECM⁸. W rzeczywistości badania w wielu kontekstach regeneracyjnych i organizmach modelowych wykazały, że unikalne właściwości materiałowe ECM podczas histalizy są w stanie indukować procesy odróżnicowania lub kierować migrację komórek w kierunku miejsca uszkodzenia (recenzja w¹¹). Co więcej, resorpcja zwapniałej tkanki w późnych stadiach histolizy okazała się kluczem do prawidłowej integracji nowo powstałych elementów szkieletu kończyny¹². Po etapie histolizy blastema powstaje pod nabłonkiem rany (WE) jako nagromadzenie niezróżnicowanych, wieloliniowych komórek progenitorowych powstałych z odróżnicowanych dojrzałych komórek tkankowych lub rezydentnych komórek macierzystych. Komórki blastemy namnażają się i różnicują we wszystkie brakujące typy komórek. Wreszcie zachodzi morfogeneza kończyn, w której tkanka szkieletowa jest regenerowana poprzez kondensację chondroprogenitorów pochodzących z komórek okołoszkieletowych i transzróżnicowanych fibroblastów skóry^13,14,15.

Chociaż zidentyfikowano wiele biochemicznych sygnałów regulujących zmiany w tożsamości komórki i składzie ECM^{10,13,14,16,17,18}, właściwości mechaniczne tkanek podczas różnych faz regeneracji kończyn, a także ich wpływ na regenerację, pozostały w dużej mierze niezbadane. Wiele badań wykazało, że komórki wyczuwają i integrują mechaniczne sygnały, które regulują ich los i zachowanie w kilku kontekstach (recenzja w^19,20). Dlatego uzupełnienie naszej wiedzy komórkowej i molekularnej na temat regeneracji kończyn o pomiary mechaniczne tkanek znacznie poprawi nasze zrozumienie tych procesów.

Opracowano różne techniki, które pozwalają na mechaniczną charakterystykę i manipulację siłą próbek biologicznych²¹. Wśród tych technik mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się złotym standardem w mechanobiologii, w której właściwości lepkosprężyste próbek biologicznych są badane w wysokiej rozdzielczości przestrzennej poprzez wgłębienie za pomocą ultraczułego czujnika siły, AFM cantilever²². Ponieważ technika ta wymaga bezpośredniego kontaktu z próbką, zazwyczaj generowane są wycinki tkanki, co w niektórych przypadkach może być trudne. W związku z tym warunki przygotowania muszą być dostosowane i zoptymalizowane dla każdej konkretnej próbki, tak aby mogła pozostać jak najbardziej zbliżona do warunków fizjologicznych i generowane były minimalne artefakty²³. Protokół ten opisuje, jak mierzyć sztywność tkanek w kończynach aksolotla za pomocą AFM, koncentrując się na tkankach chrzęstnych w nienaruszonych warunkach, podczas histolizy i na etapach kondensacji chrząstki (Rysunek 1 i Rysunek 2). Metoda ta może być również rozszerzona o pomiar innych typów tkanek.

Protokół

Aksolotle (Ambystoma mexicanum) były hodowane w obiekcie Axolotl Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie (CRTD) Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie (TUD). Pełny opis warunków hodowli można znaleźć w²⁴. Krótko mówiąc, pomieszczenia utrzymywano w temperaturze 20-22 °C z 12/12 godzinnym cyklem dzień/noc. Wszystkie zabiegi chirurgiczne i zabiegi chirurgiczne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji bioetycznej i zostały zatwierdzone przez Landesdirektion Sachsen w Niemczech.

To badanie używało białych (d/d) aksolotli do wszystkich eksperymentów, naturalnie występującego zmutowanego szczepu pozbawionego pigmentacji ciała (niewiele lub brak melanoforów i ksantoforów), z irydoforami tylko w tęczówce oczu. W badaniu wykorzystano aksolotle mierzące 8-15 cm od pyska do ogona (w wieku 5-7 miesięcy) bez uprzedzeń związanych z płcią.

