Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66953

⸱

9 sierpnia 2024

 ,  , 
1Institute for Molecular Medicine, MSH Medical School Hamburg, 2Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Streszczenie

Członkowie rodziny białek LRRC8 tworzą heteromeryczne kanały jonowe i osmolitowe, odgrywając rolę w licznych procesach fizjologicznych. Jako kanały anionowe o regulowanej objętości (VRAC)/wrażliwe na objętość kanały korygujące na zewnątrz (VSOR), są aktywowane po pęcznieniu komórek osmotycznych i pośredniczą w wytłaczaniu chlorków i osmolitów organicznych, co prowadzi do wypływu wody, a tym samym kurczenia się komórek. Poza rolą w regulacji objętości osmotycznej, VRAC są zaangażowane w procesy komórkowe, takie jak różnicowanie, migracja i apoptoza. Poprzez ich wpływ na potencjał błonowy i transport różnych cząsteczek sygnałowych, bogate w leucynę powtórzenia zawierające 8 (LRRC8) kanałów odgrywają rolę w komunikacji neuron-glej, wydzielaniu insuliny i odpowiedzi immunologicznej. Mechanizm aktywacji pozostał nieuchwytny. Kanały LRRC8, podobnie jak inne kanały jonowe, są zwykle badane przy użyciu metod elektrofizjologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykrywania aktywacji kanału LRRC8 poprzez pomiar wewnątrzkompleksowego transferu energii rezonansu rezonansowego Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET) między białkami fluorescencyjnymi połączonymi z C-końcowymi domenami powtórzeń bogatymi w leucynę podjednostek LRRC8. Metoda ta daje możliwość badania aktywacji kanałów in situ bez wymiany środowiska cytozolowego oraz podczas procesów takich jak różnicowanie komórek i apoptoza.

Wprowadzenie

Kanały jonowe zbudowane z heteromerów białek z rodziny LRRC8 (leucine-rich repeat containing 8) występują we wszystkich komórkach kręgowców i uczestniczą w szerokim spektrum funkcji fizjologicznych1,2. Kanały LRRC8, po raz pierwszy zidentyfikowane jako anionowe kanały regulowane objętościowo (VRACs) lub objętościowo wrażliwe kanały prostujące na zewnątrz (VSOR), odgrywają kluczową rolę w komórkowym regulacyjnym zmniejszeniu objętości (RVD)3,4. Ułatwiają one usuwanie jonów chlorkowych i organicznych osmolitów, czemu towarzyszy odpływ wody w odpowiedzi na obrzęk osmotyczny. Poza rolą w odpowiedzi na stres osmotyczny, ich udział w regulacji objętości komórki powiązano z proliferacją i migracją komórek, apoptozą, spermiogenezą oraz integralnością nabłonka5,6,7. Wykazano, że zmiana potencjału błonowego po aktywacji LRRC8/VRAC przyczynia się do różnicowania miotubul8 oraz wydzielania insuliny przez komórki β trzustki9,10,11. Co więcej, kanały LRRC8 przewodzą różne osmolity organiczne, takie jak purynergiczne cząsteczki sygnałowe ATP i cGAMP lub pobudzający aminokwas glutaminian, co angażuje te kanały w komunikację międzykomórkową w układzie odpornościowym lub w interakcje glej-neuron12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Kanały LRRC8 przewodzą nawet ksenobiotyki, takie jak barwnik fluoresceina, antybiotyk blastycydyna S czy lek przeciwnowotworowy cisplatyna23,24,25.

Istnieje wiele doniesień na temat transdukcji sygnału prowadzącej do aktywacji LRRC8/VRAC26,27,28. Mechanizm ten pozostaje jednak niejasny, a literatura przedstawia szeroki zakres potencjalnych mechanizmów, które mogą zależeć od konkretnego procesu fizjologicznego. Obejmują one zmiany siły jonowej cytozolu, interakcje z cytoszkieletem, skład błony, białka G, stan redoks oraz kaskady fosforylacyjne2,27,29,30,31.

Kanały LRRC8/VRAC zawierają LRRC8A jako niezbędną podjednostkę3,4, która musi tworzyć heteromery z co najmniej jednym z paralogów LRRC8B-E, aby sformować fizjologicznie funkcjonalne kanały4,14,32. Skład podjednostek determinuje właściwości biofizyczne kanału, takie jak prostowanie i zależna od depolaryzacji inaktywacja4,29,32,33,34, specyficzność substratowa15,17,20,21,24,35 oraz niektóre szlaki aktywacji36,37. Struktury uzyskane za pomocą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) wykazują, że homomery LRRC8A, jak i heteromery, montują się jako heksamery38,39,40, podczas gdy chimery LRRC8A/LRRC8C tworzące funkcjonalne kanały są heptamerami41. Część N-końcowa wszystkich białek LRRC8 składa się z czterech helis transbłonowych, a część C-końcowa zawiera domenę z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRD). Dostępne struktury kompleksów LRRC8 dostarczają dowodów na to, że domeny LRRD, które rozciągają się do cytosolu3,4,23, mogą ulegać reorganizacji konformacyjnej podczas bramkowania kanału34,42,43. Teza ta jest potwierdzona odkryciem, że fuzja białek fluorescencyjnych z końcem C prowadzi do podstawowej aktywności kanału14 oraz że wiązanie nanociał z domenami może modulować aktywność kanału44. Ponadto zmiany konformacyjne końców C wykazano za pomocą wewnątrzkompleksowego transferu energii rezonansowej Förstera (FRET)45.

Najbardziej powszechną metodą badania aktywności kanałów jonowych są pomiary elektrofizjologiczne46, które były szeroko stosowane w badaniach nad VRAC przed ich identyfikacją molekularną47. Istnieją jednak różne dodatkowe sposoby pośredniego monitorowania aktywności VRAC, w tym pomiar transportowanych przez nie substratów – jonów halogenkowych lub organicznych osmolitów – lub ich wpływu na objętość komórki48. W rzeczywistości identyfikacja białek LRRC8 jako VRAC opierała się na teście wykorzystującym wygaszanie białka fluorescencyjnego wrażliwego na halogenki49 przez jony jodowe wnikające do komórki przez aktywowane VRAC3,4. Inna metoda monitorowania aktywności kanałów LRRC8/VRAC wykorzystuje ruch domen cytozolowych, który – podobnie jak w przypadku innych kanałów jonowych50,51,52,53 – można obserwować poprzez zmiany w FRET45. W tym celu białka fluorescencyjne służące jako pary FRET, takie jak cyjanowa białko fluorescencyjne (CFP)/mCerulean3 jako donor oraz żółte białko fluorescencyjne (YFP)/mVenus jako akceptor, zostały połączone z końcami C-terminalnymi białek LRRC8 (Rycina 1). Wewnątrzkompleksowy FRET między podjednostkami LRRC8 został wykazany w eksperymentach z fotowybielaniem akceptora45. Aby uniknąć destrukcyjnej metody fotowybielania, zmiany FRET w czasie monitorowano za pomocą FRET z emisją uwrażliwioną (SE-FRET), gdzie mierzy się zasadniczo emisję uwrażliwioną akceptora po pobudzeniu donora, wynikającą z nakładania się widma emisji donora na widmo pobudzenia akceptora. Zastosowanie hipotoniczności zewnątrzkomórkowej, będącej bodźcem do aktywacji LRRC8/VRAC, spowodowało odwracalny spadek intensywności SE-FRET45. Co istotne, jednoczesne pomiary whole-cell patch-clamp i monitorowanie FRET podczas traktowania roztworem hipotonicznym wykazały, że ten spadek FRET rzeczywiście odzwierciedla aktywację LRRC8/VRAC45. Metoda ta, która pozwala uniknąć naruszania błony plazmatycznej lub zmiany środowiska wewnątrzkomórkowego przez roztwór w pipecie, stanowi alternatywę dla monitorowania aktywności LRRC8/VRAC. Jest ona szczególnie użyteczna w warunkach fizjologicznych, gdzie kluczowe jest zachowanie natywnego cytozolu, niezbędna jest rozdzielczość subkomórkowa lub wymagana jest długotrwała obserwacja aktywności kanałów.

