Artykuł metodologiczny

Optymalizacja zbierania łez u myszy do analizy mRNA i białek

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja biomarkerów RNA i białek z łez w modelach mysich jest bardzo obiecująca dla wczesnej diagnostyki różnych chorób. Manuskrypt ten zawiera kompleksowy protokół optymalizacji skuteczności i efektywności izolacji mRNA i białek z łez myszy.

Streszczenie

Film łzowy jest wysoce dynamicznym płynem biologicznym zdolnym do odzwierciedlania zmian molekularnych związanych z patologią, nie tylko na powierzchni oka, ale także w innych tkankach i narządach. Analiza molekularna tego biopłynu oferuje nieinwazyjny sposób diagnozowania lub monitorowania chorób, oceny skuteczności leczenia i identyfikacji możliwych biomarkerów. Ze względu na ograniczoną objętość próbki, pobieranie próbek łez wymaga określonych umiejętności i odpowiednich narzędzi, aby zapewnić wysoką jakość i maksymalną wydajność. W badaniach na ludziach opisano różne metodologie pobierania próbek łez. W tym artykule przedstawiono obszerny opis zoptymalizowanego protokołu, specjalnie dostosowanego do ekstrakcji informacji o białkach związanych z łzami z eksperymentalnych modeli zwierzęcych, zwłaszcza myszy. Metoda ta obejmuje farmakologiczną stymulację produkcji łez u 2-miesięcznych myszy, a następnie pobranie próbki za pomocą pasków Schirmera oraz ocenę skuteczności i efektywności protokołu za pomocą standardowych procedur, SDS-PAGE, qPCR i digital PCR (dPCR). Protokół ten można łatwo dostosować do badania sygnatury białka łez w różnych paradygmatach eksperymentalnych. Ustanawiając przystępny cenowo, ustandaryzowany i zoptymalizowany protokół pobierania próbek łez dla modeli zwierzęcych, celem było wypełnienie luki między badaniami na ludziach i zwierzętach, ułatwiając badania translacyjne i przyspieszając postępy w dziedzinie badań nad chorobami oczu i układem.

Wprowadzenie

Łzy są uważane za ultrafiltrat osocza i zostały również opisane jako płyn pośredni między surowicą osocza a płynem mózgowo-rdzeniowym ze względu na znaczne nakładanie się biomolekuł, które dzielą1. Doniesiono, że ludzkie łzy zawierają białka, lipidy łzowe, metabolity i elektrolity2. Ostatnio zidentyfikowano również inne biomolekuły, takie jak mRNA, miRNA i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe 3,4,5,6,7.

U ludzi łzy podstawne znajdują się w filmie łzowym, który składa się z trzech warstw: zewnętrznej warstwy lipidowej, która utrzymuje gładką powierzchnię łzy, abyśmy mogli przez nią widzieć i zapobiegać parowaniu łez; środkowa warstwa wodnista, która utrzymuje nawilżenie oka, odpycha bakterie, chroni rogówkę i stanowi 90% filmu łzowego; I wreszcie warstwa mucyny, rodzina białek o dużej masie cząsteczkowej, które mają kontakt z rogówką i umożliwiają łzę przyleganie do oka8. Rozkład łez na powierzchni oka rozpoczyna się od wydzieliny z gruczołu łzowego. Płyn ten jest następnie kierowany przez kanaliki łzowe, aby przejść przez powierzchnię oka i spłynąć do kanałów drenażowych. Każde mrugnięcie pozwala łzom równomiernie rozprowadzić się po całym oku, utrzymując je wilgotne9.

