Artykuł metodologiczny

Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66965

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).

Streszczenie

Ektopowa ekspresja czynników neurogennych in vivo okazała się obiecującym podejściem do zastępowania utraconych neuronów w modelach choroby. Szeroko opisano zastosowanie neuronalnych podstawowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa (bHLH) za pośrednictwem nierozprzestrzeniających się systemów cząstek wirusopodobnych, w tym retrowirusa, lentiwirusa i wirusa związanego z adenowirusem (AAV). W eksperymentach in vivo AAV są coraz częściej stosowane ze względu na ich niską patogenność i możliwość translacji. Protokół ten opisuje dwa systemy AAV do badania ektopowej ekspresji czynników transkrypcyjnych w transdukowanych komórkach po udarze niedokrwiennym. W obu układach ekspresja Neurod1 jest kontrolowana przez krótki promotor GFAP (gfaABC(1)D), który jest regulowany w górę w reaktywnych astrocytach po udarze, a także w neuronach endogennych w połączeniu z ekspresją czynnika neurogennego. W opisanym modelu udaru niedokrwiennego ogniskowe niedokrwienie jest indukowane przez wstrzyknięcie endoteliny-1 (ET-1) do kory ruchowej myszy, tworząc zmianę otoczoną reaktywnymi astrocytami eksprymującymi GFAP i neuronami, które przeżyły. Wstrzyknięcia domózgowe AAV wykonuje się w celu ektopowego wywołania ekspresji Neurod1 w fazie podostrej (7 dni) i przewlekłej (21 dni) po udarze. W ciągu kilku tygodni po wstrzyknięciu AAV znacznie większa liczba neuronów wśród transdukowanych komórek jest identyfikowana u myszy z ektopową ekspresją Neurod1 w porównaniu z myszami otrzymującymi wirusy kontrolne AAV. W strategiach opartych na AAV wykorzystano zaobserwowane wyniki zwiększonej liczby neuronów wyrażających gen reporterowy w modelu łagodnego do umiarkowanego udaru korowego. Protokół ten ustanawia standardową platformę do badania wpływu ektopowej ekspresji czynników transkrypcyjnych dostarczanych za pomocą systemów opartych na AAV, przyczyniając się do zrozumienia ekspresji czynników neurogennych w kontekście udaru.

Wprowadzenie

Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie1. Udar ma miejsce, gdy przepływ krwi do mózgu jest zakłócony. Może się to zdarzyć albo w wyniku udaru krwotocznego (~15% przypadków), w którym pęka naczynie krwionośne w mózgu, albo w wyniku udaru niedokrwiennego, w którym przepływ krwi do mózgu jest zablokowany1. Udary niedokrwienne są najbardziej rozpowszechnione i stanowią ~85% przypadków udarów1. Udar zmniejsza dostarczanie glukozy i tlenu do mózgu, prowadząc do szybkiej śmierci komórek neuronalnych i upośledzenia funkcji neuronalnych.

Udar niedokrwienny prowadzi do utraty komórek w ciągu kilku minut w rdzeniu uszkodzenia poprzez mechanizmy ekscytotoksyczności, stresu oksydacyjnego i nitrozatywnego, dysregulacji wapnia, depolaryzacji rozprzestrzeniania się kory mózgowej, obrzęku, zakłócenia bariery krew-mózg (BBB) i stanu zapalnego2,3. Komórki w regionach okołozawałowych ulegają apoptotycznej śmierci komórkowej w ciągu kilku godzin, a przez kilka dni po udarze4. Środowisko okołozawałowe jest narażone na sygnały pro- i przeciwzapalne, które prowadzą do aktywacji mikrogleju i astrocytów ("reaktywnych" astrocytów), które odgrywają różne role po urazie5,6,7,8. Reaktywne astrocyty przechodzą szereg zmian fenotypowych, które obejmują regulację w górę kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) oraz tworzenie się granicy wokół zmiany w ciągu kilku dni po udarze, co pomaga ograniczyć zakres zmiany, a także wpływa na neuroplastyczność w uszkodzonej tkance8,9,10.

Bezpośrednie przeprogramowanie komórkowe pozwala na przekształcenie jednego typu dojrzałej komórki w inny typ dojrzałej komórki bez przechodzenia przez stan pluripotencjalny11. Przekształcenie rezydentnych komórek mózgowych w nowe neurony w celu zastąpienia tych utraconych w wyniku urazu stanowi atrakcyjną drogę do odbudowy mózgu. Udar mózgu jest idealnym celem dla leczenia opartego na komórkach, biorąc pod uwagę konieczność stosowania metod terapeutycznych w celu zastąpienia utraconych neuronów, poszerzenia ram terapeutycznych i ostatecznie ułatwienia powrotu do sprawności. W tym celu opublikowano wiele prac demonstrujących przeprogramowanie astrocytów do neuronów (AtN) in vitro i in vivo, przy użyciu różnych neurogennych czynników transkrypcyjnych zasadowej helisy-pętli i helisy (bHLH), w tym Ascl1, Neurog2, Neurod1, a ostatnio zmutowanych wersji Ascl1 (Ascl1-SA6), które wykazały zwiększoną skuteczność przeprogramowywania11,12,13,14. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę wiele czynników projektu eksperymentalnego, które mogą wpływać na wyniki, interpretację i porównania między badaniami. Ghazale i in. wykazali, że skuteczność przeprogramowania AtN różniła się między różnymi szczepami myszy, serotypami AAV i promotorami przy użyciu tego samego czynnika transkrypcyjnego bHLH14. Inne czynniki, takie jak model urazu, region mózgu, dawkowanie wirusa, czas dostarczania genów, czynnik przeprogramowania i sposób dostarczania, będą miały wpływ na wyniki. Ostatnie doniesienia wykazały, że istniejące wcześniej transdukowane neurony zostały błędnie zinterpretowane jako przeprogramowane neurony15,16. Chociaż raporty niekoniecznie zaprzeczają, że zachodzi konwersja AtN, badania te podkreśliły znaczenie dobrze kontrolowanych eksperymentów, a kilka artykułów przedstawiło zalecenia dotyczące kolejnych kroków w tej dziedzinie15,17,18,19. Z literatury wynika, że ektopowa ekspresja czynników transkrypcyjnych bHLH może poprawić wyniki funkcjonalne w różnych modelach zwierzęcych choroby/urazów neurodegeneracyjnych13,20,21,22,23,24.