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół badania LRRC8/VRAC z wykorzystaniem odczytu opartego na metodzie FRET. Protokół opisuje sposób prowadzenia i transfekcji komórek, pozyskiwanie obrazów próbek i kontroli, analizę danych oraz obliczanie wartości SE-FRET (sensitized emission FRET).

figure-introduction-1
Rycina 1: Schemat systemu par FRET dla LRRC8. mCerulean3 przedstawiono w kolorze cyjanowym, a mVenus w żółtym. Po otwarciu VRAC odległość (i/lub orientacja przestrzenna) między fluoroforami ulega zmianie, co skutkuje zmniejszeniem transferu energii między donorem (Don) a akceptorem (Acc), a w konsekwencji obniżeniem obserwowanego sygnału FRET. Utworzono przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i odczynników

  1. Przygotować pożywkę oraz bufory izotoniczne, hipotoniczne i hipertoniczne, a następnie zmierzyć osmolarność buforów za pomocą osmometru, aby upewnić się, że osmolarność (Osm) mieści się w oczekiwanym zakresie z dopuszczalnym odchyleniem.
    1. Pożywki do hodowli komórkowej: Przygotować pożywkę DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) uzupełnioną o 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) oraz 1% penicyliny/streptomycyny
    2. Izotoniczny bufor do obrazowania (~340 mOsm): Przygotować izotoniczny bufor do obrazowania, mieszając 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glukozy i 10 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy).
    3. Hipotoniczny bufor do obrazowania (~250 mOsm): Przygotować hipotoniczny bufor do obrazowania, mieszając 105 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glukozy i 10 mM HEPES.
    4. Hipertoniczny bufor do obrazowania (~500 mOsm): Przygotować hipertoniczny bufor do obrazowania, mieszając 160 mM D(-)-mannitolu, 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glukozy i 10 mM HEPES.
      UWAGA: Bufory mogą być uzupełnione o specyficzne leki, w zależności od przedmiotu badań.

2. Hodowla komórek adherentnych w naczyniach z szklanym dnem

  1. Przygotuj co najmniej jedną szalkę do transfekcji wyłącznie białkiem zainteresowania (POI) połączonym z fluorophorem donorem lub akceptorem oraz co najmniej jedną szalkę do transfekcji parą donor-akceptor (Tabela 1 oraz Rysunek 2). Do mikroskopii fluorescencyjnej należy użyć szalek z szklanym dnem. W zależności od typu komórek, powierzchnię należy poddać specjalnemu oczyszczeniu lub pokryć polilizyną.
    UWAGA: W tym przypadku jako para FRET zastosowano donor mCerulean3 (mCer)54 oraz akceptor mVenus (mVen)55, jednak możliwe są również inne kombinacje fluoroforów. Próbki wykazujące ekspresję POI połączonego z samym donorem lub akceptorem służą do wyznaczenia współczynników korekcyjnych β i γ (Tabela 1), niezbędnych do skorygowania przenikania sygnału donora do kanału akceptora (bleed-through) oraz wzbudzenia krzyżowego akceptora długością fali wzbudzenia donora (Rysunek 2Ac, Bf).
  2. Dzień przed transfekcją wysiej 1 x 105 komórek HeLa w 2 mL pożywki hodowlanej na szalkach 35-mm z szklanym dnem odpowiednim do mikroskopii fluorescencyjnej. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Objętości odczynników można dostosować do powierzchni innych szalek lub kolb do hodowli komórkowych o innym rozmiarze. Liczbę komórek można dostosować do gęstości odpowiedniej dla różnych linii komórkowych i podejść eksperymentalnych.
    1. Odsącz supernatant z monowarstwy przylegających komórek hodowanych w kolbach T75 za pomocą pompy próżniowej.
    2. Przemyj komórki, dodając do kolby 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), a następnie odsącz roztwór pompą próżniową.
    3. Całkowicie pokryj komórki 1 mL 0,05% Trypsyny-EDTA i inkubuj przez 2 min w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    4. Dodaj 9 mL pożywki hodowlanej i zawieś komórki poprzez pipetowanie.
    5. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 15 mL i wiruj przy 700 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Odsącz supernatant pompą próżniową i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL pożywki hodowlanej.
    7. Wymieszaj w probówce równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% błękitu trypanu, a następnie nanieś 10 µL na szkiełko do liczenia. Włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek i rozpocznij zliczanie, korzystając z odpowiedniego programu.
    8. Aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną dla każdej szalki, podziel liczbę komórek wymaganą na szalkę (1 x 105) przez liczbę komórek na mililitr otrzymaną z licznika.
    9. Przygotuj zawiesinę komórkową w odpowiedniej probówce, zawierającą liczbę komórek wymaganą na szalkę w objętości potrzebnej na szalkę (2 mL) plus ilość na jedną dodatkową szalkę.
    10. Wymieszaj zawiesinę komórkową co najmniej 20 razy poprzez odwracanie probówki i pipetuj 2 mL zawiesiny do każdej szalki.
    11. Aby zapewnić bardziej równomierny rozkład komórek, pozostaw szalki na 30 min w temperaturze RT przed umieszczeniem ich w inkubatorze do hodowli komórkowych.

3. Transfekcja komórek

UWAGA: W tym przypadku jako odczynnik do transfekcji wykorzystano FuGENE. Możliwe jest zastosowanie innych odczynników i metod transfekcji. Optymalne proporcje plazmidowego DNA (pDNA) do odczynników do transfekcji oraz czas uzyskania optymalnej ekspresji dla każdego POI i modelu komórkowego muszą zostać określone empirycznie. W niniejszej procedurze zastosowano 2 µg całkowitego pDNA na szalkę 35 mm. Konstrukty donora i akceptora FRET wykorzystano w stosunku 1:1, a stosunek pDNA do odczynnika do transfekcji wynosił 1:4 (Tabela 1).