Film łzowy jest wysoce dynamicznym płynem biologicznym zdolnym do odzwierciedlania zmian molekularnych, które zachodzą nie tylko na powierzchni oka, ale także w innych tkankach i narządach. Analiza zróżnicowanej ekspresji w tym biopłynie stanowi obiecujące podejście do odkrywania biomarkerów w chorobach człowieka10,11. Wykorzystanie filmu łzowego jako źródła biomarkerów do wczesnej diagnozy w różnych patologiach zostało znacznie ułatwione dzięki obecności nieinwazyjnych metod pobierania. Najczęstszą metodą pobierania łez w klinikach klinicznych i weterynaryjnych jest podparcie błonowe (pasek Schirmera), które działa na zasadzie działania kapilarnego, umożliwiając wodzie we łzach przemieszczanie się wzdłuż długości papierowego paska testowego lub rurki kapilarnej umieszczonej w dolnym worku spojówkowym pacjenta12,13, Rozdział 14. Pomimo nieodłącznego ograniczenia polegającego na uzyskiwaniu małej objętości próbki za pomocą tej metody, analiza biochemiczna składu łez przy użyciu różnych czułych technik ułatwiła identyfikację potencjalnych cząsteczek biomarkerów11,15. Protokoły optymalizacji i oceny elucji białek łez z pasków Schirmera i naczyń włosowatych u ludzi są dobrze udokumentowane16,17. Jednak pełne opisy zoptymalizowanych protokołów zaprojektowanych specjalnie do ekstrakcji informacji molekularnych związanych z łzami z eksperymentalnych modeli zwierzęcych są dostępne, ale niewiele. Istniejące metody, takie jak indukcja łez poprzez bezpośrednią stymulację gruczołu łzowego18, pozwalając jednocześnie na pobieranie większych objętości, są inwazyjne i mogą powodować dyskomfort u zwierząt. Metody nieinwazyjne, takie jak pobieranie łez z powierzchni oka, zostały opisane jako sposób izolacji DNA i miRNA19,21.

Protokół ten ma na celu ustanowienie opłacalnej i zoptymalizowanej metody zbierania i przetwarzania łez u myszy. Metoda ta stawia na pierwszym miejscu nieinwazyjność przy jednoczesnym uzyskaniu wystarczającej objętości łez odpowiednich do analizy molekularnej za pomocą technik takich jak SDS-PAGE, qPCR i dPCR. Wyekstrahowane informacje o zawartości białka i mRNA można następnie wykorzystać do identyfikacji potencjalnych biomarkerów w istniejących eksperymentalnych modelach choroby.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Zwierzęta laboratoryjne były traktowane i obchodzone w ścisłej zgodności z wytycznymi czasopisma dotyczącymi wykorzystania zwierząt oraz zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zdrowie oczu przed i po zabiegach oceniano, oceniając wydzieliny z oczu, obrzęk powiek, nieprawidłowości oczne i zmiany w zachowaniu.

1. Zwierzęta i przygotowanie odczynników

  1. Do zabiegu należy użyć trzech 2-miesięcznych samców myszy C57BL/6 na powtórzenie, o masie wyjściowej ~25 g (ryc. 1). Przetwarzaj każdą mysz indywidualnie i umieść ją na poduszce grzewczej, aby utrzymać ciepło.
  2. Aby wywołać wydzielanie łez, należy przygotować roztwór podstawowy pilokarpiny w stężeniu 20 mg/ml przy użyciu jałowej wody.
  3. Przytnij paski testowe Schirmera do długości 5 mm i zegnij każdy pasek przy nacięciu pod kątem 90°.
  4. Przygotuj 250 μl sterylnej wody z inhibitorem proteazy (1 tabletka na 50 ml, zgodnie z instrukcją producenta).

2. Stymulacja i zbieranie produkcji łez

  1. Zważ każdą mysz indywidualnie, aby obliczyć odpowiednią dawkę zabiegów.
  2. Aby pobudzić wytwarzanie łez, należy podać 30 mg/kg pilokarpiny dootrzewnowo za pomocą strzykawki insulinowej 6 mm (ryc. 1B). Odczekaj 2 minuty po wstrzyknięciu leku, aby jego efekty się ujawniły.
    UWAGA: Nie można było uzyskać danych od zwierząt niestymulowanych ze względu na ograniczoną dostępność płynu łzowego.
  3. Zbierz łzy, umieszczając koniec każdego fragmentu paska Schirmera na środku dolnej powieki za pomocą pęsety i utrzymuj go na miejscu, aż łza osiągnie granicę paska (ryc. 1C). Następnie wymień pasek. Kolejno umieść 2 paski Schirmera w każdym oku, zachowując 2-minutowy odstęp między paskami do pobrania. Proces zbierania łez wymaga około czterech fragmentów pasków w ciągu 10 minut na mysz.
  4. Umieść fragmenty pasków Schirmera w sterylnych probówkach na lodzie, aby uniknąć degradacji składników. Jak tylko zbiórka się zakończy, rozpocznij przetwarzanie łez.