Tutaj ten protokół Neurod1, interesujący czynnik transkrypcyjny, jest ektopowo wyrażany w transdukowanych komórkach13,22. Stosuje się dobrze znany model endoteliny-1 (ET-1) udaru niedokrwiennego kory czuciowo-ruchowej u dorosłych myszy. Wstrzyknięcie ET-1 prowadzi do miejscowego zwężenia naczyń krwionośnych naśladującego patofizjologię udaru niedokrwiennego, w tym upośledzenie funkcjonalne22,23,25. Powszechnie stosowany promotor krótkiego GFAP (gfaABC(1)D) jest używany do napędzania ektopowej ekspresji Neurod1 w miejscu uszkodzenia i regionie okołolezyjnym przy użyciu dwóch strategii wirusowych: (1) dostarczania AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre u myszy typu dzikiego i (2) dostarczania AAV5-GFAP-Neurod1-Cre u myszy reporterowych tdTom-Cre. Aby lepiej zrozumieć potencjał ektopowej ekspresji Neurod1 w mózgu uszkodzonym po udarze, AAV podawano w fazie podostrej (7 dni) lub w fazie przewlekłej (21 dni) po udarze. W obu paradygmatach znacznie więcej znakowanych neuronów znaleziono w ciągu kilku tygodni po ektopowej ekspresji Neurod1.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Toronto i jest zgodny z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt doświadczalnych (2 edycja, Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami, 2017). W tym badaniu reporter typu dzikiego (C57BL/6J) i transgeniczny tdTom-Cre (B6. Użyto szczepów myszy Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 szczepy myszy. Myszy miały 7-9 tygodni i były wśród nich zarówno samce, jak i samice. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Endotelina-1 operacja udaru

UWAGA: Wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed operacją. Ramka stereotaktyczna jest sterylizowana za pomocą PREempt. Strzykawki są sterylizowane PREempt, 70% alkoholem i zalewane sterylnym PBS przed operacją. Endotelina-1 (ET-1) jest przechowywana na lodzie przez cały czas trwania operacji.

  1. Przed rozpoczęciem zabiegu należy przygotować obszar rekonwalescencji, umieszczając czystą klatkę na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. Alternatywnie, jeśli używana jest lampa grzewcza, umieść tylko połowę klatki pod wpływem ciepła.
    1. Aby znieczulić myszy za pomocą izofluranu, postępuj zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i włącz tlen do 1-1,5 l/min, a następnie wyreguluj parownik izofluranu na 3%-5%, aby rozpocząć znieczulenie.
  2. Wyjmij zwierzę z komory, gdy leży na boku i nie może już stać, i umieść je na czystej powierzchni. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, potwierdzając brak odruchu szczypania palców u nóg przed i w trakcie operacji.
    1. Zabezpiecz stożek nosowy wysunięty z urządzenia znieczulającego na zwierzęciu i dostosuj izofluran do 1%-2% w celu konserwacji. Należy zminimalizować narażenie na izofluran (5 minut przy 3%-5% w przypadku indukcji i pozostały czas przy 1%-2%), ponieważ procedura może trwać do 40 minut.
  3. Użyj trymerów do sierści zwierzęcej, aby usunąć sierść z szyi/za uszami do nosa zwierzęcia, aby odsłonić skórę czaszki do operacji.
  4. Zważyć zwierzę i podać podskórnie odpowiednią dawkę przedoperacyjnego leku przeciwbólowego (meloksykam (2,0 mg/kg)) w zależności od masy ciała.
  5. Nałóż maść z lubrykantem do oczu na każde oko myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia.
  6. Wysterylizuj obszar skóry strzyżony sierścią (krok 1.3) 70% etanolem, a następnie dwukrotnie alkoholem chlorheksydyny, aby utworzyć pole operacyjne.
  7. Przenieś mysz na stereotaktyczną ramkę myszy, umieszczając najpierw jej nos w stereotaktycznym stożku nosowym, a następnie ustabilizuj czaszkę za pomocą nauszników. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aby zapewnić wsparcie termiczne przez cały zabieg chirurgiczny. Utrzymuj izofluran na poziomie 1%-2%, tak aby częstość oddechów myszy wynosiła 1 oddech/s.
  8. W razie potrzeby powtórz aplikację smarowania oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu. Nałóż sterylną serwetę chirurgiczną na ciało myszy, poniżej uszu, aby zwiększyć rozmiar sterylnego pola.
  9. Wykonaj pionowe nacięcie równolegle do płaszczyzny strzałkowej zwierzęcia od tyłu środkowego punktu oczu do tyłu głowy (kości ciemieniowej) za pomocą ostrza skalpela #10. Odsłoń czaszkę, delikatnie cofając skórę na boki.
  10. Użyj patyczka higienicznego, aby przerwać powięź na czaszce i pozwól czaszce wyschnąć, aby odsłonić bregmę.
  11. Ustaw ramiona manipulatora z uchwytem wiertarskim przenoszącym szybkoobrotową wiertarkę stereotaktyczną z wiertłem .018".
  12. Wywierć 3 otwory na zadziory (średnica 0,018 cala) za pomocą szybkiego wiertła stereotaktycznego na współrzędnych w prawej korze czuciowo-ruchowej na 2,25 mm bocznie do bregmy i +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral i -1,0 mm ogonowo do bregma.
  13. Zastąp wiertło strzykawką 26 G z igłą o długości 0,375".
  14. Do strzykawki wsypać 1,5 μl 400 μM ET-1 rozpuszczonego w sterylnym PBS. Aby zapewnić dobry przepływ, uwolnij niewielką objętość ET-1, aż będzie można zaobserwować kroplę na końcu igły. Użyj sterylnej patyczka higienicznej, aby zetrzeć nadmiar przed wykonaniem wstrzyknięcia.
  15. Opuść końcówkę igły za czaszkę w środkowym otworze zadziorowym (w prawej korze czuciowo-ruchowej na poziomie + 0,0 z przodu i 2,25 mm z boku do bregmy) bez nakłuwania opony twardej. Po wyrównaniu opuść igłę na 1 mm w głąb mózgu.
  16. Wstrzyknąć 1 μl ET-1, dozując jednorazowo 0,1 μl. Popchnąć tłok strzykawki Hamilton do przodu, aby dozować 0,1 μl i odczekać minutę przed wstrzyknięciem następnego 0,1 μl, wstrzykiwać, aż zostanie dozowany 1 μl.
    1. Po wydaniu ostatniego 0,1 μl (0,1 μl x 10 wstrzyknięć = łącznie 1 μl), przytrzymaj igłę na miejscu przez 10 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu, a następnie powoli wycofaj się w górę, aby wyjąć strzykawkę.
  17. Aby upewnić się, że igła nie zostanie zablokowana podczas wstrzykiwania, należy zwolnić niewielką objętość ET-1 do momentu, gdy na końcu igły będzie można zaobserwować kroplę. Użyj sterylnej patyczka higienicznej, aby zetrzeć nadmiar przed wykonaniem wstrzyknięcia. Wysterylizuj strzykawki przed wstrzyknięciem następnemu zwierzęciu za pomocą PREempt, a następnie 70% alkoholu, a następnie sterylnego PBS.
  18. Aby zamknąć ranę, zszyj przylegającą do niej skórę na czaszce za pomocą sterylnego szwu poliestrowego 4-0 polysorb.
  19. Podawaj maść z antybiotykiem za pomocą bawełnianego wacika na zszyty obszar, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej.
  20. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i przenieś ją do czystej, wstępnie ogrzanej klatki dla zwierząt w obszarze rekonwalescencji. Wyłącz parownik izofluranu i tlen.
  21. Trzymaj klatkę na poduszce grzewczej na czas rekonwalescencji po znieczuleniu. Alternatywnie, jeśli używasz lampy grzewczej, umieść mysz z boku klatki pod lampą, aby mysz mogła przesunąć się na chłodną stronę klatki, gdy budzi się ze znieczulenia, aby zapobiec przegrzaniu. Monitoruj mysz po wyjściu ze znieczulenia w ciągu najbliższych 5-10 minut.
  22. Monitoruj mysz przez następne 3 dni (monitorowanie masy ciała), zapewnij opiekę pooperacyjną (wilgotna puree w celu zapewnienia nawodnienia) i leki przeciwbólowe (2 mg/kg meloksykamu, 2x dziennie podskórnie, przez 2-3 dni) zgodnie z przepisami określonymi przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.