  1. Przed transfekcją zastąpić nadsącz z hodowli komórkowej 2 mL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki.
  2. Rozcieńczyć pDNA w Opti-Minimal Essential Medium (MEM) do końcowej objętości 100 µL (=roztwór pDNA).
  3. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w Opti-MEM do końcowej objętości 100 µL (=roztwór odczynnika).
    UWAGA: Aby uzyskać bardziej jednorodną transfekcję, należy przygotować master mix dla roztworu pDNA i roztworu odczynnika.
  4. Dokładnie wymieszać roztwór pDNA i roztwór odczynnika.
  5. Dodać roztwór pDNA do roztworu odczynnika (=roztwór do transfekcji).
  6. Dokładnie wymieszać roztwór do transfekcji.
  7. Inkubować roztwór do transfekcji przez 15 min w RT.
  8. Dodać roztwór do transfekcji do naczynia kroplowo, wykonując ruch spiralny.
  9. Wymieszać, przesuwając naczynie 5 razy w poziomie i w pionie po powierzchni blatu.
  10. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.

  

WarunekKonstrukt(y)PróbkaStosowane do
1LRRC8A-mCeruleanWyłącznie konstrukt donorawyznaczanie współczynnika korekcyjnego β
2LRRC8E-mVenusWyłącznie konstrukt akceptorawyznaczanie współczynnika korekcji γ
3LRRC8A-mCerulean i LRRC8E-mVenuspara FRETIlościowe oznaczanie SE-FRET

Tabela 1: Przykład warunków niezbędnych dla typowego eksperymentu SE-FRET w celu pomiaru aktywności LRRC8/VRAC kanału zbudowanego z podjednostki LRRC8A połączonej z donorem (mCerulean3) oraz podjednostki LRRC8E połączonej z akceptorem (mVenus) fluoroforu.

4. Pozyskiwanie obrazów w celu wyznaczenia współczynnika korekcji

UWAGA: Podczas FRET występuje przenikanie emisji donora do wykrywanej emisji akceptora. Ponadto zachodzi wzajemna ekscytacja fluoroforu akceptora przez długość fali ekscytacji donora. Procesy te muszą zostać skompensowane podczas obliczania SE-FRET. W tym celu współczynniki korekcyjne są wyznaczane w komórkach wykazujących ekspresję wyłącznie donora lub akceptora FRET 24 h po transfekcji. W niniejszym przypadku obrazowanie przeprowadzono przy użyciu systemu Leica THUNDER Imager wyposażonego w lampę Leica LED8, kostkę filtrującą CYR71010, obiektyw HC PL APO 63x/1.40 OIL, filtry długoprzepustowe 460/80 i 553/70 oraz kamerę Leica DFC9000GTC. Eksperymenty przeprowadzono bez kontroli środowiskowej, lecz z dodatkiem HEPES w buforach do obrazowania w celu stabilizacji pH. Do obserwacji i pomiarów długoterminowych zaleca się stosowanie systemu kontroli środowiskowej. Do analizy wartość SE-FRET oblicza się na podstawie zarejestrowanych surowych obrazów. Można to zrobić jednocześnie podczas akwizycji lub po jej zakończeniu. W tym przypadku użyto oprogramowania Leica LAS X z wtyczką SE-FRET, aby uprościć procedurę eksperymentalną w zakresie obliczania współczynników korekcyjnych oraz wizualizacji zmian wartości SE-FRET w czasie rzeczywistym podczas akwizycji obrazów. W analizie poakwizycyjnej współczynniki korekcyjne i SE-FRET można wyznaczyć za pomocą innych pakietów oprogramowania (np. FIJI) po zebraniu surowych danych zgodnie z poniższym protokołem.

  1. Przed akwizycją obrazów pojedynczych przetransfekowanych komórek w celu obliczenia współczynników korekcyjnych, należy użyć jednej próbki wykazującej ekspresję pary FRET do skonfigurowania ustawień mikroskopu dla wszystkich kanałów (pobudzenie donora/emisja donora DD, donor/akceptor DA oraz akceptor/akceptor AA; patrz Tabela 1 oraz Rysunek 2C i Rysunek 3A).
    UWAGA: Dla pomiarów SE-FRET z podjednostkami VRAC znakowanymi mCerulean3 i mVenus przetransfekowanymi zgodnie z powyższym opisem, zastosowano następujące parametry: binning pikseli 8x8, czas ekspozycji 100ms oraz 10% intensywności lampy LED.
  2. Należy pobrać próbkę wykazującą ekspresję wyłącznie konstruktu donora (Rysunek 2A), odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki trzy razy 2 mL buforu izotonicznego.
  3. Należy dodać 3 mL buforu izotonicznego i umieścić próbkę na stoliku mikroskopu.
  4. Należy znaleźć pole widzenia (FOV), w którym znajduje się co najmniej jedna komórka wykazująca ekspresję konstruktu donora.
  5. Należy obrazować wszystkie kanały (DD, DA i AA; patrz Tabela 2 i Rysunek 2A).
  6. Należy wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki/komórek i zmierzyć średnią intensywność DA (= IDA; Rysunek 2Ac) oraz DD (= IDD; Rysunek 2Aa).
  7. W celu odjęcia tła należy wyznaczyć ROI w kanałach DA i DD, gdzie występuje jedynie sygnał tła, i zmierzyć średnią intensywność (IBDA oraz IBDD).
  8. Od średniej intensywności zmierzonej w ROI komórki w odpowiednim kanale należy odjąć średnią intensywność ROI tła (figure-protocol-1 oraz figure-protocol-2).
  9. Należy powtórzyć kroki 4.2- 4.5 z próbką wykazującą ekspresję wyłącznie konstruktu akceptora (Rysunek 2B).
  10. Należy wyznaczyć ROI wokół komórki/komórek i zmierzyć średnią intensywność DA (= IDA; Rysunek 2Bf) oraz AA (= IAA; Rysunek 2Be).
  11. W celu odjęcia tła należy wyznaczyć ROI w kanałach DA i AA, gdzie występuje jedynie sygnał tła, i zmierzyć średnie intensywności (IBDA oraz IBAA).
  12. Od średniej intensywności zmierzonej w ROI komórki w odpowiednim kanale należy odjąć średnią intensywność ROI tła (figure-protocol-3 oraz figure-protocol-4).
  13. Należy użyć wartości wyznaczonych dla IDA*, IDD*, i IAA* do obliczenia współczynników korekcyjnych figure-protocol-5 oraz figure-protocol-6,
    ​gdzie współczynnik korekcyjny β służy do kompensacji przenikania emisji donora do kanału DA, a współczynnik korekcyjny γ służy do kompensacji wzbudzenia krzyżowego fluoroforu akceptora przez długość fali wzbudzenia donora w kanale DA.
WzbudzenieEmisjaNazwa kanałulinia LEDKostka filtrującaFiltr długoprzepustowy
DawcaDawcaDD440 nmCYR71010460/80 nm
DawcaAkceptorDA440 nmCYR71010535/70 nm
AkceptorAkceptorAA510 nmCYR71010535/70 nm