3. Izolacja białek

  1. Umieścić fragmenty pasków w probówce mikrowirówkowej o pojemności 600 μl zawierającej 20 μl sterylnej wody z inhibitorem proteazy i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C, jak pokazano poprzednio17 (rysunek 1D).
  2. Wykonać nakłucie za pomocą igły iniektora ze stali nierdzewnej o długości 7,5 cm na końcu probówki o pojemności 600 μl zawierającej próbkę (rysunek 1E). Następnie przenieś tę przebitą probówkę do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj próbki przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, jak wcześniej podano17, aby odzyskać objętość rozcieńczonych łez. Objętość filmu łzowego (supernatantu) będzie znajdować się na dnie probówki.
  3. Utwórz pulę białek, łącząc supernatant odzyskany ze wszystkich próbek. W tym eksperymencie uzyskano całkowitą objętość około 200 μL.
    UWAGA: Produkcja łez może trwać ponad 1 godzinę. W tym czasie nadal można zbierać łzy.
  4. Określić ilościowo całkowitą zawartość białka w puli łez, stosując standardową metodę Bradforda22.

4. Analiza SDS-PAGE

  1. Podgrzewać próbki białek w temperaturze 99 °C przez 4 minuty w celu denaturacji białek. Krótko zmieszać próbki, aby wymieszać składniki.
  2. Załadować 30 μg oznaczonej ilościowo zawartości białka z każdej próbki do 10% żelu SDS-PAGE (Tabela 1) i badać próbki pod napięciem 90 V przez 2 godziny, stosując metodę standardową23.
  3. Po elektroforezie przykryj żel roztworem barwiącym (Tabela 1) i inkubuj przez 30 minut w celu wybarwienia białek.
  4. Spłucz żel roztworem odbarwiającym kilka razy, aż tło stanie się czyste i widoczne będą pasma białkowe.
  5. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu dokumentacji żelu.

