Artykuł metodologiczny

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66948

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

Streszczenie

Rozpowszechnienie urazów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w układzie zamkniętym podkreśla potrzebę lepszego zrozumienia tych urazów w celu poprawy interwencji ochronnych i terapeutycznych. Kluczowe znaczenie dla tych badań mają modele zwierzęce, które replikują uszkodzenia ośrodkowego układu zamkniętego. W tym kontekście zaprojektowano niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego, aby odtworzyć szereg uszkodzeń ośrodkowego układu zamkniętego w modelach mysich, w tym urazy oka, mózgu i rdzenia kręgowego. Do tej pory system był używany do podawania nadciśnienia powietrza skierowanego do oczu, głowy lub kręgosłupa w celu modelowania uszkodzenia przednio-tylnego bieguna w oku, pośredniej urazowej neuropatii nerwu wzrokowego (ITON), ogniskowego urazowego uszkodzenia mózgu i uszkodzenia rdzenia kręgowego. Niniejszy dokument zawiera szczegółowy protokół przedstawiający konstrukcję i działanie systemu oraz przedstawia reprezentatywne wyniki wykazujące jego skuteczność. Przedstawione tutaj solidne ramy stanowią solidną podstawę dla trwających badań nad urazami OUN. Wykorzystując elastyczne atrybuty systemu, śledczy mogą modyfikować i dokładnie kontrolować lokalizację, stopień i czas wystąpienia obrażeń. Pozwala to na kompleksowe porównanie mechanizmów molekularnych i skuteczności terapeutycznej w wielu urazach OUN w układzie zamkniętym.

Wprowadzenie

Urazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) to urazy, które są spowodowane uszkodzeniem mózgu lub rdzenia kręgowego bez powodowania pęknięcia czaszki lub kręgosłupa. Urazy te obejmują urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) i uraz rdzenia kręgowego (SCI) i mogą wystąpić w wyniku różnych incydentów, w tym urazów (np. upadków, urazów sportowych, wypadków samochodowych) i wybuchów. Urazy ośrodkowego układu zamkniętego są ogólnie uważane za mniej poważne w porównaniu z penetrującymi urazami OUN, ale występują częściej. Jednak, podobnie jak urazy penetrujące, urazy OUN w układzie zamkniętym mogą powodować długotrwałe i postępujące problemy zdrowotne, zwłaszcza po powtarzających się zdarzeniach 1,2,3,4,5,6. Niepokojące jest to, że pojawiające się dowody sugerują, że nawet subkliniczne urazy OUN w układzie zamkniętym, które po pojedynczym wystąpieniu spadają poniżej kryteriów diagnostycznych TBI lub SCI 7,8,9,10,11,12,13, mogą przekształcić się w przewlekłe choroby neurodegeneracyjne po powtarzającym się urazie 6,14,15,16. Podkreśla to pilną potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmów i konsekwencji pojedynczych i powtarzających się urazów OUN w układzie zamkniętym. Taka wiedza jest niezbędna dla poprawy podejścia ochronnego i terapeutycznego. Kluczowe znaczenie dla tego przedsięwzięcia mają modele zwierzęce, które odtwarzają urazy ośrodkowego układu zamkniętego.

Obecne modele zwierzęce urazów ośrodkowego układu zamkniętego odegrały zasadniczą rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat patofizjologii oraz potencjalnych interwencji ochronnych i terapeutycznych w przypadku tych urazów. Gryzonie są szczególnie popularne ze względu na ich niski koszt, dostępność, podatność na manipulację genetyczną, łatwość obsługi, dobrze ugruntowane testy behawioralne i fizjologiczne oraz korzystniejsze względy etyczne17. Powszechne metody indukowania TBI w układzie zamkniętym u gryzoni obejmują urządzenia do obniżania masy ciała18,19, urządzenia do kontrolowanego uderzenia korowego (CCI)20 i rurki uderzeniowe napędzane sprężonym powietrzem21. W przypadku SCI modele urazów zazwyczaj wymagają laminektomii22,23 lub innych technik chirurgicznych24 w celu bezpośredniego dostępu do rdzenia kręgowego lub przestrzeni zewnątrzoponowej. Jednak modele urazów spowodowanych wybuchem SCI z zamkniętym ciałem zostały opracowane przy użyciu rur uderzeniowych napędzanych sprężonym powietrzem 25. Pomimo dostarczania cennych informacji, każdy z tych modeli ma unikalne ograniczenia. Modele spadku masy ciała mogą charakteryzować się dużą zmiennością i ograniczoną kontrolą lokalizacji i ciężkości urazu, co stwarza eksperymentalne i etyczne obawy dotyczące powodowania poważnych, niekontrolowanych urazów26. Urządzenia CCI oferują precyzję, ale wymagają przeszkolenia w zakresie obsługi, mogą wiązać się z kraniotomią i mogą ulegać zmienności mechanicznej wpływającej na odtwarzalność27. Rurki uderzeniowe są na ogół mniej inwazyjne, ale mogą być trudne do zdobycia, skomplikowane w konfiguracji i obsłudze oraz mogą tworzyć nierealistyczne i bardzo zmienne warunki urazów spowodowane czynnikami środowiskowymi, odbiciami fal i złożonymi interakcjami ciśnień28.

Aby lepiej zbadać mechanizmy i skutki pojedynczych i powtarzających się uszkodzeń OUN w układzie zamkniętym oraz ich leczenia, w artykule przedstawiono modułową, przyjazną dla użytkownika, opłacalną i nieinwazyjną metodę. Głównym celem tego podejścia jest umożliwienie precyzyjnej kontroli i elastycznej modyfikacji parametrów urazu, w tym lokalizacji, ciężkości i czasu. Aby wesprzeć ten cel, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół budowy, kalibracji i rozwiązywania problemów z nadciśnieniowym systemem powietrznym, który odnosi się do niektórych ograniczeń istniejących urządzeń do uszkadzania ośrodkowego układu zamkniętego. System ten oferuje nie tylko opłacalność i minimalny czas konfiguracji, ale jest również bardzo wszechstronny, zapewniając spójne i powtarzalne wyniki, jednocześnie minimalizując problemy etyczne i maksymalizując znaczenie kliniczne. Ponadto opisano zdolność systemu do wywoływania szeregu uszkodzeń ośrodkowego układu zamkniętego w modelach mysich, a także jego potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach. Warto zauważyć, że celem tego manuskryptu jest zapewnienie ram, które umożliwią badaczom łatwe nabywanie, dostosowywanie i rozszerzanie tego systemu do ich konkretnych potrzeb, posuwając w ten sposób naprzód trwające badania nad urazami OUN. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki wykazujące skuteczność systemu w wywoływaniu urazów aksonalnych.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez 29,30,31,32 Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Vanderbilt oraz zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC) oraz Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Wszystkie myszy trzymano w grupach i utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność oraz dostarczano im pożywienie i wodę ad libitum. W protokole tym wykorzystano trzymiesięcznemyszy 30,31,33 C57 Bl/6.