Tabela 2: Podsumowanie kanałów wymaganych do eksperymentów SE-FRET.

figure-protocol-7
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne próbek wykorzystanych do obliczenia współczynników korekcyjnych β i γ, niezbędnych do określenia aktywności VRAC kanału składającego się z podjednostki LRRC8A połączonej z donorem mCerulean3 (mCer) oraz podjednostki LRRC8E połączonej z akceptorem mVenus (mVen) za pomocą pomiarów SE-FRET. (A,B) Detekcja kanału donor/donor DD, akceptor/akceptor AA oraz donor/akceptor DA w komórkach HeLa wykazujących ekspresję wyłącznie donora (A) LRRC8A-mCer lub akceptora (B) LRRC8E-mVen. (C) Detekcja kanałów DD, AA i DA w komórkach HeLa kotransfekowanych parą donor-akceptor LRRC8A-mCer i LRRC8E-mVen. Panele a-i przedstawiają obrazy wykonane w kanale detekcji donora (wzbudzenie donora i detekcja sygnału donora; DD; a, d i g), kanale detekcji akceptora (wzbudzenie akceptora i detekcja sygnału akceptora; AA; b, e i h) oraz kanale detekcji sygnału FRET (wzbudzenie donora i detekcja sygnału akceptora; DA; c, f i i). Panel j jest nałożeniem paneli g i h. Kanał DD pokazano w kolorze zielonym, a kanał AA w kolorze purpurowym. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Obrazowanie time-lapse dla kwantyfikacji SE-FRET

  1. Pobrać próbkę wykazującą ekspresję konstruktu donora i akceptora (Tabela 1, Rycina 2C oraz Rycina 3A), odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki trzykrotnie 2 mL buforu izotonicznego 24 h po transfekcji.
  2. Dodać 3 mL buforu izotonicznego i umieścić próbkę na stole mikroskopu.
  3. W celu późniejszego odessania buforu izotonicznego, przymocować i ustawić kaniulę z wężyka tak, aby jej końcówka sięgała dna naczynia.
  4. W celu dodawania buforów, przymocować i ustawić przewody tak, aby bufor napływający grawitacyjnie mógł wpłynąć do naczynia.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano system perfuzji grawitacyjnej sterowany zaworami, wyposażony w cztery zawory magnetyczne do kontroli przepływu buforu, jednak możliwe jest zastosowanie innych metod.
  5. Znaleźć pole widzenia (FOV) zawierające co najmniej jedną komórkę wykazującą jednoczesną ekspresję konstruktu donora i akceptora.
  6. Skonfigurować eksperyment time-lapse dla kanałów DD, DA i AA z odstępem 10 s i czasem trwania obejmującym wszystkie warunki sekwencji stymulacji, np. 12 cykli linii bazowej, a następnie 15 cykli dla każdego warunku (Rycina 3).
    UWAGA: Odstęp i liczba cykli mogą zostać dostosowane do potrzeb eksperymentalnych, ale zawsze powinny obejmować pomiar linii bazowej w celu normalizacji, co zapewnia lepszą wizualizację i porównywalność danych.
  7. Po pomiarze linii bazowej przemyć próbkę buforem dla pierwszego warunku.
    1. Odessać bufor izotoniczny za pomocą kaniuli z wężyka, wytwarzając podciśnienie strzykawką.
    2. Dodać 3 mL buforu dla następnego warunku za pomocą przepływu grawitacyjnego.
    3. Odessać bufor i ponownie dodać 3 mL tego samego buforu.
    4. Powtórzyć krok 5.7.3 jeszcze raz.
  8. Po pomiarze pierwszego warunku przemyć próbkę buforem dla kolejnego warunku (kroki 5.7.1-5.7.4).
  9. Powtarzać kroki 5.5-5.8, aż do zarejestrowania wszystkich warunków.
  10. W celu kwantyfikacji SE-FRET, wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki/komórek i zmierzyć średnią intensywność w kanałach DD (IDD), DA (IDA) i AA (IAA) dla wszystkich obrazów (punktów czasowych) w serii czasowej (Rycina 3A, B).
  11. W celu odjęcia tła dla sygnału FRET, wyznaczyć ROI w kanale DA w miejscu, gdzie występuje tylko sygnał tła, i zmierzyć średnią intensywność (IBDA).
  12. Odjąć średnią intensywność ROI tła od średniej intensywności zmierzonej w ROI komórki w kanale DA (figure-protocol-8).
  13. Wykorzystać wyznaczone wartości do obliczenia średnich wartości SE-FRET dla każdego ROI i wszystkich punktów czasowych figure-protocol-9.
  14. W celu lepszej porównywalności różnych warunków i wizualizacji wartości SE-FRET, użyć średniej z wartości linii bazowej każdego ROI do normalizacji wszystkich punktów czasowych odpowiadającego im ROI.
  15. Przedstawić znormalizowane wartości SE-FRET w funkcji czasu (Rycina 3B).

figure-protocol-10
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne i ilościowe oznaczenie SE-FRET. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne oraz pozorny SE-FRET w pierwszym punkcie czasowym eksperymentu time-lapse służącego do pomiaru aktywności VRAC za pomocą SE-FRET kanału złożonego z podjednostek LRRC8A i LRRC8E w zależności od toniczności. Pasek skali = 10 µm. Te same komórki przedstawiono na Rysunku 2C. Panele a-i przedstawiają detekcję kanałów DD, AA i DA oraz obliczony pozorny SE-FRET. Białe obrysy reprezentują obszary ROI (komórki i-iii w panelu d) wykorzystane do pomiaru średnich intensywności sygnału w DD, AA i DA oraz obrazu pozornego SE-FRET. (B) Ilościowe oznaczenie wartości SE-FRET w czasie. Sekwencja warunków obejmowała 12 cykli izotonicznego buforu obrazującego (linia bazowa), a następnie 15 cykli hipotonicznego i 15 cykli hipertonicznego buforu obrazującego. Surowa średnia wartość SE-FRET dla każdego ROI (komórki i-iii) i punktu czasowego została znormalizowana do średniej wartości bazowej (izotonicznej) dla odpowiadającego ROI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Dzięki tej metodzie opartej na FRET można monitorować aktywność LRRC8/VRAC podczas stymulacji osmotycznej, a spadek SE-FRET koreluje ze stopniem hipotoniczności środowiska zewnętrznego45. Reprezentatywne wyniki aktywacji kanałów indukowanej hipotonicznością przedstawiono również tutaj (Rysunek 3 i Rysunek 4). Ponadto można obserwować aktywację LRRC8/VRAC przez różne bodźce izoosmotyczne, takie jak manipulacja sygnalizacją diacyloglicerolu45 lub podczas aktywacji miocytów56.