2. Dostarczenie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (7 dni - model podostry lub 21 dni - model przewlekły) po udarze mózgu

UWAGA: Zapoznaj się z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi pracy z AAV. Zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Toronto, operacja ta jest wykonywana w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego Poziomu Zabezpieczenia 2.

UWAGA: Wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed operacją. Ramka stereotaktyczna jest sterylizowana za pomocą PREempt. Strzykawki są sterylizowane PREempt, 70% alkoholem i zalewane sterylnym PBS. AAV są przechowywane na lodzie przez cały czas trwania operacji.

  1. Przed rozpoczęciem zabiegu należy przygotować obszar rekonwalescencji, umieszczając czystą klatkę na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. Alternatywnie, jeśli używana jest lampa grzewcza, umieść tylko połowę klatki pod wpływem ciepła.
    1. Aby znieczulić myszy za pomocą izofluranu, umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i włącz tlen do 1-1,5 l/min, a następnie dostosuj parownik izofluranu do 3%-5%, aby rozpocząć znieczulenie (zgodnie z oficjalnie zatwierdzonymi protokołami).
  2. Wyjmij zwierzę z komory, gdy leży na boku i nie może już stać na czystej powierzchni. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, potwierdzając brak odruchu szczypania palców u nóg przed i w trakcie operacji.
    1. Zabezpiecz stożek nosowy wysunięty z urządzenia znieczulającego na zwierzęciu i dostosuj izofluran do 1%-2% w celu konserwacji. Należy zminimalizować narażenie na izofluran (5 minut przy 3%-5% w przypadku indukcji i pozostały czas przy 1%-2%), ponieważ procedura może trwać do 40 minut.
  3. Zważyć zwierzę i podać podskórnie odpowiednią dawkę przedoperacyjnego leku przeciwbólowego (meloksykam (2,0 mg/kg)) w zależności od masy ciała.
  4. Nałóż maść z lubrykantem do oczu na każde oko myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki pod narkozą.
  5. Wysterylizuj obszar skóry strzyżonej sierścią za pomocą 70% etanolu, a następnie dwukrotnie alkoholu chlorheksydyny, aby utworzyć pole operacyjne.
  6. Przenieś mysz na stereotaktyczną ramkę myszy, umieszczając najpierw jej nos w stereotaktycznym stożku nosowym, a następnie ustabilizuj czaszkę za pomocą nauszników. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aby zapewnić wsparcie termiczne przez cały zabieg chirurgiczny. Utrzymuj izofluran na poziomie 1%-2%, tak aby częstość oddechów myszy wynosiła 1 oddech/s.
  7. W razie potrzeby powtórz aplikację smarowania oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu. Nałóż sterylną serwetkę chirurgiczną na ciało myszy, poniżej uszu, aby zwiększyć rozmiar sterylnego pola.
  8. Jeśli nadal występuje, przetnij szwy nożyczkami chirurgicznymi i usuń strup za pomocą kleszczy. Cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę.
    UWAGA: W przypadku modelu przewlekłego może być konieczne wycięcie skóry ostrzem skalpela #10.
  9. Użyj sterylnego patyczka higienicznego, aby wysuszyć czaszkę i zlokalizować otwory na zadziory.
  10. Ustaw ramiona manipulatora aparatu stereotaktycznego z uchwytem na igłę przenoszącą strzykawkę 26 G z igłą o długości 0,375 cala.
  11. Załadować 3,4 μl AAV (1 x 109 kopii genomu (GC) / μL w przypadku badania ostrego; 1 x10 10 GC / μL w badaniu przewlekłym) do strzykawki. Aby upewnić się, że przepływ jest dobry, uwolnij niewielką objętość AAV, aż będzie można zaobserwować kroplę na końcu igły. Użyj sterylnej patyczka higienicznej, aby zetrzeć nadmiar przed wykonaniem wstrzyknięcia.
  12. Opuść końcówkę igły za czaszkę w pierwszym otworze zadziorowym używanym do ET-1 (w prawej korze sensomotorycznej na poziomie + 0,0 z przodu i 2,25 mm z boku do bregmy) bez nakłuwania opony twardej. Po wyrównaniu opuść igłę na 1 mm w głąb mózgu. (0 AP, +2,25 ML, −1,0 DV z bregma).
  13. Wstrzyknąć 1 μl AAV (1 x 109 GC/μL w badaniu ostrym; 1 x10 10 GC/μL w badaniu przewlekłym), dozując jednorazowo 0,1 μl. Popchnąć tłok strzykawki Hamiltona do przodu, aby dozować 0,1 μl i odczekać minutę przed wstrzyknięciem następnego 0,1 μl; wstrzykiwać do momentu wydania 1 μl. Po wydaniu ostatniego 0,1 μl (0,1 μl x 10 wstrzyknięć = łącznie 1 μl), przytrzymaj igłę na miejscu przez 10 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu, a następnie powoli wycofaj się w górę, aby wyjąć strzykawkę.