5. Izolacja mRNA do qPCR i digital PCR

  1. Umieść paski w probówce mikrowirówkowej o pojemności 600 μl zawierającej 20 μl sterylnej wody. Wykonać nakłucie na końcu probówki zawierającej próbkę, umieścić ją w nowej wysterylizowanej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować, jak wcześniej opisano w Human Tears3, przez 20 minut w temperaturze 2000 x g w temperaturze 4 °C (Rysunek 1E-H).
  2. Utwórz pulę ze wszystkich przykładów. Odzyskana objętość w tym eksperymencie wynosiła około 22 μl supernatantu na każdą mysz, tj. 66 μl całkowitej objętości. Umieść probówki na suchym lodzie, aby uniknąć degradacji biomolekuł.
  3. Dodać 200 μl jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny (otrzymywanego w handlu) i homogenizować przez pipetowanie. Odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni lub w temperaturze -70 °C przez kilka miesięcy.
  4. Dodaj 40 μl chloroformu i mieszaj w wirze przez 15 sekund. Odstawić na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
  5. Ostrożnie przenieś fazę wodną (bez pobierania interfazy) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 0,5 μl glikogenu (0,05 μg/μl) do 100 μl izopropanolu i wymieszać pipetując. Glikogen jest współstrącany z RNA i nie ingeruje w kolejne etapy.
  7. Odstawić na 10 minut w temperaturze -20 °C. Odwirować w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Szybko zdekantować supernatant.
  8. Dodaj 200 μl zimnego 75% etanolu i ponownie zawiesić osad RNA przez wirowanie. Wirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Zdekantować etanol. Nie odwracając rurki, pozostaw ją do wyschnięcia na powietrzu przez 20-30 minut. Dodać 20 μl wody wolnej od RNaz i zawiesić ponownie.
  10. Kontynuuj odczyt gęstości optycznej w spektrofotometrze mikroobjętościowym przy 260 nm i 280 nm, aby ocenić czystość RNA. Próbki muszą znajdować się na lodzie.
    UWAGA: Pasma rybosomalne 28S i 18S nie mogą być obserwowane przy użyciu żelu agarozowego ze względu na charakter próbki. Obecność innych RNA, takich jak miRNA lub mRNA, może być analizowana za pomocą bioanalizatora, jak pokazano wcześniej18.
  11. Zsyntetyzuj cDNA z RNA łez za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    1. Zacznij od wejściowego RNA w zakresie od 10 ng do 5000 ng; w zależności od zastosowanego zestawu wymieszać go z 1 μl Oligo (dT) i do 12 μL wody wolnej od RNaz. Wirować w temperaturze 500 x g przez 30 s i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    2. Dodać do probówki mieszającej 4 μl 5x buforu reakcyjnego, 1 μl inhibitora RNazy, 2 μl mieszaniny dNTP i 1 μl odwrotnej transkryptazy.
    3. Obracaj probówkę o wymiarach 500 x g przez 30 sekund, aby ściągnąć mieszaninę. Następnie inkubować probówkę w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Zakończyć reakcję przez inkubację probówki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  12. Ze względu na niskie stężenie mRNA we łzach zaleca się stosowanie nierozcieńczonego cDNA do qPCR24. W tym eksperymencie użyto 150 ng cDNA. Wykonaj qPCR przy użyciu starterów DNMT3a :
    Do przodu: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Do tyłu: Startery CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA i GAPDH :
    Do przodu: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCCTA, Do tyłu: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC zgodnie z instrukcjami producentów i procedurami sprzętowymi.
    1. W przypadku cyklu qPCR należy użyć następującego programu: Początkowa denaturacja: 95 °C przez 10 minut, następnie 45 cykli C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s i 72 °C - 30 s, zakończ końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
    2. Wykonaj analizę krzywej topnienia, aby ocenić obecność dimerów starterów lub niespecyficznych amplikonów w reakcji. Wzrost temperatury zaczynał się od 50 °C do końcowych 99 °C, z początkowym zatrzymaniem wynoszącym 90 s dla pierwszego kroku i utrzymaniem przez 5 s między każdym krokiem.
    3. W przypadku dPCR25 wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby zoptymalizować ilość cDNA wymaganą do wykrycia interesującego mRNA. W tym eksperymencie użyj następujących rozcieńczeń cDNA w wodzie wolnej od nukleaz: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng i 18,75 ng cDNA. Zastosowano wcześniej wspomniane startery do DNMT3a . W przypadku cyklu dPCR należy użyć następującego programu: początkowa denaturacja: 95 °C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli 95 °C - 15 s i 60 °C - 30 s.

Wyniki

Protokół opisany w tym artykule zapewnia łatwą i niedrogą metodę uzyskiwania informacji molekularnych z płynu łzowego przy użyciu technik powszechnie dostępnych w większości laboratoriów biologii molekularnej. Co więcej, protokół można rozszerzyć poprzez zastosowanie bardzo czułych technik, takich jak ELISA, do wykrywania aktywności enzymatycznej.

Po tych procedurach całkowita wydajność białka wynosiła około 3-4 μg / μL. Analiza strony SDS wybarwionej Coomassie całkowitych ekstraktów białkowych ujawnia wzorce ekspresji białek w całkowitej siatkówce i łzach (Figura 2A).

Wyizolowane RNA miało współczynnik absorpcji UV 260/280 między 1,9 a 2,0. Średnia wydajność wyniosła 134,8 ng/μL. qPCR przeprowadzono przy użyciu zestawów starterów dla genu porządkowego (dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego, GAPDH)3 i przypuszczalnego genu biomarkera (DNA-metylotransferaza 3a, DNMT3a)26. Użyto nierozcieńczonej próbki cDNA w stosunku 1:1 (150 ng).