1. Przygotowanie

1. Przygotuj 10% (w/v) roztwór podstawowy benzokainy, który będzie używany do znieczulenia i eutanazji aksolotli (patrz poniżej). W tym celu wymieszaj w butelce miarowej 50 g benzokainy ze 100% etanolem, aż do osiągnięcia limitu 500 ml.
2. Przygotować 0,03% (w/v) roztwór podstawowy benzokainy.
   1. Na 1 l zmieszaj 50 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) z 30 ml 10% (w/v) benzokainy i 5 ml 4000% (w/v) roztworów Holtfretera z 915 ml wody destylowanej i mieszaj przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego.
   2. Na 1 l 10x TBS roztworu wymieszaj 24,2 g zasady Trizma i 90 g NaCl z 990 ml wody dejonizowanej. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym. Następnie dodaj około 10 ml stężonego HCl (12 M lub 37%) i dostosuj do pH 8.
   3. Na 1 l 4000% (w/v) roztworu Holtfretera zmieszać 158,4 g NaCl, 11,13 g MgSO₄·_7H2O, 5,36 g CaCl₂·2H₂O i 2,88 g KCl z wodą dejonizowaną do 1 l.
3. Przygotować 0,01% (w/v) robocze rozcieńczenie benzokainy w wodzie w zbiorniku do znieczulenia, rozcieńczając 0,03% (w/v) roztwór podstawowy w stosunku 1:3.
   1. Na 1 l roztworu należy użyć 333 ml roztworu podstawowego benzokainy oraz 666 ml wody w zbiorniku.
4. Przygotować 5 mg/ml roztworu podstawowego winianu butorfanolu do znieczulenia. W tym celu wymieszaj 100 mg soli winianu butorfanolu (+) z 20 ml ultraczystej wody. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C.
5. W dniu amputacji należy przygotować świeżo 0,5 mg/l roztworu roboczego winianu butorfanolu w celu zmniejszenia bólu zwierząt po zabiegach chirurgicznych poprzez rozcieńczenie roztworu podstawowego w stosunku 1:10 000 w wodzie w zbiorniku.
   1. W przypadku zwierząt o długości mniejszej niż 8 cm należy zmieszać 20 μl roztworu podstawowego z 200 ml wody w zbiorniku.
   2. W przypadku większych zwierząt zmieszać 60 μl roztworu podstawowego z 600 ml wody w zbiorniku.
6. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (APBS), 80% (v/v) roztwór PBS i utrzymuj go w temperaturze pokojowej (RT), mieszając 800 ml DPBS z 200 ml wody dejonizowanej.
7. Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego insuliny. W tym celu zmieszaj 250 mg insuliny w proszku z 25 ml HCl 0,1 M i powoli mieszaj, aż do rozpuszczenia. Podczas mieszania dodawać 225 ml APBS, aż roztwór będzie klarowny. Sterylny filtr i przechowywać 4 ml porcji w temperaturze -20 °C.
8. Przygotować sterylną pożywkę hodowlaną (wszystkie % (v/v): 62,5% pożywki L15, 10% FBS inaktywowanego termicznie, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% insuliny, 1% L-glutaminy) i przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia użycia. W dniu eksperymentalnym, przed użyciem zrównoważyć do RT.
   1. Na 400 ml pożywki hodowlanej użyj 250 ml pożywki L15, 40 ml inaktywowanego termicznie FBS, 4 ml penicyliny/streptomycyny, 4 ml roztworu insuliny (z kroku 1.7), 4 ml L-glutaminy i 98 ml dejonizowanej sterylnej wody. Przygotować w sterylnych warunkach i sterylnym filtrze po wymieszaniu wszystkich składników. Przygotować 15 ml porcji.
9. Przygotować 2,5% i 3% (m/v) niskotopnienia (lmp)-agarozę w roztworze APBS i podgrzać w temperaturze 70 °C do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Przygotować porcje w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia użycia.
   1. Na 20 ml 2,5% (w/v) lmp-agarozy zmieszać 0,5 g lmp-agarozy z 20 ml APBS w probówce o pojemności 50 ml i podgrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 70 °C, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Rozwiązanie musi stać się jasne i przejrzyste. Przygotuj porcje, gdy są jeszcze ciepłe.
   2. Dla 20 ml 3% (w/v) lmp-agarozy wymieszaj 0,6 g lmp-agarozy z 20 ml APBS i postępuj jak powyżej.
   3. (Opcjonalnie): W przypadku 20 ml 1% (w/v) lmp-agarozy wymieszaj 0,2 g lmp-agarozy z 20 ml APBS i postępuj jak wyżej.
      UWAGA: Czas topnienia zależy od stężenia lmp-agarozy i może wynosić około 15-40 minut.
10. Do amputacji i montażu tkanek należy użyć stereoskopu w jasnym polu.
11. Zmontuj plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm, kleszcze, skalpel i nożyczki chirurgiczne do amputacji i pobierania tkanek.
12. Przygotuj plastikowe szalki Petriego o średnicy 35 mm do pomiaru wgłębień.
13. Przygotuj cylindry o długości ~1 cm i średnicy ~1 cm. W tym celu podgrzej nóż do kartonu pod płomieniem palnika Bunsena i przetnij rurkę o pojemności 15 ml za pomocą podgrzanego ostrza.
14. Wytnij małe 1 cm² kwadraty parafilmu i przechowuj.
15. Przygotować metalowy lub zimny blok w temperaturze -20 °C, pozostawiając go w zamrażarce na co najmniej 1 godzinę.
16. Przygotuj plastikowe pipety Pasteura.
17. (Opcjonalnie): Przygotować utrwalający roztwór MEMFa (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy [MOPS] 0,1 M pH 7,4, kwas glikolu etylenowego bis (eter 2-aminoetylowy)-N,N,N′,N′-tetraoctowy [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, 3,7% formaldehydu). W tym celu dodaj 10,465 g MOPS, 0,123 g MgSO₄·7H₂O, 2 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 i dodaj wodę do 45 ml. Dodać 5 ml formaldehydu 37% (w/v) do całkowitej objętości 50 ml.

2. Odczynniki

1. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z odczynnikami używanymi do tej pracy, ale można również skorzystać z usług innych dostawców komercyjnych.

3. Amputacja aksolotla i regeneracja kończyn

1. Przed wszystkimi procedurami eksperymentalnymi należy znieczulić zwierzę 0,01% (w/v) benzokainy rozcieńczonej w wodzie w zbiorniku (krok 1.3) przez 20 minut, upewniając się, że zwierzęta są głęboko znieczulone i nie reagują na bodźce dotykowe.
2. Usunąć aksolotla ze znieczulenia i położyć go na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej papierową chusteczkę zwilżoną wodą ze środkiem znieczulającym. Ustaw kończynę prostopadle do osi ciała i umieść płytkę pod stereoskopem, aby uzyskać lepszą wizualizację.
   UWAGA: Użyto tu stereoskopu z kompaktową lampą na gęsiej szyi.
3. Amputować kończynę ostrym, sterylnym skalpelem bezpośrednio dystalnie do zwapniałego obszaru obszaru zeugopodialnego (promień/kość łokciowa) (Rysunek 1A).
   UWAGA: Zgodnie z zasadą dobrostanu zwierząt 3R, zaleca się używanie kończyn, które zostały początkowo usunięte przez amputację, jako nienaruszonych elementów kontrolnych.
4. Pozostaw zwierzę na szalce i przykryj je nawilżoną bibułką nasączoną wodą zawierającą benzokainę na 15 minut, aby umożliwić krzepnięcie krwi i zamknięcie rany.
5. Umieścić zwierzęta w zbiorniku zawierającym świeżą wodę z lekami przeciwbólowymi (winian butorfanolu, 0,5 mg/l, od kroku 1.5).
6. Przenieść zwierzęta do ich pierwotnego zbiornika zawierającego świeżą wodę po 24 godzinach od pooperacyjnego leczenia przeciwbólowego.
7. Pozwól zwierzętom zregenerować się do pożądanego etapu zainteresowania.
   UWAGA: Analizowane kończyny pobrano w dniu amputacji w przypadku fazy nienaruszonej oraz 5 dni po amputacji (dpa) w przypadku fazy histolizy u zwierząt w wieku 5 miesięcy. Etap kondensacji chrząstki mierzono przy 21 dpa u 7-miesięcznych zwierząt.

