Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę natychmiastowego usuwania części kompleksów cumulus-oocyt po pobraniu komórek jajowych, aby przyspieszyć proces obserwacji IVF, skracając czas potrzebny na usunięcie komórek ziarnistych, minimalizując narażenie oocytów na czynniki zewnętrzne i nie utrudniając rozwoju zarodka, ostatecznie poprawiając efektywność procedur laboratoryjnych IVF.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Natychmiastowe częściowe usunięcie kompleksów cumulus-oocyty: wyrafinowane podejście do szybkiej obserwacji zapłodnienia in vitro
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo szybkiego postępu w klinicznych i laboratoryjnych technologiach zapłodnienia in vitro (IVF), znaczna część (10%-15%) pacjentów nadal doświadcza zaburzeń zapłodnienia, co prowadzi do niskich wskaźników zapłodnienia i produkcji niezdolnych do życia zarodków. Zapłodnienie krótkoterminowe polega na wczesnym usunięciu komórek ziarnistych w celu obserwacji ekstruzji drugiego ciała polarnego, co umożliwia ocenę nawożenia i wczesne środki zaradcze w celu rozwiązania problemu niskich wskaźników nawożenia i całkowitego niepowodzenia nawożenia. Jednak obserwacja krótkotrwałego zapłodnienia w in vitro jest utrudniona przez wyzwania, takie jak zbyt duże nieprzetworzone skupiska kompleksów wzgórek-oocyty i adhezja między komórkami jajowymi, konieczność skomplikowanych procedur zewnętrznych w celu usunięcia komórek ziarnistych oraz wydłużony czas obserwacji. Aby rozwiązać ten problem, w badaniu zaproponowano metodę natychmiastowego częściowego usunięcia komórek ziarnistych po pobraniu komórek jajowych. Takie podejście usprawnia kolejne etapy krótkotrwałego nawożenia i tradycyjnego monitorowania nawożenia, skraca czas potrzebny na ekstruzję oocytów, minimalizuje prawdopodobieństwo zewnętrznego wpływu środowiska na oocyty oraz zmniejsza ryzyko pominięcia krytycznego okna obserwacyjnego zapłodnienia. W związku z tym badanie dostarczyło nowych dowodów klinicznych mających na celu zwiększenie efektywności operacyjnej laboratoriów embrionalnych w zapłodnieniu in vitro.
Wprowadzenie
W dziedzinie zapłodnienia in vitro-transferu zarodków (IVF-ET), typowy wskaźnik zapłodnienia mieści się w zakresie od 60% do 80%1. Jednak około 4% do 16% przypadków napotyka albo całkowity brak nawożenia, albo niskie wskaźniki nawożenia, co stanowi wyzwanie w przewidywaniu2,3. Aby poprawić wyniki kliniczne ciąży i zmniejszyć liczbę przypadków całkowitego niezapłodnienia i niskiego zapłodnienia, wykorzystanie zapłodnienia krótkoterminowego w procedurach IVF rośnie4. Podejście to pociąga za sobą natychmiastowe usunięcie komórek ziarnistych w celu monitorowania ekstruzji drugiego ciała polarnego, oceny stanu zapłodnienia i potencjalnego przeprowadzenia naprawczej iniekcji plemnika docytoplazmatycznego (ICSI). Wiązanie między kompleksem komórek wzgórka jajowego (OCCC) a oocytem jest silniejsze podczas krótkotrwałego zapłodnienia w porównaniu z tradycyjnym zapłodnieniem nocnym, co zwiększa wyzwanie związane z usunięciem OCCC5. Czynniki takie jak nadmierna liczba oocytów, duże kompleksy OCCC lub zrosty między oocytami mogą prowadzić do wydłużenia czasu usuwania komórek ziarnistych podczas krótkotrwałego zapłodnienia, wydłużając w ten sposób okres, w którym jaja pozostają poza inkubatorem4. Aby zoptymalizować okres obserwacji zapłodnienia, opracowano zmodyfikowane podejście do pobierania komórek jajowych po pobraniu komórek jajowych, polegające na częściowym wycięciu komórek ziarnistych z oocytów ze znacznymi kompleksami OCCC. Technika ta pomaga w zachowaniu komórek ziarnistych otaczających oocyty, zachowując integralność wczesnej struktury oocytów6 i umożliwiając tym komórkom dalsze dostarczanie niezbędnych czynników do dojrzewania oocytów i późniejszego zapłodnienia-wiązanie zarodków7.