1. Budowa systemu

  1. Zaopatrz się w dostępny na rynku pistolet do paintballa (patrz Tabela Materiałów), który ma zintegrowany regulator ciśnienia powietrza.
  2. W razie potrzeby zmodyfikuj lufę (Rysunek 1A).
    1. Jeśli oryginalna lufa jest wyposażona w otwory lub perforacje na całej jej długości, sprężone powietrze może wyciekać i rozpraszać się w powietrzu, zmniejszając maksymalny poziom ciśnienia wyjściowego. Wymień go, kupując solidną, nieokienną lufę, aby zwiększyć zakres ciśnienia wyjściowego (Rysunek 1, I).
    2. Jeśli oryginalna lufa jest długa i nieporęczna, skróć ją, kupując krótszą lufę o niestandardowej długości lub używając obcinaka do rur lub piły.
    3. Jeśli oryginalna lufa nie wytwarza pożądanego poziomu ciśnienia wyjściowego, zmodyfikuj średnicę wewnętrzną (rozmiar otworu) lufy, kupując lufę o niestandardowej średnicy otworu. Zmniejszenie średnicy oryginalnego rozmiaru otworu zwiększy zakres ciśnienia wyjściowego i odwrotnie.
  3. W razie potrzeby zmodyfikuj regulator (Rysunek 1B).
    1. Zdejmij nasadkę prowadzącą, aby zapewnić bezpośredni dostęp do regulacyjnej (Rysunek 1, II), jeśli oryginalny regulator jest dostarczany z nasadką prowadzącą.
    2. Wymień z imbusowym na z płaskim, jeśli oryginalna śruba regulacyjna jest dostarczana z gniazdem imbusowym.
  4. Wyjmij standardową ładowarkę grawitacyjną (tj. zbiornik do przechowywania i podawania kulek paintballowych do pistoletu) i uszczelnij pionową rurkę podającą (Rysunek 1, III), aby uniknąć wycieku ciśnienia.
    1. Upewnij się, że pistolet do paintballa jest rozładowany, a źródło powietrza (CO2 lub zbiornik sprężonego powietrza) jest odłączone przed wyjęciem ładowarki grawitacyjnej.
    2. Zlokalizuj szyjkę podającą (Rysunek 1C), w której zamocowana jest ładowarka grawitacyjna. Poluzuj szyjkę podającą clamp za pomocą odpowiedniego narzędzia.
    3. Wyjmij standardową ładowarkę grawitacyjną, pociągając ją do góry.
    4. Włóż osłonę szyjki podającej lub zatyczkę, aby uszczelnić otwór. Są one zazwyczaj dostępne w sklepach paintballowych lub online i są zaprojektowane tak, aby ściśle przylegały do szyjki paszy, uszczelniając ją.
  5. Zmontuj platformę (Rysunek 1D) dla pistoletu do paintballa i stołu do pozycjonowania zwierząt x-y.
    1. Zbuduj podstawę platformy, wycinając dwa kawałki płyty pilśniowej o średniej gęstości.
      UWAGA: W zależności od dostępności i preferencji materiałowych można również zastosować materiały alternatywne (np. sklejkę).
    2. Wytnij mniejszy, kwadratowy kawałek o wymiarach 1.5 x 1.5 stopy.
    3. Wytnij większy prostokątny kawałek o wymiarach 2.5 x 1.5 stopy.
    4. Podnieś i zabezpiecz mniejszą platformę 3,5 cala nad większą platformą za pomocą dwóch równoległych 2 x 4 s.
  6. Przymocuj zmodyfikowany pistolet do paintballa do platformy.
    1. Połóż pistolet do paintballa na boku na mniejszej platformie, tak aby koniec lufy wystawał pół cala poza krawędź.
    2. Zabezpiecz pistolet do paintballa za pomocą wsporników montażowych lub zacisków, które pasują do lufy i kolby pistoletu do paintballa.
    3. Podłącz zbiornik powietrza pod ciśnieniem (Rysunek 1E; patrz Tabela materiałów) do regulatora pistoletu do paintballa. Alternatywnie można podłączyć bezpośredni przewód ciśnieniowy ze zbiornika sprężonego azotu, aby zwiększyć zakres niezawodnych poziomów ciśnienia wyjściowego.
    4. Jeśli używasz zbiornika powietrza pod ciśnieniem, przymocuj go do płyty pilśniowej za pomocą wytrzymałego paska z tkaniny. Przymocuj pasek za pomocą lub i dołącz mechanizm regulacyjny ułatwiający napinanie i odkręcanie.
  7. Przymocuj stół pozycjonujący x-y do większego kawałka prostokątnej płyty pilśniowej naprzeciwko lufy pistoletu do paintballa za pomocą lub (Rysunek 1F).
    UWAGA: Tabelę pozycjonowania x-y (patrz tabela materiałów), znaną również jako stolik x-y, można zakupić u różnych dostawców, w tym sprzedawców internetowych, dostawców przemysłowych i dostawców sprzętu naukowego. Kupując stół pozycjonujący x-y, należy wziąć pod uwagę zakres ruchu, udźwig, precyzję oraz wybór między regulacją ręczną a sterowaniem zmotoryzowanym. Ten stół pozycjonujący x-y pozwoli na precyzyjny ruch i ustawienie zwierzęcia wzdłuż dwóch osi: osi x (poziomo w kierunku lub od beczki) oraz osi y (pionowo w górę lub w dół od lufy).
  8. Zmodyfikuj stół pozycjonujący x-y, instalując trzy zaciski z PVC.
    1. Zabezpiecz dwa zaciski PVC o grubości 1 cm po obu stronach przodu lufy za pomocą lub wkrętów. Upewnij się, że zaciski są wystarczająco szerokie, aby pomieścić uchwyt na zwierzę z kroków 1.9 i 1.10 (np. 1.5 cala).
    2. Zamocuj grubszy (4 cm) zacisk PVC prostopadle i naprzeciwko dwóch zacisków o grubości 1 cm za pomocą lub wkrętów. Upewnij się, że clamp jest wystarczająco szeroki, aby pomieścić przetwornik ciśnienia z kroku 2.4 (np. 1.5 cala).
    3. Wywierć dwa otwory w górnej części trzeciego zacisku i włóż dwie plastikowe w celu dodatkowej stabilizacji przetwornika ciśnienia podczas kalibracji systemu w kroku 2.
  9. Dostosuj wnętrze uchwytu na zwierzę (Rysunek 2A).
    1. Kup i wytnij kawałek rurki PVC (średnica zewnętrzna 35 mm, średnica wewnętrzna 26 mm, długość 6,75 cala) do wewnętrznej komory przechowawczej myszy.
    2. Utwórz prostokątny otwór (3 x 5 cm) w odległości 1 cala od końca rurki, aby odsłonić głowę myszy i górne tylne ramiona, podczas gdy reszta ciała pozostaje osłonięta.
      UWAGA: Jeśli miejsce urazu OUN znajduje się niżej na grzbiecie myszy (np. odcinek piersiowy lub lędźwiowy kręgosłupa), powiększ prostokątny otwór.
  10. Dostosuj zewnętrzną część uchwytu na zwierzę (Rysunek 2B).
    1. Kup i wytnij kawałek rurki PVC (średnica zewnętrzna 44 mm, średnica wewnętrzna 35 mm, długość 6 cali) na zewnętrzną komorę przechowawczą dla myszy.
    2. Skonstruuj otwór ekspozycyjny (Rysunek 2C) w zewnętrznej komorze przechowawczej, aby precyzyjnie kontrolować miejsce uszkodzenia OUN.
    3. Utwórz otwór posuwisto-zwrotny po przeciwnej stronie, aby włożyć cylinder przetwornika ciśnienia podczas kalibracji systemu w kroku 2 (np. otwór 9 mm).
  11. Zmodyfikuj zewnętrzną część uchwytu na zwierzę, aby pomieścić podawanie znieczulenia gazowego. Jeśli zamiast tego zostanie użyty środek znieczulający do wstrzykiwań, pomiń ten krok.
    1. Uszczelnij jeden koniec zewnętrznej części uchwytu na zwierzęta za pomocą taśmy. Upewnij się, że jest ściśle dopasowany, aby zapobiec wyciekowi gazu.
    2. Wykonaj mały otwór w uszczelce, aby wprowadzić linię anestezjologiczną.
    3. Ustaw linię anestezjologiczną tak, aby wprowadzić izofluran do otoczenia rurki bez bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem.