Przeprowadzono analizę krzywej topnienia, a w oprogramowaniu qPCR obliczono współczynniki Ct . Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Analiza wykazała wartości Ct między 20 a 24, co jest odpowiednim zakresem wyjściowej ilości docelowego mRNA w próbce (Figura 2B). Jednak analiza krzywej topnienia na rysunku 2C sugeruje niską obecność docelowego mRNA. Niemniej jednak 2% żel agarozowy potwierdził obecność amplikonów o oczekiwanej wielkości (ryc. 2D).

dPCR przeprowadzono przy użyciu tej samej pary zestawów starterów dla DNMT3a. Rozcieńczenia użytych próbek cDNA wynosiły 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. dPCR był w stanie wykryć od 1,33 kopii/μl w nierozcieńczonej próbce do 0,45 kopii/μl w 8-krotnie rozcieńczonej próbce (ryc. 3A,3B). W związku z tym dPCR wykazał zwiększoną wrażliwość na docelowe mRNA obecne we łzach w porównaniu z qPCR.

figure-results-1
Ryc. 1: Schemat protokołu ekstrakcji łez od myszy. (a) Zbieranie łez. Wykorzystano trzy 2-miesięczne myszy C57BL/6J. (B) Wytwarzanie łez było farmakologicznie indukowane przez dootrzewnowe podawanie pilokarpiny. Fotografia ilustrująca rozmieszczenie wstęgi Schirmera. (c) Przetwarzanie łez. Łzy były następnie zbierane za pomocą pasków Schirmera przez 10 minut i przenoszone do probówek do mikrowirówek. (D) Łzy zebrane w paskach Schirmera odwirowano sterylną wodą i inhibitorami proteazy lub po prostu sterylną wodą. (E, F) Probówki te zostały perforowane na dole, a następnie przeniesione do nowej, wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 ml, aby ułatwić eluzę płynu. (G, H) Łzy zbiera się w 1,5 probówce o pojemności 1,5 ml. (I) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające procedurę zbierania łez. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dalsza analiza filmu łzowego do zastosowań molekularnych. (A) SDS-PAGE łez myszy i ekstrakt z białka siatkówki. MW: Marker masy cząsteczkowej.; Tor 1: Profile białkowe siatkówki (30 μg); Tor 2: profile białkowe łez (30 μg). (B) qPCR dla GAPDH i DNMT3a we łzach myszy. Średnie CT i ΔCT przedstawiono w tabeli 2. (C) Analiza krzywej topnienia dla produktów DNMT3a i GAPDH PCR. Oś y reprezentuje szybkość zmiany fluorescencji w reakcji amplifikacji (dF/dT), a oś x reprezentuje temperaturę w °C (D) Analiza amplikonu PCR w 2% elektroforezie w żelu agarozowym zawierającej 0,5 μg/ml bromku etydyny. Pas M: 1 kb plus drabinka DNA. Tor 1,2: odpowiednio amplikon GAPDH i DNMT3a PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Cyfrowy PCR (dPCR) pod kątem ekspresji DNMT3a w łzach myszy. (A) wyniki dPCR są wyświetlane jako wykres punktowy 1D pokazujący w niebieskich kropkach kopie transkrypcji DNMT3a . Czarne kropki to partycje bez obecnych kopii transkrypcji DNMT3a . (B) Wygenerowano serię rozcieńczeń cDNA w celu określenia optymalnego stężenia do ilościowego oznaczania kopii transkryptu DNMT3a . Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa materiałuOpis
10% żel SDSNa jeden żel separacyjny: 3,8 ml destylowanego H2O; 2,6 ml Tris; pH 8,8; 1,5 M 3,4 ml akryloamidu; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μl TEMED.
Na jeden żel zbiorczy: 2,72 ml destylowanego H2O, 0,52 ml Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,68 ml akryloamidu, 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS 4 μL TEMED.
Bufor do elektroforezy250 mM Baza Tris, 2 M Glicyna, 1% SDS
Roztwór do barwieniaRozpuść następujące odczynniki w 43 ml wody (przechowywać w temperaturze pokojowej w bursztynowej butelce): Coomassie 0,25 g; kwas octowy 7 ml; metanol 50 ml
Roztwór do odbarwianiaRozpuścić następujące odczynniki w 63 ml wody (przechowywać w temperaturze pokojowej): kwas octowy 7 ml; etanol 30 ml

Tabela 1. Skonfiguruj dla SDS-Page.