4. Montaż i przetwarzanie tkanek do pomiarów

1. Podgrzewać probówki o pojemności 1,5 ml zawierające 2,5% lub 3% (m/v) lmp-agarozy (z kroku 1.9) na termobloku w temperaturze 70 °C, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Zmień rurki na inny termoblok w temperaturze 37 °C i poczekaj, aż temperatura się zrównoważy przed użyciem.
   UWAGA: W tym przypadku 2,5% lmp-agarozy użyto do pomiaru regenerujących się tkanek i 3% do tkanek nienaruszonych.
2. Przykryj jedną stronę cylindrów o długości 1 cm (od kroku 1.13) jednym z kawałków parafilmu (krok 1.14), tak aby były całkowicie uszczelnione na dole.
3. Zrównoważyć 15 ml podwielokrotności pożywki do RT (od kroku 1.8)
4. Znieczulić zwierzęta, zanurzając je w wodzie zawierającej środek znieczulający (0,01% (w/v) benzokainy rozcieńczonej w wodzie w zbiorniku) na co najmniej 20 minut.
5. Zobrazuj kończyny pod stereoskopem za pomocą oprogramowania umożliwiającego pomiary ilościowe. Zmierz długość interesującej Cię struktury i oblicz, ile tkanki należy usunąć z dystalnego końca kończyny, aż do osiągnięcia interesującego Cię odcinka
.
6. W celu regeneracji kończyn należy je zebrać, przecinając skalpelem i/lub nożyczkami chirurgicznymi na poziomie łokcia i wycinając nadmiar tkanki z kończyny. Pozostaw chusteczkę w roztworze APBS podczas przygotowywania następnego kroku. Upewnij się, że cięcie jest poprzeczne (90°) do dolnej osi ramienia, aby uzyskać równą powierzchnię. W przypadku nienaruszonych kończyn usuń rękę, przecinając obszar nadgarstka.
7. Poddaj zwierzęta eutanazji, wystawiając je na działanie śmiertelnej dawki znieczulenia (0,1% benzokainy) przez co najmniej 20 minut. W tym celu należy dodać wymaganą objętość 10% (w/v) roztworu benzokainy, aby osiągnąć stężenie 0,1% (w/v).
   1. Jeśli zwierzęta były znieczulone w 100 ml 0,01% (w/v) roztworu benzokainy, dodaj 900 μl 10% (w/v) roztworu benzokainy.
8. Opłucz kończyny, zanurzając je w roztworze APBS.
9. Upewnić się, że pipety Pasteura i termoblok (ustabilizowany w temperaturze 37 °C porcjami agarozy) znajdują się blisko stanowiska roboczego. Wyjmij zimny blok z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieść na nim cylinder końcem pokrytym parafolią skierowanym w dół.
10. Chwyć wypreparowaną kończynę i delikatnie usuń nadmiar płynu bibułą. Umieść kończynę na czystej płytce, dodaj stopioną lmp-agarozę na wierzch i krótko poruszaj kończyną w agarozie, aby przemieścić pozostałe APBS z powierzchni skóry.
11. Pracując szybko, umieść kończynę wewnątrz cylindra, upewniając się, że jest zorientowana pionowo, z obszarem zainteresowania skierowanym do góry.
12. Delikatnie trzymając kończynę kleszczami, dodawaj lmp-agarozę do wnętrza cylindra, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta. Delikatnie usuń kleszcze, zanim agaroza zastygnie.
13. Wyjmij cylinder z zimnego bloku i pozwól agarozie całkowicie zestalić się w temperaturze pokojowej przez około 30 s.
14. Blok agarozy zawierający tkankę należy natychmiast przenieść do pomieszczenia z wibratomem, wraz ze sterylnymi podwielokrotnościami pożywki hodowlanej i APBS, w temperaturze RT.
15. Usuń parafilm z dna cylindra i przymocuj agarozę zawierającą tkankę do etapu wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Upewnij się, że zarówno agaroza, jak i próbka są przyklejone do stolika.
16. Zanurz stolik w APBS w celu przekroju.
    UWAGA: Nienaruszone tkanki obejmują sztywniejszą kość/chrząstkę, podczas gdy regenerujące się tkanki są bardziej miękkie. Dlatego parametry wibratomu muszą być odpowiednio dostosowane. W badaniu wykorzystano następujące parametry: tkanki nienaruszone (amplituda 1,2 mm i prędkość 0,1 mm/s) oraz tkanki regenerujące się (amplituda 0,9 mm i prędkość 0,4 mm/s).
17. Rozpocznij cięcie agarozy małymi krokami (np. w krokach co 100 μm), aż do osiągnięcia końcówki tkanki. Następnie należy przeciąć blok tkankowy, aż do usunięcia dystalnej części tkanki (obliczonej w kroku 4.5). W ten sposób przekrojowy przekrój obszaru zainteresowania będzie łatwo dostępny.
    UWAGA: Usunięty wycinek tkanki będzie zawierał bezpośrednio przylegającą powierzchnię do powierzchni badanej za pomocą AFM i może służyć jako odniesienie dla struktury tkanki. W związku z tym może być stosowany do bezpośredniej analizy uzupełniającej lub utrwalany do późniejszego barwienia (patrz punkt 6).
18. Ostrożnie usuń blok zawierający tkankę ze etapu wibratomu za pomocą żyletki i usuń wszelkie ślady kleju. Natychmiast przyklej blok na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm za pomocą kleju do tkanek chirurgicznych i dodaj około 2 ml pożywki hodowlanej w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie pokryta.
    UWAGA: Odsłonięta powierzchnia tkanki w bloku agarozy jest powierzchnią, która ma być badana.