2. Kalibracja systemu

  1. Podłącz przetwornik ciśnienia (rysunek 2D; opcje znajdują się w tabeli materiałów ) do systemu akwizycji danych (DAQ) i komputera, aby przetłumaczyć odczyty ciśnienia fizycznego na dane cyfrowe.
    1. Podłącz przetwornik ciśnienia do modułu DAQ (patrz tabela materiałów), zapewniając prawidłową polaryzację i bezpieczne połączenia.
    2. Włóż moduł DAQ do obudowy DAQ (patrz tabela materiałów), aby umożliwić mu odbieranie zasilania i komunikację z komputerem.
    3. Użyj kabla USB, aby podłączyć obudowę DAQ do komputera.
    4. Upewnij się, że komputer ma zainstalowane niezbędne oprogramowanie i sterowniki do łączenia się ze sprzętem DAQ i pobierania danych (zobacz tabelę materiałów , aby zapoznać się z opcjami).
  2. Skonfiguruj ustawienia systemowe DAQ.
    1. Otwórz zainstalowane oprogramowanie DAQ.
    2. Upewnij się, że system DAQ jest rozpoznawany przez komputer.
    3. Zapoznaj się ze specyfikacją i arkuszami danych kalibracji dla konkretnego modułu/obudowy DAQ i przetwornika ciśnienia, a następnie skonfiguruj ustawienia systemu DAQ:
      UWAGA: Ustawienia DAQ dla sprzętu DAQ używanego w tym manuskrypcie są publicznie dostępne w serwisie GitHub. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Wejście analogowe: Wybierz fizyczny kanał wejściowy w module DAQ, do którego podłączony jest przetwornik ciśnienia.
      2. Źródło wzbudzenia (źródło Vex): Określ źródło wzbudzenia modułu DAQ (np. wewnętrzne lub zewnętrzne).
      3. Napięcie wzbudzenia (wartość Vex): Ustaw wartość vex na wartość określoną przez producenta przetwornika ciśnienia (np. 5 lub 10 V).
      4. Typ mostka: Wybierz odpowiedni typ mostka dla swojego modułu DAQ (np. pełny mostek, półmostek lub ćwierćmostek).
      5. Rezystancja mostka: Ustaw rezystancję mostka na wartość określoną przez producenta przetwornika ciśnienia (np. 350 ).
      6. Współczynnik kalibracji/Skalowanie niestandardowe: Skonfiguruj skalowanie na podstawie arkusza danych kalibracji dostarczonego przez producenta przetwornika ciśnienia. Producent kalibruje przetwornik ciśnienia, stosując znaną jednostkę fizyczną (psi) i mierząc wynikowe jednostki elektryczne (mV/V). Utwórz krzywą kalibracyjną, wykreślając znane jednostki fizyczne w stosunku do uzyskanych jednostek elektrycznych.
      7. Częstotliwość próbkowania (Hz): Ustaw częstotliwość próbkowania wystarczająco wysoką, aby uchwycić dynamikę zmian ciśnienia bez aliasingu (np. 1 lub 10 kHz w zależności od prędkości zmian ciśnienia w eksperymencie).
        UWAGA: Im węższy przebieg nadciśnienia powietrza (tj. im szybciej zmienia ciśnienie), tym szerszy zakres częstotliwości, który wzbudza, a tym samym wyższa musi być częstotliwość próbkowania. Jest to szczególnie ważne w eksperymentach obejmujących modele uszkodzeń OUN, w których zmiany ciśnienia mogą zachodzić szybko.
  3. Stwórz cyfrowe narzędzie w oprogramowaniu DAQ do pozyskiwania danych.
    UWAGA: To cyfrowe narzędzie będzie używane do dokładnego pomiaru, rejestrowania, wyświetlania i analizowania ciśnień wyjściowych systemu. Narzędzie cyfrowe użyte w tym manuskrypcie jest publicznie dostępne na GitHubie. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. Zaimplementuj algorytmy przetwarzania sygnału, aby filtrować, wzmacniać lub w inny sposób przetwarzać surowe dane z przetwornika.
    2. Dodaj narzędzia analityczne, aby obliczyć wskaźniki, takie jak ciśnienie szczytowe, średnie ciśnienie i czas trwania zdarzeń ciśnienia.
    3. Uwzględnij elementy wizualne (np. wykresy), aby pokazać dane dotyczące ciśnienia w czasie rzeczywistym oraz elementy sterujące do uruchamiania, zatrzymywania i resetowania gromadzenia danych.
    4. Zapisz narzędzie cyfrowe.
  4. Zmierz ciśnienie wyjściowe systemu
    1. Włóż przetwornik ciśnienia do grubego zacisku na stole x-y, a jego lufę przez otwór uchwytu na zwierzę (utworzony w kroku 1.10.3).
    2. Wyreguluj cylinder przetwornika ciśnienia, aż końcówka znajdzie się dokładnie w miejscu uszkodzenia OUN.
    3. Zabezpiecz przetwornik ciśnienia dwiema plastikowymi (zainstalowanymi w kroku 1.8.3).
  5. Uruchom narzędzie cyfrowe w oprogramowaniu do akwizycji danych, zwalniając spust pistoletu do paintballa, aby przechwycić, przeanalizować i zobrazować ciśnienie wyjściowe systemu.
  6. Wyreguluj regulacyjną, aż ciśnienie wyjściowe systemu osiągnie żądany poziom.
    UWAGA: Po zmodyfikowaniu lufy pistoletu do paintballa tak, aby była bez okien, o długości 1,5 cala i średnicy 6,5 mm, system jest w stanie niezawodnie dostarczać nadciśnienie powietrza w zakresie 15-50 psi w odległości 5 mm od przodu lufy34. Nadciśnienie powietrza poniżej 15 psi i powyżej 50 psi wykazuje dużą zmienność intensywności. Aby uzyskać kompleksowe przedstawienie ciśnienia wyjściowego systemu (psi) w funkcji ciśnienia wejściowego (psi), odległości od cylindra (cm) i czasu (ms), patrz rysunek 2 Hines-Beard i wsp.34. Używaj sprężonego azotu zamiast sprężonego powietrza, aby niezawodnie uzyskać nadciśnienie powietrza powyżej 50 psi za pomocą tego systemu.

3. Przygotowanie zwierząt i ekspozycja na nadciśnienie powietrza

  1. Znieczulij mysz izofluranem w komorze indukcyjnej z 1,5-3%30,31,32,33 izofluranem w tlenie, aż do całkowitego uspokojenia.
    1. Potwierdź znieczulenie, oceniając brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
    2. Przymocuj mysz w wewnętrznym uchwycie zwierzęcia tak, aby jej głowa i górne tylne ramiona były odsłonięte przez prostokątny otwór, podczas gdy grzbiet i dolne kończyny tylne pozostają osłonięte.
    3. Podeprzyj głowę myszy poduszką przymocowaną do nienaruszonego dolnego segmentu wewnętrznego uchwytu na zwierzę.
    4. Zabezpiecz mysz, nakładając taśmę chirurgiczną na górne tylne ramiona.
    5. Włóż wewnętrzny uchwyt na zwierzę do zewnętrznego uchwytu na zwierzęta.
    6. Otwórz wtórną linię anestezjologiczną do podawania izofluranu do wnętrza uchwytu na zwierzę.
    7. Umieść dodatkową poduszkę na końcu uchwytu na zwierzęta, aby zapobiec wyciekaniu środka znieczulającego z rurki i zapobiec przesuwaniu się myszy podczas wystawienia na działanie powietrza pod nadciśnieniem.
  2. Dopływ powietrza pod nadciśnieniem
    1. Dopasuj zewnętrzny okrągły otwór o średnicy 4 mm do zewnętrznego uchwytu na zwierzę bezpośrednio nad lewym okiem myszy.
    2. Ustaw uchwyt na zwierzę za pomocą pokręteł sterujących na stole x-y tak, aby jego otwór pokrywał się z lufą pistoletu do paintballa, a zewnętrzna powierzchnia znajdowała się 5 mm od końca lufy.
      UWAGA: Dostosuj odległość zwierzęcia od końca beczki, aby zmienić poziom powietrza nadciśnieniowego (psi) i kształt. Odsuń zwierzę dalej od beczki, aby obniżyć poziom powietrza pod nadciśnieniem i wytworzyć bardziej rozproszoną falę nadciśnieniową.
    3. Zainicjuj sekwencję powietrza pod nadciśnieniem, aby wywołać ITON:
      1. Dostarczyć dwa impulsy powietrza o nadciśnieniu 15 psi w odstępie 0,5 s powtarzane codziennie przez 3 dni 29,30,31,32.
        UWAGA: Podobny ITON można wywołać poprzez dostarczenie trzech kolejnych impulsów powietrza o ciśnieniu 15 psi w odstępach 0,5 s23. Stopień ITON, który powstaje po dostarczeniu sześciu kolejnych impulsów powietrza o ciśnieniu 15 psi w odstępach 0,5 s, pokazano tutaj w Reprezentatywnych wynikach.
      2. Wystaw pozorne myszy na hałas powietrza pod nadciśnieniem, ale nie na samo powietrze pod nadciśnieniem, obracając uchwyt zwierzęcia tak, aby otwór nie był już skierowany w stronę lufy i zablokuj powietrze tekturową osłoną.
  3. Odzyskiwanie myszy
    1. Pozwól myszom wyzdrowieć ze znieczulenia.
      1. Podawać nawilżające krople do oczu (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec wysuszeniu oczu po znieczuleniu.
      2. Zapewnij ciepło za pomocą kontrolowanego wspomagania grzewczego (patrz Tabela materiałów).
    2. Monitoruj wzrokowo myszy, dopóki nie utrzymają wyprostowanej postawy i nie będą normalnie chodzić. Pozwól im przebywać w towarzystwie swoich kolegów z klatki.
    3. Zapewnij wszystkim myszom narażonym na nadciśnienie powietrza żelowy pokarm regeneracyjny (patrz Tabela materiałów) przez pierwsze 3 dni po urazie, aby zapobiec utracie wagi.