Nazwa genuZobacz materiał CT1Zobacz materiał CT2Średnia z SDΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
Jednostka DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

Tabela 2. Wartości Ct DNMT3a i GAPDH we łzach myszy.

Dyskusja

Płyn łzowy jest łatwo dostępny, a oznaczanie biomarkerów we łzach może być wykorzystane jako skuteczna technika uzupełniająca we wczesnej diagnostyce różnych chorób człowieka27. Podczas gdy analiza biochemiczna składu łez w eksperymentalnych modelach zwierzęcych uzupełnia to podejście i obiecuje znaczny postęp w zrozumieniu molekularnych podstaw chorób, istnieje niedobór dostępnych danych i protokołów, co skłoniło nas do opracowania jednego z nich. Metoda opisana w niniejszym raporcie jest technicznie prosta do wykonania i pozwala na wstępną identyfikację zróżnicowanej ekspresji różnych cząsteczek kandydujących związanych z chorobą.

Zbieranie łez można osiągnąć różnymi metodami, takimi jak rurki kapilarne i paski Schirmera16,17, waciki28i gąbki29. Metoda paskowa Schirmera była preferowana ze względu na łatwość dostępu, możliwości ilościowe, zdolność adaptacji podczas pobierania próbek, koszt i prostotę ekstrakcji składników łez do przetwarzania laboratoryjnego. Dodatkowo metoda ta jest opłacalna, mało inwazyjna i nie stwarza ryzyka kontuzji lub uszkodzenia rogówki, dzięki składowi papierowego paska filtracyjnego16,17. Do krytycznych etapów tego protokołu należy konieczność farmakologicznej stymulacji produkcji łez za pomocą pilokarpiny oraz dobór odpowiedniego buforu elucyjnego.

Pilokarpina jest cholinergicznym agonistą, który wiąże się z receptorami muskarynowymi M3 i może powodować farmakologiczną stymulację gruczołów zewnątrzwydzielniczych, zwiększając produkcję łez, wydzielanie śliny i oddawanie moczu. Chociaż badania na ludziach wykazały, że stymulacja łzami nie zmienia osmolarności pobranego płynu30, to wyraźnie wpływa na profile białkowe31. Stosowanie pilokarpiny jako cholinergicznego farmakologicznego stymulatora gruczołów zewnątrzwydzielniczych i wzmacniacza wydzielania łez zostało z powodzeniem opisane u królików i myszy 19,32,33, ale wpływ stymulacji na zawartość białka nie został oceniony. Aby uniknąć tego ograniczenia i umożliwić dokładne porównanie profili łez w różnych warunkach eksperymentalnych, kluczowe znaczenie ma rozważenie konkretnych ustawień pobierania. Podobnie, wprowadzenie etapu płukania przed pobraniem łez może być korzystne, aby uniknąć wcześniejszego zanieczyszczenia powierzchni oka. W protokole tym zastosowano stężenie pilokarpiny wynoszące 30 mg/kg13. Ponieważ myszy pozostały nieruchome i spokojne po wstrzyknięciu tego leku, łzy zostały zebrane bez znieczulenia, co ułatwiło pobranie próbki.

Wybór odpowiedniego buforu elucyjnego jest ściśle związany z wybraną metodą analizy składu biochemicznego próbki łzy oraz szybkości odzysku materiału biologicznego z paska. Na przykład w badaniu porównawczym skupiającym się na retencji białek z pasków Schirmera u pacjentów ustalono, że bufor składający się ze 100 mM wodorowęglanu amonu wraz z 0,25% Nonidet P40 (NP40) dał lepsze wyniki w zastosowaniach proteomicznych lub multipleksowej analizy ELISA17. W naszych rękach użycie sterylnej wody okazało się wystarczające do wizualizacji całkowitych ekstraktów białkowych w SDS-PAGE i wykrycia mRNA interesujących genów za pomocą PCR.