5. Pomiary za pomocą AFM

1. Co najmniej 1 dzień przed pomiarami przygotuj wspornik do pomiarów.
   UWAGA: W tej pracy wsporniki silikonowe bez końcówki zostały funkcjonalizowane kulkami polistyrenowymi (średnica 20 μm), a połączenie koraliko-wspornik pozostawiono do wzmocnienia na co najmniej 1 dzień przed użyciem do pomiarów wgłębień.
   1. Przymocuj koraliki do wsporników za pomocą kleju epoksydowego o czasie obróbki 5 minut.
   2. Szybko opuść wspornik przy minimalnym kontakcie na pokrytą klejem szkiełko szkiełkowe, tak aby na jego końcu utworzyła się mała kropla kleju, a następnie doprowadź go do kontaktu z odpowiednią kulką.
   3. Przytrzymaj styk wspornika-stopki przez ~ 10 minut przed podniesieniem wspornika ze związaną stopką z powierzchni.
2. Skalibruj wspornik przed pomiarami.
   UWAGA: Zmodyfikowany wspornik był kalibrowany przed każdym zestawem eksperymentów metodą szumu termicznego przy użyciu wbudowanych procedur oprogramowania AFM.
3. Włożyć szalkę Petriego z blokiem tkankowym (z kroku 4.18) i pożywką hodowlaną do uchwytu szalki Petriego AFM i uzyskać obraz poglądowy w mikroskopii jasnego pola (Rysunek 1B).
   UWAGA: Do testów wgnieceń stosuje się zestaw wyposażony w stopień silnikowy umieszczony na pionowym mikroskopie świetlnym. Zamontuj głowicę AFM i umieść wspornik na tkance i zbliż wspornik do powierzchni.
4. Wybierz konkretny obszar zainteresowania i zapisz tablicę krzywych siła-odległość (Rysunek 2A).
   UWAGA: Zastosowano nastawy siły względnej 2-25 nN w celu osiągnięcia porównywalnych głębokości wgłębień ~1-4 μm dla tkanek o różnej sztywności, przy prędkości zbliżania i cofania 7,5 μm/s, długości z 50 μm, wielkości siatki 70 μm x 70 μm z 3 x 3 punktami.
5. Dla każdego badanego obszaru uzyskaj obraz mikroskopowy w jasnym polu, aby powiązać uzyskane wartości z każdym konkretnym obszarem w sekcji kończyny.
6. W przypadku wszystkich próbek należy zbadać co najmniej 3 różne regiony dla każdego typu tkanki.
   UWAGA: We wszystkich przypadkach w tym badaniu mierzono 4 regiony w środku chrząstki i 3 regiony na obrzeżach obszaru chrząstki i utrzymywano tkankę pod mikroskopem przez maksymalnie 1 godzinę.
7. Po zakończeniu pomiarów wgłębień wyrzuć lub utrwal tkankę do dalszej analizy.
   UWAGA: Próbki utrwalono po zakończeniu pomiarów poprzez umieszczenie ich w probówkach o pojemności 2 ml zawierających roztwór MEMFa i utrwalono przez noc w temperaturze 4 °C. Użyto MEMFa (krok 1.17), ale można również użyć 4% roztworu formaldehydu (w/v) w PBS.

6. (Opcjonalnie) Przetwarzanie sąsiednich odcinków tkanek

1. Jeżeli sąsiadujące ze sobą skrawki tkanek są używane do późniejszego barwienia, umieścić je natychmiast po przecięciu w małej probówce o pojemności 2 ml zawierającej utrwalacz i utrwalić przez noc w temperaturze 4 °C.
   1. Aby ujawnić architekturę tkankową poprzez znakowanie cytoszkieletu i jąder aktyny, przemyj 3 razy PBS przez 5 minut każdy, aby usunąć utrwalacz i zabarwić roztworem zawierającym Alexa Fluor 488 sprzężoną falloidynę (1:250) i Hoechst 33258 (1:10000) w PBS przez 1 godzinę w RT na platformie kołyszącej.
   2. Następnie unieruchomić zabarwione próbki na wierzchu naczyń ze szklanym dnem za pomocą 1% (w/v) lmp-agarozy w APBS ustabilizowanej w temperaturze 37 °C (od kroku 1.9). Upewnij się, że interesująca Cię powierzchnia jest skierowana w stronę szkła. Gdy agaroza zastygnie, przykryj próbki PBS, aby zapobiec odwodnieniu.
      UWAGA: Próbki nienaruszone i histolizy są obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (10-krotne powiększenie i przekroje optyczne 8 μm). Obrazy w Rysunek 1C to maksymalne rzuty 8 sekcji optycznych.
2. Jeśli sąsiedni wycinek tkanki jest używany do natychmiastowej dalszej analizy wymagającej świeżej tkanki (takiej jak ekstrakcja RNA, inkubacja z żywymi barwnikami itp.), upewnij się, że pracujesz szybko i używasz pożywki do hodowli komórkowej (od kroku 1.8), aby zapewnić najwyższą możliwą integralność tkanki.