W związku z tym, to badanie skupia się na pacjentkach poddawanych leczeniu IVF-ET w centrum medycyny reprodukcyjnej jako uczestnikach badania, mając na celu zbadanie wpływu metody natychmiastowego mechanicznego wycinania częściowej ziarnistości komórek na czas trwania procedur zarówno krótkoterminowego nawożenia, jak i monitorowania nawożenia nocnego, a także oceny wyników normalnego zapłodnienia i późnego etapu rozwoju. Badania te mają na celu dostarczenie cennych informacji na temat ulepszenia procedur laboratoryjnych na zarodkach w zapłodnieniu in vitro.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi Wydziału Medycyny Reprodukcyjnej w Szpitalu Ludowym w Meizhou i podlegały przeglądowi przez Komisję Etyki tego samego departamentu. Uzyskano pisemną świadomą zgodę każdej z uczestniczących par. W badaniu wzięły udział uczestniczki przechodzące pierwszy cykl zapłodnienia in vitro z transferem zarodków w stadium rozszczepienia lub blastocysty, a także kobiety w wieku od 20 do 45 lat. Kryteria wykluczenia obejmowały wykorzystanie komórek jajowych/nasienia dawcy oraz szczególne warunki, takie jak wrodzone lub wtórne nieprawidłowości macicy (np. macica przegrodowa, macica jednorożca, didelphys macicy), adenomioza, mięśniaki podśluzówkowe macicy lub grubość endometrium poniżej 7 mm w dniu transferu zarodka. Łącznie 115 pacjentów włączonych między grudniem 2023 r. a lutym 2024 r. podzielono na dwie grupy w zależności od tego, czy wykonano natychmiastowe częściowe usunięcie OCCC.
1. Przygotowanie przed pobraniem oocytów
- Umieścić szalki do pobierania komórek jajowych (tabela materiałów) w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.
- Inkubować przez noc 12 ml pożywki manipulacyjnej z pęcherzykami (tabela materiałów) w probówkach okrągłodennych o pojemności 14 ml w temperaturze 37 °C. Przenieś probówki do wstępnie ogrzanego stojaka na probówki 30 minut przed pobraniem oocytów.
- Przygotować pożywkę manipulacyjną do pęcherzyków: Dodać 9 ml pożywki do manipulowania pęcherzykami do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml (tabela materiałów) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. W dniu pobrania komórek jajowych przenieść 4,5 ml pożywki do wstępnie inkubowanego naczynia do pobierania komórek jajowych (tabela materiałów) pokrytego 2 ml 100% oleju parafinowego.
- Przygotować roztwór płuczący OCCC: Dodać 4,5 ml pożywki do nawożenia (tabela materiałów) do naczynia do pobierania oocytów i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Przygotować pożywkę nawozową: Dodać 1 ml pożywki nawozowej do 6 cm naczynia pokrytego 100% olejem parafinowym (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Przygotuj szklane pipety Pasteura (Tabela Materiałów): Delikatnie stępić i zaokrąglić końcówki, paląc je na lampie alkoholowej przez około 5 sekund (Rysunek 1). Przymocuj głowicę ssącą do końcówki pipet Pasteura, upewniając się, że może dotykać dna naczynia bez zarysowania. Opłucz szklane pipety Pasteura i 10 cm szalki pożywką do manipulowania mieszkami włosowymi.
2. Pobranie oocytów i natychmiastowe częściowe usunięcie OCCC
UWAGA: Użyj stereomikroskopu podczas procedur izolacji oocytów i usuwania OCCC. W celu uzyskania optymalnych rezultatów wszystkie zabiegi powinny być wykonywane na stole grzewczym z regulacją temperatury (37 °C), a cały sprzęt powinien być wstępnie podgrzany na 30 minut przed pobraniem komórek jajowych.
- Pobrać przedowulacyjny płyn pęcherzykowy podczas pobierania oocytów zgodnie z zaleceniami ESHRE8.
- Krótko mówiąc, użyj igły 17 G, aby pobrać oocyty pod kontrolą ultrasonograficzną przezpochwową. Odpowiednie podciśnienie waha się w zakresie 120-140 mmHg.
- Wlej płyn pęcherzykowy zebrany w 14 ml probówce okrągłodennej do 10-centymetrowego naczynia (tabela materiałów), utrzymując głębokość płynu mniejszą niż 0,5 cm. Umieść naczynie na platformie o stałej temperaturze (37 °C).
- Obserwuj OCCC pod mikroskopem stereoskopowym, aby potwierdzić obecność oocytów i ocenić ich dojrzałość.