figure-results-1
Rysunek 4: Profile SE-FRET. (A) Pozorne profile SE-FRET z 5 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiają średnią ± SD dla N = 2 do N = 7 komórek na pole widzenia (FOV). (B) Średnia ± SD dla wszystkich komórek (N = 31 komórek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ponieważ kanały LRRC8/VRAC biorą również udział w apoptotycznym zmniejszeniu objętości24,57, obserwacja aktywności kanałów po indukcji apoptozy stanowiłaby kolejne zastosowanie opisanej tutaj metody. W związku z tym, protokół monitorowania SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A-mCerulean3 i LRRC8E-mVenus przeprowadzono podczas stosowania leków indukujących apoptozę za pośrednictwem receptorów śmierci. Wcześniej wykazano, że czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α oraz cykloheksymida (CHX) wywołują prądy VRAC w ciągu kilku minut58. Po dodaniu 2 ng/mL TNF-α i 1 µg/mL CHX w buforze izotonicznym odnotowano silny spadek SE-FRET (Rycina 5). Po zastąpieniu buforu medium hipertonicznym, mimo zawartości TNF-α i CHX, wartości SE-FRET powróciły do poziomu bliskiego wartości bazowej (Rycina 5A), co odpowiada zmniejszeniu prądów VRAC w hipertonicznym roztworze kąpieli podczas leczenia ligandem Fas indukującym apoptozę58. Traktowanie komórek DMSO, rozpuszczalnikiem dla TNF-α i CHX, nie spowodowało redukcji SE-FRET. TNF-α + CHX nie wpłynął na SE-FRET konstruktu CFP-18aa-YFP, będącego tandemową konstrukcją EYFP i ECFP służącą jako kontrola FRET59, co potwierdza specyficzność względem LRRC8/VRAC (Rycina 5B).

figure-results-2
Rysunek 5: Izosmotyczna aktywacja VRAC indukowana apoptozą zapośredniczoną przez receptory śmierci. (A) Znormalizowane wartości SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 szalek, 23 komórki) w funkcji czasu. Po 15 cyklach w izotonicznym buforze obrazującym (linia bazowa), roztwór kąpieli zastąpiono izotonicznym buforem uzupełnionym o 2 ng/mL TNF-α i 1 µg/mL cykloheksymidu (CHX) przez 30 cykli, a następnie zastosowano hipertoniczny bufor obrazujący z TNF-α i CHX przez 20 cykli. Surowa średnia wartość SE-FRET dla każdego ROI i punktu czasowego została znormalizowana do średniej wartości bazowej (izotonicznej) dla odpowiedniego ROI. (B) Ilościowe oznaczenie znormalizowanych wartości SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A/E, jak w A, z roztworem izotonicznym zawierającym DMSO jako kontrolę nośnika dla CHX (n = 5 szalek, 12 komórek) lub buforem izotonicznym zawierającym induktory apoptozy, jak w A (n = 8 szalek, 23 komórki), lub w komórkach HeLa wykazujących ekspresję CFP-18aa-YFP z induktorami apoptozy (n = 3 szalki, 9 komórek). Dane przedstawiają średnią z ostatnich 10 punktów czasowych w odpowiednim buforze dla poszczególnych komórek (symbole) oraz średnią dla wszystkich komórek ± SD; ** p < 0.01 zwykła jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie post-hoc test wielokrotnych porównań Tukeya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Mikroskopia FRET jest dobrze ugruntowaną, szeroko stosowaną techniką do badania interakcji między białkami. W związku z tym metody oparte na FRET mogą być stosowane w wielu laboratoriach o zróżnicowanej specyfice. Rearanżacje konformacyjne podczas bramkowania były monitorowane dla szerokiego zakresu kanałów jonowych za pomocą testów opartych na FRET (przykłady patrz referencje 34,50,51,52,53,60,61,62,63,64,65,66,67), w niektórych przypadkach w połączeniu z elektrofizjologią we fluorometrii patch-clamp 68,69,70,71. FRET może być używany do badania zależności struktura-funkcja tych kanałów jonowych lub do monitorowania ich aktywności niezależnie od transportu jonów. Przedstawiona metoda może mieć wyraźną przewagę nad elektrofizjologią, ponieważ umożliwia monitorowanie aktywności kanałów LRRC8/VRAC in situ.

Krytyczne kroki w protokole obejmują posiew komórek w celu osiągnięcia optymalnej konfluencji dla transfekcji i obrazowania, co w idealnym przypadku ułatwia łatwe rozróżnianie komórek do późniejszej analizy. Skuteczna kotransfekcja różnych podjednostek ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej lokalizacji subkomórkowej; na przykład nadmiar podjednostki nie-LRRC8A doprowadzi do zwiększonej lokalizacji retikulum endoplazmatycznego (ER)4. W związku z tym może być konieczne dostosowanie proporcji plazmidów. W zależności od systemu, nowo wygenerowane pary FRET powinny być weryfikowane, np. poprzez bielenie akceptorowe. Binning i czas ekspozycji muszą być zrównoważone względem siebie, aby umożliwić optymalną rozdzielczość czasową i przestrzenną dla pytania badawczego. Binning umożliwia krótsze czasy naświetlania, a tym samym zmniejsza potencjalne blaknięcie czujnika FRET przy jednoczesnym zmniejszeniu rozdzielczości przestrzennej. W związku z tym, jeśli konfiguracja doświadczalna wymaga, np. subkomórkowej dyskryminacji aktywności LRRC8/VRAC, należy unikać binningu. Pytanie badawcze w równym stopniu determinuje liczbę i interwał cykli w serii poklatkowej. Interwał ma znaczenie tylko wtedy, gdy wymagana jest kinetyka zmian FRET (a tym samym aktywacja/dezaktywacja LRRC8/VRAC); W przeciwnym razie można również wykonać proste nagrania "przed i po". Długość eksperymentu zależy od procesu fizjologicznego. Idealnie, aktywność LRRC8/VRAC po bodźcach powinna być monitorowana do momentu ustabilizowania się SE-FRET. Czynniki te można określić w eksperymentach pilotażowych. Współczynniki korekcyjne do obliczenia rzeczywistego sygnału SE-FRET muszą być określone dla wszystkich warunków. Nieprawidłowo wyznaczone współczynniki korekcyjne mogą prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania intensywności SE-FRET. Wreszcie, po ustaleniu stabilnej linii bazowej, odstęp czasu między obrazami musi być wystarczająco krótki, aby uchwycić interesujący nas proces fizjologiczny.

Metoda ta ma pewne ograniczenia. Jednym z nich jest to, że zmiany intensywności FRET między LRRC8, choć odzwierciedlają ruchy LRRD, niekoniecznie odpowiadają transportowi jonów lub osmolitów przez pory. Wynika to jasno ze zmian FRET obserwowanych w homomerach LRRC8A45 pomimo ich minimalnych prądów 4,32,72. Blokery porów kanałów LRRC8/VRAC mogą nie wpływać na sygnał FRET, co sprawia, że metoda ta nie nadaje się do poszukiwania konkretnych modulatorów kanałów. Co więcej, poziomy ekspresji nadekspresji białek LRRC8 mogą wpływać na obserwowane procesy fizjologiczne, zwłaszcza że znakowane C-końcowo białka LRRC8 wykazują aktywność podstawową14.