4. Pobieranie i przetwarzanie tkanek

  1. Poddaj myszy eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu roboczego Avertin.
    1. Wytwarzać Avertin Stock, mieszając 10 g 2,2,2,-tribromoetanolu (patrz Tabela Materiałów) z 10 ml 1-Pentanolu (patrz Tabela Materiałów). Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj roztwór roboczy Avertin, łącząc 1,25 ml bulionu Avertin, 45 ml podwójnie destylowanej wody i 5 ml 10x PBS (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować, wysterylizować mieszaninę i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
  2. Perfuzja przezsercowa myszy z 4% paraformaldehydem (patrz Tabela materiałów) w 1x PBS (patrz Tabela materiałów).
  3. Wyłuszczyć oko wystawione na działanie powietrza pod nadciśnieniem za pomocą cienkich kleszczy (patrz Tabela materiałów) i nożyczek (patrz Tabela materiałów), upewniając się o zachowaniu nerwu wzrokowego (ON).
  4. Zbierz ON wraz z wyłuszczoną tkanką oka do dalszej analizy.
  5. Osmicate ON tkanka.
    1. Postfix ON tkankę na noc w 4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego (patrz Tabela Materiałów) w 1x PBS. W przypadku pracy z tkanką, która nie została perfuzjonowana (jak w kroku 4.2), postfiksuj przez 5 dni zamiast przez noc.
    2. Przenieś tkankę ON na 12- lub 24-dołkową płytkę (patrz Tabela Materiałów) za pomocą 1x PBS za pomocą pędzla (patrz Tabela Materiałów) lub ostrego drewnianego patyczka.
    3. W dygestorium zastąp 1xPBS 2% tetratlenkiem osmu (patrz tabela materiałów) w 0,2 M buforze kakodylowym (receptura jest publicznie dostępna na GitHubie. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) za pomocą pipety transferowej. Inkubować na lodzie przez 2 godziny.
    4. Wykonaj trzy prania za pomocą 1x PBS
      1. Odpady osmu należy odpowiednio wyrzucić.
      2. Pozostaw płytkę w dygestorii na dwie noce po trzecim myciu PBS.
  6. Odwodnić tkankę ON w serii stopniowanego etanolu.
    1. Przenieś nerwy na nową płytkę z 50% etanolem i inkubuj przez 30 minut.
    2. Zastąp 70% etanolem na 30 min.
    3. Zastąp 95% etanolem na 30 min.
    4. Zastąp 100% etanolem na 30 min.
  7. Osadź tkankę ON w epon.
    UWAGA: Przepis Epon jest publicznie dostępny na GitHubie. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się z materiałami wymienionymi w przepisie.
    1. Dzień 1: Przenieś tkankę do fiolki o pojemności 2 ml z tlenkiem propylenu (patrz tabela materiałów)/100% etanolem (1:1) i wstrząsaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp czystym tlenkiem propylenu i wstrząsaj przez 15 minut, powtarzając raz. Zastąp tlenkiem propylenu/eponem (1:1) i wstrząśnij przez noc w chłodni.
    2. Dzień 2: Przenieś tkankę na 12- lub 24-dołkową płytkę ze 100% epon i wstrząsaj przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Zastąp świeżym 100% eponem i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w próżni.
    3. Dzień 3: Powtórz inkubację epon, jak w dniu 2.
    4. Dzień 4: Przenieś tkankę do płaskiej formy ze 100% eponem, zmień orientację tkanki i umieść w piekarniku o temperaturze 60 °C na 48 godzin.
  8. Sekcja ON tkanka.
    1. Przytnij formy pod lunetą sekcyjną w podwójną piramidę z nerwem pośrodku.
    2. Zebrać przekroje o grubości 700 nm za pomocą ultramikrotomu i noża diamentowego (patrz Tabela materiałów).
    3. Zbierz skrawki na naładowanych szkiełkach mikroskopowych z białego szkła za pomocą wody destylowanej.
    4. Suszyć szkiełka w suszarce o temperaturze 60 °C, aż woda odparuje. Schłodzić w temperaturze pokojowej.
  9. Zaplamić tkankę.
    1. Zanurz szkiełka w 1% parafenylenodiaminie (PPD) (patrz tabela materiałów) w mieszaninie metanolu i 2-propanolu w stosunku 1:1 na 28 minut.
    2. Przepłukać szkiełka w dwóch kolejnych mieszaninach metanolu w stosunku 1:1 (patrz tabela materiałów) i 2-propanolu (patrz tabela materiałów) przez 1 minutę każda.
    3. Opłucz szkiełka w 100% etanolu przez 1 minutę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Umieścić szkiełka w wilgotnym pudełku i przykryć sekcje 1% błękitem toluidynowym (patrz Tabela materiałów) za pomocą pipety transferowej.
    5. Inkubować w suszarce o temperaturze 60 °C przez 20 minut.
    6. Opłucz szkiełka podwójnie destylowaną wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  10. Zamontuj i zobrazuj tkankę.
    1. Szkiełko nakrywkowe przesuwa się za pomocą nośnika montażowego (patrz Tabela metod), usuwając nadmiar nośnika.
    2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc.
    3. Obrazuj przekroje za pomocą mikroskopii jasnego pola z obiektywem zanurzeniowym 100x.
  11. Osadzanie, cięcie i immunohistochemiczne barwienie tkanki siatkówki.
    1. Postfix całą tkankę oka w 4% paraformaldehydzie przez 2-4 godziny.
    2. Krioprotektoratuj całą tkankę oka w 30% sacharozie (patrz Tabela materiałów w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Osadź tkankę oka w podłożu zamrażającym (patrz tabela materiałów).
    4. Zbierz przekroje siatkówki o grubości 10 μm na kriostacie i zamontuj skrawki na naładowanych szkiełkach mikroskopowych z białego szkła (patrz tabela materiałów).
    5. Przemyć szkiełka w 1x PBS i inkubować w buforze blokującym (5% Triton X-100 i 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (patrz Tabela Materiałów) w 1x PBS) z 5% normalną surowicą osła (NDS) (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    6. Inkubować szkiełka podstawowe przez noc w temperaturze 4 °C (lub w temperaturze pokojowej przez 4 godziny) w przeciwciałie pierwszorzędowym (patrz tabela materiałów) w 0,5% Triton X-100 (patrz tabela materiałów) w 1xPBS (PBT).
    7. Przemyć szkiełka w PBT i inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (patrz tabela materiałów) w buforze blokującym z 5% NDS.
    8. Umyj szkiełka w PBT, nałóż medium montażowe za pomocą DAPI (patrz Tabela Materiałów), szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci.
    9. Slajdy obrazu na mikroskopie epifluorescencyjnym.
    10. W przypadku ilościowego określania intensywności fluorescencji upewnij się, że obrazy są wykonywane z tego samego obszaru siatkówki z identycznymi ustawieniami powiększenia, wzmocnienia i ekspozycji.
  12. Licz na aksony.
    1. Ręcznie policz liczbę aksonów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów), pobierając próbki z 20% całkowitego obszaru przekroju poprzecznego nerwu za pomocą stałej nakładki siatki w celu oszacowania gęstości aksonów (aksony/mm2).
    2. Zmierz pole przekroju ON.
      1. Użyj funkcji Ustaw skalę , aby ustawić piksele/mikrony dla obiektywu używanego do obrazowania.
      2. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów , aby obrysować wzdłuż osłonki mielinowej nerwu wzrokowego, z wyłączeniem układu krwionośnego.
      3. Zmierz obszar ON za pomocą funkcji Measure .
      4. Określ 20% całkowitej powierzchni, mnożąc zmierzoną powierzchnię przez 0,2.
    3. Nałóż stałą siatkę na przekrój ON.
      1. Pobierz wtyczkę Counting Array.
        UWAGA: Ta wtyczka jest publicznie dostępna w serwisie GitHub. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Otwórz wtyczkę Counting Array, aby nałożyć stałą siatkę na przekrój poprzeczny, składającą się z 9 równomiernie rozmieszczonych kwadratów w kształcie znaku plus.
      3. Edytuj powierzchnię dla każdego z 9 regionów, dzieląc 20% całkowitej powierzchni przekroju ON (obliczonej w kroku 4.6.2.4) przez 9.
      4. Wyśrodkuj stałą siatkę tak, aby środek znaku plus był wyśrodkowany w środku przekroju ON.
    4. Policz żywe i degenerujące się aksony osobno.
      1. Pobierz i otwórz wtyczkę Cell Counter.
        UWAGA: Ta wtyczka jest publicznie dostępna w serwisie GitHub. Zainteresowani czytelnicy mogą uzyskać dostęp do repozytorium pod adresem https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Dla każdego z 9 regionów policz osobno liczbę żywych i degenerujących się profili aksonów, wizualizując stan osłonki mielinowej. Upewnij się, że kwantyfikacja aksonów jest przeprowadzana, gdy jest ślepy na grupę doświadczalną zwierzęcia, aby uniknąć stronniczości.
      3. W przypadku żywych aksonów szukaj tych, w których osłonka mielinowa wydaje się nienaruszona, jednolicie wybarwiona oraz gładko i równomiernie otoczona wokół aksonu.
      4. W przypadku zdegenerowanych aksonów szukaj tych z pogrubieniem, cebulą lub zapadnięciem się osłonki mielinowej.
      5. Jeśli akson jest częściowo odcięty przez nałożoną siatkę, uwzględnij go w liczbie aksonów tylko wtedy, gdy widoczny jest prześwit.
      6. Upewnij się, że podłużne aksony nie są przypadkowo liczone więcej niż raz i nie myl zanieczyszczeń lub kurzu z degenerującym się profilem aksonów.
    5. Przeprowadzaj analizy statystyczne w celu sprawdzenia znaczących różnic w średniej liczbie aksonów między grupami. Upewnij się, że w każdej grupie znajdują się co najmniej cztery ON, aby uwzględnić normalną zmienność zaobserwowaną w poprzednich analizach.
      1. Wykonaj test t dla prób niezależnych (znany również jako test t Studenta dla prób niezależnych), aby ocenić znaczące różnice między średnimi dwóch niezależnych grup.
      2. Przeprowadzić alternatywę nieparametryczną, test U Manna-Whitneya, jeśli nie mogą być spełnione warunki testu t dla prób niezależnych (tj. jeśli dane nie mają rozkładu normalnego lub wielkość próby jest zbyt mała).

Wyniki

Korzystając z opisanego tutaj systemu wytwarzania nadciśnienia powietrza, pośrednia traumatyczna neuropatia nerwu wzrokowego (ITON) została wywołana poprzez wystawienie lewego oka dorosłego (3-miesięcznego) samca myszy C57Bl / 6 (n = 4) na sześć kolejnych impulsów nadciśnienia powietrza 15 psi w odstępach 0,5 s. Zwierzęta pozorowane (n = 8; dane zaczerpnięte z Vest et al.33) zostały znieczulone, umieszczone w uchwycie na zwierzęta i wystawione na działanie dźwięku, ale nie powietrza pod nadciśnieniem.