7. Analiza i wyświetlanie danych

1. Aby obliczyć pozorny moduł Younga, przeanalizuj krzywe siła-odległość przy użyciu modelu Hertza/Sneddona (równanie 1) dla wgłębnika sferycznego przy użyciu oprogramowania do przetwarzania danych JPK/Bruker, przyjmując współczynnik Poissona 0,5,
   (Eq.1)
   Gdzie R: promień wgłębnika, E: moduł sprężystości, ν: współczynnik Poissona, a: promień okrągłej powierzchni styku między wgłębnikiem a próbką, δ: głębokość wgłębienia.
2. W celu analizy lepkosprężystości przeanalizuj części podejścia krzywych siła-wgłębienie w PyJibe 0.15.0 z rozszerzeniem "Model Hertza skorygowany o lepkosprężystość przy użyciu Kelvina-Voigta-Maxwella (KVM)" (napisany przez Paula Müllera, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. Funkcja dopasowania jest oparta na modelu opisanym przez Abuhattum et al.²⁶, integrując elementy modelu Kelvina-Voigta-Maxwella.
   1. Wstępnie przetworzyć krzywe wcięcia siły, aby oszacować punkt kontaktowy przy użyciu pasowania odcinkowego z linią (linią bazową) i funkcją dopasowania wielomianowego dla części dojazdowej.
   2. Dopasuj krzywe siła-wgniecenie do "modelu Hertza skorygowanego o lepkosprężystość przy użyciu modelu Kelvina-Voigta-Maxwella (KVM)". Z dopasowania uzyskaj nierozluźniony moduł Younga, pozorny moduł Younga i pozorną lepkość. Model podaje również czasy relaksacji i wgłębień Maxwella.
      UWAGA: W kilku analizowanych krzywych wgłębienia siły (w szczególności nienaruszonej tkanki) czasy relaksacji Maxwella były znacznie większe lub mniejsze niż czas wgłębienia, co wskazuje odpowiednio raczej na zachowanie sprężyste lub mechaniczne Kelvina-Voigta.
3. Wyeksportuj wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego i oblicz medianę pozornych modułów Younga dla każdego typu tkanki i próbki.
4. Wykreśl i przeanalizuj statystycznie dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
   UWAGA: Używany jest tutaj GraphPad Prism, a opisując wyniki, badanie odnosi się do średniej ± SD mediany pozornych modułów Younga na próbkę (wyświetlanych w Rysunek 2D-F).
5. Wyświetlaj wycinki optyczne z obrazów konfokalnych, wyświetlając je za pomocą funkcji maksymalnej projekcji Fidżi. Dostosuj jasność i kontrast każdego kanału z osobna, aby uzyskać optymalną wizualizację barwień fluorescencyjnych.
6. Wygeneruj panel figur za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
   UWAGA: Affinity Designer służy do generowania paneli, a model w Rysunek 1A jest rysowany za pomocą Affinity Designer.

Wyniki

Korzystając z protokołu opisanego powyżej, zmierzyliśmy pozorny moduł Younga w tkankach chrzęstnych kończyn aksolotla w warunkach homeostatycznych ("Nienaruszonych"), podczas wczesnej histolizy chrząstki i późniejszych etapów kondensacji chrząstki (Rysunek 1A). Zbadaliśmy również właściwości mechaniczne elementów szkieletowych w różnych regionach, w tym w ich środku i na obrzeżach, jak pokazano na obrazach przedstawiających pozycję wspornika (Rysunek 1B). Aby wyświetlić architekturę tkanki i skorelować ją z pomiarami sztywności, albo poprzeczne odcinki tkanki, albo blok tkanki, w którym wykonano pomiary, zostały utrwalone i wybarwione pod kątem włókien i jąder aktyny odpowiednio za pomocą Alexa Fluor 488 sprzężonych z falloidyną i Hoechstem (Rysunek 1C). W nienaruszonych kończynach promień jest wyraźnie większy niż kość łokciowa, ale oba chrzęstne elementy szkieletowe mają podobną morfologię, z równomiernie rozmieszczonymi okrągłymi jądrami w środku, otoczonymi pierścieniem spłaszczonych jąder odpowiadających perichondrium²⁴. Podczas fazy histolizy wykryto dramatyczne zmiany w architekturze tkanek, z niezorganizowanymi i mniej gęścią upakowanymi jądrami wewnątrz elementów szkieletowych. W późniejszej fazie kondensacji chrząstki jądra ponownie się organizują, z wyraźnym rozgraniczeniem między nowo tworzącą się chrząstką a otaczającymi ją regenerującymi się tkankami. Jednak na tym etapie większość jąder jest spłaszczona i nie ma wyraźnych różnic morfologicznych między centrum a obrzeżami.

Gdy zmierzono przekroje poprzeczne obu elementów szkieletowych obecnych w okolicy zeugopodialnej (promień i kość łokciowa), wykryto nierozróżnialne pozorne moduły Younga w nienaruszonych kończynach, z medianami wartości odpowiednio 10,95 ± 11,69 kPa i 15,71 ± 6,49 kPa (Rysunek 2D, po lewej), co zgadza się z ich anatomicznymi podobieństwami (Rysunek 1C). Co ciekawe, analiza centrum chrząstki w porównaniu z obwodem wykazała, że w nienaruszonych warunkach pozorne moduły Younga w centrum były wyższe niż na obrzeżach, z medianą wartości odpowiednio 16,48 ± 6,86 kPa w porównaniu z 7,53 ± 4,63 kPa (Rysunek 2E, po lewej). W 5 dniu po amputacji, odpowiadającej fazie histolizy, pozorne moduły Younga w promieniu i kości łokciowej znacznie się zmniejszyły (odpowiednio 0,03 ± 0,02 kPa i 0,13 ± 0,09 kPa, Rysunek 2D, po prawej), ale zniknęły również różnice między centrum a obrzeżami, przy medianie modułów Younga wynoszących 0,11 ± 0,07 kPa i 0,27 ± 0,34 kPa, odpowiednio (Rysunek 2E, po prawej). Analizując właściwości chrząstki na późniejszym etapie regeneracji, w momencie, gdy chrząstka zaczyna się zagęszczać, wykryto znaczny wzrost pozornych modułów Younga, osiągając wartości pośrednie między fazą nienaruszoną a histolityczną (0,77 ± 0,29 kPa, Rysunek 2F).