Aspektem, który można uznać za ograniczenie lub zaletę w zależności od konkretnego pytania badawczego, jest to, że w tej metodzie selektywnie mierzone są tylko podjednostki LRRC8 wyrażane ektopowo. Tak więc poziomy tła białek endogennych prawie nie zakłócają pomiarów. Z drugiej strony, nadekspresja białek może nie zachowywać się jak endogenne kanały LRRC8 o potencjalnie różnym składzie podjednostek i stechiometrii. Na przykład różne bodźce, takie jak utlenianie, mogą mieć przeciwstawne efekty modulacyjne na różnie skomponowane kanały LRRC836. Zmieniając stosunki między podjednostkami o współekspresji, ich stechiometrię i ogólną przewodność jonówmożna dostosować 14,73, ale ich natywny skład, z prawdopodobnie często więcej niż dwoma paralogami w jednym kompleksie21, nie jest jasny i może się różnić w zależności od typu komórki 74,75,76. Ponadto wykazano, że fuzja białek fluorescencyjnych z cytozolowymi C-końcami białek LRRC8 zwiększa podstawową aktywność kanału LRRC8 / VRAC w oocytach Xenopus 14, prawdopodobnie dlatego, że duże znaczniki modulują konformację LRRD, która może regulować otwarcie kanału 14,44,45. Dlatego rozmiar białek fluorescencyjnych, łącznik i ich orientacja mogą nie tylko wpływać na wydajność FRET, ale także na aktywność kanału. Jednak, co ważne, kanały VRAC białek LRRC8 połączone z białkami fluorescencyjnymi pozostały wrażliwe na stymulację hipotoniczną14, umożliwiając ich wykorzystanie jako czujników FRET45.

Zalety tej nieinwazyjnej metody monitorowania aktywności kanału LRRC8/VRAC za pomocą mikroskopii świetlnej w porównaniu z innymi metodami obejmują: (i) Umożliwia obserwację LRRC8/VRAC w komórkach lub przedziałach zwykle niedostępnych dla elektrofizjologii. Obejmuje to organelle wewnątrzkomórkowe, na których można znaleźć kompleksy LRRC8 lub być ukierunkowane na 45,77,78. (ii) Skład cytozolowy pozostaje niezmieniony przez metodę, podczas gdy podczas pomiarów klamry krosowej całej komórki cytozol jest w dużej mierze zastępowany roztworem pipety, co może wpływać na szlaki sygnałowe, jak obserwowano w przypadku aktywacji LRRC8 / VRAC indukowanej przez octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA)45. (iii) Daje możliwość obserwacji aktywacji LRRC8 / VRAC z rozdzielczością subkomórkową, taką jak rozróżnianie aktywności na krawędziach natarcia i spływu podczas migracji komórek, gdzie - ograniczone do ograniczonych przestrzeni - VRAC został zaangażowany79,80. (iv) Umożliwia ciągłe monitorowanie aktywności LRRC8 / VRAC podczas rozszerzonych procesów fizjologicznych, takich jak różnicowanie miocytów56.

Chociaż metoda ta wiąże się z ograniczeniami i wyzwaniami, jest obiecująca dla dalszych badań, w tym potencjalnych zastosowań w modelach zwierzęcych. W połączeniu z innymi metodami badania tej rodziny kanałów jonowych i osmolitowych, ten test oparty na FRET może znacząco przyczynić się do rozwikłania mechanizmów aktywacji i zbadania różnorodnych funkcji fizjologicznych kanałów LRRC8 w ich natywnym środowisku.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy C.F. Kaminskiemu za uprzejmy dar plazmidu kodującego konstrukcję CFP-18aa-YFP, A. Klemmerowi za pomoc techniczną oraz wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Staubera, którzy przyczynili się do rozwoju tej metody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAgibco25300-054
Aparat fotograficzny DFC9000GTCLeica11547007
CFP-18aa-YFPN/A/AElder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Prezent od C.F. Kamińskiego (University of Cambridge, Wielka Brytania)
Cykloheksymid (CHX)Sigma-Aldrich66-81-9
D(-)-MannitolCarl Roth4175.1
D(+)-GlukozaCarl RothHN06.1
DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)PAN-BiotechP04-03590
DPBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco)PAN-BiotechP04-36500
Koło filtra emisji (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)Leica11525480
FBS (płodowa surowica bydlęca)PAN-BiotechP30-3302
Kostka filtra CYR71010Leica11525416
FuGENEPromegaE2691
Szklane naczynia do hodowli zwierząt 35 mmMatTekP35G-0-10-C
Komórki HeLaLeibniz Forschungsinstitut DSMZACC 57Rak szyjki macicy u ssaków/ Uzyskane z Leibniz Forschungsinstitut DSMZ
HEPESCarl Roth9105.4
ibidi µ-Disch 35 mmibidi81156
KCl (chlorek potasu)Carl Roth6781.1
LAS X FRET WizardLeica
Źródło światła LED8Leica11504256
LRRC8A-mCerulean3N/AN/AKö nig et al. 2019
LRRC8E-mVenusN/AN/AKö nig et al. 2019
Luna-II Automatyczny licznik komóreklogo biosystemsL40002
Luna-II Cell Counter Slideslogo biosystemsL12001
MgCl2 (chlorek magnezu)Carl RothKK36.1
Mikroskop THUNDER Imager na żywoLeica11525681
NaCl (chlorek sodu)Carl Roth9263
Obiektyw HC PL APO 63x/1.40 OILLeica11506349
Opti-Minimal Essential Medium (MEM)gibco11058
Osmometr OM807VogelV04807
Streptomycyna penicylina (krok pióra)gibco15070-063
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)SigmaT8154
Czynnik martwicy nowotworu (TNF)-ASigma-Aldrich94948-59-1
System perfuzji grawitacyjnej sterowanyzaworem ALA Scientific InstrumentsVC3-4xG
N11640862