  14. Aby upewnić się, że igła nie zostanie zablokowana podczas wstrzykiwania, należy uwolnić niewielką objętość AAV do momentu, gdy będzie można zaobserwować kroplę na końcu igły. Użyj sterylnej patyczka higienicznej, aby zetrzeć nadmiar przed wykonaniem wstrzyknięcia.
  15. Powtórz kroki 2.11-2.14 dla wstrzyknięć AAV do dwóch pozostałych otworów zadziorowych (w prawej korze czuciowo-ruchowej przy +1 AP, +2,25 ML, −1,0 DV; i −1 AP, +2,25 ML, −1,0 DV mm od bregma. Wysterylizuj strzykawki przed wstrzyknięciem następnemu zwierzęciu za pomocą PREempt, następnie 70% alkoholu, a na końcu sterylnego PBS.
  16. Aby zamknąć ranę, zszyj przylegającą do niej skórę na czaszce za pomocą sterylnego szwu poliestrowego 4-0 polysorb.
  17. Podawaj maść z antybiotykiem za pomocą bawełnianego wacika na zszyty obszar, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej.
  18. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i przenieś ją do czystej, wstępnie ogrzanej klatki dla zwierząt w obszarze rekonwalescencji. Wyłącz parownik izofluranu i tlen.
  19. Trzymaj mysz wewnątrz klatki i wysterylizuj zewnętrzną część klatki za pomocą PREempt i 70% alkoholu przed umieszczeniem jej na poduszce grzewczej w celu odzyskania znieczulenia.
    1. Alternatywnie, jeśli używasz lampy grzewczej, umieść mysz z boku klatki pod lampą, aby mysz mogła przesunąć się na chłodną stronę klatki, gdy budzi się ze znieczulenia, aby zapobiec przegrzaniu. Monitoruj mysz po wyjściu ze znieczulenia w ciągu najbliższych 5-10 minut.
  20. Monitoruj mysz przez następne 3 dni (monitorowanie masy ciała), zapewnij opiekę pooperacyjną (wilgotna puree w celu zapewnienia nawodnienia) i leki przeciwbólowe (2 mg/kg meloksykamu, 2x dziennie podskórnie, przez 2-3 dni) zgodnie z przepisami określonymi przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.

3. Przygotowanie i rozbiór tkanek

  1. Aby poddać mysz eutanazji, wstrzyknij jej dootrzewnowo tribromoetanol (Avertin) (stężenie 12,5 mg/ml, 250 mg/m.c. (kg)) i odczekaj 2-3 minuty na pełną indukcję. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, wyjmując mysz z klatki i potwierdzając brak odruchu szczypania palców
    2. .
  2. W dygestorium wykonaj perfuzję przezsercową26 z solą fizjologiczną, a następnie 4% paraformaldehydem. Spryskaj głowę uśpionego zwierzęcia 70% etanolem, aż do namoczenia.
  3. Odetnij głowę u podstawy czaszki za pomocą dużych nożyczek. Rozetnij skórę wzdłuż linii środkowej całej czaszki za pomocą prostych nożyczek do tęczówki 4-1/2 ". Cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę.
  4. Od otworu jamy rdzeniowej na szyi włóż nożyczki do tęczówki i przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i międzyczołowego.
  5. Następnie włóż nożyczki do dwóch oczodołów i przetnij szew czołowo-nosowy.
  6. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mózgu. Podważ płytki czaszki w lewo i w prawo, aż mózg zostanie odsłonięty.
  7. Przenieś mózg do fiolki scyntylacyjnej z 4% paraformaldehydem. Utrzymuj mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 4 godziny.
  8. Mózg jest następnie kriochroniony poprzez zastąpienie 4% paraformaldehydu 30% sacharozą. Utrzymuj mózg w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno fiolki (~12 godzin).

4. Sekcja zamrożonych mózgów

  1. Ustaw temperaturę komory kriostatu w zakresie od -20 °C do -26 °C.
  2. Wykonaj nacięcie koronalne w poprzek móżdżku i przymocuj płaską, ogonową część mózgu do uchwytu kriostatycznego ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
  3. Umieść uchwyt z mózgiem w uchwycie dysku i wyrównaj opuszkę węchową z ostrzem noża.
  4. Pokrój mózg na plastry koronalne o grubości 20 μm. Aby uniknąć smug lub zadrapań na pociętych wycinkach mózgu, umieść kawałek taśmy na platformie do cięcia, aby utworzyć niewielką szczelinę między płytą zapobiegającą toczeniu się a platformą. Pędzel malarski może być użyty do dostosowania orientacji przekroju przed uchwyceniem go na dodatnio naładowanym szkiełku podstawowym.
  5. Szkiełka z wycinkami mózgu należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. Immunohistochemia i kwantyfikacja