Aby ocenić obecność mRNA DNMT3a i GAPDH w łzach myszy, porównaliśmy wydajność qPCR i dPCR. Obecność dimerów starterów obserwowana w krzywej topnienia qPCR przypisuje się niskiej liczebności transkryptu DNMT3a . Jak wykazano, dPCR ma znacznie większą czułość i skuteczność w wykrywaniu docelowego mRNA w tych próbkach w próbkach nierozcieńczonych i rozcieńczonych. Ta precyzyjna zdolność wykrywania sprawia, że dPCR jest preferowaną metodą analizy łez u myszy, oferując badaczom i klinicystom niezawodne narzędzie do przyszłych badań i potencjalnych zastosowań klinicznych.

Opracowanie ustandaryzowanego protokołu pobierania próbek łez w modelach zwierzęcych stanowi znaczący postęp w badaniach. Protokół ten nie tylko ułatwia systematyczne i precyzyjne pobieranie próbek łez, ale także otwiera szeroki wachlarz możliwości ich zastosowania w różnych dziedzinach nauki. Możliwość pozyskiwania próbek łez z modeli zwierzęcych pozwala na badanie szerokiego spektrum chorób i stanów, a także na badanie nowych biomarkerów i potencjalnych terapii. Ponadto, ustanawiając ustandaryzowany protokół, zwiększa się odtwarzalność wyników w różnych badaniach i laboratoriach, przyczyniając się w ten sposób do ważności i wiarygodności badań. Ostatecznie, ten postęp w metodologii pobierania próbek łez w modelach zwierzęcych może przyczynić się do ważnych odkryć i lepszego zrozumienia patofizjologii różnych chorób, otwierając nowe możliwości diagnozowania, leczenia i profilaktyki.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez VELUX STIFTUNG [projekt 1852] dla M.L. oraz stypendia podyplomowe od CONAHCYT dla M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) i A.M.F (CVU 1317418). Serdeczne podziękowania dla wszystkich członków laboratorium, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento i Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) za ich wkład w inspirujące dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolGibco (firma Gibco)1985023
2x bufor LaemmliBio-Rad16-0737
Kwas octowyQuimica Meyer64-19-7
AkrylamidSigma-AldrichNr kat. A4058
Odczynnik BradfordSigma-AldrichZobacz materiał B6916
ChloroformSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Niebieski R 250Biologiczny w USA6104-59-2
EtanolQuimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb plus drabinka DNANaukowy ThermofisherZobacz materiał SM1331
GlicerolBiologiczny w USAZobacz materiał G8145
GlicynaSANTA CRUZSC- 29096
GlikogenRoche10901393001
HclQuimica Rique7647-01-0
IzopropylowyQuimica Rique67-63-0
MetanolQuimica Meyer67-56-1
Mikroprobówki 1,5 mlAxygen (Axigen)MCT-150-C
Mikrorurki 600 i mikro; lAxygen (Axigen)MCT-060-C
Zawartość NaClSigma-AldrichS3014 powiedział:
Probówki do PCR i PaskiNovasbio powiedział:PCR 0104 (tkanina PCR)
PilokarpinSigma-AldrichZobacz materiał P6503-10g
Inhibitor proteazyRoche11873580001
Zestaw QIAcuity EvaGreen PCR (5 ml)Qiagen powiedział:250112
QIAcuity Nanoplate 26k, 24-dołkowy (10)Qiagen powiedział:250001
Prawdziwy qPlus 2x Master Mix ZielonyWzmacniaczA323402
Zestaw do syntezy cDNA RevertAid First StradNaukowy ThermofisherZobacz materiał K1622
Paski testowe SchirmeraLaboratorio SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma aldrich102560430
Odczynnik TRISigma-AldrichT9424-200MLJednofazowy roztwór fenolu i izotiocyjanianu guanidyny
TrisBiologiczny w USAZobacz materiał T8650 TGL
Baza TrisChem CruzSC-3715A

Bibliografia

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pobieranie ez u myszyanaliza bia ek zawychanaliza mRNApaski Schirmerastymulacja farmakologicznaSDS PAGEcyfrowy PCRbiomarkery ezmodele chor b oczu

Powiązane artykuły