Bibliografia

  1. Jentsch, T. J. VRACs and other ion channels and transporters in the regulation of cell volume and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 293-307 (2016).
  2. Chen, L., et al. More than just a pressure relief valve: physiological roles of volume-regulated LRRC8 anion channels. Biol Chem. 400 (11), 1481-1496 (2019).
  3. Qiu, Z., et al. SWELL1, a plasma membrane protein, is an essential component of volume-regulated anion channel. Cell. 157 (2), 447-458 (2014).
  4. Voss, F. K., et al. Identification of LRRC8 heteromers as an essential component of the volume-regulated anion channel VRAC. Science. 344 (6184), 634-638 (2014).
  5. Hoffmann, E. K., Schettino, T., Marshall, W. S. The role of volume-sensitive ion transport systems in regulation of epithelial transport. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (1), 29-43 (2007).
  6. López-Cayuqueo, K. I., et al. Renal deletion of LRRC8/VRAC channels induces proximal tubulopathy. J Am Soc Nephrol. 33 (8), 1528-1545 (2022).
  7. Lück, J. C., Puchkov, D., Ullrich, F., Jentsch, T. J. LRRC8/VRAC anion channels are required for late stages of spermatid development in mice. J Biol Chem. 293 (30), 11796-11808 (2018).
  8. Chen, L., Becker, T. M., Koch, U., Stauber, T. The LRRC8/VRAC anion channel facilitates myogenic differentiation of murine myoblasts by promoting membrane hyperpolarization. J Biol Chem. 294 (39), 14279-14288 (2019).
  9. Best, L., Brown, P. D., Sener, A., Malaisse, W. J. Electrical activity in pancreatic islet cells: The VRAC hypothesis. Islets. 2 (2), 59-64 (2010).
  10. Kang, C., et al. SWELL1 is a glucose sensor regulating beta-cell excitability and systemic glycaemia. Nat Commun. 9 (1), 367(2018).
  11. Stuhlmann, T., Planells-Cases, R., Jentsch, T. J. LRRC8/VRAC anion channels enhance beta-cell glucose sensing and insulin secretion. Nat Commun. 9 (1), 1974(2018).
  12. Hisadome, K., et al. Volume-regulated anion channels serve as an auto/paracrine nucleotide release pathway in aortic endothelial cells. J Gen Physiol. 119 (6), 511-520 (2002).
  13. Burow, P., Klapperstück, M., Markwardt, F. Activation of ATP secretion via volume-regulated anion channels by sphingosine-1-phosphate in RAW macrophages. Pflügers Arch. 467 (6), 1215-1226 (2015).
  14. Gaitán-Peñas, H., et al. Investigation of LRRC8-mediated volume-regulated anion currents in Xenopus oocytes. Biophys J. 111 (7), 1429-1443 (2016).
  15. Lahey, L. J., et al. LRRC8A:C/E heteromeric channels are ubiquitous transporters of cGAMP. Mol Cell. 80 (4), 578-591 (2020).
  16. Chen, X., et al. Regulation of anion channel LRRC8 volume-regulated anion channels in transport of 2'3'-cyclic GMP-AMP and cisplatin under steady state and inflammation. J Immunol. 206 (9), 2061-2074 (2021).
  17. Zhou, C., et al. Transfer of cGAMP into bystander cells via LRRC8 volume-regulated anion channels augments STING-mediated interferon responses and anti-viral immunity. Immunity. 52 (5), 767-781 (2020).
  18. Feustel, P. J., Jin, Y., Kimelberg, H. K. Volume-regulated anion channels are the predominant contributors to release of excitatory amino acids in the ischemic cortical penumbra. Stroke. 35 (5), 1164-1168 (2004).
  19. Mongin, A. A. Volume-regulated anion channel--a frenemy within the brain. Pflügers Arch. 468 (3), 421-441 (2016).
  20. Schober, A. L., Wilson, C. S., Mongin, A. A. Molecular composition and heterogeneity of the LRRC8-containing swelling-activated osmolyte channels in primary rat astrocytes. J Physiol. 595 (22), 6939-6951 (2017).
  21. Lutter, D., Ullrich, F., Lueck, J. C., Kempa, S., Jentsch, T. J. Selective transport of neurotransmitters and modulators by distinct volume-regulated LRRC8 anion channels. J Cell Sci. 130 (6), 1122-1133 (2017).
  22. Yang, J., et al. Glutamate-releasing SWELL1 channel in astrocytes modulates synaptic transmission and promotes brain damage in stroke. Neuron. 102 (4), 813-827 (2019).
  23. Lee, C. C., Freinkman, E., Sabatini, D. M., Ploegh, H. L. The protein synthesis inhibitor blasticidin s enters mammalian cells via leucine-rich repeat-containing protein 8D. J Biol Chem. 289 (24), 17124-17131 (2014).
  24. Planells-Cases, R., et al. Subunit composition of VRAC channels determines substrate specificity and cellular resistance to Pt-based anticancer drugs. EMBO J. 34 (24), 2993-3008 (2015).
  25. Model, M. A., Nia, F. H., Zook, E., Hollembeak, J. E., Stauber, T. Uptake of fluorescein upon osmotic cell swelling is dependent on the volume-regulated anion channel VRAC/LRRC8. Paracelsus Proc Exp Med. 1 (1), 3-14 (2022).
  26. Stauber, T. The volume-regulated anion channel is formed by LRRC8 heteromers - molecular identification and roles in membrane transport and physiology. Biol Chem. 396 (9-10), 975-990 (2015).
  27. Bertelli, S., et al. Mechanisms of activation of LRRC8 volume regulated anion channels. Cell Physiol Biochem. 55 (S1), 41-56 (2021).
  28. Liu, T., Li, Y., Wang, D., Stauber, T., Zhao, J. Trends in volume-regulated anion channel (VRAC) research: visualization and bibliometric analysis from 2014 to 2022. Front Pharmacol. 14, 1234885(2023).
  29. Strange, K., Yamada, T., Denton, J. S. A 30-year journey from volume-regulated anion currents to molecular structure of the LRRC8 channel. J Gen Physiol. 151 (2), 100-117 (2019).
  30. Osei-Owusu, J., Yang, J., Vitery, M. D. C., Qiu, Z. Molecular biology and physiology of volume-regulated anion channel (VRAC). Curr Top Membr. 81, 177-203 (2018).
  31. Friard, J., Laurain, A., Rubera, I., Duranton, C. LRRC8/VRAC channels and the redox balance: A complex Relationship. Cell Physiol Biochem. 55 (S1), 106-118 (2021).
  32. Syeda, R., et al. LRRC8 proteins form volume-regulated anion channels that sense ionic strength. Cell. 164 (3), 499-511 (2016).
  33. Ullrich, F., Reincke, S. M., Voss, F. K., Stauber, T., Jentsch, T. J. Inactivation and anion selectivity of volume-regulated anion channels (VRACs) depend on C-terminal residues of the first extracellular loop. J Biol Chem. 291 (33), 17040-17048 (2016).
  34. König, B., Stauber, T. Biophysics and structure-function relationships of LRRC8-formed volume-regulated anion channels. Biophys J. 116 (7), 1185-1193 (2019).
  35. Concepcion, A. R., et al. The volume-regulated anion channel LRRC8C suppresses T cell function by regulating cyclic dinucleotide transport and STING-p53 signaling. Nat Immunol. 23 (2), 287-302 (2022).
  36. Gradogna, A., Gavazzo, P., Boccaccio, A., Pusch, M. Subunit-dependent oxidative stress sensitivity of LRRC8 volume-regulated anion channels. J Physiol. 595 (21), 6719-6733 (2017).
  37. Bertelli, S., Zuccolini, P., Gavazzo, P., Pusch, M. Molecular determinants underlying volume-regulated anion channel subunit-dependent oxidation sensitivity. J Physiol. 600 (17), 3965-3982 (2022).
  38. Deneka, D., Sawicka, M., Lam, A. K. M., Paulino, C., Dutzler, R. Structure of a volume-regulated anion channel of the LRRC8 family. Nature. 558 (7709), 254-259 (2018).