  1. Przetwórz skrawki do immunohistochemii przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko NeuN, markerowi panneuronalnemu, zgodnie ze standardowymi protokołami22,26.
  2. Rozmrażaj kriokonserwowane skrawki mózgu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć sekcje trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez 5 minut każda.
  3. Inkubować skrawki w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej do przepuszczalności.
  4. Przygotować roztwór blokujący (5% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 w PBS) i inkubować skrawki w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe, królicze anty-NeuN, w stosunku 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować skrawki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Umyj sekcje trzykrotnie 0,3% Triton X-100 w PBS, przez 5 minut każde pranie.
  7. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe, kozie przeciwciało anty-królicze 568 lub 488, w stosunku 1:1000 w PBS. Skrawki inkubować z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  8. Wykonaj trzy prania 0,3% Triton X-100 w PBS, każde po 5 minut. Inkubować skrawki z DAPI (1:10 000 w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj sekcje jeszcze trzy razy PBS, po 5 minut każda. Zamontuj witraże na szkiełku podstawowym z fluorescencyjnym medium montażowym i szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw zamontowane szkiełka do wyschnięcia przez noc.
  10. Szkiełka barwione obrazem za pomocą obiektywu 20x z mikroskopem konfokalnym w celu uzyskania widoków komórek Reporter+ wokół zmiany udaru w 3 różnych odcinkach koronalnych (między anatomicznymi obszarami skrzyżowania ciała modzelowatego z przodu i skrzyżowania spoidła przedniego z tyłu) dla każdego zwierzęcia.
    UWAGA: Odległość rozprzestrzeniania się AAV będzie się różnić w obrębie półkuli. Jednak w oparciu o nasze doświadczenie i analizę komórek Reporter+ po przetworzeniu tkanki, rozprzestrzenianie się AAV zwykle obejmuje około +3 mm do -3 mm od bregma. Należy określić ilościowo komórki reporter+ wokół zmiany po udarze (zidentyfikowanej przez brak/rzadkie zabarwienie NeuN) w obszarze między miejscem, w którym ciało modzelowate przecina linię środkową a łączy się spoidło przednie.
  11. W celu ilościowego określenia transdukowanych neuronów należy przeprowadzić analizę kolokalizacji. Ręcznie policz liczbę komórek podwójnie dodatnich (Reporter+NeuN+) i całkowitą liczbę transdukowanych komórek (Reporter+) w wycinkach mózgu. Aby uzyskać przedstawione wyniki, policzono >3 pola widzenia otaczające zmianę (przyśrodkową, boczną i dolną) z 3 odcinków koronalnych na mysz.

Wyniki

Aby zbadać komórkowe skutki ektopowej ekspresji Neurod1 sterowanej krótkim promotorem GFAP (gfaABC(1)D) u myszy typu dzikiego (C57BL/6J) oraz u myszy transgenicznych z reporterem tdTom-Cre (konkretnie B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22, zastosowano dwa systemy oparte na AAV5 u myszy po udarze wywołanym przez ET-1 (Rysunek 1A-C). W podostrym modelu udaru Neurod1 zapakowano do systemu AAV Cre-Flex i podano myszom typu dzikiego w 7. dobie po udarze (Rysunek 1B). Drugi wektor Flex zawiera odwróconą sekwencję GFP sterowaną przez promotor CAG, flankowaną heterotypowymi, antyrównoległymi miejscami rekombinacji typu loxP (Rysunek 1B). Oba konstrukty wirusowe wstrzyknięto jednocześnie w tym samym czasie po udarze. Po ekspresji Cre w transdukowanych komórkach, GFP zostaje odwrócona i wycięta w miejscach rekombinacji, co orientuje sekwencję w kierunku sensownym, umożliwiając ekspresję GFP. Zatem komórki wykazujące ekspresję Cre będą GFP-dodatnie, co wskazuje na ich transdukcję wektorami Cre-Flex. W modelu podostrym myszy uśpiono w 21. dobie po transdukcji (tj. 28 dni po udarze), a następnie w miąższu mózgów uszkodzonych udarem policzono liczbę komórek transdukowanych (GFP+) oraz liczbę komórek NeuN+GFP+ (komórek transdukowanych wykazujących ekspresję NeuN). Jak widać na Rysunku 2A, w miejscu uszkodzenia niedokrwiennego dochodzi do utraty neuronów. Ilościowe oznaczenie komórek transdukowanych w schemacie podostrym z użyciem systemu AAV Cre-Flex wykazało znacznie więcej znakowanych neuronów (komórki NeuN+GFP+/GFP+) u myszy leczonych Neurod1 w porównaniu do myszy kontrolnych Stroke-Cre (odpowiednio 43,05 +/- 5,50% vs 18,43 +/- 3,03% komórek NeuN+GFP+/GFP+ w grupie Stroke-Neurod1 vs Stroke-Cre (kontrolnej)) (p = 0,0172) (Rysunek 2B,C).

W osobnym zestawie eksperymentów konwersję AtN przeprowadzono w chronicznym modelu udaru (Rysunek 1B,C). Czynnik transkrypcyjny Neurod1 wprowadzono myszom reporterowym tdTom-Cre z udarem wywołanym ET-1 w 21. dniu po udarze (Rysunek 1C). Podobnie jak w systemie Cre-Flex stosowanym u myszy typu dzikiego, ekspresję Neurod1 sterował krótki promotor GFAP. Jednak w tym systemie zastosowano pojedynczą konstrukcję AAV, w której za Neurod1 następowała rekombinaza Cre (Rysunek 1B). W konsekwencji komórki wykazujące ekspresję GFAP produkują rekombinazę Cre, która indukuje reporter tdTom, co wskazuje na komórki poddane transdukcji AAV. Myszy uśmiercono 77 dni po udarze (8 tygodni po AAV) (Rysunek 1C). Jak widać na Rysunku 3A, w 77. dniu po udarze u myszy tdTom-Cre obserwuje się zmianę korową. Ilościowo określono liczbę przetransdukowanych komórek wykazujących marker neuronalny NeuN+ (relatywny procent komórek (NeuN+tdTom+/tdTom+) w chronicznej fazie po udarze) i stwierdzono, że myszy, które otrzymały Stroke-Neurod1, miały znacząco więcej oznakowanych neuronów w porównaniu z myszami kontrolnymi Stroke-Cre (odpowiednio 74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% komórek NeuN+tdTom+/tdTom+ w myszach leczonych Stroke-Neurod1vs. Stroke-Cre (kontrolnych)) (p = 0,0355) (Rysunek 3B,C).