Jak można zobaczyć na dostarczonych przykładowych krzywych (Rysunek 2B), histereza wystąpiła między większością par krzywych podejścia i retrakcji, co wskazuje na lepkosprężystą reakcję tkanki pod wpływem siły. Następnie postanowiliśmy bardziej szczegółowo przeanalizować właściwości lepkosprężyste różnych tkanek. Ponieważ pomiary oscylacyjne na wielu częstotliwościach są czasochłonne i nieco krytyczne w odniesieniu do zachowania integralności tkanki, zwłaszcza podczas mapowania wielu obszarów tkanki, użyliśmy wcześniej opublikowanej metody Abuhattuma i wsp., która pozwala na dopasowanie części podejścia krzywych siła-odległość przed natychmiastowym wycofaniem wspornika²⁶. Model oparty jest na elementach modelu Kelvina-Voigta Maxwella i był wcześniej stosowany do analizy właściwości lepkosprężystych komórek i hydrożeli²⁶, a także trzustka tissue²⁷. Mediana modułów nierozluźnionych (nienaruszona: 23,05 kPa, histoliza: 0,20 kPa i chrząstka kondensacyjna: 1,60 kPa) i pozorne moduły Younga (nienaruszone: 17,54 kPa, histoliza: 0,07 kPa i chrząstka kondensacyjna: 1,54 kPa) uzyskane dla tkanek na różnych etapach regeneracji wykazały znaczące różnice (Rysunek 2G-H). Ogólnie rzecz biorąc, zaobserwowano głównie elastyczną reakcję tkanek na deformację przy wybranej szybkości deformacji, co odzwierciedla duże podobieństwo nierozluźnionych i pozornych modułów sprężystości (Rysunek 2G, H). Istotnie niższe mediany wartości lepkości pozornej uzyskano dla etapu histolitycznego (0,72 Pa·s) w porównaniu z etapem nienaruszonej (2,06 Pa·s) i kondensującej chrząstki (2,32 Pa·s) (Rysunek 2I). Zgodnie z oczekiwaniami, pozorne moduły Younga w analizie PyJjibe (Rysunek 2H) były w wysokim stopniu zgodne z wartościami uzyskanymi przez oprogramowanie do przetwarzania danych JPK (Rysunek 2F).

Podsumowując, charakterystyka mechaniczna odzwierciedla dynamiczną restrukturyzację tkanek podczas procesu regeneracji. Pomiary te są zgodne z obserwacjami anatomicznymi, gdzie sztywność tkanek zmniejsza się wraz z obserwowanymi zmianami w architekturze tkanek (Rysunek 1C) i jest stopniowo odzyskiwana podczas regeneracji.