  39. Kasuya, G., et al. Cryo-EM structures of the human volume-regulated anion channel LRRC8. Nat Struct Mol Biol. 25 (9), 797-804 (2018).
  40. Kefauver, J. M., et al. Structure of the human volume regulated anion channel. Elife. 7, e38461(2018).
  41. Takahashi, H., Yamada, T., Denton, J. S., Strange, K., Karakas, E. Cryo-EM structures of an LRRC8 chimera with native functional properties reveal heptameric assembly. Elife. 12, e82431(2023).
  42. Sawicka, M., Dutzler, R. Regulators of cell volume: The structural and functional properties of anion channels of the LRRC8 family. Curr Opin Struct Biol. 74, 102382(2022).
  43. Kasuya, G., Nureki, O. Recent advances in the structural biology of the volume-regulated anion channel LRRC8. Front Pharmacol. 13, 896532(2022).
  44. Deneka, D., et al. Allosteric modulation of LRRC8 channels by targeting their cytoplasmic domains. Nat Commun. 12 (1), 5435(2021).
  45. König, B., Hao, Y., Schwartz, S., Plested, A. J., Stauber, T. A FRET sensor of C-terminal movement reveals VRAC activation by plasma membrane DAG signaling rather than ionic strength. Elife. 8, e45421(2019).
  46. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. 3rd edn. , Sinauer. Sunderland, Massachusetts. (2001).
  47. Pedersen, S. F., Okada, Y., Nilius, B. Biophysics and physiology of the volume-regulated anion channel (VRAC)/volume-sensitive outwardly rectifying anion channel (VSOR). Pflügers Arch. 468 (3), 371-383 (2016).
  48. Kolobkova, Y., Pervaiz, S., Stauber, T. The expanding toolbox to study the LRRC8-formed volume-regulated anion channel VRAC. Curr Top Membr. 88, 119-163 (2021).
  49. Galietta, L. J., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Lett. 499 (3), 220-224 (2001).
  50. Bykova, E. A., Zhang, X. D., Chen, T. Y., Zheng, J. Large movement in the C terminus of CLC-0 chloride channel during slow gating. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1115-1119 (2006).
  51. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  52. Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5217-5222 (2013).
  53. Zachariassen, L. G., et al. Structural rearrangement of the intracellular domains during AMPA receptor activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (27), E3950-E3959 (2016).
  54. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), e17896(2011).
  55. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20 (1), 87-90 (2002).
  56. Chen, L., König, B., Stauber, T. LRRC8 channel activation and reduction in cytosolic chloride concentration during early differentiation of C2C12 myoblasts. Biochem Biophys Res Commun. 532, 482-488 (2020).
  57. Maeno, E., Ishizaki, Y., Kanaseki, T., Hazama, A., Okada, Y. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9487-9492 (2000).
  58. Shimizu, T., Numata, T., Okada, Y. A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume-sensitive Cl- channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (17), 6770-6773 (2004).
  59. Elder, A. D., et al. A quantitative protocol for dynamic measurements of protein interactions by Förster resonance energy transfer-sensitized fluorescence emission. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl 1 S59-S81 (2009).
  60. Glauner, K. S., Mannuzzu, L. M., Gandhi, C. S., Isacoff, E. Y. Spectroscopic mapping of voltage sensor movement in the Shaker potassium channel. Nature. 402 (6763), 813-817 (1999).
  61. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 686-694 (2019).
  62. Renart, M. L., et al. Conformational plasticity in the KcsA potassium channel pore helix revealed by homo-FRET studies. Sci Rep. 9 (1), 6215(2019).
  63. Wang, S., et al. Potassium channel selectivity filter dynamics revealed by single-molecule FRET. Nat Chem Biol. 15 (4), 377-383 (2019).
  64. Harley, C. A., et al. Conformation-sensitive antibody reveals an altered cytosolic PAS/CNBh assembly during hERG channel gating. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (44), e2108796118(2021).
  65. Han, S., et al. Structural dynamics determine voltage and pH gating in human voltage-gated proton channel. Elife. 11, e73093(2022).
  66. Cullinan, M. M., Klipp, R. C., Camenisch, A., Bankston, J. R. Dynamic landscape of the intracellular termini of acid-sensing ion channel 1a. Elife. 12, e90755(2023).
  67. Kim, J., Won, J., Chung, D. K., Lee, H. H. FRET analysis of the temperature-induced structural changes in human TRPV3. Sci Rep. 13 (1), 10108(2023).
  68. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Sci STKE. (176), PL7(2003).
  69. Kusch, J., Zifarelli, G. Patch-clamp fluorometry: electrophysiology meets fluorescence. Biophys J. 106 (6), 1250-1257 (2014).
  70. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. J Gen Physiol. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  71. Bhat, S., Blunck, R. Characterising ion channel structure and dynamics using fluorescence spectroscopy techniques. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1427-1445 (2022).
  72. Yamada, T., Figueroa, E. E., Denton, J. S., Strange, K. LRRC8A homohexameric channels poorly recapitulate VRAC regulation and pharmacology. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (3), C293-C303 (2021).
  73. Yamada, T., Wondergem, R., Morrison, R., Yin, V. P., Strange, K. Leucine-rich repeat containing protein LRRC8A is essential for swelling-activated Cl- currents and embryonic development in zebrafish. Physiol Rep. 4 (19), e12940(2016).
  74. Pervaiz, S., Kopp, A., von Kleist, L., Stauber, T. Absolute protein amounts and relative abundance of volume-regulated anion channel (VRAC) LRRC8 subunits in cells and tissues revealed by quantitative immunoblotting. Int J Mol Sci. 20 (23), 5879(2019).
  75. Kern, D. M., et al. Structural basis for assembly and lipid-mediated gating of LRRC8A:C volume-regulated anion channels. Nat Struct Mol Biol. 30 (6), 841-852 (2023).
  76. Rutz, S., Deneka, D., Dittmann, A., Sawicka, M., Dutzler, R. Structure of a volume-regulated heteromeric LRRC8A/C channel. Nat Struct Mol Biol. 30 (1), 52-61 (2023).
  77. Li, P., et al. LRRC8 family proteins within lysosomes regulate cellular osmoregulation and enhance cell survival to multiple physiological stresses. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (46), 29155-29165 (2020).
  78. Kashyap, P., et al. An optogenetic method for the controlled release of single molecules. Nat Methods. 21 (4), 666-672 (2024).
  79. Liu, T., Stauber, T. The volume-regulated anion channel LRRC8/VRAC is dispensable for cell proliferation and migration. Int J Mol Sci. 20 (11), e2663(2019).
  80. Zhang, Y., et al. Polarized NHE1 and SWELL1 regulate migration direction, efficiency and metastasis. Nat Commun. 13 (1), 6128(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kana y LRRC8anionowy kana regulowany obj to ciowostymulacja osmotycznatransport jonowykom rki HeLaaktywacja kana wbufor hipotonicznyobrazowanie time lapseindukcja apoptozy
Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.