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wykazują podstawową transdukcję neuronów oraz większą liczbę transdukowanych komórek wykazujących ekspresję NeuN+ po dostarczeniu Neurod1 zarówno w podostrej, jak i chronicznej fazie po udarze u myszy typu dzikiego oraz myszy reporterowych tdTom-Cre, przy zastosowaniu dwóch różnych systemów opartych na AAV.

Schemat wstrzykiwania AAV i AAV Cre-Flex u myszy; ekspresja genów, model udaru, oś czasu eksperymentu.
Rysunek 1: Ektopowa ekspresja Neurod1, wektory i osie czasu. (A) Graficzna reprezentacja indukcji udaru poprzez wstrzyknięcie endoteliny-1 (ET-1) do kory ruchowej myszy. Wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) dostarczony w 3 miejscach: w miejscu wstrzyknięcia ET-1 oraz w miejscach otaczających zmianę, 1mm przedniej i tylnej strony. Powiększony panel pokazujący komórki transdukowane AAV-Neurod1 w korze ruchowej. (B) Schemat dwóch wektorów AAV w systemie Cre-Flex dostarczonych myszom typu dzikiego (górny panel). Wektor AAV5 1 zawiera krótki promotor GFAP, czynnik transkrypcyjny Neurod1 oraz sekwencję rekombinazy Cre flankowaną przez miejsce loxP (czarny trójkąt) i miejsce lox2272 (biały trójkąt). Wektor AAV5 2 niesie odwróconą sekwencję reporteru genu GFP flankowaną przez parę miejsc loxP i lox2272. Transdukcja obu wektorów w komórkach prowadzi do wycinania i inwersji zależnej od Cre, co umożliwia ekspresję GFP w celu oznakowania transdukowanych komórek. Neurod1 był również dostarczany myszom tdTom-Cre za pomocą jednego wektora AAV5 (dolny panel). W wektorze AAV5 1 zapakowano krótki promotor GFAP, czynnik transkrypcyjny Neurod1 oraz sekwencję rekombinazy Cre. Ekspresja Cre w transdukowanych komórkach powoduje wycięcie kodonu Stop w miejscach loxP (czarny trójkąt), umożliwiając ekspresję tdTomato. (C) System Cre-Flex przetestowano u myszy typu dzikiego z AAV wstrzykniętymi w okresie podostrym po udarze (7. dzień po udarze). Myszy typu dzikiego uśmiercono 21 dni po transdukcji AAV (28 dni po udarze). AAV dostarczono myszom tdTom-Cre w okresie przewlekłym po udarze (21. dzień po udarze), a myszy uśmiercono 56 dni po transdukcji AAV (77 dni po udarze). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki indukcji udaru; obraz mikroskopowy ekspresji NeuN/DAPI/GFP; wykres procentowej zawartości neuronów.
Rycina 2: Ektopowe dostarczenie Neurod1 przy użyciu AAV Cre-Flex w podostrej fazie po udarze prowadzi do zwiększenia liczby przetransdukowanych komórek wykazujących ekspresję NeuN. (A) Immunobarwienie koronalnych przekrojów mózgu przez korę ruchową w 28. dniu po udarze u myszy kontrolnych Stroke-Cre (lewo) oraz Stroke-Neurod1 (prawo). Ubytek neuronów widoczny jest w miejscu zmiany (białe linie przerywane). W korze widoczne są komórki przetransdukowane (GFP+, zielone), neurony (NeuN+, czerwone) oraz komórki kolokalizowane NeuN+GFP+ (pomarańczowe). Paski skali: 250 µm. (B) Reprezentatywne obrazy tkanki mózgowej myszy kontrolnych Stroke-Cre (góra) i Stroke-Neurod1 (dół) pokazujące neurony (NeuN+, czerwone) i komórki przetransdukowane AAV GFP+ (zielone). Wstawki obramowane na biało przedstawiają powiększenie komórek dla każdego pojedynczego kanału. Białe groty strzałek wskazują komórki przetransdukowane AAV (GFP+). Białe strzałki wskazują kolokalizowane komórki NeuN+GFP+. Paski skali: 125 µm. (C) Ilościowe oznaczenie komórek NeuN+GFP+/GFP+ u myszy Stroke-Cre i Stroke-Neurod1. N = 3 myszy na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Test Shapiro-Wilka (p = 0,3223). Nieparzysty t-test, *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna znaczników DAPI/NeuN/fdTom, Stroke-Cre vs Stroke-Neurod1, analiza neuronów.
Rysunek 3: Ektopowe dostarczenie Neurod1 u myszy reporterowych tdTom-Cre w chronicznej fazie po udarze prowadzi do zwiększenia liczby transdukowanych komórek wykazujących ekspresję NeuN. (A) Immunobarwienie koronalnych przekrojów mózgu przez korę ruchową w 77. dniu po udarze u myszy kontrolnych Stroke-Cre oraz myszy Stroke-Neurod1 . Utrata neuronów widoczna jest w miejscu uszkodzenia niedokrwiennego (białe przerywane linie). Komórki transdukowane w obszarze okołozawałowym są znakowane tdTom (czerwony). Komórki NeuN+tdTom+ (pomarańczowy) to komórki transdukowane, które wykazują ekspresję markerów neuronalnych. Paski skali: 250 µm. (B) Reprezentatywne obrazy tkanki mózgowej myszy kontrolnych Stroke-Cre (góra) i Stroke-Neurod1 (dół), pokazujące neurony (NeuN+, zielony) oraz komórki transdukowane AAV (tdTom+, czerwony). Wstawki obramowane na biało przedstawiają powiększenie komórek dla każdego pojedynczego kanału. Białe groty strzałek wskazują komórki transdukowane AAV (tdTom+). Białe strzałki wskazują kolokalizowane komórki NeuN+tdTom+. Paski skali: 125 µm. (C) Ilościowa analiza komórek NeuN+tdTom+/tdTom+ w paradygmacie chronicznym wykazuje istotnie większą liczbę transdukowanych komórek wykazujących ekspresję NeuN+ (komórki NeuN+tdTom+/tdTom+) u myszy leczonych Neurod1 . N = 3 myszy na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Test Shapiro-Wilka (p = 0,2044). Nieparowany t-test, *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten szczegółowo opisuje dwa systemy AAV i modele myszy do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w kontekście łagodnego i umiarkowanego modelu udaru korowego ET-1. Należy wziąć pod uwagę szereg krytycznych kroków związanych z udarem ET-1 dla odtwarzalności i spójności urazu. Otwory na zadziory należy ostrożnie wywiercić bez przebijania opony twardej, aby zapobiec niezamierzonym obrażeniom chirurgicznym. Ważne jest, aby używać spójnych punktów orientacyjnych, w tym przypadku bregma, aby zapewnić podobny obszar zainteresowania (kora sensomotoryczna w tym badaniu). Jest to szczególnie ważne w przypadku badań wykorzystujących oceny behawioralne, ponieważ lokalizacja i wielkość zmiany będą miały wpływ na wyniki funkcjonalne 13,22,25,27. Co najważniejsze, szybkość wstrzykiwania ET-1 i nacisk wywierany przez chirurga na strzykawkę muszą być spójne, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Należy zauważyć, że igła strzykawki może się zatkać i musi być czyszczona między zwierzętami, aby zapewnić dokładne podanie ET-1. Podczas analizy komórkowej tkanki, jeśli nie obserwuje się zmiany po udarze, igła prawdopodobnie została zatkana podczas operacji. Jeśli problem będzie się powtarzał, zaopatrz się w nową partię endoteliny-1 od producenta, ponieważ w przeszłości obserwowano problemy z potencją zależną od partii.