Proksymalne nerwy wzrokowe zwierząt pozorowanych (ryc. 3A) wydawały się zdrowe z gęsto upakowanymi aksonami o jednolitej wielkości otoczonymi komórkami glejowymi o normalnej morfologii i rozmieszczeniu. Dla porównania, proksymalne nerwy wzrokowe myszy wystawionych na działanie ITON (tj. 6 kolejnych impulsów powietrza o wysokim ciśnieniu 15 psi oddzielonych odstępami 0,5 s) (Figura 3B) wydawały się degenerować z oznakami utraty aksonów, takimi jak zwiększone odstępy między pozostałymi aksonami, oznaki zwyrodnienia aksonów, w tym obrzęk, nieregularności w kształcie aksonu i rozpad osłonki mielinowej aksonów, i objawy glejozy, w tym przerost i przerost komórek glejowych. Testy U Manna-Whitneya potwierdziły istotną różnicę w całkowitej liczbie aksonów (p = 0,0040) (ryc. 3C) i profilach zwyrodnieniowych (p = 0,0028) (ryc. 3D) między ITON a myszami pozorowanymi. Wyniki te sugerują, że ITON znacznie zmniejsza całkowitą liczbę aksonów i znacznie zwiększa profile zwyrodnieniowe. Testy U Manna-Whitneya zostały przeprowadzone, ponieważ dane dla grupy ITON nie miały wystarczająco dużej wielkości próby dla testu t dla prób niezależnych.

Barwienie immunohistochemiczne przekrojów siatkówki anty-Iba1 (patrz tabela materiałów), markera mikrogleju (pierwotnych komórek odpornościowych ośrodkowego układu nerwowego), przeprowadzono zarówno na myszach pozorowanych (Figura 4A), jak i ITON (Figura 4B). Barwienie ujawniło, że mikroglej był w stanie spoczynku dla wszystkich myszy, charakteryzujący się małymi ciałami komórkowymi z długimi, cienkimi i silnie rozgałęzionymi procesami. Warto zauważyć, że u myszy ITON zaobserwowano zwiększoną liczbę mikrogleju (Figura 4B), co sugeruje proliferację mikrogleju w odpowiedzi na uraz. Ponadto u myszy ITON zaobserwowano, że mikroglej nienormalnie rozciąga się do zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), gdzie znajdują się ciała komórek fotoreceptorowych (Figura 4B). Kontrastuje to ze zwierzętami pozorowanymi (ryc. 4A), gdzie mikroglej był zlokalizowany w warstwie komórek zwojowych (GCL), wewnętrznej warstwie splotowatej (IPL), wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) i zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL) - warstwach, w których mikroglej zwykle znajduje się w zdrowej, nieuszkodzonej siatkówce.

Późniejsze barwienie immunohistochemiczne za pomocą anty-PKC-α (patrz tabela materiałów) i anty-synaptofizyny (patrz tabela materiałów), markerów odpowiednio dla pręcików komórek dwubiegunowych i synaps wstęgowych fotoreceptorów, ujawniło nienaruszone połączenia synaptyczne zarówno u myszy pozorowanych (Figura 5A), jak i ITON (Figura 5B). W szczególności zaobserwowano, że dendryty pręcików komórek dwubiegunowych rozciągają się i nakładają na zakończeniach synaptycznych fotoreceptorów pręcików. Odkrycie to kontrastuje z wczesnym badaniem35, które wykazało retrakcję dendrytów komórek dwubiegunowych pręcików w kierunku ich ciał komórkowych cztery tygodnie po ITON z dwóch kolejnych wybuchów nadciśnienia powietrza o ciśnieniu 15 psi (w odstępie 0,5 s) raz dziennie przez 3 dni. Rozbieżność ta może być przypisana różnym punktom czasowym pobierania tkanek między tymi dwoma badaniami. Obecne próbki zostały pobrane 2 tygodnie po ITON, w porównaniu do 4 tygodni po ITON we wcześniejszym badaniu. Chociaż w obecnej analizie nie wykryto żadnej synaptopatii, zauważyliśmy rozszerzenie procesów mikrogleju do ONL (Figura 4B), gdzie znajdują się ciała komórek fotoreceptorowych. Obserwacja ta sugeruje, że przerwanie połączeń synaptycznych między komórkami dwubiegunowymi a fotoreceptorami może pojawić się jako wtórny efekt urazu, podczas gdy utrata aksonów, degeneracja aksonów i glejoza stanowią pierwotne skutki uszkodzenia.

figure-results-1
Rycina 1: System do ogniskowego, zamkniętego uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego. Przerywane prostokąty na górnym obrazie są powiększone i pokazane jako B, C i A na dwóch poniższych obrazach (oznaczone białymi strzałkami). (A) Niestandardowa 1,5-calowa, niefenestralna lufa (I) na końcu pistoletu do paintballa. (B) Regulator ciśnienia ze zdjętą nasadką prowadzącą w celu odsłonięcia regulacyjnej (II). (C) Szyjka podająca ze zdjętą ładowarką grawitacyjną i zainstalowaną pokrywą szyjki podającej (III). (D) Platforma podstawowa składająca się z kawałka płyty pilśniowej o wymiarach 1,5 stopy x 1,5 stopy uniesionego nad większym kawałkiem płyty pilśniowej o wymiarach 2,5 stopy x 1,5 stopy. (E) Zbiornik sprężonego powietrza podłączony do regulatora ciśnienia pistoletu do paintballa i przymocowany do platformy z płyty pilśniowej za pomocą wytrzymałego paska. (F)x-y tabela pozycjonowania zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Niestandardowy uchwyt na zwierzę do ogniskowego dostarczania powietrza pod nadciśnieniem. (A) Wnętrze uchwytu na zwierzę składającego się z wąskiej rurki z PVC z prostokątnym otworem (3 x 5 cm) w celu odsłonięcia głowy zwierzęcia i górnej części tylnych ramion. (B) Na zewnątrz uchwytu na zwierzę, składająca się z szerszej rurki z PVC, do której wsuwa się węższa rurka z PVC, osłaniając całe ciało zwierzęcia z wyjątkiem odsłoniętej tkanki w otworze ekspozycji. (C) Otwór ekspozycyjny do ogniskowego dostarczania powietrza pod nadciśnieniem do miejsca uszkodzenia OUN będącego przedmiotem zainteresowania. (D) Przetwornik ciśnienia do kalibracji ciśnienia wyjściowego systemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: ITON ze względu na ogniskowe dostarczanie powietrza pod nadciśnieniem. Panie przewodniczący, panie i panowie! Reprezentatywne mikrofotografie jasnego pola przekrojów poprzecznych proksymalnego nerwu wzrokowego z (A) pozorowanego i (B) ITON. (C) Kwantyfikacja całkowitej liczby aksonów. (D) Kwantyfikacja profili aksonów zwyrodnieniowych. n = 4 dla ITON. n = 9 dla pozoru. Dane dotyczące liczby aksonów dla grupy pozorowanej zostały zaczerpnięte z Vest et al.33. **p < 0,005. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Podziałka = 20 μm. Skrót: ITON = pośrednia urazowa neuropatia nerwu wzrokowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Nieprawidłowa proliferacja mikrogleju i migracja do ONL z powodu indukowanego przez system ITON. (A,B) Reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne przekrojów siatkówki z znakowaniem anty-Iba1 mikrogleju (czerwony) od (A) zwierząt pozorowanych i (B) ITON. Podziałka = 100 μm. Skróty: ITON = pośrednia traumatyczna neuropatia nerwu wzrokowego; GCL = warstwa komórek zwojowych, INL = wewnętrzna warstwa jądrowa, ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Wczesna perseweracja połączeń synaptycznych między pręcikami dwubiegunowymi komórkami a fotoreceptorami z powodu indukowanego przez system ITON, pomimo potencjału opóźnionej synaptopatii. (A,B) Reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne przekrojów siatkówki z znakowaniem anty-synaptofizyną synaps wstęgowych fotoreceptorów (czerwony) i znakowaniem anty-PKC-α pręcików komórek dwubiegunowych (zielony) z (A) pozorowanego i (B) Zwierzęta ITON. Podziałka = 100 μm. Skróty: ITON = pośrednia traumatyczna neuropatia nerwu wzrokowego; PKC = kinaza białkowa C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego jest przydatnym narzędziem do badania uszkodzeń OUN w układzie zamkniętym w modelach mysich. Reprezentatywne wyniki przykładowego eksperymentu pokazują, że ogniskowe dostarczanie powietrza pod nadciśnieniem za pomocą tego systemu może skutecznie indukować ITON, powodując znaczną utratę aksonów i zwyrodnienie. Podkreśla to zdolność systemu do wytwarzania precyzyjnych i powtarzalnych uszkodzeń OUN.