UWAGA: Dojrzałość OOOC ocenia się na podstawie morfologii komórek wzgórka i widoczności niektórych struktur oocytów9. - Odessać OCCC za pomocą pipety Pasteura. Przechyl 10 cm szalkę o około 15 stopni i rozłóż wszystkie duże OCCC. Unikać zasysania oocytu i otaczających komórek ziarnistych w promieniu 2500 μm. Odetnij nadmiar komórek ziarnistych za pomocą pipety Pasteura wzdłuż osi podłużnej (Rysunek 2). Szczegółowe kroki są następujące:
- Obserwuj gołym okiem, aby zobaczyć, czy w płynie pęcherzykowym znajduje się szarawa, półprzezroczysta masa śluzowata. Jeśli nie zostanie znaleziony, szybko poszukaj szarawej, półprzezroczystej masy śluzowej, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara od zewnątrz do wewnątrz pod mikroskopem stereoskopowym, OCCC.
- Potwierdź, czy w OCCC znajdują się oocyty i dokonaj wstępnej oceny dojrzałości oocytów.
- Następnie należy wstępnie przygotować silikonową pipetę aspiracyjną z okrągłą, polerowaną płomieniowo pipetą Pasteura, odessać OCCC i jednocześnie delikatnie podnieść naczynie hodowlane w pozycji godziny 9-10 lewym palcem serdecznym ręki trzymającej 10 cm szalkę, przechylając szalkę hodowlaną lekko o około 15° w lewo (umieszczenie palca serdecznego pod naczyniem to w przybliżeniu wymagany kąt).
- Wypluwając zasysany OCCC w pozycji godziny 11 naczynia, delikatnie wydłuż go poziomo w prawo. Następnie obserwuj wielkość komórek ziarnistych wokół rozszerzonego OCCC. Następnie, w odpowiednim położeniu poziomo wydłużonego OCCC, za pomocą pipety Pasteura wykonaj szybkie i delikatne nacięcie w dół na nadmiarze komórek ziarnistych od góry do dołu.
- Przenieś pocięty OCCC do naczynia zbiorczego zawierającego roztwór płuczący OCCC. Wlej pozostały płyn pęcherzykowy do sterylnego pojemnika na próbkę (tabela materiałów). Powtarzaj te kroki, aż wszystkie kompleksy zostaną zebrane.
3. Przygotowanie nasienia i inseminacja in vitro
- Próbki nasienia należy pobrać przez wytrysk rano w dniu pobrania komórek jajowych. Oceń koncentrację, ruchliwość i morfologię plemników pod mikroskopem świetlnym zgodnie z kryteriami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, 2010) 10. Następnie przenieś osad nasienia do nowej probówki wirówkowej i umyj go dwukrotnie w pożywce do zapłodnienia11. Inkubować je w temperaturze 6% CO2 i temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
- Inseminować OCCC ruchliwymi plemnikami 1 x 105 do 3 x 105 na mililitr w pojedynczej kropli około 2-3 godziny po pobraniu do naczynia do zapłodnienia (tabela materiałów). Do naczynia nawozowego dodać 6-8 OCCC i 1 ml pożywki nawozowej.
UWAGA: Po umyciu lepkiego OCCC przenosi się je do naczynia do nawożenia za pomocą pipety Pasteura. Uwalniaj po jednym OCCC na raz, delikatnie podnosząc pipetę z powierzchni cieczy przed wypuszczeniem następnej, upewniając się, że każdy OCCC jest umieszczony indywidualnie w naczyniu, aby zapobiec grupowaniu.
4. Usuwanie komórek kłębka
- W przypadku nawożenia krótkoterminowego postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
- Współinkubować OCCC z plemnikami przez 4-6 godzin. Po inkubacji mechanicznie usuń wzgórki otaczające oocyty.
- Odessać oocyty za pomocą pipety o średnicy wewnętrznej nieco mniejszej niż oocyty, aby zapewnić całkowite usunięcie komórek wzgórka.
- Potwierdź zapłodnienie, obserwując obecność dwóch ciał polarnych. Oocyty wykazujące drugie ciało polarne uważa się za zapłodnione.
- Zidentyfikuj te przypadki, które nie pokazują drugiego ciała polarnego jako niepowodzenia zapłodnienia, co wymaga ratunku ICSI.
- W przypadku regularnego zapłodnienia, po 18-20 godzinach wspólnej inkubacji, należy usunąć komórki wzgórka za pomocą pipet do oceny zapłodnienia.
5. Hodowla zarodków
- Hodowla i monitorowanie zapłodnionych oocytów przez 3-5 dni po pobraniu oocytów. Oceń zapłodnienie po 20 godzinach od inseminacji, aby określić liczbę przedjądrzy. Następnie należy wyhodować każdą zygotę indywidualnie w pożywce kropelkowej i przenieść zarodki po zapłodnieniu do podłoża do rozszczepienia.