Rysunek 1: Pomiary wgłębień chrząstki kończyny aksolotla podczas regeneracji. (A) Schematyczne przedstawienie etapów regeneracji. Linia przerywana wskazuje przybliżone miejsce przekroju poprzecznego generowanego przez wibratom, w którym wykonano pomiary. (B) Reprezentatywne obrazy pomiarów środkowych (górnych) i obwodowych (dolnych) w chrząstce kończyny. końcówka to wspornik. Pasek skali: 100 μm. (C) Architektura tkanek w nienaruszonych kończynach (po lewej), tkanka ulegająca histolizie (w środku) i kondensacja chrząstki (po prawej). Zielony: jądra (Hoechst), magenta: włókna aktynowe (falloidyna). Pasek skali: 500 μm. C' Powiększony obszar obrysowany na panelu. Podziałka: 100 μm. Siatki wcięć o wymiarach 70 μm x 70 μm są oznaczone białymi (środek) i żółtymi (obrzeża) kropkowanymi kwadratami. W panelach B i C litery R i U oznaczają odpowiednio promień i kość łokciową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pomiar sztywności chrząstki podczas regeneracji kończyn aksolotla za pomocą AFM. (A) Schematy eksperymentu z wgłębieniami AFM pokazane jako siła w funkcji czasu (powyżej) i siła jako funkcja odległości między wgłębnikiem a próbką (poniżej). Krzywe zbliżania i cofania są wyświetlane odpowiednio na niebiesko i czerwono. Punkt kontaktowy jest wyświetlany przez czarną pionową linię przerywaną. Krzywe siła-wgłębienie zostały dopasowane do części podejścia krzywej, albo przy użyciu modelu Hertza/Sneddona (oprogramowanie do przetwarzania danych JPK i Pyjibe), albo lepkosprężystego rozszerzenia modelu KVM w Pyjibe. (B) Reprezentatywne krzywe siła-odległość z pomiarów AFM w nienaruszonych i regenerujących się kończynach podczas etapów histolizy i kondensacji chrząstki. Procent krzywych możliwych do analizy (tj. bez artefaktów) jest wskazany w prawym górnym rogu każdej krzywej. (C) Przykłady typowych artefaktów w krzywych siła-wgniecenie, np. z powodu niewłaściwego kontaktu wgłębnika z powierzchnią. Pokazane przykłady odpowiadają nienaruszonym kończynom, ale równoważne typy artefaktów zaobserwowano we wszystkich warunkach. Dla B-C: Reprezentatywne krzywe siła-odległość zostały dopasowane i wyświetlone za pomocą Pyjibe. Jasnoniebieska krzywa przedstawia część zbliżającą się krzywej, a jasnoczerwona krzywa to część cofania. Ciemniejsza niebieska linia to zastosowana metoda Hertza/Sneddona pasująca do wgłębnika sferycznego. Odpowiednie reszty z pasowania są pokazane poniżej dla dolnych krzywych siła-odległość. Wykreślone reszty reprezentują różnicę między wartościami dopasowania a rzeczywistymi wartościami siły. (D) Pozorne moduły Younga w promieniu i ośrodku łokciowym mierzone w nienaruszonych kończynach i poddawanych histolizie. (E) Pozorne moduły Younga centrum chrząstki w stosunku do obwodu (Peri) w nienaruszonych kończynach i podczas histolizy. (F) Pozorne moduły Younga mierzone dla centrum chrząstki na analizowanych etapach regeneracji. Dla D-F: Każda kropka pochodzi z jednej pomyślnie przeanalizowanej krzywej siła-odległość, a większe kropki odpowiadają medianie wartości na próbkę. Pozorne moduły Younga uzyskano przy użyciu dopasowania modelu Hertza/Sneddona w oprogramowaniu JPK Bruker. (G-I) Moduł niezrelaksowany (G), pozorny moduł Younga (H) i lepkość pozorna (I) obliczone za pomocą PyJibe (przedłużenie KVM) na podstawie pomiarów środka chrząstki na analizowanych etapach regeneracji. Każda kropka jest wyprowadzana z jednej, pomyślnie przeanalizowanej krzywej siła-odległość. Linie odpowiadają średnim wartościom wszystkich pomiarów dla każdego warunku. Dla D-I: Kruskal-Wallis z testem wielokrotnych porównań Dunna. Różne litery reprezentują warunki, które statystycznie różnią się od siebie (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy technikę pomiaru sztywności chrząstki w kończynach aksolotla z AFM. Jednak metoda ta może być rozszerzona o sondowanie również innych typów tkanek. Kluczowym krokiem do udanych pomiarów AFM jest przygotowanie próbki, która okazała się szczególnie trudna w przypadku próbek aksolotlów. Odkryliśmy, że badanie powierzchni tkanki, która była nadal osadzona w bloku agarozowym, było najlepszym sposobem na zachowanie integralności tkanki. Dzieje się tak, ponieważ skóra aksolotla wydziela duże ilości śluzu na powierzchnię naskórka, co uniemożliwia stabilne osadzenie się pokrojonego fragmentu tkanki w agarozie.

Niektóre próbki mogą wiązać się z dodatkowymi wyzwaniami, takimi jak wysoka przyczepność. Doświadczyliśmy tego problemu, szczególnie w próbkach w fazie histolizy, które były stosunkowo podatne i adhezyjne. Na tych próbkach zaobserwowaliśmy również wiele krzywych siła-odległość, w których część wgłębienia miała "postrzępiony" wygląd, co wskazuje, że ścieg deformował powierzchnię próbki w sposób nieciągły (rysunek 2C), np. z powodu powierzchni poddawającej się pod wpływem naprężeń. Takie krzywe siła-odległość musiały zostać odrzucone, ponieważ nie można było ich dopasować do modelu Hertza-Sneddona. W celu zmniejszenia adhezji pomocna może być pasywacja wgłębnika²⁸, tj. poprzez pokrycie stopki wgłębnika środkami zmniejszającymi jego lepkość, takimi jak glikol polietylenowy (PEG) lub albumina surowicy bydlęcej. Można również zastosować alternatywne modele do dopasowywania krzywych siła-odległość, np. JKR (Johnson-Kendall-Roberts) model²⁹. Ponieważ analizowane tutaj tkanki wykazywały stosunkowo duże różnice w modułach sprężystości o więcej niż jeden rząd wielkości dla sąsiednich obszarów tkanek i różnych badanych warunków, wybór jednego idealnego wspornika/wgłębnika (stała sprężystości/rozmiar wgłębnika) był wyzwaniem. Dość duże różnice w sztywności tkanki wymagały również dostosowania przyłożonej siły nacisku w celu utrzymania porównywalnej głębokości wgłębienia i w odpowiednim zakresie (około 5%-25% średnicy wgłębnika).

Innym krytycznym parametrem pozwalającym zachować właściwości mechaniczne tkanki tak fizjologicznie, jak to tylko możliwe, jest utrzymanie maksymalnej integralności tkanki. Zapewniono to poprzez pomiar świeżych próbek, które zostały przetworzone natychmiast po pobraniu i utrzymywane w odpowiedniej temperaturze w pożywce do hodowli komórkowych o stabilnym pH.

Ostatnio inne grupy przeprowadziły pomiary mikrowgłębień w elementach szkieletu aksolotla przy użyciu alternatywnych metod przetwarzania próbek³⁰. Jednak w tych eksperymentach tkanka została wcześniej zamrożona, a regenerujące się kawałki szkieletu zostały ręcznie wypreparowane z otaczających je tkanek w celu zmierzenia ich in situ. Dopóki nie zostanie to udowodnione empirycznie, nie jest jasne, czy manipulacje te mają wpływ na integralność tkanki chrzęstnej i właściwości mechaniczne. Przedstawiono również analizy mięśni salamander i blastemów^31,32. W tych przypadkach jednak skóra została usunięta, a próbki nie zostały podzielone na sekcje; W ten sposób uzyskano tylko informacje z powierzchni znajdującej się bezpośrednio pod usuniętym nabłonkiem. Chociaż ten rodzaj kwantyfikacji jest dokładny, dostarcza raczej informacji o bocznej powierzchni mięśnia, ignorując w ten sposób informacje mechaniczne z wewnętrznych warstw mięśni. Użyliśmy wgłębnika o średnicy 20 μm, co oznacza, że pomiary nie były masowe, jak podawano w pomiarach mikrowgłębień 30,31,32, ale raczej w skali komórkowej i zewnątrzkomórkowej. W związku z tym uzyskujemy rozdzielczość, która odzwierciedla mechaniczne sygnały, na które komórki są faktycznie narażone, a także ujawnia niejednorodność tkanek (ryc. 2D-I).