Jedną z głównych zalet tego systemu jest jego możliwość dostosowania do wywoływania szeregu urazów OUN. Stopień urazu można regulować, modyfikując ogólne ciśnienie wyjściowe systemu, odległość zwierzęcia od końca beczki za pomocą stolika pozycjonowania x-y, rozmiar i kształt otworu ekspozycji, liczbę ekspozycji na powietrze pod nadciśnieniem oraz odstęp między ekspozycjami. Dodatkowo lokalizację urazu OUN można dostosować, modyfikując położenie otworu ekspozycyjnego w uchwycie na zwierzę. Ta wszechstronność umożliwiła systemowi wytwarzanie spektrum uszkodzeń OUN w układzie zamkniętym w modelach mysich. Początkowo system był używany do modelowania urazów w kuli zamkniętej, koncentrując się na uszkodzeniach przednich i tylnych biegunów oraz związanych z nimi deficytach34,36, w tym wpływie odpowiedzi układu odpornościowego37, wynikach specyficznych dla szczepu38 oraz skuteczności środków neuroprotekcyjnych39. Ostatecznie aplikacja ta została rozszerzona o ocenę następstw powtarzających się ekspozycji skierowanych do oka w celu modelowania pośredniej urazowej neuropatii nerwu wzrokowego (ITON)30 i zbadania wpływu liczby i odstępu między powtarzającymi się ekspozycjami33. Od tego czasu zastosowanie systemu rozszerzyło się na model łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI) za pomocą ekspozycji skierowanej na głowę40,41 oraz uszkodzenia rdzenia kręgowego zamkniętego ciała (SCI) za pomocą ekspozycji skierowanej na grzbiet42, podkreślając zdolność adaptacyjną i wszechstronność urządzenia w badaniu różnych domen uszkodzenia OUN.

Podczas korzystania z tego systemu konieczne jest podjęcie działań mających na celu zminimalizowanie zmienności wyników urazów, aby zapewnić odtwarzalność i wiarygodność wyników eksperymentalnych. Kluczowe środki obejmują kalibrację poziomów ciśnienia wyjściowego systemu przed i po każdej serii trzech ekspozycji w celu zapewnienia stałego dostarczania ciśnienia. Chociaż zmienność jest niewielka, gdy system pracuje przy ciśnieniu od 15 psi do 50 psi przy użyciu sprężonego powietrza34, konsekwentna kalibracja pomaga wykryć nieoczekiwane błędy, takie jak niski poziom naładowania baterii lub niski poziom powietrza. Dodatkowo umieść każde zwierzę w tej samej odległości od końca beczki, aby zapewnić stałą wielkość nadciśnienia, ponieważ intensywność fali ciśnienia zmniejsza się wraz z odległością. Jednolite ustawienie zapewnia również, że każde zwierzę jest dotknięte tą samą częścią fali powietrznej. Co więcej, równomierne zabezpieczenie zwierząt w uchwycie zapewnia, że tkanka będąca przedmiotem zainteresowania jest konsekwentnie ukierunkowana, zwłaszcza w modelach wielokrotnego narażenia, gdy istnieje ryzyko przemieszczania się. Wreszcie, jednolitość wieku, płci i tła genetycznego zwierząt ma kluczowe znaczenie, ponieważ czynniki te wpływają na reakcję na uraz. Na przykład w poprzednich badaniach z użyciem tego systemu porównano wpływ powietrza pod nadciśnieniem skierowanym do oczu na różne szczepy myszy, podkreślając znaczące różnice w reakcji na uraz między myszami C57Bl/6J36, DBA/2J37 i Balb/c38 . Myszy DBA / 2J i Balb / c wykazywały poważniejsze patologie przedniego bieguna, większe uszkodzenia siatkówki, wyższy stres oksydacyjny i wyraźniejsze reakcje neurozapalne w porównaniu z myszami C57Bl / 6J, przy czym myszy Balb / c wykazywały szczególnie solidne i trwałe profile urazów38.

Rozwiązywanie problemów z systemem
Jeśli wartości ciśnienia są nietypowo niskie dla danego ustawienia manometru, pociągnij za spust 5-10x, pozwalając powietrzu przepływać przez układ i regulatorowi dostosować się do nowego ustawienia. W zbiorniku powietrza nie może być żadnych nieszczelności. O-ring na zbiorniku powietrza nie może być uszkodzony ani zużyty, zbiornik powietrza powinien mieć wystarczającą ilość powietrza, a bateria pistoletu nie powinna być wyczerpana. Stół x-y nie powinien był odchylić się od swojego zwykłego położenia od końca lufy, a otwór ekspozycji na nadciśnienie powietrza powinien być ustawiony w jednej linii z lufą pistoletu i nie zasłaniać jej. Regulator powinien być mocno przymocowany do uchwytu pistoletu. Jeśli wartości ciśnienia są zbyt niskie pomimo użycia najwyższego ustawienia na manometrze, manometru nie wolno zwiększać powyżej 200 psi, a ustawienie prędkości na pistolecie należy ustawić na maksymalne ustawienie. Jeśli ustawienia ciśnienia są niespójne (np. wysokie, a następnie niskie), upewnij się, że zbiornik powietrza ma wystarczającą ilość powietrza, regulator jest mocno przymocowany do uchwytu pistoletu, nie ma nieszczelności w zbiorniku powietrza i że jest on mocno przykręcony, a O-ring na zbiorniku powietrza nie jest uszkodzony ani zużyty.

Aby w pełni zrozumieć możliwości tego systemu, ważne jest rozpoznanie jego ograniczeń. Naśladowanie rzeczywistych scenariuszy w warunkach laboratoryjnych pozostaje wyzwaniem. Chociaż system ten wytwarza powietrze pod nadciśnieniem, nie odtwarza złożonej dynamiki zdarzenia wybuchowego, takiej jak zmienne gradienty ciśnienia i temperatury, obecność odłamków i odbitych fal oraz wielofazowy charakter. Ponadto nie naśladuje kształtu fali Friedlandera ("pierwotnej fali uderzeniowej"), która charakteryzuje się ostrym, niemal natychmiastowym szczytem ciśnienia, po którym następuje szybki wykładniczy zanik, który spada poniżej ciśnienia otoczenia przed powrotem do linii bazowej43. Kształt fali wytwarzany przez ten system reprezentuje raczej prostszy, bardziej symetryczny profil, w którym występuje bardziej stopniowy wzrost i spadek ciśnienia bez wyraźnej fazy ujemnej (patrz rysunek 2C w Hines-Beard i wsp.34). Nieco korzystnie jest to, że ten kształt fali łączy w sobie elementy zarówno obrażeń wybuchowych, jak i. "Impuls ciśnieniowy" w kształcie dzwonu zapewnia stałe uderzenie nadciśnienia, podobne do "ściany powietrza" uderzającej w obiekt. Jednak nadciśnienie powietrza dostarczane przez falę jest również kluczowym aspektem charakterystycznym dla urazów spowodowanych wybuchem. Niektórzy mogą twierdzić, że chociaż ten kształt fali obejmuje aspekty obu typów urazów, nie oddaje w pełni złożoności żadnego z nich. Jednak ten spójny i powtarzalny "impuls ciśnienia" jest idealny do kontrolowanych eksperymentów w warunkach laboratoryjnych w celu zbadania ogniskowego uszkodzenia OUN w układzie zamkniętym. Już wcześniej wykazaliśmy ogniskowy charakter urazu. Na przykład ekspozycja na jedno oko nie powoduje uszkodzenia pierwotnego nabłonka nosa lub mózgu44. Ponadto, gdy jest skierowany na bok głowy myszy, dotknięty jest niewielki obszar mózgu45. Wreszcie, energia z nadciśnienia powietrza z tego systemu na poziomie ciśnienia używanym w ITON nie wpływała na mysz, chyba że powtarzała się w krótkim odstępie czasu33. W związku z tym ciśnienie nie jest szkodliwe i dlatego nie replikuje siły od strony strumienia. Co więcej, nawet przy wielokrotnym narażeniu oka na nadciśnienie powietrza nie stwierdzono wpływu na struktury przedniego oka33. Znaczne zwyrodnienie nerwu wzrokowego i utrata wzroku występowały tylko przy wielokrotnym narażeniu z odstępem między ekspozycjami krótszymi niż 1 min33.