UWAGA: Idealny zarodek do trzeciego dnia powinien składać się z sześciu lub więcej blastomerów o równej wielkości i wykazywać współczynnik fragmentacji mniejszy lub równy 10%12. - Decyzja o kontynuowaniu posiewu blastocyst zależy od preferencji pacjenta i konkretnych okoliczności, takich jak ilość i jakość zarodków uzyskanych w 3 dobie. Przenieś zarodki z 3 dnia do pożywki blastocysty i oceń w 5 dniu. Użyj systemu punktacji Gardnera do oceny blastocyst, przy czym blastocysty wysokiej jakości mają wyniki ≥ 4 BB13.
6. Pomiary wyników i analiza statystyczna
- Podać dane ciągłe jako średnią ± odchylenie standardowe i wyrazić dane porządkowe jako proporcje. Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta lub testu chi-kwadrat w odpowiednim oprogramowaniu do analizy danych (tutaj IBM SPSS Statistics). Za istotny statystycznie należy uznać poziom istotności P < 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W grupie poddanej procedurom krótkiej współinkubacji wykluczono pacjentki, które wymagały procedury ratunkowej. spośród 47 pacjentek poddanych krótkoterminowej inseminacji nie zaobserwowano istotnych różnic pod względem wieku pacjentek oraz liczby pobranych oocytów (Tabela 1). Natychmiastowe częściowe usunięcie OCCC doprowadziło do rozluźnienia pozostałego OCCC wokół oocytów (Rysunek 3), co ułatwiło wykrycie drugiego ciałka polarnego. Średni czas procedury był istotnie króts...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Natychmiastowe częściowe usunięcie komórek ziarnistych może przyspieszyć wczesny proces rozpadu krótkotrwałego zapłodnienia, skrócić czas obserwacji drugiego ciała polarnego zarówno w przypadku zapłodnienia krótkoterminowego, jak i konwencjonalnego zapłodnienia in vitro i nie zagrozić późniejszemu rozwojowi zarodka. Obecnie laboratoria na całym świecie stosują różne strategie w celu złagodzenia zaburzeń zapłodnienia i niskich wskaźników sukcesu. Preferowana metoda polega na pobraniu komórek ziarnistych w celu obserwacji ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy wyrażają swoją wdzięczność personelowi Departamentu Medycyny Rozrodu w Szpitalu Ludowym Meizhou w Guangdong, Chiny, za ich aktywny udział w tym badaniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3001 rurka | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 kubek | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 miska | Corning | 351058 | |
| Pasteur pipeta | Darwin | D1150-5P |
Bibliografia
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Reprod. 5 (4), 451-456 (1990).
- Kuczyński, W., et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod. 17 (9), 2423-2427 (2002).
- He, Y., et al. Effect of early cumulus cells removal and early rescue ICSI on pregnancy outcomes in high-risk patients of fertilization failure. Gynecol Endocrinol. 34 (8), 689-693 (2018).
- Turathum, B., Gao, E. M., Chian, R. C. The function of cumulus cells in oocyte growth and maturation and in subsequent ovulation and fertilization. Cells. 10 (9), 2292(2021).
- Bárcena, P., Rodríguez, M., Obradors, A., Vernaeve, V., Vassena, R. Should we worry about the clock? Relationship between time to ICSI and reproductive outcomes in cycles with fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod. 31 (6), 1182-1191 (2016).
- Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
- D'Angelo, A., et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019 (4), hoz025(2019).
- Hu, Y., et al. Transcriptomic profiles reveal the characteristics of oocytes and cumulus cells at GV, MI, and MII in follicles before ovulation. J Ovarian Res. 16 (1), 225(2023).
- Lu, W. H., Gu, Y. Q. Insights into semen analysis: a Chinese perspective on the fifth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Asian J Androl. 12 (4), 605-606 (2010).
- Delos Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Hum Reprod. 31 (2015), 685-686 (2016).
- Nagy, Z. P., et al. Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates. Fertil Steril. 80 (1), 67-74 (2003).
- Gardner, D. K., Lane, M., Stevens, J., Schlenker, T., Schoolcraft, W. B. Reprint of: Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. 112 (4), Suppl1 e81-e84 (2019).
- Esfandiari, N., Claessens, E. A., Burjaq, H., Gotlieb, L., Casper, R. F. Ongoing twin pregnancy after rescue intracytoplasmic sperm injection of unfertilized abnormal oocytes. Fertil Steril. 90 (1), e5-e7 (2008).
- Wetzels, A. M., et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation. Hum Reprod. 13 (5), 1325-1330 (1998).
- Kattera, S., Chen, C. Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study. Fertil Steril. 80 (4), 1017-1021 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