Etapy procedury chirurgicznej w celu dostarczenia AAV są podobne do tych w protokole indukcji udaru ET-1. W związku z tym powyższe względy są krytyczne. Ponadto miano i objętość wirusa AAV muszą być spójne, aby zapewnić możliwość porównania skuteczności transdukcji między grupami. W tym protokole podawano 1 x 109 GC/μL AAV w badaniu ostrym i 1 x10 10 GC/μL AAV w badaniu przewlekłym. Bardzo ważne jest, aby wybrać dawkę wirusa, która jest wystarczająco niska, aby zminimalizować artefakty błędnej ekspresji, a jednocześnie jest wystarczająco wysoka, aby zapewnić wystarczającą transdukcję komórkową, umożliwiając wykrycie różnic między grupami eksperymentalnymi. Optymalny zakres dawek wirusa dla takich badań został określony na 107-10 10 GC/μL13,24. Wyższe miana AAV nie tylko powodują rozległe znakowanie neuronów w grupie kontrolnej, ale wykazano również, że indukują astrocytozę, zakłócają barierę krew-mózg i zwiększają reakcje zapalne28,29. W badaniach nad dostarczaniem czynnika transkrypcyjnego za pośrednictwem wirusa po udarze mózgu wykorzystano różne miejsca dostarczania do wstrzykiwań AAV. Jedno z badań opisało udane znakowanie transdukowanych komórek za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia AAV w miejsce zmiany po udarze13. Inne badania koncentrują się na jednym do trzech obszarów wokół obszaru zawału30. W tym przypadku AAV został dostarczony w trzech lokalizacjach, z jednym wstrzyknięciem we współrzędnych miejsca wstrzyknięcia ET-1 i 2 wokół miejsca zmiany (jedno wstrzyknięcie w 1,0 mm z przodu i jedno wstrzyknięcie w 1,0 mm z tyłu) w celu transdukcji reaktywnych astrocytów w perylezyjnej granicy glejowej9. Podczas analizy komórkowej tkanki, jeśli nie zaobserwuje się żadnych lub bardzo mało (1-10 komórek/sekcyjny) komórek fluorescencyjnych, igła mogła zostać zatkana podczas wstrzyknięcia lub AAV został zbyt wiele razy zamrożony i rozmrożony, co doprowadziło do inaktywacji wirusa.

Skuteczność transdukcji badano w różnych momentach w modelu łagodnego i umiarkowanego udaru, a wyniki pokazują, że znacznie więcej neuronów jest znakowanych w mózgach leczonych Neurod1 zarówno w podostrym, jak i przewlekłym czasie po udarze. Pokazana tutaj praca jest pierwszą, która demonstruje transdukcję Neurod1 w fazie przewlekłej po udarze i ujawnia neurony ektopowo wyrażające Neurod1 nawet 8 tygodni po udarze. Podczas gdy odkrycia, że zwiększona liczba transdukowanych neuronów jest obserwowana w mózgach z uszkodzeniem udaru, które otrzymały Neurod1 w porównaniu z wektorami kontrolnymi, są zgodne z tym, że Neurod1 odgrywa rolę w konwersji AtN, interpretacja wyników komórkowych wymaga solidnej wiedzy na temat ograniczeń paradygmatu eksperymentalnego. Zdecydowana większość opublikowanych badań dotyczących konwersji AtN wykorzystuje GFAP jako promotor, ponieważ GFAP jest regulowany w górę w reaktywnych astrocytach w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym po udarzemózgu 4,31. Wykazano jednak, że niska ekspresja GFAP występuje również w neuronach32. Jest to zgodne z przedstawionymi tutaj odkryciami, w których odsetek transdukowanych komórek w grupie kontrolnej (Stroke-Cre) to wcześniej istniejące neurony32. W szczególności grupy kontrolne Stroke-Cre w tym protokole wykazały 18,43 +/- 3,03% i 53,05 +/- 5,028% znakowania komórek NeuN + Reporter +, co reprezentuje znakowanie wcześniej istniejących neuronów, co wskazuje na ekspresję w neuronach sterowaną przez promotor GFAP. Rzeczywiście, ukierunkowana ekspresja Neurod1 zależy od wielu czynników, w tym tropizmu wirusowego. Wykazano, że AAV5 transdukuje neurony z różną wydajnością w różnych obszarach mózgu, w tym w korze sensomotorycznej, co wskazuje, że serotypy AAV mają regionalny tropizm komórkowy, który należy wziąć pod uwagę w badaniach indukujących ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych31,33. Szczepy myszy mogą również wpływać na transdukcję AAV 14,34. Badanie porównujące transdukcję AAV w prążkowiu myszy typu dzikiego (C57BL / 6J) i FVB / N wykazało zmienny tropizm komórek i wydajność transdukcji w dwóch szczepach34.