W porównaniu z innymi urządzeniami laboratoryjnymi do tworzenia urazów OUN w układzie zamkniętym, system ten oferuje wyjątkowe korzyści. Może dostarczać sekwencyjne wyrzuty powietrza pod nadciśnieniem w krótkich odstępach czasu (w odstępach 0,5 s)33, naśladując warunki panujące w środowiskach zawodowych wysokiego ryzyka, w których narażenie na gwałtowne wybuchy jest częstym zagrożeniem. Na przykład personel wojskowy, zarówno w scenariuszach szkoleniowych, jak i bojowych, używa wielu automatycznych broni palnych zdolnych do szybkiego, powtarzalnego strzelania, w tym karabinów automatycznych (np. M16, AK-47), karabinów maszynowych (np. M2 kalibru .50), karabinów Gatlinga i minigunów. Inne wolniejsze, ale powtarzalne bronie używane przez personel wojskowy to artyleria, moździerze, granaty i improwizowane urządzenia wybuchowe (IED). Robotnicy rozbiórkowi zaangażowani w kontrolowane wyburzenia i górnicy zaangażowani w operacje strzałowe mające na celu rozdrobnienie skał i wydobycie minerałów również doświadczają sekwencyjnych wybuchów w krótkich odstępach czasu. Wreszcie, pracownicy budowlani używający narzędzi pneumatycznych, kafarów lub innego ciężkiego sprzętu, który generuje potężne siły udarowe, mogą doświadczać szybkich, powtarzających się uderzeń, które naśladują ekspozycję na wybuch. Warto zauważyć, że szybkie dostarczanie powietrza pod nadciśnieniem nie jest możliwe w przypadku urządzeń takich jak rurki uderzeniowe, które wymagają rozległej rekonfiguracji lub ponownego zwiększania ciśnienia między każdym zdarzeniem. Rurki uderzeniowe wykorzystują membrany, które pękają, aby wytworzyć fale uderzeniowe, a po każdym pęknięciu membranę należy wymienić. Proces ten wymaga czasu, ponieważ rurka uderzeniowa musi zostać otwarta, zużyta membrana usunięta, zainstalowana nowa membrana, a system dał czas na zresetowanie i ponowne zwiększenie ciśnienia. Dlatego, szczególnie w przypadku badań oceniających uszkodzenie OUN po szybkim, powtarzającym się narażeniu na podmuch, idealny jest system, który nie wymaga rozległej rekonfiguracji lub ponownego zwiększania ciśnienia między każdym zdarzeniem.

Przyszłe zastosowania tego modulacyjnego, przyjaznego dla użytkownika i ekonomicznego systemu są obiecujące. Wykorzystując swoje elastyczne i unikalne cechy, system ten otwiera kilka obiecujących możliwości dla przyszłych przedklinicznych badań terapeutycznych. Jego zdolność do dostarczania szybkich, sekwencyjnych wyrzutów powietrza pod nadciśnieniem może być wykorzystana do badania skumulowanych skutków powtarzających się ekspozycji na wybuchy, co jest istotne dla zrozumienia przewlekłej encefalopatii pourazowej i innych długotrwałych schorzeń neurodegeneracyjnych. Ponadto system ten może być wykorzystany do zbadania skuteczności różnych interwencji farmakologicznych mających na celu złagodzenie urazów OUN w układzie zamkniętym, w tym czasu i dawkowania leków neuroprotekcyjnych w celu określenia optymalnych okien leczenia. Co więcej, precyzja systemu w naśladowaniu aspektów mechanizmów urazów spowodowanych i wybuchowym pozwala na opracowanie kompleksowych modeli urazów, które odzwierciedlają złożoną traumę doświadczaną przez osoby w rzeczywistych scenariuszach. Może to ułatwić testowanie terapii multimodalnych, które dotyczą powszechnych globalnych aspektów urazów, takich jak stan zapalny, stres oksydacyjny i śmierć neuronów. Ogólnie rzecz biorąc, urządzenie to oferuje wszechstronną i potężną platformę do pogłębiania naszej wiedzy na temat urazów OUN w układzie zamkniętym i opracowywania skutecznych interwencji terapeutycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez fundusze z NIH NEI P30 EY008126, Potocsnak Discovery Grant in Regenerative Medicine, Ret. Major. General Stephen L. Jones, MD Fund oraz Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds (VEI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-PentanolFisher NaukowyAC160600250Służy do wytwarzania roztworu Avertin 
2,2,2-trybometanolSigma AldrichZobacz materiał T48402Służy do wytwarzania roztworu Avertin 
Płytki 24-dołkowe z pokrywkąFirma VWR76520-634Płytka 24-dołkowa
2-Propanol Fisher NaukowyA451-1 
50 kS/s/kanał Mostek wejść analogowych Instrumenty krajoweNI-9237Moduł DAQ
Albumina frakcji bydlęcej V (BSA) Międzynarodowe Targi Produktów Badawczych A30075 powiedział:BSA
Przeciwciało pierwotne anty-Iba1 (kozie poliklonalne) Biblioteka ab5076 powiedział:Marker mikrogleju, stosowany w stężeniu 1:500 
Przeciwciało pierwotne anty-synaptofizyny (mysie przeciwciało monoklonalne) Biblioteka ab8049 powiedział:Marker synaps wstęgowych fotoreceptorów, stosowany w stężeniu 1:20
Araldit GY 502 Nauki o mikroskopii elektronowej10900
Bufor kakodylowyNauki o mikroskopii elektronowej11652
Kanister z filtrem węglowymSystemy E-ZEZ-258Zbiórka odpadów anestezjologicznych
Przezroczysty H20 DietGel 76AWyczyść H2O 72-07-5022Używany po wybuchu do pomocy w rekonwalescencji zwierząt
Podwozie CompactDAQInstrumenty krajoweZłącze USB-9162 (USB-9162)Podwozie DAQ
Sprężone powietrzeA-L GazGSMCA300 Służy do napełniania zbiornika powietrza pod ciśnieniem
DAPI Fluoromount-G Południowa biotechnologiaNośniki montażowe za pomocą DAPI
Nóż diamentowyMicro Star Technologies, Grupa Bruker Nano, Inc. Do cięcia nerwów wzrokowych, 3 mm/45 stopni/Styl H 
Przeciwciało drugorzędowe anty-kozie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alex Fluor 594Invitrogen (Dostawca: Fisher Scientific)A-11058Przeciwciało drugorzędowe dla mikrogleju, stosowane w stężeniu 1:200
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko mysim przeciwciałom przeciw myszym, Alex Fluor 594Invitrogen (Dostawca: Fisher Scientific)A-21203Przeciwciało drugorzędowe dla synaps wstęgowych fotoreceptorów, stosowane w stężeniu 1:200
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi IgG (H + L), Alex Fluor 488Invitrogen (Dostawca: Fisher Scientific)A-21206Przeciwciało drugorzędowe dla pręcików komórek dwubiegunowych, stosowane w stężeniu 1:200 
Serum osła Sigma Aldrich Zobacz materiał D9662NDS
Dumont #3 KleszczeNarzędzia naukowe11231-30Cienkie kleszczyki do enukleacji całego oka 
Etanol (200 proof) KOPTEC (Dostawca: VWR) 89125-188Alkohol etylowy 
Fluoromount-G Invitrogen (Dostawca: Fisher Scientific)00-4958-02Nośniki montażowe
Żel okulistyczny Genteal TearsChciwość72359Smar do oczu zapobiegający wysuszaniu oczu podczas/po znieczuleniu 
Aldehyd glutarowyNauki o mikroskopii elektronowej16200
Butla z podziałką 1000 mlFisher Naukowy08-572G
Butla z podziałką 250 mlFisher Naukowy08-572E
Butla z podziałką 500 mlFisher Naukowy08-572F
Poduszka grzewcza Naukowe drzewo mózgówAP-R 26EKontrolowane wspomaganie ogrzewania
Wysokociśnieniowa stacja napełnianiaNinja PaintballSystem plików HPFSV2Służy do napełniania zbiornika powietrza pod ciśnieniem
ObrazJNarodowe Instytuty Zdrowia Oprogramowanie do analizy obrazu
Odwrócenie MiniImperium PaintballPistolet do paintballa
IzofluranChciwość29405Znieczulenie wziewne
Waporyzator izofluranuWyposażenie weterynaryjne901806Znieczulenie zwierząt
Pompa MasterflexCole'a-ParmeraSłuży do perfuzji zwierzęcej
Metanol Sigma Aldrich322415-2L 
Szkiełka mikroskopoweGlobus Naukowy1358 WSzkiełka mikroskopowe z białego szkła
Eksplorator pomiarów i automatyzacji NI (NI MAX) Instrumenty krajoweOprogramowanie do konfiguracji ustawień systemowych DAQ
Sterowniki NI-DAQmx Instrumenty krajoweSterownik do współpracy z systemem DAQ 
Mikroskop Nikon Eclipse Ni-EInstrumenty firmy Nikon
Tetrtlenek osmu 2%Nauki o mikroskopii elektronowej19152
Paraformaldehyd 32%Nauki o mikroskopii elektronowej15714-SPFA rozcieńczony do 4%
Parafenylenodiamina Sigma AldrichZobacz materiał P6001
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher Naukowy70011044PBS rozcieńczony do 1x
Tlenek propylenu Nauki o mikroskopii elektronowej20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminiowy zbiornik o wartości 3000 psiNinja PaintballZbiornik powietrza pod ciśnieniem
Butelka do przechowywania multimediów wielokrotnego użytku Pyrex 1000 mlFisher Naukowy06-414-1D
Butelka do przechowywania multimediów wielokrotnego użytku Pyrex 500 mlFisher Naukowy06-414-1C
Butelki do przechowywania multimediów wielokrotnego użytku Pyrex 250 mlFisher Naukowy06-414-1B
Rekombinowane przeciwciało pierwszorzędowe anty-PKC-a (monoklonalne królika) Biblioteka ab32376 powiedział:Marker do pręcików komórek dwubiegunowych, stosowany w stężeniu 1:500 
Żywica 812Nauki o mikroskopii elektronowej14900
Przetwornik ciśnienia serii TJE, 100 psi Honeywell 060-0708-10TJGWeź pod uwagę zakres przy wyborze przetwornika ciśnienia, aby zoptymalizować rozdzielczość pomiarów 
SacharozaSigma AldrichS5016 powiedział:
Przetwornik ciśnienia Super TJE, 7500 psi Honeywell Weź pod uwagę zakres przy wyborze przetwornika ciśnienia, aby zoptymalizować rozdzielczość pomiarów 
Zestaw strzykawka/igłaCovetrus 60728Strzykawka/igła do wykonywania iniekcji IP
Związek Tissue-Plus OCTFisher Naukowy23-730-571 Medium do zamrażania 
Błękit toluidynowyFisher NaukowyZobacz materiał BP107-10
Tryton X-100Sigma AldrichZobacz materiał T8787 TGL
Stół UniSlide XYVelmex Seria AXY40Stół pozycjonujący XY 
Pędzel uniwersytecki - seria 233 - okrągły, rozmiar 000Winsor i Newton Pędzel
Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2.5 mmNarzędzia naukowe15000-08Nożyczki do enukleacji całego oka
Instrument wirtualnyInstrumenty krajowe Cyfrowe narzędzie do akwizycji danych 