W pomiarach wykryto niższe pozorne wartości modułów Younga na obrzeżach nienaruszonych elementów szkieletowych, co sugeruje, że okołochrzęstne aksolotla jest bardziej podatne niż chrząstka. Nie można jednak wykluczyć, że badaniom poddano również tkanki przylegające do elementów szkieletowych ze względu na ustawienie siatki 70 μm x 70 μm. W fazie histolitycznej nie zaobserwowano takich różnic, co sugeruje, że histoliza w kończynach regenerujących aksolotl może przebiegać równoważnie w chrząstce, otaczającej ją okołochrzęstnej i sąsiednich tkankach. Kość promieniowa i łokciowa mają podobną budowę, ale mają znaczne różnice anatomiczne, takie jak promień o większej średnicy, a kość łokciowa jest dłuższa²⁴. Niemniej jednak do tej pory nie przedstawiono analizy porównawczej ich sztywności, z wyjątkiem ich reakcji na obciążenia mechaniczne w celach medycznych³³. W tym miejscu opisujemy pomiary wgłębień w przekrojach tych dwóch elementów szkieletowych w nienaruszonych i regenerujących się kończynach. Pokazujemy, że nie ma istotnych różnic w sztywności między promieniami a łokciami w kończynach aksolotl, co jest zgodne z równoważnymi gęstościami mineralnymi kości wykrytymi u ludzkich odpowiedników³⁴. Zaobserwowano jednak tendencję do niższych pozornych modułów Younga w promieniu, szczególnie podczas histoklizy. Aby ustalić, czy ta obserwacja jest istotna z biologicznego punktu widzenia, preferowana byłaby większa liczba próbek. Na podstawie danych uzyskanych w tym badaniu proponujemy minimum 5 próbek na warunek. Podczas fazy histolizy oba elementy szkieletu stają się bardziej podatne, co jest zgodne z opisanym na^{tym etapie} przebudową ECM 9. Wreszcie, pomiary uzyskane w tym badaniu sugerują, że sztywność chrząstki stopniowo wzrasta w późniejszej fazie kondensacji chrząstki. Obserwacje te zgadzają się z niedawno opisanymi pomiarami wgnieceń w nienaruszonych kościach i chrząstce kondensacyjnej²⁹, a także z oceną in vivo właściwości mechanicznych chrząstki za pomocą mikroskopii konfokalnej Brillouina³⁵.

Podsumowując, prace te rozszerzają potencjał AFM jako cennego narzędzia do badania właściwości mechanicznych kończyn aksolotlów. Dzięki tej technice zamierzamy uzupełnić naszą wiedzę na temat ekspresji genów i trajektorii transdyferencjacji komórek^16,13, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób mechanika tkanek kształtuje i wpływa na proces regeneracji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Affinity Designer	Affinity	wersja 1.10.4	Do montażu figur
Agaroza o niskiej stopie topliwości	Roth	6351.1	Do przygotowania próbki
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Do barwienia tkanek
Axiozoom	Zeiss		Do obrazowania próbki pod AFM
Benzokaina	Sigma-Aldrich	E1501	Aby znieczulić zwierzęta
Winian butorfanolu (+) sól	Sigma-Aldrich	B9156	Jako środek przeciwbólowy
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	Do pomiarów wgnieceń AFM
Zestaw Cellhesion 200 wyposażony w motorstage	JPK/Bruker		Do pomiarów wgłębień AFM
CellSense Entry			Do obrazowania w stereoskopie Olympus UC90
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	Do czyszczenia próbek i sekcji pod wibratomem
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	wersja 2.9.0/1.53t	Do przetwarzania obrazu
GraphPad	Prism Oprogramowanie GraphPad	(wersja 8.4.3)	Do wykresu i analizy statystycznej danych
Inaktywowany termicznie FBS	Gibco	10270-106	Do komórki pożywka
hodowlana Klej histoakrylowy (2-butyl-cyjanoakryl)	Braun		Do przyklejania próbki do szalek Petriego
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	Do barwienia tkanek
Insulina	Sigma-Aldrich	I5500	Do pożywki do hodowli komórkowych
Odwrócony mikroskop konfokalny	Zeiss	780 LSM	Do obrazowania skrawków tkanek
Odwrócony mikroskop konfokalny	Zeiss	980 LSM	Do obrazowania skrawków tkanek
Oprogramowanie do przetwarzania danych JPK/Bruker	JPK/Bruker	SPM 6.4	Do analizy krzywych siła-odległość
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	Do pożywki do hodowli komórkowych
L-glutamina	Gibco	25030-024	Do pożywki do hodowli komórkowych
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140-122	Do komórki pożywka
hodowlana kulki polistyrenowe ( 20 & mikro; m średnicy); )	mikrocząstki		do pomiarów wgnieceń AFM
Pyjibe	napisane przez Paula Mü ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	Do analizy lepkosprężystej
Stereoskop Olympus SX10	Olympus	SX10	Do amputacji kończyn i montażu tkanek
Stereoskop Olympus UC90	Olympus	UC90	Do obrazowania
Vibratome	Leica	Leica VT 1200S	Do sekcji tkanek