Zaletą systemu Cre-Flex jest to, że może być on stosowany do długotrwałego znakowania u myszy typu dzikiego, co może zmniejszyć problem niespecyficznej ekspresji Cre obecnej w liniach myszy Cre-reporter15,35. Wadą systemu Cre-Flex jest to, że ekspresja transgenu niezależna od Cre może wystąpić z powodu 0,1%-0,8% cząstek wirusa, które mają rekombinowane miejsca LoxP podczas produkcji wirusa36. Odkrycia te podkreślają znaczenie eksperymentów ze śledzeniem linii, na przykład wstępnego znakowania astrocytów przed podaniem AAV przy użyciu linii myszy Aldh1l1-CreERT2, aby zapewnić, że konwersja AtN nie jest przeszacowana podczas przedstawiania wniosków15. Badania sugerują, że aktywacja ludzkiego promotora GFAP (stosowanego w tych badaniach) poprzez regulację cis przez geny niższego szczebla (takie jak Neurod1) może powodować ekspresję GFAP w neuronach endogennych, prowadząc do większej liczby znakowanych neuronów w grupie leczonej15,32. Łącznie badania te i ich wyniki podkreślają znaczenie eksperymentów śledzenia linii, na przykład wstępnego znakowania astrocytów lub neuronów przed podaniem AAV, w celu rozróżnienia między wcześniej istniejącymi i endogennymi neuronami podczas analizy15.

Rozważając kolejne kroki, które mogłyby zmniejszyć transdukcję neuronalną, przydatne byłyby różne serotypy AAV i / lub zastosowanie mniej rozwiązłego promotora specyficznego dla astrocytów19. Rosnąca liczba doniesień opisujących heterogeniczność astrocytów może dodatkowo wpływać na specyficzność ekspresji genów, jeśli różne subpopulacje astrocytów są ogólnie bardziej podatne na konwersję AtN 37,38,39,40.

Wiek zwierząt wykorzystywanych w przedklinicznych modelach urazów lub chorób jest również ważnym czynnikiem, który może wprowadzać zmienne wyniki. Na przykład w przypadku neurotraumy wiek może wpływać na reaktywność astrocytów, co miałoby wpływ na wyniki badań nad konwersją AtN41. Ponadto indukowane przez Cre linie reporterowe mogą z czasem tracić swoistość ekspresji, co może wpływać na miary wyników42. Do tej pory przeprogramowanie u starszych zwierząt nie zostało kompleksowo zbadane43.

Protokół opisuje dostarczanie AAV w 2 fazach po udarze: (1) fazie podostrej (po 7 dniach) i (2) fazie przewlekłej (po 21 dniach) po udarze niedokrwiennym. Ektopowa ekspresja Neurod1 w modelu przewlekłego udaru mózgu nie została zbadana; W związku z tym obserwacja, że znacznie więcej neuronów jest znakowanych na tym późnym etapie, ma ważne implikacje dla przyszłych badań mających na celu promowanie powrotu do zdrowia po udarze w przewlekłym udarze. Badania badające potencjał ektopowej ekspresji Neurod1 w celu poprawy wyników udaru będą musiały uwzględniać oceny behawioralne, ponieważ wyniki funkcjonalne po udarze są najbardziej istotnymi klinicznie miernikami sukcesu interwencji terapeutycznej 13,22,25,27.

Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia dla pacjentów cierpiących na niepełnosprawność spowodowaną udarem mózgu w podostrej i przewlekłej fazie po udarze, z wyjątkiem rehabilitacji, która przynosi ograniczone korzyści. Wykazano, że wymuszona ekspresja neurogennych genów bHLH w gleju poprawia wyniki funkcjonalne po udarze22,30. Wyniki są zgodne z badaniami nad przeprogramowaniem AtN, które wykazały, że ektopowa ekspresja Neurod1 zwiększa transdukcję neuronalną po 3 i 7 tygodniach od dostarczenia AAV w porównaniu z myszami otrzymującymi wektor kontrolny. Co najważniejsze, w kilku artykułach przedstawiono zalecenia dotyczące kontroli, projektowania i interpretacji badań w dziedzinie przeprogramowania AtN 17,18,19,22. W tym celu w protokole tym opisano systemy AAV i mysie modele ektopowej ekspresji czynników transkrypcyjnych po udarze, które mogą być wykorzystane do informowania i posuwania naprzód dalszych badań nad mechanizmami komórkowymi leżącymi u podstaw obserwacji.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Heart and Stroke Foundation, Ontario Institute of Regenerative Medicine, Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) oraz Connaught Innovation Award (University of Toronto).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#77 Wiertło (.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreWektor  Biolabs
Polysorb™ Poliester CV-15 3/8 Okrągła igła stożkowa Rozmiar 4 - 0 PlecioneCovidienGL-881
(królik) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MyszyCharles River027
Roztwór chlorheksydynyPartnarPCH-020
Contec™   WYWŁASZCZANIE i handel; Roztwór dezynfekujący RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0,5MG
Pióra maszynka do golenia Ostrza mikrotomuPióro12-631P
Fisherbrand  Okulary nakrywkowe: prostokątneFisher Scientific12-545M 
Medium do montażu fluorescencyjnegoAgilent TechnologiesS3023 
Strzykawka HamiltonHamilton Company7634-01
Szybkobieżna wiertarka stereotaktycznaDavid Kopf Instruments1474
Rozwiązanie Metacam (meloksykam)Boehringer Ingelheim
OCT CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Maść Polyderm USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   Poduszka grzewcza do temperatury zwierzątFisher Scientific04-777-177
Instrumenty stereotaktyczneInstrumenty Davida KopfaModel 902
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus, białeFisherbrand12-550-15
tdMyszy Tomato Reporter Jackson Laboratory007914
V-1 Stołowy laboratoryjny system znieczulenia zwierzątVetEquip901806
Wchłanialny szew z igłą przeciwciało anty-NeuN

Bibliografia

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja Neurod1model udaru niedokrwiennegopromotor GFAPprzeprogramowanie astrocytówwstrzyknięcie stereotaktycznewstrzyknięcie endoteliny-1neurony transdukowanemysi model udaru
Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.