Bibliografia

  1. Schneiderman, A. I., Braver, E. R., Kang, H. K. Understanding sequelae of injury mechanisms and mild traumatic brain injury incurred during the conflicts in Iraq and Afghanistan: Persistent postconcussive symptoms and posttraumatic stress disorder. Am J Epidemiol. 167 (12), 1446-1452 (2008).
  2. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: Preliminary findings in a us army brigade combat team. J Head Trauma Rehabil. 24 (1), 14-23 (2009).
  3. Morissette, S. B., et al. Deployment-related tbi, persistent postconcussive symptoms, ptsd, and depression in oef/oif veterans. Rehabil Pyschol. 56 (4), 340(2011).
  4. Cooper, D. B., et al. Treatment of persistent post-concussive symptoms after mild traumatic brain injury: A systematic review of cognitive rehabilitation and behavioral health interventions in military service members and veterans. Brain Imaging Behav. 9, 403-420 (2015).
  5. Elder, G. A. Update on tbi and cognitive impairment in military veterans. Curr Neurol Neurosci Rep. 15 (10), 68(2015).
  6. Vincent, A. S., Roebuck-Spencer, T. M., Cernich, A. Cognitive changes and dementia risk after traumatic brain injury: Implications for aging military personnel. Alzheimers Dement. 10, S174-S187 (2014).
  7. St Onge, P., Mcilwain, D. S., Hill, M. E., Walilko, T. J., Bardolf, L. B. Marine corps breacher training study: Auditory and vestibular findings. US Army Med Dep J. , 97-107 (2011).
  8. Capó-Aponte, J. E., et al. Effects of repetitive low-level blast exposure on visual system and ocular structures. J Rehabil Res Dev. 52 (3), 273-290 (2015).
  9. Tate, C. M., et al. Serum brain biomarker level, neurocognitive performance, and self-reported symptom changes in soldiers repeatedly exposed to low-level blast: A breacher pilot study. J Neurotrauma. 30 (19), 1620-1630 (2013).
  10. Carr, W., et al. Repeated low-level blast exposure: A descriptive human subjects study. Mil Med. 181 (suppl_5), 28-39 (2016).
  11. Caplan, B., et al. Relation of repeated low-level blast exposure with symptomology similar to concussion. J Head Trauma Rehabil. 30 (1), 47-55 (2015).
  12. Woodall, J. L., et al. Repetitive low-level blast exposure and neurocognitive effects in army ranger mortarmen. Mil Med. 188 (3-4), e771-e779 (2023).
  13. Stone, J. R., et al. Functional and structural neuroimaging correlates of repetitive low-level blast exposure in career breachers. J Neurotrauma. 37 (23), 2468-2481 (2020).
  14. Gavett, B. E., Stern, R. A., Cantu, R. C., Nowinski, C. J., Mckee, A. C. Mild traumatic brain injury: A risk factor for neurodegeneration. Alzheimers Res Ther. 2, 1-3 (2010).
  15. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive tbi: Substrates of dementia. Nat Rev Neurol. 9 (4), 211-221 (2013).
  16. Juan, S. M., Daglas, M., Adlard, P. A. Tau pathology, metal dyshomeostasis and repetitive mild traumatic brain injury: An unexplored link paving the way for neurodegeneration. J Neurotrauma. 39 (13-14), 902-922 (2022).
  17. Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. Spinal cord injury: Current mammalian models. Am J Neurosci. 4 (1), 1-12 (2013).
  18. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  19. Khalin, I., et al. A mouse model of weight-drop closed head injury: Emphasis on cognitive and neurological deficiency. Neural Regen Res. 11 (4), 630-635 (2016).
  20. Jamnia, N., et al. A clinically relevant closed-head model of single and repeat concussive injury in the adult rat using a controlled cortical impact device. J Neurotrauma. 34 (7), 1351-1363 (2017).
  21. Mishra, V., et al. Primary blast causes mild, moderate, severe and lethal tbi with increasing blast overpressures: Experimental rat injury model. Sci Rep. 6 (1), 1-14 (2016).
  22. Hu, C. -K., Chen, M. -H., Wang, Y. -H., Sun, J. -S., Wu, C. -Y. Integration of multiple prognostic predictors in a porcine spinal cord injury model: A further step closer to reality. Front Neurol. 14, 1136267(2023).
  23. Lim, J. -H., et al. Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression. J Vet Sci. 8 (1), 89(2007).
  24. Fukuda, S., et al. New canine spinal cord injury model free from laminectomy. Brain Res Protoc. 14 (3), 171-180 (2005).
  25. Norris, C., et al. A closed-body preclinical model to investigate blast-induced spinal cord injury. Front Mol Neurosci. 16, 1199732(2023).
  26. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  27. Osier, N. D., Dixon, C. E. The controlled cortical impact model: Applications, considerations for researchers, and future directions. Front Neurol. 7, 214364(2016).
  28. Chen, Y., Constantini, S. Caveats for using shock tube in blast-induced traumatic brain injury research. Front Neurol. 4, 117(2013).
  29. Bernardo-Colón, A., et al. Antioxidants prevent inflammation and preserve the optic projection and visual function in experimental neurotrauma. Cell Death Dis. 9 (11), 1097(2018).
  30. Bernardo-Colón, A., et al. Progression and pathology of traumatic optic neuropathy from repeated primary blast exposure. Front Neurosci. 13, 719(2019).
  31. Thomas, C. N., et al. Assessment of necroptosis in the retina in a repeated primary ocular blast injury mouse model. Exp Eye Res. 197, 108102(2020).
  32. Naguib, S., Bernardo-Colón, A., Rex, T. S. Intravitreal injection worsens outcomes in a mouse model of indirect traumatic optic neuropathy from closed globe injury. Exp Eye Res. 202, 108369(2021).
  33. Vest, V., Bernardo-Colón, A., Watkins, D., Kim, B., Rex, T. S. Rapid repeat exposure to subthreshold trauma causes synergistic axonal damage and functional deficits in the visual pathway in a mouse model. J Neurotrauma. 36 (10), 1646-1654 (2019).
  34. Hines-Beard, J., et al. A mouse model of ocular blast injury that induces closed globe anterior and posterior pole damage. Exp Eye Res. 99, 63-70 (2012).
  35. Naguib, S., Bernardo-Colon, A., Cencer, C., Rex, T. S. Galantamine confers neuroprotection in a model of indirect traumatic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (9), 4407-4407 (2019).
  36. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Molecular changes and vision loss in a mouse model of closed-globe blast trauma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 4853-4862 (2014).
  37. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., D'surney, L., Rex, T. S. Exacerbation of blast-induced ocular trauma by an immune response. J Neuroinflammation. 11 (1), 1-15 (2014).
  38. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Eye-directed overpressure airwave-induced trauma causes lasting damage to the anterior and posterior globe: A model for testing cell-based therapies. J Ocul Pharmacol Ther. 32 (5), 286-295 (2016).
  39. Bricker-Anthony, C., et al. Erythropoietin either prevents or exacerbates retinal damage from eye trauma depending on treatment timing. Optom Vis Sci. 94 (1), 20-32 (2017).
  40. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2(2014).
  41. Guley, N. H., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury using focal primary overpressure blast to the cranium in mice. J Neurotrauma. 33 (4), 403-422 (2016).
  42. Del Mar, N., et al. A novel closed-body model of spinal cord injury caused by high-pressure air blasts produces extensive axonal injury and motor impairments. Exp Neurol. 271, 53-71 (2015).
  43. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374 (9687), 405-415 (2009).
  44. Bricker-Anthony, C., Rex, T. S. Neurodegeneration and vision loss after mild blunt trauma in the c57bl/6 and dba/2j mouse. PLoS One. 10 (7), e0131921(2015).
  45. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zamkni ty uk ad urazu OUNurazowa neuropatia nerwu wzrokowegosystem nadci nienia powietrznegoogniskowy uraz m zguuraz rdzenia kr gowegomodele uraz w zwierz cychdegeneracja akson wproliferacja mikroglejudegeneracja wt rnakontrola stopnia ci ko ci urazu
System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.